CMV specifické T- lymfocyty po alogenní transplantaci hemopoetických progenitorových buněk

Transkript

1 CMV specifické T- lymfocyty po alogenní transplantaci hemopoetických progenitorových buněk Hematologicko-onkologické oddělení FN Plzeň Daniel Lysák Motolský minikurz cytometrie 2007

2 1. CMV u pacientů po alogenní transplantaci kostní dřeně 2. MHC tetramer (multimer) 3. Problémy spojené s použitím MHC multimeru 4. Příprava vzorku 5. Výsledky pilotní studie

3 CMV sérostatus Celkové přežití podle serostatusu dárce (d) a příjemce (p) Kröger N, Br J Hematol 2001

4 CMV po alosct u u imunokompetentního hostitele perzistentní latentní virus s nulovou patologií (60-90 % séropoz.) CMV séropozitivní jedinci _ cirkulující CMV specif. T-lymfo ( 0.1%, ~ 1 %, 1-10/μl) CMV rizikový faktor u alosct: h TRM přímý efekt: nepřímý efekt: vliv virostatik: CMV nemoc bakteriální infekce neutropenie pozdní CMV reakt. mykotické infekce nefrotoxicita rezistentní CMV infekce rekonstituce protiinfekční imunitní odpovědi po alosct: granulocyty, NK buňky: < 1 měs T a B lymfocyty: 6-24 měs kinetika ovlivněna: typ dárce, typ štěpu, TCD, GVHD, kortikoterapie, D/R sérostatus

5 Rekonstituce lymfocytů po alogenní transplantaci Gratama JW, Erasmus MC, Rotterdam

6 Imunitní odpověď na CMV virus specifické CD8+ cytotoxické T- lymfocyty (CTL) namířena proti proteinu pp65 a intermediate- early antigenu IE-1 v rámci pp65 a IE-1 definováno množství epitopů pro CD4+ i CD8+ T- lymfocyty peptid NLVPMVATV (pp65) presentovaný alelou HLA A*0201 _ imunodominantní epitop pro CD8+ T- lymfocyty

7 Cytomegavirová pneumonie po alogenní transplantaci

8 Preemptivní léčba a riziko reaktivace CMV Preemptivní léčba: monitorace RT-PCR, CMV PCR, antigenemie (pp65) hodnoty > 500 kopií/μl, PCR+, > 5 poz. elementů Ag aktivita CMV infekce _ zahájit preemptivní léčbu Riziko reaktivace: 1. hladina CD4+ T- lymfo (< 100/μl = vysoké riziko) 2. hladina CMV specifických T-lymfo (> 10-20/μl = dostatečná ochrana) _ lepší identifikace rizikových pacientů, ale: přesná hladina a kombinace CD4+/CD8+ T- lymfo nutná k ochraně je kontroverzní

9 1.CMV u pacientů po alogenní transplantaci kostní dřeně 2.MHC tetramer (multimer) 3.Problémy spojené s použitím MHC multimeru 4.Příprava vzorku 5.Výsledky pilotní studie

10 MHC multimer komplex několika (4, 10) MHC molekul: asociované se specifickým peptidem a vázané na fluorochrom nízká afinita mezi MHC komplexem a TRC: monomery multimery váží se na určitý T- cell receptor (TCR) na CD8+ T- lymfo (class I) nebo CD4+ T- lymfo (class II) _ T- lymfocyty specifické ke komplexu peptidu a HLA molekuly _ buněčná odpověď ke komplexu peptidu a HLA molekuly x bez ohledu na funkční status

11 MHC tetramer

12 Peptidy derivované z pp65 Chen FE et al., Cytotherapy 2002, 4: 41-48

13 Vazba na TCR ANTIGEN PRESENTUJÍCÍ BUŇKA Aktivace T- lymfocytu vyžaduje rozeznání peptidu a MHC molekuly

14 2.66 % HLA-B*0702

15 1.CMV u pacientů po alogenní transplantaci kostní dřeně 2.MHC tetramer (multimer) 3. Problémy spojené s použitím MHC multimeru 4.Příprava vzorku 5.Výsledky pilotní studie

16 Problémy s použitím MHC multimeru 1. MHC restrikce 2. Specifita epitopů 3. CD8 nebo CD4? 4. Funkční heterogenita 5. Nespecifická vazba 6. Falešně negativní výsledek

17 MHC restrikce 1. T- lymfo haplotypu a je spec. k peptidu x Odpověď T- lymfo vyžaduje vazbu peptidu a MHC molekuly a T- lymfo rozeznávají Ag pouze, pokud jsou presentovány MHC molekulami originálního haplotypu (s nímž se potkaly v době svého vývoje)

18

19 MHC restrikce 2. je potřeba znát alespoň sérologickou HLA typizaci (A24, B7, A1 ) nejlépe DNA typizace na A a B lokusu (alely) použít tetramery s frekventními alelami (maximální množství pacientů): HLA-B*0702 (> 90 %) HLA-A*0201 (~ 60 %) HLA-A*0101 (~ 80 %) HLA-B*3501 (~ 70 %) panel tetramerů, které obsáhnou maximální % pacientů ve studované populaci (a daném etniku) pro výběr tetrameru: u transplantace kostní dřeně fenotyp dárce x fenotyp pacienta u transplantace solidních orgánů CFC, ELISPOT... nezávislé na znalosti HLA

20 Specifita epitopů tetramer identifikuje ve vzorku pouze část virus specifických T-lymfo rozeznávajících peptid, který je součástí tetrameru pro posouzení imunitní odpovědi k virovému Ag (polypeptidu) je nutné identifikovat imunodominantní epitopy a připravit vhodné tetramery různé epitopy různě imunodominantní př. imunodominance HLA-B*07 před HLA-A*02 (A*02/ B*07 haplotyp) % z CD8 A2 tetra ke komplexnímu posouzení imunitní odpovědi: panel tetramerů pokrývající různé epitopy presentované různými HLA specifitami Lacey SF, Hum Immunol 2003 B7 tetra

21 CD8 nebo CD4? 1. u Tx ledviny korelují změny CD4 CMV spec. T-lymfo s výskytem infekčních komplikací hladina CD4 T-lymfo se mění (se stabilizací cca rok po Tx) CD8 bez signifikantního vývoje CD4 T-lymfo jsou důležité pro rekonstituci CD8+ odpovědi a pro ochranu před CMV CD4 T-lymfo důležité i pro imunoterapii Sester M, Transplantation 2001

22 CD8 nebo CD4? 2. vyšetřujeme pouze CD8 T-lymfo a jejich odpověď pomocí tetramerů I.třídy je to jen malá část buněčné odpovědi, stejně důležité pro její vytvoření a udržení jsou CD4 T-lymfo k posouzení buněčné imunity nejlépe vyšetřovat obě populace, ale: CD4 T-lymfo rozeznávají antigen presentovaný HLA II. třídy pro výběr tetrameru nutná znalost alel na DR event. DP lokusu omezená nabídka tetramerů alel i peptidů (custom) CFC, ELISPOT... nezávislé na znalosti HLA

23 Funkční heterogenita mezi Ag specifickými T-lymfo existuje funkční heterogenita absolutní množství CTL detekovaných tetramerem vs CTL nebo ELISPOT (až 1.5 krát) při značení ex vivo pouze část Ag spec. T-lymfo produkuje po stimulaci Ag IFN-γ (50 60 %) pravděp. paměťový charakter části T-lymfo minimální hladina pro protekci před CMV reaktivací cca 1/µl pro ELISPOT a 10/µl pro tetramer tetramery neříkají nic o funkci kombinovat metody (CFC, ELISPOT)

24 Nespecifická vazba tetramer CD8 MHC class I se mohou nespecificky vázat -zejm. na CD8 molek. na T-lymfo titrace tetrameru mutace (alpha-3 domény) MHC itag MHC tetramer

25 Falešně negativní výsledek pp65 protein je hlavním zdrojem imunodominantních epitopů pro CTL testování CD8 T-lymfo specifických k NLV(PMVATV) je informativní u většiny HLA-A2* pacientů cílem imunitní odpovědi proti CMV mohou být ale i jiné proteiny než jen pp65 (IE1) testovaný epitop nemusí být imunodominantní (viz. specifita epitopů) To vysvětluje: vyšetření je negativní i přes dobrou protivirovou odpověď u části zdravých seropozitivních HLA-A2* jedinců nejsou detekovatelné A2-NLV-CD8 specifické T-lymfo někteří pacienti s velmi nízkými či chybějícími A2-NLV-CD8 specifických T-lymfo nevyvinou CMV viremii

26 1.CMV u pacientů po alogenní transplantaci kostní dřeně 2.MHC tetramer (multimer) 3.Problémy spojené s použitím MHC multimeru 4. Příprava vzorku 5.Výsledky pilotní studie

27 Korelace % a absolutních počtů CMV spec. CTL R 2 = 0,82 bb/ul % monitorace po alosct _ absolutní počty

28 d extram er % Který multimer? tetramer vs dextramer R 2 = 0, tetramer % 20 % měření _ 0 vazba dextrameru ( falešná negativita)

29 1.CMV u pacientů po alogenní transplantaci kostní dřeně 2.MHC tetramer (multimer) 3.Problémy spojené s použitím MHC multimeru 4.Příprava vzorku 5.Výsledky pilotní studie

30 Korelace mezi CMV spec. CTL a reaktivací CMV infekce CMV spec. CTL/ul medián CMV spec. CTL/μl: q PCR q PCR (p <.0001) 0

31 Vliv intenzity chemoterapie 100 % of the pts with more than 10/ul CMV spec. CTL myeloablative non-myeloablative months after SCT Kumulativní množství pac, kteří dosáhli 10/μl CMV spec. CTL

32 Vliv zdroje krvetvorných buněk 100,0 90,0 marrow PBSC 80,0 CMV spec. CTL/ul 70,0 60,0 50,0 40,0 30,0 20,0 10,0 0,0 0,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0 months after SCT

33 Vliv CMV sérostatusu a reaktivace 100,0 CMV spec. CTL/ul 90,0 80,0 70,0 60,0 50,0 40,0 30,0 seropoz. pts without infection seropoz. pts with infection seroneg. pts seropoz. pts with seroneg. donor 20,0 10,0 0,0 0,0 5,0 10,0 15,0 20,0 months after SCT

34 CMV spec. CTL/ul Kinetika CTL rekonstituce steroids 90 steroids CMV CMV CMV months after SCT Pacient po nepříbuzenecké transplantaci s časnou CTL rekonstitucí. Po léčbě kortikoidy pro chronickou GVHD, pokles CTL z 54 na 9 CTL/μl. CMV spec. CTL/ul months after SCT Pacient po příbuzenecké transplantaci. CTL detekovatelné měsíc po Tx (4.7/μl). Po opakovaných epizodách of CMV reaktivace vzestup CTL to 87/μl navzdory akutní GVHD a léčbě kortikoidy.

35 Výhody a nevýhody tetramerů J TETRAMERY rychlá metoda, z periferní krve vyšetřované bb. neztrácejí viabilitu vyšší standardizovatelnost snadná charakteristika bb. (další Ag) L 0 informace o funkci použití u HLA kompatibilních vzorků panel tetramerů obtížná kvantifikace imunitní odpovědi ke komplexnímu Ag CFC, ELISPOT detekce funkčních T-lymfo vyšší citlivost (ELISPOT dřívější detekce CTL) nezávislost na znalosti HLA typizace větší časová náročnost limitovaná informace o imunofenotypu (ELISPOT) nutnost metabolicky aktivních bb. (CFC) kombinovat metody

36 Děkuji za pozornost