Neočekáváné výsledky cytometrického vyšetření lymfocytárních subpopulací, aneb kam zařadit pacienta

Transkript

1 Neočekáváné výsledky cytometrického vyšetření lymfocytárních subpopulací, aneb kam zařadit pacienta Marcela Vlková Ústav klinické imunologie a alergologie LF MU a FN u sv. Anny v Brně

2 Vyšetřované parametry při podezření na primární imunodeficit Počet leukocytů, lymfocytů Přítomnost T-B- NK buněk Hladina sérových imunoglobulinů Komplement Fagocytóza Markery zánětu Subpopulace T- a B- lymfocytů Funkční testy T- a B- lymfocytů

3 Funkční testy lymfocytů na průtokovém cytometru Proliferace stimulace PHA, CoN A, anti CD3+ CD28 využití CFSE, Ki-67, BrDU Měření exprese CD40L a ICOS po stimulaci na T-lymfocytech Měření exprese CD80, CD86 na B-lymfocytech Sledování tvorby plasmablastů po očkování Sledování tvorby cytokinů

4 Rutinní vyšetření lymfocytárních populací

5 Leukocytární subpopulace v plné krvi pomocí znaku CD45

6 Výsledky vyšetření pana Průměrného ref. rozmezí 55-83% ref. rozmezí 28-57% ref. rozmezí 6-19% ref. rozmezí 7-31% ref. rozmezí 10-39%

7 T-lymfocytární subpopulace

8 T-lymfocytární subpopulace Dodělat T-reg u CVIdů

9 Pacient Š.A., r RA: neg. OA: I. dítě I. grav. 40TG perinatálně bpn. Vakcinace bez komplikací dle kalendáře Zdráv 10 měsíců, prospíval V 10 měsíci - hospitalizace : Fakultní dětská nemocnice, infekční klinika pro : Klebsiela pneum. sepse bez patologického nálezu, infekce močových cest ATB Protrahovaný pokles CRP, febrilní špičky Transitorní lymfocytopenie Indikace imunologického vyšetření

10 Pacient Š.A., nar Věk 10 měsíců Leukocyty abs.počty 10,7 Lymfocyty % 19 T lymfocyty CD3+ % 53 CD3+ abs.počty 1,08 CD3+4+ % 36 CD3+4+ abs.počty 0,73 CD3+8+ % 13 CD3+8+ abs.počty 0,26 Poměr CD3+4+/CD3+8+ 2,77 B lymfocyty CD19+ % 32 CD19+ abs.počty 0,65 NK buňky CD3-CD16,56+ % 12 CD3-CD16,56+ abs.počty 0,24

11 Pacient Š.A., nar , výsledky cytometrického měření T-lym. sub. Mírně snížené zastoupení CD45RA z CD3+4+ = 64% Mírně zvýšené procento CD45RO z CD3+4+ = 30% Bez známek vysoké aktivace na T-lym.: CD3+HLA-DR+ = 6,4% Normální procento TCRαβ a TCRγδ Vzhledem k věku a k celkovému počtu T- lymfocytů zvýšené procento Treg: 7%

12 Pacient Š.A., 2016, výsledky T-reg Zdravá kontrola Pacient Š.A.

13 Pacient Š.A., 2016 serologie Zvýšení IgA IgG, IgM norma Anti PCP, TET, HiB norma Zvýšení koncentrace C3 složky komplementu TREC redukce (T-Cell Receptor Excision Circles)

14 Patient Š.A., nar. 2016, další kontrola Věk 11 měsíců 10 měsíců Leukocyty abs.počty 8,9 10,7 Lymfocyty % T lymfocyty CD3+ % CD3+ abs.počty 2,36 1,08 CD3+4+ % CD3+4+ abs.počty 1,32 0,73 CD3+8+ % 15,0 13 CD3+8+ abs.počty 0,71 0,26 Poměr CD3+4+/CD3+8+ 1,82 2,77 B lymfocyty CD19+ % CD19+ abs.počty 1,70 0,65 NK buňky CD3-CD16,56+ % CD3-CD16,56+ abs.počty 0,47 0,24

15 Pacient ŠA 2016 Sepse: Zvýšení IgA IgG, IgM norma Anti PCP, TET, HiB norma 1M po propuštění: IgA norma IgG, IgM norma Anti PCP, TETm HiB norma Zvýšení C3 složky komplementu Lymfocytopenie Elevace T reg (7%) TREC redukce C3 norma Lymfocyty norma Normalizace T reg (3,7%) T lymf proliferace norma (PHA, ConA, CD3 )

16 Sepse jako imunosupresivní onemocnění Mění imunologický profil pacienta Známky: lymfopenie, granulocytopenie Zvýšení Treg 3-7 den redukce thymocytů x vzestup progenitorových buněk V progenitorových buňkách regulovány geny pro vývoj lymfocytů, upřednostnění genů pro myeloidní buňky Postižena i reakce B-lymfocytů mohou se produkovat plasmablasty, ale vzniklé Ig jsou málo specifické, důležitá je produkce IgM

17 Pacient PM 1983 RA: matka a otec matky sel def IgA otec M Crohn OA: Recidivující sinusitis Protrahované hojení ran Astma bronchiale intermitens Rec. tonsnilitis

18 Pacient P.M, (1983) Klinika: Normální hladina IgG Selektivní deficit IgA Snížená hladina IgM = 0,22g/l Homozygotní deficit MBL Autoprotilátky nepřítomny Mírný pokles v čase protilátek proti tetanickému toxoidu a pneumokoku

19 Pacient P.M. (1983): Vývoj procentuálního zastoupení T-lymfocytů v čase % Vzestup 8/38: (45%) CD3+ (%) CD3+4+ (%) CD3+8+ (%)

20 Pacient P.M.,(1983): Vývoj zastoupení absolutního počtu T-lymfocytů v čase 1,4 1,2 X10*9/l 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 Hranice normálních hodnot pro CD3 Hranice normálních hodnot pro CD3+4+ Hranice normálních hodnot pro CD3+8+ Vzestup 8/38: (45%) CD3+ CD CD3+4+

21 Pacient P.M., r.1983 CD3+ T lymfocytopenie abs a rel. počtu CD4+ T lymfocytopenie v abs a rel. počtu CD19+ lymfocytopenie v abs.počtu CD16/56+ norma HIV 1 HIV neg. Vyloučena hematologická malignita

22 Pacient P.M, (1983) Snížení %CD45RA z CD4+: 18% Normální aktivace HLA-DR na T-lymfocytech: 6,9% Chronická aktivace CD8+ T-lymfocytů: CD : 30% Normální proliferační odpověď T-lymfocytů na všechny typy Ag ( PHA, ConA, CD3+CD28)

23 Pacient P.M, (1983) Vzhledem k rodinné anamnéze chronickým sinusitidám selektivnímu deficitu IgA hladině IgM RS: rozvoj kombinovaného imunodeficitu, možná CVID

24 Pacientka V.I., r.1999 RA: otec - zemřel v 39 letech na kolorektální karcinom matka a sestry zdrávy OA: rec. nekomplikované otitidy v dětství tonsilitis cca 1x ročně Pro rec. impetigo - vyšetření na imunologii 2015

25 Pacientka V.I.,(1999) Snížené hladiny IgG (kolísání od 4,0 po 7,2g/l) Normální hladiny IgA i IgM MBL v normě Autoprotilátky: ANA, typ JG, titr kolísá 1:80-1:160 Mírný pokles protilátek proti pneumokoku, HIB, tetanus v normě Nižší hladiny leukocytů a lymfocytů kolísají mezi 3,7-5,8x10*9/l

26 Pacientka V.I.,(1999): výsledky vyšetření procentuálního zastoupení T-lymfocytárních subpopulací 60 Spodní hranice normálních hodnot Pacientka % CD3+ CD3+4+ CD3+8+ %CD45RA+ z CD

27 Pacientka V.I.,(1999): výsledky vyšetření absolutního počtu pro T-lymfocytární subpopulace 0,8 0,7 Spodní hranice normálních hodnot 0,6 X10*9/l 0,5 0,4 0,3 Pacientka 0,2 0,1 0 CD3+ CD3+4+ CD3+8+ CD

28 Proliferační vyšetření - pacientka V.I. (1999) Izolace PBMC bb /jamka Počet impulsů Kontrola Pacientka PHA (2ng/ml) PHA (5ng/ml) ConA (1ng/ml) ConA (2ng/ml) CD3+CD28+ (10ng/ml)

29 Pacientka V.I., (1999) Těžká CD3+CD4+ T lymfocytopenie v absolutním a relativním počtu Středně těžká CD3+CD8+T lymfocytopenie Normální aktivace HLA-DR na T-lymfocytech: 4,3% Bez známek chronické i akutní aktivace CD8+ T-lymfocytů Snížená T lymfocytární odpověď na proliferační podnět Redukce %CD45RA z CD4+ (31%) vzhledem k věku Nízké hladiny TREC obtížná interpretace HIV1 a HIV 2 neg. Vyloučena hematologická malignita FA: 2017 ATB profylaxe TMP/CTM Absence manifestních infektů spojených s prim. imunodeficiencí

30 Pacientka MB r.1972 OA: st.p. boreliosis Herpes zoster brachii et toracis l.dx 8/15 Hypacusis l.dx perceptiva mesocochlearis l.dx cum tinnitu 8/15 Monohočetná ložiska břišní stěny 8/15 UZ břicha: hypochondrium l.sin v podkoží, na fascii a v levém mesogastriu neostře ohraničený hypoechogenní útvar, difusně v rozsahu břicha v podkožním tuku patrné vícečetné útvary obdobného vzhledu cca 5mm 9/15 Histologie: Nekrotizující granulomatózní panikulitida reaktivní nodulární lymfoidní hyperplázií. 9/15 Vyloučeno maligní onemocnění 9/15 Vyloučena vaskulitis 10/15 HLA B 27 positivní spondyloartritis 11/15

31 Pacientka M.B., (1972) Laboratoř Normální hladiny IgG, IgA i IgM, IgG anti TET, anti PCP, anti Hib norma MBL v normě Autoprotilátky: ANA, typ homogenní, titr kolísá mezi 1:80-1:320 Leukocyty a lymfocyty se pohybují na dolní hranici normy

32 Pacientka M.B.,(1972): výsledky vyšetření procentuálního zastoupení T-lymfocytárních 60 Spodní hranice normálních hodnot subpopulací Pacientka % CD3+ CD3+4+ CD3+8+ %CD45RA+ z CD %TCRγδ+ z CD3+

33 Pacientka M.B.,(1972): graf absolutních hodnot zastoupení T lymfocytárních subpop. 0,8 0,7 Spodní hranice normálních hodnot X10*9/l 0,6 0,5 0,4 Pacientka 0,3 0,2 0, CD3+ CD3+4+ CD3+8+ CD3-19+

34 Proliferační vyšetření - pacientka M.B. (1972) Počet impulsů Kontrola Pacientka Médium PHA (5ng/ml) ConA (2ng/ml) CD3+CD28 (10ng/ml)

35 Pacientka M.B., r.1972 Těžká CD3+CD4+ T lymfocytopenie v absolutním a relativním počtu Středně těžká CD3+CD8+T lymfocytopenie CD19+B lymfocytopenie v absolutním počtu Snížená T lymfocytární odpověď na proliferační podnět Absence TREC Redukce %CD45RA z CD4+ HIV1 a HIV 2 neg. Vyloučena hematologická malignita

36 Nízké hladiny CD4+ X10*9/l 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 Spodní hranice normálních hodnot P.M. V. I. M.B. CD3+ 1 CD CD CD U všech prezentovaných pacientů zjištěny nízké hladiny CD4+ T- lymfocytů, které neodpovídají klinickému stavu pacienta.

37 % Nízké hladiny CD4+CD45RA+ T-lymfocytů %CD45RA z CD4+ %CD4+CD45RA Spodní hranice normálních hodnot % X10*9/l CD4+RA+ (x10*6/l)

38 Idiopatická CD4+ T lymfocytopenie (ICL) CD4+ <300 cells/ul nebo <20 % z celkového počtu T lymfocytů prokázané min 2x za 6 týdnů Absence terapie vedoucí k CD4+ T lymfocytopenii ICL dg kriteria HIV-1 HIV-2 HTVL seronegativit Vyloučení definovaného imunodeficitu asymptomatické oportunní infekce UNC, LCK MGT1 (XMEN sy) CXCL12/CXCR4 (WHIM sy) ICL manifestace mutace Malignity nej. Hematologické; nonhodgkinův lymfom autoimunní onemocnění MHCII CIITA RFXANK RFX5 RFXAP RAG, JAK3

39 B-lymfocytární subpopulace Naivní folikulární B-lymfocyty Zdravá kontrola IgM paměťové/marginální zóna Vývoj B-lymfocytárních subpopulací odráží případné změny v diferenciaci či aktivaci CD4+ T-lymfocytů. Izotypově přepnuté paměť. B-lymfocyty Plasmablasty

40 Pacient Š.A., nar , výsledky cytometrického měření B-lym. sub. Naivní folikulární B-lymfocyty Zdravá kontrola IgM paměťové/marginální zóna Pacient Š.A. Izotypově přepnuté paměť. B-lymfocyty Plasmablasty

41 Š.A. % Z.K. P.M. V. I. M.B. %IgM+CD27+/CD %IgM-CD27+/CD19+ P.M. V. I. M.B.

42 Závěr U pacientů s ICL nemusí klinické příznaky odpovídat laboratorním nálezům pacienta Tento stav může trvat i několik let, či desetiletí Je nutné sledovat zastoupení T-i B- lymfocytárních subpopulací, hladiny Ig, proliferační schopnosti

43 Poděkování MUDr. Evě Hlaváčkové Prof., MUDr. Jiří Litzman, CSc. Kolektivu lékařů a sester UKIA FNUSA Laborantkám UKIA

44 Děkuji za pozornost