Identifikace subpopulací makrofágů v tukové tkáni

Transkript

1 Identifikace subpopulací makrofágů v tukové tkáni Centrum pro kardiovaskulární výzkum Laboratoř imunologické diagnostiky IKEM Praha ve spolupráci s firmou Beckman Coulter, Praha Konference DNA analýza XI, Praha 1

2 Akumulace tukové tkáně Dyslipoproteinémie FFA uvolňování (postprandiálně VLDL1 small dense LDL) Leptin, adiponektin Interleukin 6, MCP-1, TNFα, VCAM, ICAM Zvýšená infiltrace imunitních buněk, zejména makrofágů a změna jejich fenotypu metabolic inflammation Konference DNA analýza XI, Praha 2

3 Imunologické komplikace obezity dané chronickým zánětem tukové tkáni ale i lipogenezí v primárních i sekundárních lymfatických orgánech thymus, kostní dřeň či lymfatické uzliny Konference DNA analýza XI, Praha 3

4 Anatomické rozložení tukové tkáně Podkožní tuková tkáň - břicho, trup, končetiny Nitrobřišní tuková tkáň - viscerální (mesenterická and omentalní) - retroperitoneální (perirenální a perigonadální) Další lokalizace - Perivaskulární / epikardiální -intramuskulární, intermuskulární - Konference DNA analýza XI, Praha 4

5 Komplikace obezity Pulmonary disease abnormal function obstructive sleep apnea hypoventilation syndrome Nonalcoholic fatty liver disease steatosis steatohepatitis cirrhosis Gall bladder disease Gynecologic abnormalities abnormal menses infertility polycystic ovarian syndrome Osteoarthritis Skin Gout Idiopathic intracranial hypertension Stroke Cataracts Coronary heart disease Diabetes Dyslipidemia Hypertension Severe pancreatitis Cancer breast, uterus, cervix colon, esophagus, pancreas kidney, prostate Phlebitis venous stasis 5

6 Příklady látek, uvolňovaných tukovou tkání Konference DNA analýza XI, Praha 6

7 Příklady receptorů, exprimovaných v tukové tkáni Konference DNA analýza XI, Praha 7

8 Typy buněk v bílé tukové tkáni - adipocyty 30-60% - preadipocyty, fibroblasty a kmenové buňky - matrix kolagenových vláken - cévy (myocyty/endotheliální buňky) - imunitní buňky (monocyty/makrofágy, lymfocyty) - a další.. Lymfocyty Endotheliální buňky Makrofágy Monocyty Preadipocyty Adipocyty Konference DNA analýza XI, Praha 8

9 Adipocytokiny zdroj Adipocyty MCP-1, macrophage migration inhibitory factor, IL-6, leptin, adiponektin, SVF IL1β, IL-8, IL-10, TNF-α, resistin, VEGR. Konference DNA analýza XI, Praha 9

10 Molecular mechanism underlying adipose tissue inflammation. Suganami T, Ogawa Y J Leukoc Biol 2010;88: by Society for Leukocyte Biology Konference DNA analýza XI, Praha 10

11 DAMP signály při excesivní obezitě J. Clin. Invest. 2006;116:33-35 J. Intern. Med. 2007;262: Konference DNA analýza XI, Praha

12 . je ale makrofág v tukové tkáni skutečně statickou buňkou? Netrin -1 - protein, který byl dosud sledován zejména vzhledem k jeho roli ve vývoji nervového systému a při regulaci růstu nádorů. * zřejmě reguluje migraci buněk v širším kontextu Netrin-1 promotes adipose tissue macrophage retention and insulin resistance in obesity. Ramkhelawon B et al., Nat Med Apr;20(4): * Exprimován pouze v tukové tkáni obézních myší * Exprese v makrofázích je aktivována saturovanými mastnými kyselinami (palmitát) a přes receptor Unc5B blokuje migraci makrofágů, tj. efflux z tkání. Konference DNA analýza XI, Praha 12

13 Experiment Detekce rozdílů v zastoupení jednotlivých subtypů makrofágů v subkutánní, perirenální a perivaskulární (podél a. renalis) tukové tkáni u pacientů s pokročilou aterosklerózou vs. zdravým jedincům Zjištění korelace mezi rizikovými faktory aterosklerózy a zastoupením jednotlivých subpopulací makrofágů Konference DNA analýza XI, Praha 13

14 Subjekty pacienti indikovaní k rekonstrukční operaci tepen pánve a dolních končetin tj. pacienti s pokročilou aterosklerózou Kde ale vzít vzorky nitrobřišní tukové tkáně od zdravých jedinců? kontrolní soubor zdravých jedinců program transplantace ledvin od živých dárců Konference DNA analýza XI, Praha 14

15 Dárci ledvin jsou ochotni účastnit se studie jsou velmi dobře vyšetřeni budou sledováni po celý život (sběr dat i po delší době) Konference DNA analýza XI, Praha 15

16 Metody 1. Analýza subpopulací pomocí průtokové cytometrie 2. Určení genové exprese cytokinů a adipokinů 3. Zjištění zastoupení jednotlivých typů mastných kyselin v tukové tkáni tj. dieta 4. Odběry séra zaměření na rozvoj inzulinové rezistence, cytokiny v séru 16

17 WHITE ADIPOSE TISSUE ADIPOSE TISSUE ADIPOSE TISSUE MATRIX. FIBERS FILTER 250 μm MESH COLLAGENASE DIGESTION CENTRIFUGE FILTRATE FILTER 50 μm MESH ADIPOCYTES STROMAL VASCULAR CELLS (MONOCYTES/MACROPHAGES/PREADIPOCYTES, ENDOTHELIAL CELLS) FILTER 50 μm MESH Flow cytometry Konference DNA analýza XI, Praha 17

18 Postup - pokračování Ochlazení vzorku, filtrace (150 µm) Opakované promytí, cetrifugace 1200m rpm Označení monoklonálními protilátkami s navázanými fluorochromy (CD 14 (PC7) (Beckman Coulter), CD16 (ECD) (Beckman Coulter), CD 36 (FITC) (Beckman Coulter), a CD 163 (PE) (Biolegenda) a kalprotectin (PC7)(Acris antibodies)), následně analyzována metodou průtokové cytometrie. Izotypové kontroly - IgG1 FITC, PE, ECD Konference DNA analýza XI, Praha 18

19 CD 16 Výskyt-2 formy první je exprimovaná na NK buňkách, monocytech, makrofách a některých T lymfocytech. Jedná se o transmembránovou formu. Molekulová hmotnost kDa (FcγRIII-A) druhá je exprimovaná na neutrofilech a je glykosilphosphatidylinositolem kotvená forma. Molekulová hmotnost-48kda (FcγRIII-B). Spoluzodpovídá za jejich aktivaci a expresi adhesivních molekul. Znak aktivních, proinflamačních monocytů/makrofágů Konference DNA analýza XI, Praha 19

20 CD 36 Scavenger receptor Funkce - fagocytoza apoptotických neutrofilů a modifikovaných nízko densitních lipoproteinů Norma % Molekulová hmotnost kda Výskyt na buňkách - monocyty, makrofágy, krevní destičky, endoteliální buňky Konference DNA analýza XI, Praha 20

21 CD 163 scavenger receptor pro hemoglobin-haptoglobinový komplex Funkce - monocyty/makrofágy protizánětlivého charakteru - odstraňování hemoglobin-haptoglobinového komplexu Výskyt na buňkách-makrofágy, Kupferovy buňky jater, monocyty, část dendritických buněk, část progenitorových buněk Exprese na povrchu buněk je indukovaná glukokortikoidy (nezávisle na IL10) a IL10 asociované s ateroprotektivní aktivitou, klíčová role v pooperačním hojení Vazba hemoglobin-haptoglobinového komplexu na CD163 vede k zvýšené syntéze IL10 Exprese znaku CD163 roste při diferenciaci monocytu na makrofág 21 Konference DNA analýza XI, Praha

22 Kalprotektin (calprotectin) MRP8/14 protein, calgranulin, L1 protein, 27E10 antigen cytosolový protein, který se uvolňuje z leukocytů po jejich aktivaci nebo lýze.jedná se o kalcium a zinek vazebný protein s antimikrobiální aktivitou o molekulové hmotnosti 36,5 kda. Skládá se ze dvou těžkých řetězců a jednoho lehkého řetězce. Tvoří jej především monocyty a neutrofily membránová forma kalprotektinu je pouze na nezralých makrofázích a je ukazatelem influxu do místa zánětu. Konference DNA analýza XI, Praha 22

23 Životnost buněk renální tuková tkáň

24 První výsledky. CD14+ CD14+CD16+ CD14+CD16+CD36+++CD163- *** * Konference DNA analýza XI, Praha 24

25 Korelace s BMI 25

26 Prezentované výsledky a postupy jsou výsledkem pracovní skupiny pod vedením Rudolfa Poledneho Anna Králová Alena Sekerková Jiří Froněk Jana Ždychová Ilja Stříž Pavel Kružík Děkuji Evě Fáberové a Adéle Sajdlové za velmi významnou pomoc s realizací experimentu. Konference DNA analýza XI, Praha 26

27 Na druhou stranu..fat, fit and healthy fenomen. Obézní jedinci, kteří ale vykazují normální, metabolické parametry lipoproteinové parametry, glykémie, IR Nemají zvýšený krevní tlak Jsou v dobré fyzické kondici Konference DNA analýza XI, Praha 27

28 možné vysvětlení. Konference DNA analýza XI, Praha 28

29 Konference DNA analýza XI, Praha 29

30 Děkuji za pozornost a přeji Vám dobrou chuť! ivka@medicon.cz Konference DNA analýza XI, Praha 30

31 Izotypové kontroly