Z meče pluh. Aneb od toxinu manipulujícího imunitní odpovědí k nástroji pro imunology. P. Šebo MBÚ AV ČR

Transkript

1 Sebolab

2 Z meče pluh Aneb od toxinu manipulujícího imunitní odpovědí k nástroji pro imunology P. Šebo MBÚ AV ČR

3 OBECNĚ: Bakterie se v kontaktu s hostiteli vyvíjely stovky miliónů let a vyvinuly si úžasné nářadí k manipulaci hostitele

4 Bakteriální toxiny jsou chytré, krásné a užitečné Snad není buněčný proces který by nezmanipulovaly

5 Bakteriální toxiny jsou krásné heptamer alfa-toxinu Stapylococcus aureus

6 Toxiny jsou mazané Manipulují například hladinou camp buněčnou signalizací TII TIV Cya Ac Sec TI Cholera toxin Pertussis toxin ATP camp B. pertussis AC B. anthracis EdTx TTSS Gs a ADPR Gi a ADPR P. aeruginosa ExotoxinY ExoY Ac ATP camp EF ATP camp ATP camp (Steve Lory ETOX 11, 2003)

7 bez Adenylyl cyklázového toxinu Je Bordetella pertussis avirulentní Colonisation of respiratory epithelium by B. pertussis

8 Aktivita ACT na sliznici průdušnice Pertactin Capsule Periplasm DNT PT CyaA FHA TCT fimbriae IL-6 invasion Macrophage Mucus layer Respiratory epithelium Ciliated cells Nonciliated cells (Goblet cells, Absorptive cells) Cilliated cells Intraepithelial DC Submucosa Type I B.pertussis secreting CyaA Immature dendritic cell? IL-6 Macrophage CyaA ATP camp CD11b/CD18 Intoxication IL-12, TNFα, CCL3 IL-10, IL-6, (Semi-mature state of DC?) T regulatory response? Phagocytic functions Phagocytosis Superoxid production Chemotaxis Apoptosis Cell lysis Cations Channel formation? Dendritic cell Neutrophil Macrophage Neutrophil B cell T cell Osičková et al., (1999) J. Biol. Chem. 274, 37644) Vojtová et al., 2006, Curr. Op.. Microbiol. 9, 69-75

9 Nedávno byla určena struktura AC domény AC doména RTX hemolyzín T25 T18 CD11b/CD18 Vazebné místo N C I II CBS III Hydrofóbní segmenty 42 kalcium vazebných míst X-(L/I/F)-X-G-G-X-G-(D/N)-D Sekreční signáll Palmitoylace na K860 ak983 I T25 T18 C-CaM II III Guo Q. et al. (20005) EMBO J. 24,

10 Morphological changes of mouse J774A.1 macrophage-like cells ACT-AC - (detoxified) 10 ng/ml 5 min a b Act wt 10 ng/ml 5 min c d

11 III. Detoxifikovaný ACT jako užitečný nástroj pro imunology

12 AC dact jako dopravce antigenů Vložený antigen (z viru, bakterie, parazita, nádoru) Ag Repeats Ag Repeats Ag a M 2 integrin CD11b/ CD18 Ag AC Ag translokace? MHC I Proteasome Transporter associated with antigen procesing Golgi MHC I peptide endocytóza Endoplasmatic reticulum MHC II Endosome? MHC II CD8+ T cell CD4 +

13 Příklady využití I. diagnostika latentní infekce Mycobacterium tuberculosis (LTBI) lidí a skotu Robert J. Wilkinson Martin Vordemeier Imperial College, London VLA Surrey

14 Příklady využití II. Očkování proti Plasmodium berghei (myší model malárie) Susanne Tartz Thomas Jacobs Bernhard Nocht Insitute for Tropical Medicine, Hamburg

15 Příklady využití III. Imunoterapie nádorů vyvolaných HPV16 Ve spolupráci s Dr. Šárkou Němečkovou, ÚHKT Praha

16 Tumor area [mm 2 ] Prime/Boost imunoterapie nádorů vyvolaných E7 onkoproteinem HPV PBS + PBS 8/8 CyaA wt + CyaA wt 8/8 CyaA wt + MVA-SigE7LAMP 6/8 *P=0.01 MVA-SigE7LAMP+ MVA-SigE7LAMP 5/8 **P= CyaA336/E7 + MVA-SigE7LAMP 0/8 ***P< CyaA336/E7 + CyaA336/E7 0/8 ***P< MVA-SigE7LAMP + CyaA336/E7 2/8 ***P< MVA-SigE7LAMP + CyaA wt 6/8 **P= Days after administration of 3x10 4 TC-1 cells Mackova et al. (2005) Cancer Immun. Immunother., 55, 39-46

17 Stav technologie po 13-ti letech práce Proof of concept in mice specifické CTL CD8 + and CD4 + T buněčné odpovědi Ochranná imunita proti virům (LCMV) Ochranná imunita proti Plasmodium berghei (myší malárie) Imunoterapie experimentálních nádorů vyvolaných HPV16 polyvalentní buněčná imunitní odpověď - několik antigenů v různých místech (US Patent No. 5,503,829, No. 5,679,784, No. 5,935,580 EU Patent application No , US Prov 03495, 6094 (2003) ) Mnoho preklinických dat z in vitro a in vivo modelů Připravená toxikologická studie Připravovány phase I&II klinické testy na pacientech s: melanomy the 6th EU FP consortium THERAVAC (Ludwig Institute) S nádory děložního čípku (HPV16) - BT Pharma S.A. Toulouse France Vylepšení detekce latetní infekce Mycobacterium tuberculosis u lidí a skotu Další diagnostické možnosti u jiných infekcí a rakoviny reviewed in: Šimšova et al. (2004). Int. J. Med. Microbiol., 293,

18 Laboratory of ligand engineering Scientific excellence through oriented research P. Šebo

19 Binding proteins Antibodies Receptor proteins Small scaffold Affinity High high Can be high Production Not cheap Problematic Straightforward Regeneration Stability Problematic Average Excellent IFNgRa

20 why not antibodies? IgG is a large, multidomain assemblage with disulphide binds and glycosylation essential for function Comparatively difficult and expensive to manufacture Sensitive to reducing intracellular environment Often aggregating when fused to other functional domains Complicated patent situation

21 why recombinant ligands Small, stable, robust and soluble proteins High thermal and hydrodynamic stability no disulphide bonds free cysteines for labeling Bacterial expression en masse Amenable to crystallization and structure-function studies Amenable to protein NMR spectroscopic structure determination Amenable to rational improvement and ab initio design High potential of gaining fundamental mechanistic insight Amenable to high-throughput selection of better binders Extremely promising future in therapeutic and diagnostic use Excellent future in research use can be doing substantially better than antibodies Binz HK, Amstutz P, Plückthuhn A (2005) Nature Biotechnology 23, 1257

22 ABD: selection of residues for library construction Set A: residues 2, 6, 10, 13, 19, 23, 26 Set B: residues 20, 24, 27, 29, 32, 33, 36, 37, 40, 44 Set C: residues 3, 4, 7, 11, 14, 15, 31, 35, 39, 42, 43 Core residues: 1, 5, 8, 9, 12, 16, 17, 18, 21, 22, 25, 28, 30, 34, 38, 41, 45, 46 Set A Set C Set B

23 Ribosome display Clone and Sequence P T7 (NNK) n Synthetic DNA library Transcription 5 (NNK) n 3 Translation Amplification 5 (NNK) n (NNK) n cdna Synthesis 5 (NNK) n 3 Elution of mrna 5 (NNK) n 3 Affinity Selection Immobilized Receptor

24 Absorbance at 492nm ELISA affinity measurement Affinity measurment for ABDTolA variants u 81+u 75+u 78+u Li10+u 24-u 24+u 1 0 1E-14 1E-13 1E-12 1E-11 1E-10 1E-09 1E-08 1E-07 1E-06 0, ,0001 0,001 Conc in mol/l

25 Thanks for attention