KFC/STBI Strukturní bioinformatika

Transkript

1 KFC/STBI Strukturní bioinformatika 02_struktury Karel Berka

2 Jak získávat strukturu RTG xyz souřadnice atomů krystal, rozlišení, interpretace mezimolekulové interakce EM elektronový obal nízké rozlišení velké komplexy NMR torzní uhly a vzdálenosti dynamická informace zpracování pomocí MD MS vzdálenosti hmotnosti dostupnost rozpouštědla neúplná informace a další FRET - vzdálenosti

3 Získávání struktury Xray začátek (krystalografického) experimentu klonování exprese proteinu purifikace proteinu krystalizace difrakce RTG zářením fázový problém zisk mapy elektronové hustoty fit modelu vyřešení struktury

4 Rentgenová krystalografie 1. Růst proteinových krystalů 2. Difrakční experiment 3. Výpočet mapy elektronové hustoty. 4. Stavba modelu do mapy el. hustoty

5 Proč X-Ray Elektromagnetické záření interaguje s objekty jejichž velikost je srovnatelná s vlnovou délkou (λ). Např. viditelné světlo má vlnovou délku přibližně od 400 do 700 nm. Vzdálenosti mezi atomy: C-C = 1,54 Å, C=C = 1,23 Å 1 Å (Ångstrom) = 0.1 nm C-N = 1,45 Å 1 Å = m N-(H)..O = 2,8 Å V laboratoři se běžně používá CuKα -λ= 1,54 Å. Synchrotron λ= 0,5 Å 2,5 Å.

6 Krystaly X-paprsky se rozptylují na elektronech. Tato interakce je však příliš slabá pro detekci rozptylu na jedné molekule. Proto používáme krystaly, které obsahují triliony molekul v identické orientaci. Složením rozptýlených vln pak vzniká měřitelný difrakční signál.

7 Krystalizace Energetický diagram krystalizace Experimentální uspořádání Airlie J McCoy, Protein Crystallography course

8 Krystalová mřížka Krystal má translační symetrii z definice. Jestli je ρ(r) elektronová hustota krystalu v bodě r, potom existují vektory a, b, c pro které platí: ρ(r) = ρ(r + u a + v b + w c) kde u, v, w jsou celáčísla. Každá identická kopie se nazývá základní buňka. a, b, c se nazývají vektory základní buňky. Délka vektorů základní buňky je a = a, b = b, c = c. α, β, γ označují úhly mezi vektory základní buňky Pravotočivý systém souřadnic

9 Operace symetrie Translace (opakování základní buňky) E identita (C 1 ) i - Inverze (symetrie přes bod) (S 2 ) C nm - Rotační symetrie (rotace kolem osy o 360 / n m-krát) σ - Roviny zrcadlení (S 1 ) S nm Kombinace rotace o 360 /n m -krát následovaná zrcadlením přes rovinu Kombinace s translací

10 Bodové grupy symetrie proteinových krystalů

11 Asymetrická jednotka a základní jednotka asymetrická jednotka základní jednotka Asymetrická jednotka = Nejmenší objem z něhož můžeme zrekonstruovat základní jednotku aplikací krystalografické symetrie. Základní jednotka = Nejmenší objem jehož translací v 3D můžeme zrekonstruovat celý krystal.

12 Krystalové kontakty Krystaly proteinu obsahují velké kanály naplněné rozpouštědlem Kontakty molekul v rámci krystalu nemají (většinou!!!) vliv na strukturu proteinu. Spakování krystalu glykolátoxidasy (schematicky)

13 Difrakce X-paprsků Rosalind Franklin & Raymond Gosling Nature 171 (1953)

14 Princip difrakce Braggův zákon n.λ= 2d.sinθ (W. H. Bragg & W. L. Bragg, 1912) Difraktované záření - sety rovin, které nejsou navzájem rovnoběžné

15 Výpočet mapy elektronové hustoty Cílem krystalografie je pomocí amplitud a fází tisíců F hkl vypočítat mapu elektronové hustoty ρ(x,y,z)

16 Fázový problém Amplitudy a fáze F hkl jsou zakódovány v paprscích záření,které rozptylují atomy v krystalu Amplituda F h,k,l je druhá odmocnina intenzity rozptýleného záření, které měříme standardním difrakčním experimentem. Φ hkl je fáze rozptýlené vlny. Ta nemůže být měřena přímo Fázový problém.

17 Fázový problém názorně Difrakční data s fázovou informací Reálná difrakční data

18 Rekonstrukce objektu FT snadné FT obtížné

19 Význam fáze F 1, Φ 1 F 2, Φ 2 F 1, Φ 2 F 2, Φ 1

20 Metody řešení fázového problému Přímé metody Založeny na systematických souvislostech mezi určitými reflexemi. Nutné mít data s vysokým rozlišením a relativně malý systém. Velmi populární při řešení struktur malých molekul. Molekulární nahrazení Když existuje vyřešená struktura podobná té kterou chceme řešit,potom ji můžeme použít k odhadu fází. Je stále více populární s tím jak roste počet vyřešených struktur. Metody těžkých atomů Do krystalu vneseme těžký atom, který silně rozptyluje (např. Hg, Fe, Pb, I,Se..). Nebo nahradíme všechny Met v proteinu Se-Met. Použijeme vícečetné isomorfní nahrazení (Multiple Isomorphous Replacement).MIR Použijeme vícečetnou nebo jednoduchou anomální difrakci (Multiple nebo Single Anomolous Diffraction). MAD there is an app for that SOLVE, SHELL-X, Phaser

21 První mapa Jakmile známe experimentální fáze, můžeme provést Fourierovu transformaci. Když získáme dostatečně kvalitní mapu elektronové hustoty, potom začneme budovat model. Nejdříve řetězec Cα atomů pomocí poly-ala modelu. Poté identifikujeme elementy sekundární struktury. Poté stavíme postraní řetězce s pomocí znalosti sekvence. Programy: CNS, O, COOT, ARPwARP

22 Rozlišení (R) v jednotkách Å, (více reflexí-lepší zesílení signál-šum) schopnost rozlišit detaily na vzdálenost. Teoreticky rozlišitëlné detaily separované nejméně 0.7x rozlišení. Čím lepší rozlišení, tím lepší mapu dostaneme - snadnější stavba modelu! 3.5 Å mapa fotosystému II 2.3 Å mapa fotosyntetického reakčního centra 0.95 Å mapa elastasy

23 Nízké rozlišení Mapy s nízkým rozlišením ukazují pouze obecné vlastnosti jako je např. tvar molekuly a umístění elementů sekundární struktury. R = 7 Å, tropomyosin.

24 Klasické rozlišení proteinů běžné rozlišení u proteinových struktur pod 2.5 Å Při tomto rozlišení je snadné sledovat průběh hlavního řetězce a řada postraních řetězců má také dobře definovanou hustotu. U proteinů je limit pro publikaci struktury rozlišení 3.0 Å. R = 2.6 Å

25 Vysoké rozlišení Mapa elektronové hustoty s velmi vysokým rozlišením jasně ukazuje pozice jednotlivých atomů. R = 1.2 Å H-vazby (fialová) mezi N a O atomy.

26 Validace R free (Brünger, 1992) test set (~5-10%) of reflekcí vynecháno z určování struktury Stereochemie Ramachandranův diagram WHATIF MOLPROBITY Bad contacts stérické problémy ve struktuře

27 And now something completely different

28 Nukleární magnetická rezonance NMR NMR spektroskopie využívá magnetických vlastností jader atomů. Absorpční(emisní) spektroskopie, podobně jako IČ nebo UV. Detekuje absorbci radiofrekvenčního záření jádry atomů v molekule. Radiofrekvenční energie ( E přechodů jaderného spinu): λ = 1011 až 3 x 107 nm ν = 106 až 1010 Hz Nastavením frekvence elektromagnetického záření (ν, nebo ω) na rezonanční podmínku dojde k indukci přechodů mezi hladinami jaderného spinu (tzn. můžeme měřit NMR spektrum!).

29 NMR Externí magnetické pole => energetický rozdíl mezi spinovými stavy jaderných magnetických momentů (m) Rozdíl v populaci stavů je dán rozdílem energií např. E=3.8x10-5 kcal/mol pro 1 H při 400 MHz (B o =9.5T) Nα/Nβ= Rozdíly populací velmi malé

30 Pravidla pro určení spinu izotopu Nukleon.č.(A) Proton.č.(Z) I Detekce liché sudé nebo liché 1/2, 3/2, 5/2 ano sudé sudé 0 ne sudé liché 1, 2, 3 ano Možný počet spinových stavů = 2I + 1: Jádro Spin.kvant.č. Počet stavů Mag.spin.č. 1 H I = 1/2 2(1/2) + 1 = 2 m = ±1/2 14 N I = 1 2(1) + 1 = 3 m = -1, 0, 1

31 NMR-aktivní jádra v proteinech Přirozená: 1 H, spin ½ 31 P, spin ½ Obohacená díky bakteriální expresi: 2 H, spin 1 13 C, spin ½ 15 N, spin ½

32 Orientace mag.spinů Bez externího magnetického pole náhodné orientace degenerace S magnetickým polem Makroskopická magnetizace (M z )

33 Vliv magnetického pole Energie µ v poli B o E = -µ B o pro jednu hladinu: E m = -m B o γ ħ Projekce je kvantována, takže E závisí na: 1) typ jádra (γ) 2) spinový stav (m) 3) síla magnetu (B o )

34 Rezonance rezonanční podmínka: E = hν = ħω = B o γħ E = ħω o ω o = B o γ

35 Excitace a podélná relaxace (M z -> rovnováha) nárůst pokles

36 Chemický posun Různá jádra mají různé rezonanční frekvence Magnetické pole, ve kterém se jádro nachází není rovno vnějšímu magnetickému poli. Elektrony v okolí jádra (chemické okolí) stíní vnější pole výsledné efektivní magnetické pole B eff je tvořeno vnějším polem B 0 a polem lokálním B loc. B eff = B 0 B loc = B 0 (1-σ), kde σ je konstanta magnetického stínění

37 NMR řešení struktury makromolekul Pozorujeme protony ( 1 H) (! x-ray difrakce, kde elektronová hustota atomů s vyšším počtem elektronů (C, N, O)!) Protein je v roztoku.

38 NMR proteinů Přiřazení pozorovaných 1 H rezonancí individuálním aminokyselinám. Protonové rezonance jsou často rozlišeny na základě rozdílů v chemickém posunu. Měříme intra-aminokyselinové a inter-ak proton-protonové vzdálenosti prostřednictvím dipolárních spřáhnutí. Měříme torzní úhly prostřednictvím J- spřáhnutí. Získané vzdálenosti a torzní úhly použijeme k určení sekundární a terciární struktury.

39 NMR interakce 1 H mezi sebou, ale také se značenými 13 C a 15 N

40 Přenos magnetizace Mezi 1 H, 13 C a 15 N může dojít k přenosu magnetizace, což můžeme použít k určení konektivity. Chemické posuny J-spřáhnutí (skrze vazby) Dipolární spřáhnutí (skrze prostor)

41 FT Obecný 2D experiment

42 COSY (Correlated Spectroscopy)

43 NOESY (Nuclear Overhauser Enhancement Spectroscopy) Intenzita cross-píků odpovídá inter-jaderné vzdálenosti

44 Určování struktury pomocí NMR

45 Určení struktury pomocí NMR Přiřazení sekvence (určení vedlejších řetězců) COSY NOESY 3D-NMR experimenty Sekundární struktura chemické posuny (backbone) dipolární spřáhnutí => prostor J-spřáhnutí => torzní úhly Terciární struktura (do modelu) NOE intenzity (neodpovídající COSY pro vedlejší řetězce)

46 Získané parametry z NMR Raw Time-domain: 1D,2D,3D,4D spektrum Processed (FT) frekvency domain NMR parametry peak list chemical shifts 1H-1H NOE J-couplings residual dipolar couplings NMR relaxation rates Derived data NMR peak assignments % expected in observed data covalent structure bond hybridizations Derived data secondary structure interatomic distances torsion angles hydrogen bonds order parameters solvent exposure 3D structure binding constant ph titration parameters hydrogen exchange rates termodynamics and kinetics of structural rearangements disordered regions

47 Kvalita struktury NMR Výsledkem NMR experimentu = Zisk celé sady struktur, které splňují podmínky Kvalita: Stereochemie Ramachandran Ekvivalent R free vynechá se část dat při určování struktury a pak se to přes ně kontroluje není standardizováno!

48 Elektronový mikroskop EM magnetické čočky rozlišení R = 0.61λ/nsin α zelené světlo λ=400nm => R=150 nm elektrony 200 kv~ λ=0.0025nm => R=0.02nm (teoretický limit) R=1 nm (TEM), méně cryo-hrtem

49 TEM transmisní elektronový mikroskop do tloušťky 100 nm

50 SEM skenovací elektronový mikroskop krystalografie odražené e. sekundární e. transmitované e. Xray

51 Elektronová tomografie programy: Chimera, Modeller, IMP

52 Kryoelektronová tomografie 200kDa 400 MDa Asymmetric monomeric proteins e.g.dna-pkcs, 470 kda Protein/RNA or DNA complexes e.g.ribosome, ~2 MDa Icosahedral viruses 60-fold symmetry e.g.adenovirus, ~150 MDa Detergent solubilized membrane proteins e.g.voltage-sensitive sodium channel ~300 kda, Sato et al., Nature 2001 e.g.platelet integrin αiibβ3 ~230 kda, Adair & Yeager, PNAS 2002

53 How to EM

54 Fluorescence Jablonskiho diagram

55 Fluorescence Z Jablonskiho diagramu vyplývá, že energie emitovaného záření (fluorescence) je typicky nižší než energie absorbovaného záření. (G.G.Stokes,1852,U.of Cambridge) Zvýšení polarity rozpouštědla většinou způsobuje červený posun fluorescence.

56 Fluorescence (Förster) Resonance Vzdálenosti - r Energy Transfer (FRET) Když se tyto dva fluorofory dostanou blízko k sobě, tak po excitaci dojde k FRET R 0 je vzdálenost mezi D a A při které je přenos energie 50% (polovina energie se přenese z D na A). R 0 je typicky mezi 20-90Å

57 Typické hodnoty R o Donor Akceptor R o (Å) Fluorescein Tetramethylrhodamine 55 IAEDANS Fluorescein 46 EDANS Dabcyl 33 Fluorescein Fluorescein 44 BODIPY FL BODIPY FL 57 Fluorescein QSY 7,QSY 9 dyes 61

58 Take home message X-ray: krystaly (kontakty), vnitřní elektrony elektronová mapa R do 2.5 A se dá, jinak jen obálky velikost neomezená NMR roztok, značené proteiny, jádra protonů vzdálenosti a torzní úhly korelační 2D, 3D-spektra, je výhodné pro homologní modelování omezení na velikost EM jednotlivé molekuly, vnitřní elektrony elektronová mapa nemá atomární rozlišení (R > 5 A) použitelné pro struktury komplexů jako obálka Fluorescence (FRET), MS vzdálenosti kontrola: Ramachandran, R free (Xray, NMR), krystalové kontakty, stérické kontakty

59 Nobelovské porovnání jednotlivých metod X-Ray 1901: Wilhelm C. Röntgen (Physics) X-ray 1914: Max von Laue (Physics) diffraction of X-rays by crystals 1915: William H. Bragg and William L. Bragg (Physics) Bragg s equation 1964: Dorothy C. Hodgkin (Chemistry) structures of penicillin and vitamin B : Herbert A. Hauptman and Jerome Karle (Chemistry) phase problem 1954: Linus Pauling (Chemistry) chemical bond, peptide bond, and the structures of the alpha helix and beta strand 1962 Francis H.C. Crick, James D. Watson, Maurice H.F. Wilkins (Physiology or Medicine) DNA 1962: Max F. Perutz and John C. Kendrew (Chemistry) globular proteins myoglobin, hemoglobin 1988: Johann Deisenhofer, Robert Huber, and Hartmut Michel (Chemistry) photosynthetic reaction centre (1PRC). 1996: Paul D. Boyer, John E. Walker, and Jens C. Skou (Chemistry) F1-ATPase (1bmf, 1cow) 2003: Peter Agre and Roderick MacKinnon (Chemistry) membrane channels (1bl8, 2f2b, 2evu) 2006: Roger Kornberg (Chemistry) molecular basis of eukaryotic transcription (1i3q, 1i50, 1i6h) 2009 Venkatraman Ramakrishnan, Thomas A. Steitz, and Ada E. Yonath (Chemistry) ribosome (1ffk, 1fjg, 1fka, 1gix, 1giy) Others 1943: Otto Stern (Physics) magnetic moment of the proton (NMR) 1944: Isidor I. Rabi (Physics) resonance method for recording the magnetic properties of atomic nuclei (NMR) 1952: Felix Bloch, Edward M. Purcell (Physics) nuclear magnetic precision measurements (NMR) 1982: Aaron Klug (Chemistry) crystallographic electron microscopy (EM) 1986: Ernst Ruska, Gerd Binnig, Heinrich Rohrer (Physics) TEM, STM 1991: Richard R. Ernst (Chemistry) high resolution nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy 1994: Bertram N. Brockhouse and Clifford G. Shull (Physics) neutron scattering 2002: John B. Fenn, Koichi Tanaka (Chemistry) soft ionization mass spectrometry (MS) 2002: Kurt Wüthrich (Chemistry) nuclear magnetic resonance (NMR) 2003: Paul C. Lauterbur, Peter Mansfield (Physiology or Medicine) magnetic resonance imaging (MRI)

60 Validační metody servery Program ANOLEA PROCHECK, PROVE, WHAT IF DACA ERRAT MC-Annotate MOLEMAN2 Verify3D Reference Melo and Feytmans, 1998 EU 3-D Validation Network, 1998 Vriend and Sander, 1993 Colovos and Yeates, 1993 Gendron, Lemieux, and Major, 2001 Kleywegt, 1997 Bowie, Luthy and Eisenberg, 1991 Protein/NA Protein Protein Protein Protein RNA Protein (Caplha) Protein URL ebi.ac.uk cmbi1.cmbi.kun.nl:1100/wiwwwi/oldqua. html www-lbit.iro.umontreal.ca/mcannotate xray.bmc.uu.se/cgi-bin/gerard/ 3D R.A. Laskowski Structural quality assurance

61 Validační metody programy Program Reference URL ADIT ERRAT PROCHECK PROVE SQUID WHATCHECK WHAT IF PDB Colovos and Yeates, 1993 Laskowski et al., roman/procheck/proche 1993 ck.html Pontius, Richelle, and Wodak, 1996 Oldfield, 1992 Hooft et al., 1996 Vriend, 1990 pdb.rutgers.edu/software oldfield/squidmain.html R.A. Laskowski Structural quality assurance