Experiment lnì Ë st. vod

Transkript

1 ANAL ZA PEPTIDŸ POMOCÕ HMOTNOSTNÕ SPEKTROMETRIE MALDI-TOF ONDREJ äedo * a JOSEF HAVEL Katedra analytickè chemie P ÌrodovÏdeck fakulta Masarykova univerzita Kotl sk 6 37 Brno sedo@post.cz Doölo 7.6. p epracov no 7.. p ijato..3. KlÌËov slova: anal za peptid neuroprotektivnì peptidy MALDI-TOF MS PSD vod V znam metody hmotnostnì spektrometrie s laserovou desorpcì a ionizacì za Ëasti matrice (MALDI) v poslednì dobï neobyëejnï vzr st. D vodem je schopnost tèto techniky ionizovat za Ëasti matrice i velkè biomolekuly (> Da) a detegovat vzniklè ionty v analyz toru mï enìm doby letu (TOF) coû d v metodï nezastupitelnou roli zejmèna v anal ze lidskèho proteomu v souëasnosti nejrozs hlejöìm v zkumnèm projektu v oblasti p ÌrodnÌch vïd. KromÏ molekulovè hmotnosti je metoda MALDI-TOF MS schopna poskytnout daje i o struktu e peptid. Zv öenìm v konu laseru je moûnè dos hnout nadmïrnè excitace molekul analytu kterè se v d sledku p ebytku energie rozpadajì na menöì fragmenty (obr. ) z jejichû molekulov ch hmotnostì lze odvodit Ë st sekvence aminokyselin nebo celou strukturu peptidu. Sledov n m ûe b t rozpad molekul peptidu p Ìmo v iontovèm zdroji metodou ISD/ISF (in-source decay/fragmentation ñ rozpad/fragmentace ve zdroji) nebo bïhem letu v analyz toru TOF metodou PSD (post-source decay ñ rozpad za iontov m zdrojem). P i PSD jsou laserov mi pulsy zìsk ny molekulovè ionty vöech peptid z analyzovanè smïsi zvolen peptid je pak od ostatnìch separov n pomocì tzv. iontovè br ny (ion gate viz obr. ). BÏhem letu se Ë st iont rozpad. Kinetick energie tïchto iont se distribuuje na vznikajìcì fragmenty v z vislosti na jejich hmotnosti. V reflektronu potè doch zì k separaci iont na z kladï r znè kinetickè energie. Metoda PSD byla spïönï aplikov na pro urëov nì struktury peptid izolovan ch z ûivoëiön ch tk nì p i studiu exprese gen nebo pro identifikaci protein urëenìm malè Ë sti jejich struktury 3. S jejì pomocì lze lokalizovat posttranslaënì modifikace jako nap Ìklad radik lovou nitraci nebo fosforylaci. Metoda ISD se pouûìv mènï Ëasto kv li nutnosti p edchozì separace analyzovanèho peptidu navìc lze s jejì pomocì zìskat informaci jen o Ë sti struktury peptid 6. P Ìtomnost urëit ch druh peptid v mozku m spojitost s Alzheimerovou chorobou. Vedle tzv. β-amyloid a presenilin kterè poökozujì mozkovè synapse byl v ned vnè dobï objeven peptid nazvan humanin 7 kter naopak neurony chr nì p ed neurotoxick mi Ëinky patologick ch peptid. Jde o peptid s molekulovou hmotnostì 663 a strukturou Met-Ala-Pro-Arg-Gly-Phe-Ser-Cys-Leu-Leu-Leu-Leu- -Thr-Ser-Glu-Ile-Asp-Leu-Pro-Val-Lys-Arg-Arg-Ala. Mechanismus jeho neuroprotektivnìho p sobenì nebyl doposud objasnïn jeho biologick Ëinnost m ûe b t v raznï ovlivnïna substitucì nïkterè z aminokyselin. Experiment lnì Ë st Chemik lie a p Ìstroje Pro p Ìpravu vöech roztok byla pouûita voda redestilovan v k emennè aparatu e od fy. Heraeus (NÏmecko) acetonitril a kyselina trifluoroctov byly dod ny firmou Merck Obr.. Struktura a n zvoslovì fragment vznikajìcìch rozpadem peptid struktura vnit nìho fragmentu V V p V / V p t p V H + R R ñhnñchócoónhóchñcoñ a R R x + + ñhn=ch COóNHóCHñCOñ b R R y + + ñhnñchóco NH3 ñchñcoñ c R R z + + ñhnñchócoónh 3 CHñCOñ R R + HNñCHñCOñNHñCHñCO V Obr.. SchÈma principu funkceiontovè br ny; ionty jsou bïhem pr letu mezi destiëkami iontovè br ny vychylov ny napïtìm V p. V okamûiku kdy iontovou br nou proch zejì ionty zvolenèho peptidu (Ëas t p ) je napïtì V p vypnuto a pouze tyto ionty pokraëujì d le do reflektronu t V p TOF * Ondrej äedo zìskal. mìsto za nejlepöì studentskou vïdeckou pr ci v oboru analytickè chemie v celost tnì soutïûi o cenu firmy Merck v Praze 6.ñ7. nora. 9

2 (NÏmecko). Jako matrice pro MALDI byla pouûita kyselina α-kyan--hydroxysko icov (CHC ñ 3-(-hydroxyfenyl)-- -kyanpropenov kyselina) od firmy Sigma-Aldrich (NÏmecko). Anal zy byly provedeny na hmotnostnìm spektrometru MALDI-TOF Axima-CFR (Kratos Analytical Shimadzu Corporation Anglie). P Ìprava vzork Pro anal zu byl pouûìv n nasycen roztok matrice CHC ve smïsi % trifluoroctovè kyseliny a acetonitrilu :. Bylo postupov no tak ûe µl roztoku matrice byl s µl vzorku smìch n p Ìmo na destiëce spektrometru a smïs byla potè suöena proudem vzduchu p i laboratonì teplotï. V sledky a diskuse Metodou PSD bylo analyzov no nïkolik peptid s molekulov mi hmotnostmi ñ p iëemû u vöech byl pozorov n vznik iont typu a b a y fragment vytvo en ch Obr. 3. PSD spektrum lidskèho luteinizaënìho a vyluëovacìho hormonu (struktura pglu-his-trp-ser-tyr-gly-leu-arg-pro-gly-nh ); koncentrace peptidu µmol.l ñ matrice CHC namï eno v reflektronovèm pozitivnìm mûdu se zpoûdïnou extrakcì a iontovou br nou nastavenou na 7ñ9 Da v kon laseru 67 mw; ña ñb 3 ñ SY ñ WS ñy 3 6 ñy 3 7 ñ SYGL- ña 9 ñb ñy ña 3 ñb 3 -H O ñy ñb 3 ñ SYGLR 6 ña 7 ñy 6 ñb -H O 9 ñb ñb ñy 7 ña 6 3 ñb 6 ñy ñ a 7 6 ñ a 7 7 ñb 7 ñ b 7 9 ñ [M+H] Obr.. NalezenÌ Ë sti sekvence aminokyselin v nezn mèm peptidu; koncentrace peptidu µmol.l ñ matrice CHC namï eno v reflektronovèm pozitivnìm mûdu se zpoûdïnou extrakcì a iontovou br nou nastavenou na 6ñ63 Da v kon laseru 33 mw; ñ Gly ñ Ala 3 ñ Ser ñ Pro ñ Val 6 ñ Cys 7 ñ Leu/Ile ñ Asn 9 ñ Lys/Gln ñ Met ñ His ñ Arg ñ Trp ñ CO-Met ñ [M+H] +

3 odötïpenìm vody nebo amoniaku od tïchto iont a vnit nìch fragment (p Ìklad jednoho z namï en ch PSD spekter je uveden na obr. 3). UrËenÌ struktury Ñnezn mèhoì peptidu V tomto p ÌpadÏ byl analyzov n peptid o Ñnezn mèì struktu e jejìû urëenì popìöeme jako uk zku. Monoizotopick relativnì hmotnost tohoto peptidu byla zjiötïna anal zou ve smïsi se Ëty mi jin mi peptidy se zn m mi hmotnostmi kterè slouûily jako vnit nì kalibraënì standardy. V sledn hodnota molekulovè hmotnosti Ñnezn mèhoì peptidu byla urëena s p esnostì 3 ppm (6±37). S pouûitìm vyööì energie laseru pak byla provedena anal za pomocì PSD. P i vyhodnocov nì spekter bylo vyuûito skuteënosti ûe se molekulovè hmotnosti iont typu a a b liöì o Da. Z takto identifikovan ch moûn ch iont typu b se poda ilo urëit Ë st sekvence aminokyselin (obr. ). Vöechny zjiötïnè daje byly potè zaps ny do programu ProteinProspector MS-Seq (cit. 9 ) ve kterèm byl v datab zi OWL (aktualizace 7..) nalezen pouze jeden peptid odpovìdajìcì zadan m parametr m. älo o peptid bombesin kter m monoizotopickou molekulovou hmotnost 6 a strukturu pglu-gln-arg-leu-gly-asn- -Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH Obr.. HmotnostnÌ spektrum smïsi vzniklè p i syntèze deriv tu neuroprotektivnìho peptidu; vodn roztok o koncentraci mg.ml ñ matrice CHC mï eno v reflektronovèm pozitivnìm mûdu se zpoûdïnou extrakcì v kon laseru 7 mw; srovn nì teoretickèho modelu molekuly C H 6 N 3 O 9 S + H + (ve v ezu naho e) s detailnìm pohledem na pìk hlavnìho produktu (ve v ezu dole) Obr. 6. PSD spektrum deriv tu neuroprotektivnìho peptidu; matrice CHC namï eno v reflektronovèm pozitivnìm mûdu se zpoûdïnou extrakcì a iontovou br nou nastavenou na ñ Da v kon laseru 3 mw; ñy 3 ñb 3 ñy ña 6 ñ a 6 6 ñ b 6 7 ñb 6 ñy 9 ñy 6 ñb 7 ñy 6 ñy 7 ñ b ñy 7 ñy 6 ñy 9 7 ñy ñy 9 ñy ñb ña ñy 3 ñb ñ b ñy -H O 6 ñ b 6 7 ñy 6 ña 9 ñb 3 ña 9 3 ñb 9 3 ñy 9 33 ñ b 3 ñy 3 ñ [M+H] +

4 a b Obr. 7. Srovn nì modelovèho spektra (a) derivatizovanèho peptidu bombesinu o struktu e C 7 H N O S (bombesin).oso.c H N (OsO - -bipy).h + vypoëìtanèho na z kladï p irozenèho isotopovèho zastoupenì prvk s namï en m spektrem (b); mï eno v reflektronovèm pozitivnìm mûdu se zpoûdïnou extrakcì v kon laseru 67 mw Anal za smïsi peptid PomocÌ metody MALDI-TOF byla analyzov na smïs vznikl p i pokusu o syntèzu deriv tu neuroprotektivnìho peptidu humaninu. CÌlem anal zy bylo potvrzenì struktury hlavnìho produktu a pokus o urëenì sloûenì fragment peptidu obsaûen ch v prepar tu. Na z kladï struktury p edpokl danèho produktu syntèzy (Ala-Arg-Gly-Phe-Gly-Cys-Leu-Leu-Leu-Leu-Thr- -Gly-Glu-Ile-Asp-Leu-Pro-Val-Lys-Arg-Arg-Ala) byla vypo- ËÌt na jeho teoretick molekulov hmotnost a isotopov vzor jeho molekulov ch pìk kterè byly srovn ny s namï en m spektrem (obr. ). Metodou PSD byla potvrzena struktura hlavnìho produktu (obr. 6) a nalezena struktura dalöìch dvou peptid. Z deseti mï enì intenzit pìk vöech ionizovan ch produkt bylo odhadnuto zastoupenì hlavnìho produktu na 39±3 %. Derivatizace peptid a jejich anal za JednÌm z mnoha Ëinidel kter by mohla slouûit k urëov - nì struktury protein je komplex oxid osmiëel ñbipyridin (OsO -bipy) kter podle literatury reaguje v peptidov ch etïzcìch p edevöìm s tryptofanem a ze sterick ch d vod nenì schopen pronikat do vnit nìch Ë stì struktur protein. Na obr. 7 je uvedeno srovn nì spektra peptidu bombesinu derivatizovanèho OsO -bipy s modelem vytvo en m na z kladï p edpokl danèho mechanismu reakce. Z vïr Byla vytvo ena a provï ena metodologie urëov nì molekulov ch hmotnostì a struktury peptid metodou MALDI- -TOF MS. ZÌskanÈ zkuöenosti byly spïönï aplikov ny p i urëov nì sekvence aminokyselin v peptidech a p i kontrole Ëistoty a potvrzenì struktury novèho deriv tu neuroprotektivnìho peptidu humaninu. Demonstrov na byla principi lnì moûnost ionizace peptid derivatizovan ch OsO -bipy. NÏkterÈ peptidy byly laskavï poskytnuty prof. RNDr. Emilem PaleËkem DrSc. z Biofyzik lnìho stavu AV»R Brno. Tato pr ce je souë stì projektu Ministerstva ökolstvì ml deûe a tïlov chovy»eskè republiky projekt Ë. CEZ: J 7/9: 3. LITERATURA. Marvin L. F. Zatylny C. Leprince J. Vandry H. Henry J.: Peptides 9 9 ().

5 . Ovsyannikova G. Johnson K. L. Naylor S. Poland G. A.: J. Immunol. Methods 6 (). 3. Flad T. Kalbacher H. Kaufmann R. Spangler B. Meyer H.: Immunol. Lett (997).. Sarver A. Scheffler N. K. Shetler M. D. Gibson B. W.: J. Am. Soc. Mass Spectrom. 39 ().. Talbo G. H. Suckau D. Malkoski M. Reynolds E. C.: Peptides 93 (). 6. Reiber D. Grover T. A. Brown R. S.: Anal. Chem (99). 7. Hashimoto Y. Niikura T. Tajima H. Yasukawa T. Sudo H. Ito Y. Kita Y. Kawasumi M. Kouyama K. Doyu M. Sobue G. Koide T. Tsuji S. Lang J. Kurokawa K. Nishimoto I.: Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A ().. PatoËka J. Slaninov J.: Cesk. Slov. Psychiat. 9 () Deetz J. S. Behrman E. J.: J. Org. Chem. (9).. Emerman M. Behrman E. J.: J. Histochem. Cytochem (9). O. äedo and J. Havel (Department of Analytical Chemistry Faculty of Science Masaryk University Brno): Analysis of Peptides by MALDI-TOF Mass Spectrometry The MALDI-TOF MS method can be used for the exact determination of molecular weight of peptides. Detailed study of fragmentation of metastable ions after leaving the ion source (post-source decay PSD) makes it possible to determine also the sequence of amino acids in peptides. If complete primary structure cannot be reliably determined due to the complexity of PSD spectra the missing part of the sequence can be found in Internet bases. Because of a simple preparation of samples and short analysis times MALDI-TOF MS is an extraordinarily suitable method for checking purity of peptide preparations. It can be also used for study of peptide derivatization.