DATABÁZE A VYHLEDÁVÁNÍ SEKVENCÍ

Transkript

1 DATABÁZE A VYHLEDÁVÁNÍ SEKVENCÍ MOLEKULÁRNÍ TAXONOMIE 2015 MARIAN NOVOTNÝ

2 OSNOVA co je substrát pro molekulární taxonomii? kde se shromažďují data? jak data vyhledávat?

3 REKONSTRUKCE EVOLUČNÍ HISTORIE rekonstrukce na základě srovnávání znaků v molekulární taxonomii se používají sekvence sekvence (DNA, RNA, proteiny) se srovnávají tzv. alignmentem

4 KDE NAJÍT SEKVENCE?

5 BIOINFORMATICKÉ DATABÁZE úložiště dat (volně) dostupné pro kohokoliv snadno k nalezení lednové číslo Nucleid Acid Research (NAR)

6 LEDNOVÉ ČÍSLO NAR NUCLEOTIDE SEQUENCE DATABASES RNA SEQUENCE DATABASES PROTEIN SEQUENCE DATABASES STRUCTURE DATABASES GENOMICS DATABASES (NON-VERTEBRATE) METABOLIC AND SIGNALING PATHWAYS HUMAN AND OTHER VERTEBRATE GENOMES HUMAN GENES AND DISEASES MICROARRAY DATA AND OTHER GENE EXPRESSION DATABASES PROTEOMICS RESOURCES OTHER MOLECULAR BIOLOGY DATABASES ORGANELLE DATABASES PLANT DATABASES IMMUNOLOGICAL DATABASES

7 VLASTNOSTI DATABÁZE četnost aktualizace dat četnost aktualizace software redundance anotace dat anotace databáze

8

9

10

11 ...A NÁSTROJE

12 DNA DATABÁZE GenBank(NCBI) EMBL (EBI) DDJB (Japonsko)

13 MÁLO ANOTOVANÁ SEKVENCE

14 ANOTOVANÁ SEKVENCE

15

16 GENOMICKÁ DATA První RNA genom bacteriofág MS bazí První DNA genom fág Φ-X bazí První bakteriální genom... Heamophilus influenze ,83 Mb Největší genom... Amoeba dubia Gb Organism Complete Draft assembly In progress total Prokaryotes 946 (658) Archaea 84 (61) (97) Bacteria 862 (598) (1606) Eukaryotes 40 (22) Viruses HUMAN GENOMES SEQUENCED IN 2014

17 GENOMOVÉ DATABÁZE

18

19

20

21

22 PROTEINOVÉ DATABÁZE Uniprot - Swissprot + TrEMBL - 52,7 mil. sek. Swiss-prot - anotováno, ~ sekvencí GenPept - překládaný GenBank

23 UNIPROT + TREMBL AMINO ACID COMPOSITION 2.1 COMPOSITION IN PERCENT FOR THE COMPLETE DATABASE ALA (A) 8.57 GLN (Q) 3.88 LEU (L) 9.81 SER (S) 6.72 ARG (R) 5.47 GLU (E) 6.14 LYS (K) 5.30 THR (T) 5.61 ASN (N) 4.17 GLY (G) 7.08 MET (M) 2.45 TRP (W) 1.31 ASP (D) 5.28 HIS (H) 2.20 PHE (F) 4.03 TYR (Y) 3.06 CYS (C) 1.29 ILE (I) 6.00 PRO (P) 4.74 VAL (V) 6.71 ASX (B) GLX (Z) XAA (X) 0.06

24

25 JAK DATA VYHLEDÁVAT?

26 >ASTAKINE MKMRGVSVGVLVVAMMSGLAMAGSCNSQEPDCGPSECCLQGWMR YSTRGCAPLGEAGSSCNVFTQAPVKGFYIGMCPCRAGLVCTRPSATCQLPSQDNTLDSYY EXISTUJÍ PŘÍBUZNÉ SEKVENCE A KDE JE NAJÍT?

27 HLEDÁNÍ V DATABÁZÍCH - ALGORITMY tradiční algoritmy (Needleman-Wunsch, Smith-Waterman) pomalé pro prohledávání velkých databází používány heuristické metody - rychle vede k výsledku, který se blíží optimálnímu řešení (ale nezaručuje jej) -> pro vyšší rychlost je obětována přesnost (rule of thumb) v případě sekvenčního srovnávání se metoda vzdává jistoty nalezení optimálního alignmentu, aby v krátkém čase provedla srovnání se všemi sekvencemi v databázi (50-100x rychlejší) klasickými heuristickými metodami jsou FASTA a BLAST obě metody použitelné pro DNA i proteinové sekvence

28 FASTA metoda popsaná v 80. letech 20. století (Lipman & Pearson) rychlá, heuristická metoda (na úkor senzitivity), globální alignment zjednodušení v první fázi, sekvence rozděleny na krátké úseky program generuje všechny možné k-tuples o délce k z dané sekvence k = 1-2 pro proteiny, k = 4-6 pro DNA k-tuples jsou porovnávány s k-tuples sekvencí v databázích

29 FASTA hledání SHOD v k-tuples skórováni shod pomocí skórovací tabulky (Blosum 50) a rozšíření alignmentu (bez mezer) vysoce skórující shody vybrány vybere úseky, které budou součástí alignmentu dynamické programování pro konečný alignment (mezery)

30 BLAST BLAST = Basic Local Alignment Search Tool Altschul et al., 1990 sekvence rozděleny na slova (words) a slova skórována vůči databázi všech slov slova skórována skórovací tabulkou (Blosum 62) a jen ty, které dosáhnou předem nadefinovaného minimálního skóre (treshold) jsou dále používány slova se skóre větším než treshold nemusí nutně obsahovat jen shody ( na rozdíl od Fasty) v prvním kroku se porovnávají slova bez mezer

31 w=3 SEWRFKHIYRGQPRRHLLTTGWSTFVT SEW EWR WRF Parameter: Word length (w) Increase = faster, but less sensitive

32 BLAST - HSP HSP - high scoring pair vyber jen taková slova, která dosahují alespoň skóre X (treshold) PEG versus PQA PEQ má s Blosum 62 skóre 15, PQA jen 12 pokud si stanovíme treshold 13, tak budeme dále hledat jen slovo PEQ

33 Then it scans database sequences for exact matches with these words

34 BLAST II takto vybráná slova jsou hledána v databázi modifikovaným Smith- Watermanem (50 x rychlejší) HSP jsou dále rozšiřovány na obě strany dokud skóre roste v posledním kroku jsou nejlépe skórující páry (HSP`s) podrobeny dynamickému programování, které produkuje výsledné skóre a alignment vzhledem k rostoucí velikosti databází je třeba algoritmus neustále modifikovat (dvě shody v okně definované velikosti) obvykle citlivější než FASTA implementován jako server na řadě míst (NCBI, EBI)

35 If two hits are found on the same diagonal the alignment is extended until the score drops by a certain amount This results in a High-scoring Segment Pair (HSP) Parameters: Drop off Substitution matrix

36 BLAST step 4 If the total HSP score is above another threshold then a gapped extension is initiated Parameters: Extension threshold (Sg) Substitution matrix Sequence searching - Andrew Cowley

37 VERZE BLASTU blastn - hledá s DNA sekvencí (query) v DNA databázi blastp - hledá s proteinovou sekvencí v proteinové databázi blastx - hledá s DNA sekvencí (6 rámců) v proteinové databázi tblastn - hledá s proteinovou sekvencí v DNA databázi tblastx - překládaná DNA v překládané DNA databázi megablast - víc query najednou

38

39

40 Query: 241 FTTVQILHRGKKVGTERIWYGDKENIDLGTEQEFWMVLPKAEIPHIKAKYTLDGKELTAP 300 F TV + T+R+W+GDK ++LG + + +P KA YTL +LTAP C. On-line Summaries Smallest Sum High Probability Sequences producing High-scoring Segment Pairs: Score P(N) N... sp P08506 DACC_ECOLI PENICILLIN-BINDING PROTEIN 6 PRECURS e sp P38422 DACF_BACSU PENICILLIN-BINDING DACF PROTEIN PREC e sp P28271 IREB_MOUSE IRON-RESPONSIVE ELEMENT BINDING PROT sp P31571 CAIA_ECOLI PROBABLE CARNITINE OPERON OXIDOREDUC D. Alignments... >sp P08506 DACC_ECOLI PENICILLIN-BINDING PROTEIN 6 PRECURSOR (D-ALANYL-D-ALANINE CARBOXYPEPTIDASE FRACTION C) (EC ) (DD-PEPTIDASE) (DD-CARBOXYPEPTIDASE) (PBP-6). Length = 400 Score = 894 (409.5 bits), Expect = 5.0e-120, P = 5.0e-120 Identities = 169/342 (49%), Positives = 237/3 42 (69%) Query: 1 MDYTTGQILTAGNEHQQRNPASLTKLMTGYVVDRAIDSHRITPDDIVTVGRDAWAKDNPV 60 MDY +G++L GN ++ +PASLTK+MT YVV +A+ + +I D+VTVG+DAWA NP Sbjct: 45 MDYASGKVLAEGNADEKLDPASLTKIMTSYVVGQALKADKIKLTDMVTVGKDAWATGNPA 104 Query: 61 FVGSSLMFLKEGDRVSVRDLSRGLIVDSGNDACVALADYIAGGQRQFVEMMNNYAEKLHL 120 GSS+MFLK GD+VSV DL++G+I+ SGNDAC+ALADY+AG Q F+ +MN YA+KL L Sbjct: 105 LRGSSVMFLKPGDQVSVADLNKGVIIQSGNDACIALADYVAGSQESFIGLMNGYAKKLGL 164 Query: 121 KDTHFETVHGLDAPGQHSSAYDLAVLSRAIIHGEPEFYHMYSEKSLTWNGITQQNRNGLL 180 +T F+TVHGLDAPGQ S+A D+A+L +A+IH PE Y ++ EK T+N I Q NRN LL Sbjct: 165 TNTTFQTVHGLDAPGQFSTARDMALLGKALIHDVPEEYAIHKEKEFTFNKIRQPNRNRLL 224 Query: 181 WDKTMNVDGLKTGHTSGAGFNLIASAVDGQRRLIAVVMGADSAKGREEEARKLLRWGQQN 240 W +N DG+KTG T+GAG+NL+ASA G RLI+VV+GA + + R E+ KLL WG + Sbjct: 225 WSSNLNEDGMKTGTTAGAGYNLVASATQGDMRLISVVLGAKTDRIRFNESEKLLTWGFRF 284

41 BLAST - VÝBĚR databáze - DNA x protein, anotovaná x kompletní, strukturní, genomové, specializované (protilátky)... organismus datum - sekvence za poslední dva týdny skórovací tabulka - blosum 62 velikost slova low-complexity region filter - často P, D, N, E - false positive default nastavení algoritmu vhodné ve většině případů

42 BLOSUM BLOSUM 80 - tabulka vypočítaná na základě alignmentu bloku sekvencí s identitou 80 % BLOSUM 62 - tabulka vypočítaná na základě alignmentu bloku sekvencí s identitou 62 %

43 BLOSUM VERSUS PAM PAM 10 BLOSUM 90 PAM 250 BLOSUM 62 VELMI PŘÍBUZNÍ VZDÁLENĚ PŘÍBUZNÍ

44 VÝZNAMNOST NÁLEZU optimální alignment lze nalézt pro jakékoliv dvě sekvence dvě náhodné DNA sekvence = ~ 25% SI dvě náhodné proteinové sekvence = ~ 5% SI jak určit, že je alignment statisticky významný?

45 PARAMETRY VÝZNAMNOSTI P-value E-value pouze statistická významnost skóre -> biologickou relevanci záhodno ověřovat experimentálně

46 P-VALUE P-value - pravděpodobnost, že sekvence budou srovnány s nalezeným nebo vyšším skóre a zároveň nebudou příbuzné (false positive hit) P-value - pravděpodobnost, že bude skóre x nebo vyššího dosaženo náhodou pro účely výpočtu lze náhodu simulovat přeskládáváním sekvencí nebo výběrem vzorku z databáze druhá možnost lépe odpovídá realitě a poskytuje lepší výsledky (především u DNA)

47 EVD rozložení skóre lokálních alignmentů nepříbuzných sekvencí neodpovídá normálnímu rozdělení, ale rozdělení podle extrémních hodnot (EVD) při normálním rozdělení by docházelo k přeceňování významu dosažených skóre DUNDAS ET AL. BMC BIOINFORMATICS 2007

48 P-VALUE P-value (S>x) = 1-exp (-exp (-λ(x-u))), u = charakteristická hodnota = Kmn/λ m,n = délky sekvencí; K = konstanta; λ = decay factor K a λ mohou být kalkulovány z vlastností skórovací tabulky

49 E-VALUE E-value = pravděpodobnost, že bude dosaženo skóre x nebo vyššího náhodou v databázi dané velikosti E-value = P-value x N ; velikost databáze příklad: databáze o miliónu sekvencí a P-value = 10-6 E-value = 10-6 x 10 6 =1 cutoff (expect treshold) parametr v BLASTU - udává kolik lze průměrně očekávat false positives v databázi dané velikosti -> způsob jak vyvažovat senzitivitu a selektivitu nižší hodnota cutoff zvyšuje selektivitu, ale snižuje senzitivitu

50 BLAST / EVOLUČNÍ VZDÁLENOST říká nám BLAST něco o příbuznosti nalezených sekvencí? Je první hit evolučně nejpříbuznější query (hledané sekvenci)? BLAST většinou nalezá příbuzné sekvence nejpříbuznější sekvence však mohou chybět v databázi lokální alignment - často skóruje nejlépe vzdálené příbuzné 7 % sekvencí E.coli mělo nejlépe skórující sekvenci mimo Bacteria

51

52

53 2JTK

54 SEQUENCE IDENTITA/HOMOLOGIE NEHOMOLOGNÍ PROTEINY ROST, 1999

55 SEQUENCE IDENTITA/HOMOLOGIE HOMOLOGNÍ PROTEINY ROST, 1999

56 SEQUENCE IDENTITA/HOMOLOGIE sekvenční identita > 35% - pravděpodobně homolog sekvenční identita = 20-35% ( twilight zone ; Doolittle) - může být homolog sekvenční identita < 20% - midnight zone (Rost) - sekvence zcela nedostatečná k určení homologie

57 SANDER ET AL., PREPRINT Average sequence identity of random alignments % Average sequence identity of remote homologues %

58 SSEARCH pokud máte moře času nebo počítačový klastr nebo jste zoufalí rigorózní Smith-Waterman - local alignment v databázi

59 When to use what? Query length WU-BLAST NCBI BLAST FASTA PSI-SEARCH Database size

60 When to use what? t ime to search WU-BLAST NCBI BLAST FASTA PSI-SEARCH PDB Swiss-Prot UniRef50 UniRef 90 UniRef100 UniProtKB UniParc Sequence searching - Andrew Cowley

61

62 DALŠÍ METODY HLEDÁNÍ V DATABÁZÍCH profilové metody HMM modely

63 PROFILY modifikují skórovací tabulky specificky pro skupiny proteinů a pozici v alignmentu (např. globiny) pro každou pozici v alignmentu jsou generovány specifická skóre jak pro záměnu za jakoukoliv aa, tak pro inzerci nebo deleci Prof (pos,aa) = Σtype N(pos,type) x S(type, aa) x 10 N(pos,type) = podíl výskytu aa x na pozici y S(type, aa) = skóre skórovací tabulky pro zaměňovaný pár

64 PŘÍKLAD PROFILU v alignmentu globinů se na pozici 3 vyskytuje 3x Ala, 6x Val, 1x Ile, používáme tabulku Blosum 62 jaké bude profilové skóre pro výskyt Ile a His? N(x,A) = 0.3, N(x,V) = 0.6, N(x, I) = 0.1 S(A,I) = -1, S(V,I) = 3, S(I,I) = 4 S(A,H) = -2, S(V,H) = -3, S(I,H) = -3 Prof (x, I) = 0.3 x x x 4 = 2.1 x 10 (v profilu) = 21 ( -1, 3, 4) Prof (x, H) = 0.3 x x x -3 = -2.7 x 10 = -27 (-2, -3, -3)

65 PSI-BLAST PSI-BLAST = Position Specific Iterative Blast Altschul et al., 1997 profilová metoda, používá Position Specific Scoring Matrix (PSSM) v prvním kole klasický BLAST, z vysoko skórujících alignmentů je generována PSSM v dalším kole hledání je už použita nová matrice a následně znovu generována nová PSSM opakováno libovolně dlouho (až ke konvergenci) benchmark metoda

66 Context-Specific Iterative Blast CS/CSI BLAST Biegert, Soeding, 2009 context vytváří 12 aa v okolí sledované aa (6 na každé straně) 2x více vzdálených homologů než klasický blast při zachování rychlosti a chybovosti CSI - podobná aplikace na PSI-blast po dvou iteracích csi blast stejné výsledky jako po pěti iteracích psi-blast benchmark metoda???

67 HMM HMM = Hidden Markov Model profilová metoda, používána při rozhodování, zda protein spadá do jisté skupiny proteinů, typicky pro sekvence s nízkou %SI velmi citlivá metoda, která vytváří statistický model pro definovanou skupinu sekvencí na základě tréninku na sekvencích patřících do jedné skupiny (globiny) generuje pravděpodobnost nejen pro jednotlivé záměny a inzerce a delece, ale i pro přechody mezi nima dovede do modelu zahrnout i aminokyseliny, které se v tréninkové skupině nevyskytují alignment s největší pravděpodobností je optimální posuzuje jak dobře daná sekvence odpovídá modelu

68 HMM

69 SHRNUTÍ databáze by měly být pravidelně updatovány přehled dostupných biologických databází vždy v lednovém čísle NAR řada velmi specializovaných databází hledání v databázích povětšinou heuristickými metodami standard dnes BLAST nutno hodnotit statistickou významnost nálezu citlivější metodou PSI-Blast nebo HMM metody