Genetika nádorové predispozice: mutační analýza kandidátních genů pro mammární karcinomy v chromosomální oblasti 11q22-q23

Transkript

1 Genetika nádorové predispozice: mutační analýza kandidátních genů pro mammární karcinomy v chromosomální oblasti 11q22-q23 Mgr. Daria Strouhalová

2 Poděkování Děkuji vedení Ústavu patologické fyziologie LF MU v Brně, jmenovitě Prof. MUDr. Anně Vašků, CSc. a Prof. MUDr. Jiřímu Váchovi, DrSc., za vstřícný přístup a umožnění pracovat v laboratořích Ústavu patologické fyziologie Lékařské fakulty MU v Brně. Dále děkuji svému bývalému školiteli MUDr. Igorovi Vořechovskému, CSc. za pomoc při publikování našich výsledků a současnému školiteli Prof. MUDr. Jiřímu Váchovi, DrSc. za velkou pomoc při sepisování této disertační práce. 2

3 Obsah 1. ÚVOD Geny a vznik nádoru Nádory Nádory prsu Gen ATM kandidátní gen pro vznik nádoru prsu Gen ATM a onemocnění Ataxia telangiectasia Mutace genu ATM a nádory Gen ATM a odpověď buňky na poškození DNA Protein ATM jako člen PI3K proteinkinázové rodiny Protein ATM Substráty ATM Další procesy probíhající v buňce po aktivaci ATM ATM a poškození nezávislé na genomové stabilitě Syndromy genomové instability Cíl práce MATERIÁL A METODY DETEKCE MUTACÍ Detekce mutace ATM 7271T>G Vyšetřované skupiny PCR RFLP Detekce mutace ATM IVS10-6T> G Vyšetřované skupiny PCR RFLP LOH (Loss of Hetrozygosity = Ztráta heterozygotnosti) Vyšetřovaná skupina Izolace DNA z krve Izolace DNA z parafinových bločků PCR LOH v oblasti 11q22-q Příprava skel Příprava vzorků na gel Polyakrylamidový gel a ELFO Fixace a vizualizace gelu PCR-SSCP Vzorky PCR SSCP Příprava skel Příprava vzorků pro SSCP Příprava polyakrylamidového gelu a ELFO Fixace a barvení polyakrylamidového gelu stříbrem VÝSLEDKY Průkaz mutace ATM 7271T>G metodou RFLP Průkaz mutace ATM IVS10-6T> G metodou RFLP

4 3.3. LOH v oblasti 11q22-q Mutační analýza PCR-SSCP DISKUSE ZÁVĚR LITERATURA

5 1. ÚVOD Nádor je genetické onemocnění somatických buněk. Toto klišé zvyšuje svůj význam s objevením každého nového onkogenu či tumor supresorového genu. Cesta ke vzniku nádoru je souborem změn v sekvenci a organizaci buněčného genomu, zahrnujícím jednotlivé nukleotidové substituce, ale i velké chromozómové aberace. Postupně s rozvojem neoplastického fenotypu buňky se snižuje i stabilita genomu, což vede k řadě dalších genomových aberací a vzestupu malignity (Hahn, 2002). I když změny v genomické DNA jsou důležité pro udržení genetické variability, změny v sekvenci DNA somatických buněk jsou nežádoucí, a buňky se snaží tyto změny rozpoznat a odstranit speciálními mechanismy a udržet tak stabilní genom (Levitt, 2002). Klíčovou událostí pro počátek malignity je jedna genomová změna (např. substituce v jedné aminokyselině), jejíž výsledkem může být jen mírné snížení množství proteinu. Špatná funkce buněčného mechanismu, který je schopen detekovat poškození DNA nebo záměnné (mismatch) mutace, pak umožňuje výskyt a fixaci takových změn v DNA. Taková buňka není schopna obnovit svou původní sekvenci DNA a dochází tak k narušení jejího životního cyklu. Ke změnám v sekvenci DNA dochází (Hoeijmakers, 2001): a) spontánními chemickými změnami složek DNA b) replikačními chybami c) poškozením přímo na DNA. Nejvíce poškození DNA způsobují látky, které mohou být buď endogenního původu (vznikají při metabolismu) a nebo exogenního původu (přicházejí z okolního prostředí). Poškozující agens, jako radiace a reaktivní chemikálie, jsou schopny ve velké míře indukovat poškození DNA. Některá poškození, pokud nejsou reparována, jsou extrémně cytotoxická, zatímco jiná jsou mutagenní a mohou ovlivnit produkci, strukturu a funkci buněčných proteinů. Mutagenní poškození vyvolává maligní transformaci buňky. Není překvapující, že mnoho mutagenů jsou také karcinogeny a mezi jejich mutagenitou a karcinogenitou je vysoká korelace (Davidson, 2002). Buňky se snaží eliminovat poškození tím, že se primárně snaží poškození opravit. Může se stát, že poškození je takového charakteru, že jej opravit nelze, a v buňce jsou pak nastartovány procesy vedoucí k programované buněčné smrti (apoptóze). 5

6 Mechanismus, který řídí rozhodnutí, zda buňka přežije, a nebo bude nastartována apoptóza, není zatím úplně jasný Geny a vznik nádoru Změny v expresi protoonkogenů a tumorsupresorových genů hrají klíčovou roli v onkogenezi. Dysfunkce jejich proteinových produktů vede k abnormální regulaci životních funkcí, jako jsou buněčný cyklus, apoptóza, genetická stabilita, diferenciace buněk a morfogenetické procesy. Změny v těchto důležitých fyziologických procesech jsou zodpovědné jak za počáteční krok neoplastické transformace buněk, tak za určení následného rozvoje nádoru (progrese) a vzniku maligního tumoru. Geny, které vyvolávají rozvoj nádorů, mohou být rozděleny do tří hlavních skupin: Protoonkogeny, tumor supresorové geny a geny udržující genomovou stabilitu. Protoonkogeny Protoonkogeny jsou strukturní buněčné geny, které se svými translačními produkty do značné míry podílí na regulaci dělení buněk a jejich diferenciaci. Přítomnost protoonkogenů v buňce je jednou z hlavních podmínek jejího normálního růstu, dělení a regulované diferenciace. Normální nemutovaná forma genu se nazývá protoonkogen, mutovaná verze pak onkogen. Onkogeny jsou přílišně nebo nepřiměřeně aktivní. Už jedna mutovaná alela má vliv na fenotyp buňky. Patří sem například geny pro: - růstové faktory (př. sis) - receptory růstových faktorů (př. erb-b) - proteiny v signálních drahách receptorů růstových faktorů (protein kinázy př. src, G-proteiny př. ras) - transkripční faktory, které aktivují geny v odpovědi na růstové faktory (fos, jun) 6

7 Tumor supresorové geny (TS geny) TS geny se podílí na procesech kancerogeneze (vzniku nádorů) spolu s onkogeny. Je to zcela odlišná skupina genů, které svými proteiny, jež kódují, nevyvolávají v normálních buňkách proliferaci, ale naopak proliferaci buněk potlačují. Jejich ztráta (delece) se pak projeví neregulovanou proliferací, která může vést ke kancerogenezi. Obě alely TS genu musí být mutovány (inaktivovány), aby se změnila funkce buňky (Obr.1). Patří sem například geny pro dvě formy retinoblastomu (nádor retiny) familiární a sporadický. Geny udržující genomovou stabilitu Tato skupina genů bývá často řazena do skupiny tumor supresorových genů. Geny se podílí na udržení integrity genomu a kontrolují přesnost přenosu informace. Až ztráta funkce obou alel učiní buňku náchylnou k chybě. Pokud nefungují tyto geny, může vzniknout řada mutací i v protoonkogenech a tumor supresorových genech (Strachan, 1996). Patří sem například geny ATM, MSH2 a MLH Nádory Příčiny vzniku nádorů Pro vznik nádorové buňky je potřeba několikanásobné somatické mutace Knudsonova teorie (Obr.1). Tyto mutace mohou být způsobeny: 1) kancerogeny - mutagenními chemikáliemi - radiací - růst podporujícími faktory 7

8 2) viry - retroviry Rous sarcoma virus (přenáší buněčný onkogen v-src) Ptačí leukosní viry (aktivují buněčný onkogen c-myc) - DNA nádorové viry (inserční mutagenese) Adenovirus, SV40, Hepatitis B virus 3) Riziko vzniku rakoviny může být dědičné (obr.1- b) - člověk zdědí 1 poškozenou (mutovanou) alelu, ale pro vznik nádoru je potřebná ještě somatická mutace druhé wild type alely (retinoblastom, Wilmsův tumor, nádory prsu) Obr.1 Knudsonova Two-hit hypotéza vzniku nádoru (týkající se tumor supresorového genu (TSG) modifikováno dle (Strachan, 1996) 8

9 Typy nádorů 1) Podle schopnosti infiltrovat do jiné tkáně a proliferovat v ní za tvorby nového nádoru, tedy co do schopnosti metastáze, je možno nádory rozdělit na: a) benigní (nádor nezhoubný) nešíří se metastázováním a neinfiltruje do jiné tkáně b) metastatické - infiltruje do jiné tkáně a šíří se v těle metastázováním 2) Determinace podle typu původních buněk, z nichž je nádor odvozen: a) kostní dřeň leukémie b) lymfatické uzliny a slezina lymfomy c) mesoderm (svaly, kosti, chrupavky) sarkomy d) epitely (žlázy obecně, prsní žlázy, kůže, plíce, atd.) karcinomy (až 85% všech) Charakteristika nádorových buněk a) nekontrolovaný růst - nesmrtelnost - nepotřebují růstové faktory - žádná inhibice kontaktem b) mohou se šířit na jiná místa v těle (metastázy) - postupně ztrácejí vlastnosti normálních buněk, ze kterých jsou odvozeny - získávají nové vlastnosti (transformace) - rostou na měkkém agaru - produkují nové buněčné povrchové markery 9

10 Funkce nádorových genů Aby se z normální buňky stala typická nádorová buňka, musí v její DNA dojít k mnohonásobné (vícenásobné) mutaci. Tyto mutace vnikají v genech, které regulují buněčný růst, chrání jedince před smrtelným poškozením nebo nepotřebnými buňkami, reparují DNA, determinují vlastnosti buňky anebo podporují angiogenezi Nádory prsu Nádory prsu představují jednu z nejvýznamnějších malignit vůbec. Přibližně 7% nádorů prsu a 10% nádorů vaječníků v populaci je přisuzováno dědičnosti nádorově citlivých genů (Claus, 1996). Nádory prsu jsou nejčastějšími malignitami u žen a zahrnují až 30% případů rakoviny ve světě (Parkin, 1993). Pravděpodobnost vzniku nádoru roste se vzrůstajícím věkem, ale klesá kolem menopausy. Nejvýznamnějším rizikovým faktorem pro vznik nádoru prsu je jeho výskyt v rodinné historii. Jak se ukázalo, reprodukční a hormonální faktory, jako jsou menstruace, pozdní menopausa, krátká doba kojení, užívání orální hormonální antikoncepce a hormonální substituce jsou asociovány s vyšším rizikem vzniku nádoru prsu. Obezita, konzumace alkoholu, vyšší socioekonomická úroveň, vystavení radiaci a předešlá benigní onemocnění prsu jsou další známé faktory pro vznik nádoru prsu (Shiloh, 2002). Nádory prsu vznikající z epitelu zahrnují jak lobulární, tak duktální části prsní žlázy. Normální prsní epitel je v prvním kroku transformován a vzniká tzv. atypická hyperplasie. Dalšími transformacemi pak může vzniknout karcinom in situ, případně invazivní karcinom in situ a metastázy. Prognosa u pacientů s nádory prsu závisí hlavně na klinickém stádiu v čase diagnosy. Přibližně 14 % nádorů prsu je ve stádiu 0 (karcinom in situ) kde je přežívání 10 let téměř 100 %. Stádium I (rozměr nádoru 2 cm a menší, axilární uzliny nejsou zasaženy) representuje asi 40 % všech nádorů a přežívání 10 let se pohybuje kolem 90 %. Stádium II je diagnostikováno u 32 % pacientů (tumor je v průměru 2 až 5 cm velký/nebo jsou postiženy axilární uzliny), kde je pravděpodobnost přežití 10 let %. Stádium III (nádor větší než 5 cm, zasaženy axilární uzliny) reprezentuje 5-10 % nádorů prsu. V této skupině je pravděpodobnost 10

11 přežití 10 let kolem 35 %. Asi 4% nádorů prsu je ve IV stádiu (metastázy) už v době diagnostiky nádoru. V těchto případech je přežívání po dobu 10 let špatné, asi jen kolem 5 % (Bland, 1998). Standardní klinická a histopatologická klasifikace, molekulární a biochemická vyšetření tumorových markerů mohou pomoci při určení prognosy a vhodné léčby. Nejčastěji používané markery jsou estrogenový receptor (ER) a progesteronový receptor (PgR), které odrážejí endokrinní citlivost nádoru. Dalšími prognostickými markery mohou být mutace v TP53 a ERBB2 genech a exprese antigenu Ki67, které jsou používány jako indikátory odpovědi na chemoterapeutickou léčbu. Řada jiných faktorů, jako je exprese upa/pai 1 (urokinase-type plasminogen activator/plasminogen activator inhibitor 1) nebo exprese EGFR (epidermal growth factor) anebo exprese BCL2, mohou být také použity k odhadu prognosy onemocnění (Dowsett, 1998). Objev genů, jejichž konstituční mutace/inaktivace výrazně disponuje k malignitám, jako např. BRCA1 nebo BRCA2, znamenal pokrok v pochopení mechanismů maligní transformace, ale také možnost individuální predikce rozvoje mammárních karcinomů. Mutace v těchto dvou důležitých genech jsou nejčastěji nalezeny v rodinách s vícečetnými případy nádoru prsu. Nicméně mutace v BRCA1 a BRCA2 genech byly identifikovány jen u kolem 80% rodin s 4 nebo 5 případy nádoru prsu žen (Ford, 1998). To jsou důvody, proč se předpokládá, že pravděpodobně existuje jeden nebo více jiných genů, jejíchž mutace zvyšují riziko vzniku nádoru prsu. U velkého množství případů však stále není objasněna příčina vzniku nádorů prsu. Několik vědeckých skupin hledá tento gen (geny) po celém genomu, ale zatím neúspěšně. Negativní výsledek tohoto hledání je ovlivněn velkou heterogenitou chromosomálních oblastí, které souvisí s nádorem prsu. Nezdar v identifikaci dalších genů, které se podílí na vzniku nádoru prsu, souvisí i s vysokým rizikem onemocnění, napovídajícím, že bude existovat více než 1 gen. Používanou metodou je vyhledávání kandidátních genů v rodinách s více případy nádoru prsu a následná determinace mutací v těchto genech, které by mohly být zodpovědné za vznik nádorů prsu s neznámou genetickou etiologií. V poslední době se výzkum soustředí kromě genů BRCA1 a BRCA2 také na geny TP53, ATM, RB1, Cyclin D1. (Chunder, 2004). 11

12 1.4. Gen ATM kandidátní gen pro vznik nádoru prsu Protein ATM, produkt genu ATM, vystupuje jako model signálního transduktoru poškození DNA v buňce. Další výzkum tohoto proteinu by mohl přinést cenné informace o odezvě buňky na poškození DNA, jedné z kardinálních procesů pro udržení buněčné homeostázy a stability buňky a ochrany buňky před vznikem nádoru. Odpověď na poškození DNA je soubor reakcí, které probíhají také při procesech rozvoje tkání, stárnutí buněk i vzniku nádorů. Pochopení regulace sítě, ve které je ATM nadřazena dalším procesům, přes pochopení mechanismu aktivace ATM, až po poznání dalších ATM efektorů, má velký vliv v mnoha oblastech medicíny. Mutace v genu ATM a jejich výskyt v lidské populaci stojí v centru zájmu vědců z oboru epidemiologie nádorů. Gen ATM je zkoumán především jako gen pro nádorovou predispozici Gen ATM a onemocnění Ataxia telangiectasia Gen ATM má 66 exonů a je exprimován v širokém spektru tkání jako 12-kb m RNA, která kóduje 350 kda protein s protein kinázovou doménou (Gatti, 1999). Protein ATM byl identifikován jako produkt genu, který je mutován (ztracen nebo inaktivován) u genetického onemocnění člověka zvaného Ataxia telangiectasia (zkráceně A-T) (Savitsky, 1995). A-T patří do skupiny onemocnění, známých jako syndromy genetické instability, se společným znakem poruch v odpovědi na specifická poškození DNA. Ataxia telangiectasia (MIM ) je autosomálně recesivní genetické onemocnění, které se u novorozenců ve světě vyskytuje s frekvencí 1: : (Shiloh, 1995). Onemocnění je doprovázeno rozsáhlou kombinací somatických a fyziologických poruch (Boder, 1958; Lavin, 1997). Klinické příznaky tohoto onemocnění jsou: neuromotorická dysfunkce, telangiectasia (v očích a v obličeji), degenerace thymu a gonád, imunodeficience, u některých pacientů neustále se vracející infekce plic, retardovaný růst těla, předčasné stárnutí, 100x vyšší riziko vzniku malignit a senzitivita k ionizačnímu záření a látkám indukujícím dvouřetězcové zlomy na DNA (DSBs = double-strand breaks), dále defektní produkcí p53 v odpovědi na ionizující záření, defekty v obou G1/S a G2/M 12

13 kontrolních bodech buněčného cyklu a defektní inhibicí DNA replikace. DSBs u těchto pacientů nemohou být opraveny (Crawford, 1998; Becker-Catania, 2001). Buňky kultivované v tkáňových kulturách, pocházející od A-T pacientů, vykazovaly velké odchylky v odpovědi na DSBs ve srovnání s buňkami pocházejícími od zdravých lidí. Tyto chyby se projevily ve všech stupních odpovědi. Buňky vykazovaly jiný buněčný fenotyp, který byl způsoben mutací v genu ATM. Gen ATM byl postaven do čela kaskády reakcí probíhající v buňce při odpovědi na DSBs poškození DNA (Shiloh & Kastan, 2001). Bylo zjištěno, že inaktivace obou kopií tohoto genu je zapojena v patogenezi sporadických T-buněčných leukemií (Stilgenbauer, 1997; Vorechovsky, 1997) Mutace genu ATM a nádory Jako i jiné syndromy genomové nestability, tak i A-T je nádorově predisponující onemocnění. ATM-deficientní myši vykazují vysokou predispozici k lymfoidním malignitám (lymfomy thymu), kterým podléhají už před dosažením věku 1 roku (Sesto, 2002; Shiloh, 2001; Shiloh & Kastan, 2001). Gen ATM zajímá vědce z oboru epidemiologie nádorů více než dvě desetiletí. Hlavním důvodem je predispozice ke vzniku nádorů u A-T nosičů. Byl popsán vysoký výskyt malignit, hlavně nádorů prsu, mezi heterozygotními nosiči v A-T rodinách (Khanna, 2000). Asociace mezi A-T a rakovinou prsu byla poprvé popsána v práci Swiffta, který popsal častější výskyt případů nádoru prsu u příbuzných A-T pacientů, než bylo očekáváno (Swifft, 1991). Tento objev se stal základem dalších studií A-T rodin (Janin, 1999; Inskip, 1999; Olsen, 2001; Geoffroy-Perez, 2001), kde bylo popsáno 3-7x vyšší riziko vzniku nádoru prsu pro příbuzné z A-T rodin. Na základě počátečních odhadů výskytu A-T nosičů (A-T heterozygotů) v populaci kolem 1 % a 3x vyššího rizika vzniku nádoru prsu u těchto nosičů, bylo odhadnuto, že A-T heterozygoti mohou tvořit až 5 % případů všech nádorů prsu (Easton, 1994). Jiný odhad vycházející z rizika vzniku nádoru prsu pro A-T přenašeče, které bylo u mužů odhadnuto na 2,3 a u žen 3,1, předpokládá, že množství nádorů prsu asociované s heterozygotností pro A-T je až 8 % případů sporadických nádorů prsu (Swift, 1991). Tyto odhady jsou vyšší než je 1-2 % přisuzované mutacím v BRCA1 a BRCA2. To vyvolává otázku, zda může být gen ATM považován za gen důležitý 13

14 pro nádorovou predispozici a zda by měli být lidé, kteří byli nebo jsou častěji vystaveni radiaci, vyšetřováni na mutace v genu ATM. I když vazebné studie neposkytly důkaz o roli ATM v predispozici nádoru prsu (Cortessis, 1993; Wooster, 1993), protože tyto analýzy trpěly nedostatkem statistické síly testu, je ATM pořád v centru zájmu vědců z oboru epidemiologie nádorů. Epidemiologické studie, které zatím byly prováděny v různých populacích, a jejíchž výsledky byly srovnávány, dávají protichůdné výsledky o rozsahu nádorové predispozice mezi A-T nosiči. Ve studiích zabývajících se mutacemi genu ATM (truncated mutations) bylo zjištěno, že některé mutace, vyskytující se u A-T pacientů, vedou k expresi zkráceného proteinu, který je nestabilní, nebo je exprimováno jinak funkční, ale redukované množství proteinu ATM, anebo není protein ATM exprimován vůbec. Jiné mutace genu ATM vedou k substituci nebo deleci aminokyselin (missense mutation = měnící smysl kodónu), a tak je inaktivována katalytická aktivita proteinu. Předpokládá se, že buňky nosičů těchto mutací obsahují obě, jak funkční, tak i inaktivovanou formu molekul ATM v různých poměrech (procentu). Vysoký výskyt missence mutací byl zjištěn u A-T rodin, u kterých byla rovněž i vysoká incidence vzniku nádorů (Stankovic, 1998). Důležitost těchto mutací v predispozici ke vzniku nádorů je vysvětlována jednoduše dominantně negativním efektem - inaktivní verze proteinu vede k redukci funkce ATM v buňce, která je vyšší než u nosičů truncated mutací (Gatti, 1999). Experimentální demonstraci provedl (Scott, 2002), který exprimoval v buňkách rekombinantní protein ATM. Upravené molekuly ATM obsahovaly rizikové varianty (mutace), které byly před tím nalezeny u příslušné skupiny pacientů s nádory prsu (Dork, 2001). Některé z těchto mutovaných proteinů ATM suprimovaly kinázovou aktivitu endogenní ATM a způsobily radiosenzitivitu buněk a nestabilitu genomu. Tyto výsledky podpořila i další práce, ve které byl použit A-T zvířecí model myš. Byly použity myši s navozenou mutací (delecí uvnitř čtecího rámce). Tato mutace byla předtím nalezena v případech A-T u lidí. Myší homozygoti pro tuto mutaci produkovali malé množství inaktivního proteinu ATM a vykazovali znaky Atm-knockoutovaného fenotypu. Důležité je, že myší heterozygoti pro tuto mutaci vykazovali predispozici k různým nádorům (Spring, 2002). 14

15 Mutace v genu ATM byly nalezeny i při hledání somatických mutací ATM genu u sporadických nádorů u člověka. Somatické mutace v genu ATM byly nalezeny u sporadických lymfoidních nádorů, kde se gen ATM choval jako tumorsupresorový gen (Stankovic, 2002). Gen kódující protein ATM je zařazen na seznam genů podílejících se na genetické predispozici vzniku nádorů (Khanna, 2000; Gatti, 1999). Role genu ATM v nádoru prsu je zkoumána dvěmi různými cestami: hodnocením rizika vniku nádoru prsu u A-T nosičů a analýzou mutací genu ATM u pacientů s nádorem prsu. Čtyři studie popsaly zvýšené riziko výskytu nádoru prsu u příbuzných žen A-T pacientů, kde se riziko zvýšilo v průměru v rozsahu 3-7x, přesně od 2-6x až po odhad 2-17x (Janin, 1999; Olsen, 2001; Geoffroy-Perez, 2001; Athma, 1996). Byla nalezena mutace v genu ATM (7271T>G nebo také Val2424Gly), která byla identifikována u dvou A-T rodin a byla asociována s 13x vyšším rizikem vzniku rakoviny prsu jak u heterozygotů, tak homozygotů (Stankovic, 1998). Ve velkém počtu studií je frekvence mutací genu ATM ve sporadických nebo neselektovaných případech pacientů s nádorem prsu srovnávána s kontrolní skupinou. Tyto studie obecně užívají metody, které jsou postaveny na detekci protein trunction mutace (Vorechovsky, 1996; FitzGerald, 1997; Bishop, 1997; Chen, 1998; Shayeghi, 1998; Appleby, 1997; Ramsay, 1998). Většina studií nepotvrdila zvýšenou prevalenci mutací genu ATM u pacientů s nádorem prsu. Nicméně ve studii 82 pacientů z Holandska s počátečním stádiem nádoru prsu, kteří byly vystaveni nízké dávce ionizačního záření v nízkém věku, a kteří přežili více než 5 let po diagnostikování nádoru prsu, bylo nalezeno 7 germinálních mutací v genu ATM, včetně IVS10-6T>G, která byla detekována u 3 pacientů a která zvyšuje riziko vzniku nádoru prsu až 9x (Broeks, 2000). Mutace IVS10-6T>G byla popsána i u jednoho německého pacienta s klasickou A-T. Tato mutace byla považována za patogenní (Dork, 2001). Výzkum týkající se role genu ATM v riziku vzniku nádoru prsu probíhá ve 2 hlavních proudech. Testuje se hypotéza, že: 1. K nádoru prsu může predisponovat jen jistá mutace genu ATM (Vorechovsky, 1996; Dork, 1999; Teraoka, 1999), která má vliv mimi jiné na fosforylaci BRCA1 a/nebo p53. Jsou analyzovány A-T rodiny. 2. Analyzují se pacienti s nádorem prsu, kteří jsou vybíráni bez rodinné historie nádoru prsu a u kterých se vyhledávají mutace genu ATM. 15

16 Gen ATM a odpověď buňky na poškození DNA Pokud není spuštěna apoptóza a buňka se snaží opravit poškození DNA, je v buňce aktivována řada reparačních mechanismů, které se podílí na rozpoznání specifického poškození DNA (Obr.2). Poškození DNA jsou buď reparována in situ, anebo odstraněna a obnovena původní sekvence (Hoeijmakers, 2001). Za posledních 50 let bylo získáno mnoho informací o reparačních mechanismech v buňce. Tyto mechanismy se liší pro různé typy poškození DNA. U některých systémových onemocnění jsou tyto reparační mechanismy narušeny genetickými chybami. Dochází tak k degeneraci některých tkání, obzvláště nervového a imunitního systému. Pacienti postižení těmito syndromy, mají mnohem vyšší riziko vzniku rakoviny (Vessey, 1995; Moses, 2001; Thompson, 2002; O Driscoll, 2002). Odezva na poškození DNA, hlavně u vysoce cytotoxických poškození DNA, jako je vznik dvouřetězcových zlomů (DSBs = double-strand breaks), nezahrnuje jen opravu DNA, ale i další přídatné procesy (Jackson, 2002; Khanna, 2001; van Gent, 2001). Charakteristickým znakem odpovědi na tento typ poškození je aktivace kontrolních bodů (checkpoints) buněčného cyklu a jeho následné zastavení. Náhlé zastavení buněčného cyklu vyvolává velké změny v mnoha fyziologických procesech. Dochází ke změně expresního profilu buňky - jak syntézy, tak degradaci i transportu proteinů (Amundson, 2001; Jelinsky, 2000; Sesto, 2002). Rychlost, kterou k těmto reakcím dochází, naznačuje, že v buňce musí existovat více drah, které jsou schopny rychle zprostředkovat odpověď buňky na poškození DNA. Mechanismy zodpovědné za reakci na DSBs byly nalezeny v buňkách kvasinek až po buňky savců. Je to jemně vyladěná, mnohonásobně rozvětvená síť signálních drah, které pracují společně při reparaci letálních DSBs, zatímco je dočasně zastaven buněčný cyklus a adekvátně pozměněn metabolismus. Tato složitá síť je mobilizována účinkem jedinečné protein kinázy ATM. 16

17 Typ poškození Spontánní (replikační chyby, modifikace bází) Chemické látky Endogenní Exogenní Radiace UV záření Ionizační záření DNA léze Inzerce, delece, záměny bazí, zlomy řetězců Modifikace a ztráta bazí, zlomy řetězců Adice na DNA, crosslink, zlomy řetězců Pyrimidinové dimery, modifikace bází Modifikace a ztráta bazí, zlomy řetězců Rozsah poškození Opravitelná poškození Neopravitelná poškození Buněčná odpověď Aktivace reparačního systému Nepřesná Aktivace apoptózy oprava Odpověď na stres Kontrolní body b. cyklu Oprava DNA Mutace, chromozomální aberace Následek Přežití buňky Maligní transformace Smrt buňky Obr. 2: Odpověď buňky na DNA poškození (modifikováno dle Shiloh, 2003) 17

18 DSBs vznikají v buňce i přirozeně při procesech, jako je meiotická rekombinance nebo kompletování genů pro receptory T-buněk a genů pro imunoglobuliny cestou V(D)J rekombinace v T případně B lymfocytech. Přirozené buněčné DSBs mechanismy jsou v buňce udržovány na nízké úrovni aktivity, a tak je zajištěno, že buňka zůstane po těchto procesech (vzniku DSBs a znovuspojení) nepoškozena. Pokud ale v buňce vzniknou DSBs na DNA vlivem škodlivých agens, jako jsou volné radikály nebo ionizační záření, je to pro buňku mnohem větší nebezpečí. Řádově v minutách dojde k vyvolání odpovědi na poškození DNA (Jackson, 2002; Khanna, 2001; van Gent, 2001). Současné modely popisují odpověď na DSBs jako sérii kroků (viz Obr. 3). V buněčném cyklu s kontrolními body jsou proteiny drah rozděleny na senzory, transduktory a efektory. Senzory monitorují a rozpoznávají příslušné procesy, transduktory přenášejí signál od senzorů k efektorům a efektory jsou cílovými proteiny kontrolních bodů. Aktivita efektorů je pak důležitá pro kontrolu průběhu buněčného cyklu. Řada senzorů a transduktorů se může spojovat do velkých komplexů, což dokazuje složitost celého procesu. V případě DSBs musí být nejprve rozpoznány zlomy, to se děje senzorovými proteiny. Zlomené konce DNA jsou chemicky různé, proto nemohou sloužit jako substrát pro reparační enzymy, a proto jsou aktivovány transduktory, které přenášejí signál o poškození DNA efektorům, nacházejícím se v dráze pod nimi. Takovýto systém zahrnující transduktory a efektory potom umožňuje, že jeden transduktor může rychle působit na procesy na mnoha drahách. Transduktory se mohou zapojovat do sestavování DNA reparačního komplexu v místě poškození (Obr. 3). V případě DSB je iniciálním a primárním transduktorem ATM - protein kináza. Signál je přenášen standardním signálním modem fosforylací proteinů. 18

19 Dvouřetězcový zlom (DSB) Změny chromatinu Senzory - detekce poškození Působení enzymů Modifikované DSB Transduktory Aktivované transduktory Efektory Aktivace Oprava DNA Komplex reparačních enzymů Opravená DNA Kontrolní body buněčného cyklu Dráha odpovídající na stres Přežití buňky Obr.3 Schéma opravy DSBs ( modifikováno dle Shiloh, 2003) 19

20 Protein ATM jako člen PI3K proteinkinázové rodiny ATM - protein kináza patří do rodiny proteinů, které mají serin/threonin kinázovou aktivitu (Shiloh, 2001; Shiloh & Kastan, 2001; Abraham, 2001; Durocher, 2001; Khanna, 2001). Všechny tyto proteiny obsahují doménu s motivem, který je typický pro lipidovou kinázu phosphatidylinositol 3-kinázu (PI3K), nazývanou také PI3K-like protein kinases = PIKKs (viz Obr. 4). PI3K doména se vyskytuje v katalytickém místě aktivních proteinkináz z PIKK rodiny. Ze savčích kináz do této rodiny patří další zástupci - ATM, ATR, ATX/SMG- 1, mtor/frap, DNA-PKcs a TRAP (Obr. 4). Tyto protein kinázy mají společné tři domény: FAT a FATC doménu (ve FAT doméně ATM - kinázy na pozici aminokyseliny Ser1981, je místo, kde probíhá autofosforylace proteinu během aktivace ATM) a doménu PI3K, která obsahuje fosfatidylinositol s katalytickým místem této kinázové rodiny. TRAP není kináza, ale protein, který je součástí histon acetyl-transferázového komplexu. Do této rodiny je řazen kvůli podobné struktuře (McMahon, 2000; Nikiforov, 2002). Protein kinázy z PI3K rodiny, které jsou konzervativní od kvasinek až po savce, jsou zodpovědné za fosforylace klíčových proteinů různých drah buněčného cyklu. Mohou ovlivnit řadu procesů v buňce prostřednictvím substrátů, které fosforylují. Odpovědi na DNA poškození se účastní čtyři savčí PIKKs. Jsou to: DNA-depedentní protein kináza (DNA-PK), ATM, ATR a ATX (Shiloh, 2001; Shiloh & Kastan, 2001; Abraham, 2001; Durocher, 2001). 20

21 Obr. 4 ATM a příbuzné protein kinázy podílející se na udržení integrity genomu. U každého proteinu je zobrazena FAT, PI3K a FATC doména a číslo udávající počet aminokyselin, které tento protein tvoří (modifikováno dle Shiloh, 2003) Zatímco ATM a DNA-PK se účastní v odpovědi na DSBs, ATR a ATX se účastní v odpovědi jak na poškození DNA UV zářením (UV záření pravděpodobně indukuje zastavení replikace), tak na DSBs. ATR také odpovídá za zastavení replikační vidlice. mtor/frap jsou jediné aktivní kinázy z této rodiny, které se nezapojují při odpovědi na poškození DNA. Reagují na množství živin a na mitogenní stimuly a podílejí se na aktivaci procesů translace a pravděpodobně i degradace proteinů. Účastní se i kontroly buněčného růstu (Proud, 2002; Dennis, 2002) Protein ATM Aktivace ATM ATM protein se nachází převážně v jádře dělících se buněk. Při vzniku DSBs tento protein velice rychle a intenzivně fosforyluje řadu substrátů (Obr. 5). Fosforylací se zesiluje nebo potlačuje jejich aktivita. Fosforylované substráty se pak přímo účastní specifických procesů obrany buňky proti DSBs. ATM fosforyluje 21

22 v proteinech aminokyseliny serin a threonin. Fosforylace je velice rychlá a řádově v minutách je přeměněno mnoho substrátů ve fosforylované deriváty (Banin, 1998; Canman, 1998). Změna v aktivitě ATM by mohla být vysvětlením rozsáhlosti a rychlosti tohoto procesu. Protein ATM se může aktivovat i sám, procesem zvaným autofosforylace (Kozlov, 2004). Molekuly proteinu ATM jsou v nepoškozených buňkách inaktivní a nacházejí se ve stavu dimerů až multimerů (Bakkenist, 2003). V této konfiguraci je kinázová doména blokována tzv. FAT doménou (Obr. 4) jiné molekuly ATM. Za signál pro aktivaci ATM jsou považovány změny chromatinu (Bakkenist, 2003). Při poškození DNA každá molekula ATM fosforyluje jinou molekulu ATM na aminokyselině Ser1981, uvnitř FAT domény. Fosforylace uvolňuje 2 molekuly ze vzájemné vazby, a tak vznikají dva plně aktivní monomery. Po vzniku DSBs v genomu se během několika minut vytvoří řada plně aktivních molekul ATM proteinu. Část aktivního Proteinu ATM je transportována do místa vzniku DSBs, kde ATM silně adheruje na zlomy DNA. Tento komplex pak slouží jako základ pro další enzymatické reakce v místě zlomu (Andegeko, 2001). V buňce se pravděpodobně vyskytují molekuly proteinu ATM ve dvou frakcích. Po vzniku DSBs na DNA jsou obě frakce aktivovány a jedna frakce se váže na chromatin a druhá frakce se pohybuje volně v jádře (Shiloh, 2003). Protein ATM řídí mnoho rozvětvených drah buněčného cyklu. Několika různými cestami je schopen dosáhnout stejného konečného výsledku. Příkladem je opět kontrolní bod v intra S-fázi buněčného cyklu, kde se sbíhá několik drah řízených ATM a provádí se zde kontrola procesu odpovědi buňky na DSBs (Obr. 5). Bylo zjištěno, že do tohoto kontrolního bodu se sbíhá nejméně pět drah řízených ATM Substráty ATM Mezi nejprozkoumanější substráty ATM patří p53, BRCA1, NBS1, SMC1, FANCD2, CHK1 a CHK2, které jsou součástí sítě drah ATM a podílejí se na procesech odehrávajících se v kontrolních bodech buněčného cyklu. Obrázek č. 5 znázorňuje, jak ATM tyto dráhy řídí použitím několika strategií. 22

23 Obr. 5 Ovlivnění procesů buněčného cyklu ATM a ATR - kinázou po vzniku DSBs označení inhibice, Inhibice fosforylace je označena čárou přes šipku, DeP defosforylace, pozice fosforylovaných zbytků jsou popsány jejich číslem. (Často je to Ser, kromě fosforylace CHK2, kde je fosforylován threonin). Mnoho drah je primárně regulováno ATM, hlavně v časných stádiích po vzniku poškození. Regulace prostřednictvím ATR se děje až v pozdějších fázích této opravy. V této dráze jsou fosforylovány proteiny RAD17 a CHK1 (modifikováno dle Shiloh, 2003) 23

24 ATM a p53 ATM ovlivňuje kontrolní bod G1/S buněčného cyklu tím, že aktivuje a stabilizuje protein p53. Protein p53 aktivuje transkripci, která kóduje CDK2-cyclin E inhibitor WAFI (známý jako p21 nebo CIP1). ATM fosforyluje p53 na aminokyselině Ser15 (Banin, 1998; Canman, 1998; Khanna, 1998). Fosforylací se zvýší aktivita p53 jako transkripčního faktoru (Khosravi, 1999; Ashcroft, 1999; Dumaz, 1999). ATM také fosforyluje a aktivuje kinázu CHK2 (Checkpoint Kinase 2) (McGowan, 2002; Bartek, 2001), která fosforyluje protein p53 na aminokyselině Ser20. Tím je ovlivněna interakce mezi p53 a MDM2. Onkogenní protein MDM2 je jak přímým, tak nepřímým inhibitorem p53, a vystupuje jako ubiquitin ligasa v p53 ubiquitinylaci (Ryan, 2001; Oren, 2002). ATM dále fosforyluje i přímo MDM2 na aminokyselině Ser395. Fosforylovaný MDM2 se nedá odstranit z komplexu p53- MDM2 a chrání tak p53 před degradací (Khosravi, 1999; Maya, 2001). Další ATM dependentní procesy jsou fosforylace p53 na aminokyselinách Ser9 a Ser46 (Saito, 2002) a defosforylace aminokyseliny Ser376 proteinu p53 (Waterman, 1998). Tato série ATM depedentních modifikací, které aktivují a stabilizují p53, i když ne úplně, ilustruje komplikovanou cestu, ve které ATM řídí jeden efektor. Taktéž ale naznačuje, že ATM může regulovat několik efektorů uvnitř téže dráhy. ATM a BRCA1 Protein ATM aktivuje po poškození DNA i tumor supresorový protein BRCA1. Protein BRCA1 se váže na velký proteinový komlex, ve kterém se nacházejí spolu s proteinem ATM i DSBs reparační enzymy (Wang, 2000). Činnost toho komplexu v reparaci DSBs není v současnosti úplně jasná. Tento komplex aktivuje expresi genů odpovídajících na poškození DNA a je zapojen v kontrolních bodech buněčného cyklu v intra-s-fázi a G2/M fázi (Venkitaraman, 2002; Jasin, 2002; Yarden, 2002; El-Deiry, 2002). ATM fosforyluje protein BRCA1 na několika místech (Cortez, 1999; Gatei, 2000; Gatei, 2001). Jedna fosforylace je na aminokyselině Ser1387. Takto aktivovaný protein BRCA1 působí jako regulátor v intra-s-fázovém kontrolním bodu buněčného cyklu. Dále ATM fosforyluje BRCA1 na aminokyselině Ser1423 a tím se urychluje zapojení BRCA1 proteinu v G2/M 24

25 kontrolním bodě buněčného cyklu. Fosforylace na různých místech proteinu BRCA1 může přímo ovlivnit procesy v různých drahách. Protein ATM aktivuje také CHK2 kinázu, která může ještě dále fosforylovat molekulu BRCA1 (Xu, 2002). ATM může na dvou aminokyselinových zbytcích fosforylovat i CtIp (inhibitor BRCA1). CtIp inhibuje funkci a další stimulaci BRCA1 (Li, 2002). ATM a NBS1 Protein ATM fosforyluje i protein NBS1 (Obr.5), který je součástí multifunkčního komplexu MRE11-RAD50-NBS1 (MRN) (Lim, 2000; Zhao, 2000; Gatei, 2000). Tento komplex je také zahrnut do reparací DSBs (D Amours, 2002). ATM fosforyluje protein NBS1 na několika místech na aminokyselinách Ser343 a Ser278. Tyto fosforylace hrají důležitou roli v kontrolním bodě buněčného cyklu nacházejícího se v S-fázi (Zhao, 2000; Gatei, 2000). ATM a SMC1 Dalším substrátem, který protein ATM fosforyluje v kontrolním bodě v S-fázi buněčného cyklu, je protein SMC1 (Structural Maintence of Chromosomes 1). Tento protein, který byl původně znám jako protein podílející se na soudržnosti sesterských chromatid, je fosforylován ATM na dvou serinových zbytcích, a podílí se na vypnutí kontrolního bodu v S-fázi buněčného cyklu (Kim, 1999; Yazdi, 2002). ATM a FANCD2 Jiným identifikovaným efektorem ATM v kontrolním bodě v S- fázi buněčného cyklu je protein FANCD2, který ATM fosforyluje na aminokyselině Ser222, po vzniku DSBs a po předchozí ubiquitinylaci zprostředkované BRCA1 (Taniguchi, 2002). Protein FANCD2 je členem multiproteinového komplexu, který je porušený při dalším syndromu genomové nestability Fanconiho anemii. ATM a kinázy CHK1 a CHK2 Kinázy CHK2 a CHK1 (jsou aktivovány ATM/ATR) také ovlivňují kontrolní body buněčného cyklu. Obě fosforylují fosfatázu CDC25A v kontrolním bodě buněčného cyklu a ta je pak degradována (Mailand, 2000; Falck, 2001; Falck, 2002; Mailand, 2002; Zhao, 2002). Úkolem proteinu CDC25A je defosforylace CDK2 a 25

26 CDK1 (cyklindepedentních kináz). CDK2 a CDK1 jsou aktivní v defosforylovaném stavu. Kináza CDK2 řídí přechod mezi G1 a S-fází a celou S-fázi buněčného cyklu. CDK1 řídí přechod z G2-fáze buněčného cyklu do mitosy. Destrukce proteinu CDC25A ovlivňuje přechod mezi G1 a S-fází, S-fázi a přechod mezi G2 a M-fází buněčného cyklu (Obr.5). Dráha vedoucí přes protein CDC25A ovlivňující přechod mezi G1-S fází buněčného cyklu je rychlá a není závislá na aktivaci genu a syntéze proteinu p53 (Falck, 2002). Další substráty ATM ATM působí i na další protein kinázy, které jsou zároveň samy schopny ovlivnit další efektory, a tak kontrolovat podskupiny drah buněčného cyklu. Např. CHK2-kináza také fosforyluje p53, BRCA1, CDC25A a CDC25C (McGowan, 2002; Bartek, 2001) (Obr. 5). Dráha CHK2-CDC25C je podobná dříve zmíněné dráze CHK2-CDC25A, ale působí jako náhradní v řízení přechodu buňky mezi G2 a M- fází buněčného cyklu. Fosforylace CDC25C, zprostředkovaná CHK2, je důležitá pro vyvázání CDC25C proteinu v cytoplazmě. Volný CDC25C protein brání aktivaci CDK1. Gen CHK2, který kóduje tento protein, hraje pravděpodobně roli tumorsupresorového genu u pacientů s nádory u syndromu Li-Fraumeni (Bell, 1999; Sodha, 2002). Germinální mutace v CHK2 genu je řazena mezi mutace nacházející se u familiárních nádorů prsu (Meijers-Heijboer, 2002; Vahteristo, 2002). Somatické mutace v genu CHK2 byly nalezeny i v různých sporadických solidních nádorech (Khosravi, 1999; Ashcroft, 1999). Dalším substrátem ATM je protein genu RAD17. Ten je fosforylován v ATM/ATR dráze na dvou serinových zbytcích. Tato fosforylace byla prokázána v různých laboratořích a bylo zjištěno, že je důležitá pro správnou funkci kontrolních bodů buněčného cyklu G1/S a G2/M (Bao, 2001; Post, 2001). Tento protein se zapojuje v časné fázi odpovědi na DSBs a je součástí trimolekulárního komplexu na DNA, který sestává z lidských proteinů podobných kvasničným Rad9, Hus1 a Rad1 (komplex 9-1-1). Tento komplex je málo stabilní, a pravděpodobně funguje jako sensor pro poškození DNA (Thelen, 1999; Venclovas, 2000; Rauen, 2000; Roos- Mattjus, 2002). I další dva proteiny účastnící se v tomto procesu - RAD17 a RAD9 - jsou také fosforylovány ATM/ATR depedentním způsobem (Bao, 2001; Post, 2001; Chen, 2001) (Obr. 5). 26

27 Další procesy probíhající v buňce po aktivaci ATM Po vzniku DSB je signál o poškození DNA zesílen cyklickým procesem více, než by se stalo sérií kroků v lineární hirearchii. Funkce H2AX Vznik DSBs na DNA iniciuje masivní fosforylaci konců histonových proteinů H2AX (Redon, 2002). Fosforylované H2AX vznikají rychle na DSBs místech a jejich vznik je nezbytný pro další posílení (aktivaci) reparačních genů, jako je MRN-komplex, RAD51 a BRCA1 (Celeste, 2002). Fosforylace H2AX patří mezi prvotní reakce, které probíhají v kaskádě reakcí vyvolaných DSBs; a byla popsána jako ATM depedentní (Burma, 2001). Fosforylace H2AX může být i ATR depedentní, a pak je indukována pokud jsou obtíže při replikaci (Ward, 2001). Fosforylace H2AX může sloužit jako rychlý a účinný mechanismus pro zesílení signálů poškození cestou opakovaných cyklů fosforylace H2AX i jako posílení tvorby ostatních faktorů účastnících se v procesech odpovědi na poškození DNA. Tak se do místa poškození mohou dostat další přenašeče informace o poškození společně s reparačními proteiny. NMR-komplex K dalšímu zesílení signálu může dojít fosforylací některých substrátů ATM. Protein NBS1, sám substrát ATM, slouží jako adaptor (protein, který pomáhá) ve fosforylaci jiných substrátů ATM, jako je CHK2 (Buscemi, 2001; Girard, 2002) a SMC1 (Kim, 2002; Yazdi, 2002), zvláště při malém poškození DNA. V tomto mechanismu je nutná fosforylace jednoho substrátu, aby mohlo dojít k fosforylaci jiných substrátů. Tuto roli má NBS1 v MRN-komplexu. Celý MRN-komplex se účastní v časných stádiích odpovědi na poškození DNA (D Amours, 2002). 53BP1 Jiný protein, který umožňuje fosforylaci některých substrátů ATM je 53BP1. Tak jako NBS1, tak i 53BP1 obsahuje doménu BRCT (BRCA1 C-terminal). Vyskytuje se v jádře, v oblastech s DSBs, a je potřebný pro správnou aktivaci 27

28 některých kontrolních bodů buněčného cyklu. Je také sám substrátem pro protein ATM (DiTullio, 2002; Fernandez-Capetillo, 2002; Wang, 2002). Další protein obsahující BRCT je protein NFBD2. Má podobné vlastnosti jako 53BP1 (Peng, 2003; Shang, 2002; Xu, 2002). Vztahy mezi ATM a těmito třemi substráty ATM umožňují vznik nových drah pro šíření signálu o poškození DNA. V těchto drahách má několik proteinů více než jednu roli. RAD51-asociovaný komplex Buňky A-T vykazují defekty v reparaci DSBs. Jsou připisovány suboptimálním sestavením a funkci RAD51-asociovaného proteinového komplexu na opravy DSBs (Chen, 1999; Morrison, 2000). Aktivace této dráhy je spojena s fosforylací proteinů RAD51 a RAD52 ABL-tyroxin kinázou (Chen, 1999; Yuan, 1998; Kitao, 2002), která přímo interaguje s ATM a je aktivována ATM depedentním způsobem po indukci DSBs (Shafman, 1997; Baskaran, 1997; Shangary, 2000). Po poškození DNA je nutná rychlá odezva na toto poškození. Zároveň je potřeba řada funkčních interakcí mezi proteiny. Proto tyto důležité proteiny zůstávají v buňce trvale v těsné fyzické blízkosti. V lidských buňkách byl identifikován velký komplex obsahující BRCA1, ATM a mnoho dalších reparačních proteinů (Wang, 2000). Fyzické interakce uvnitř komplexu jsou pravděpodobně dynamické a reagují rychle na poškození DNA. Příkladem je interakce mezi dvěma členy reakce na poškození BRCA1 a ABL. Tento komplex se rychle rozpadá po poškození DNA ATM dependentním způsobem (Foray, 2002). Transkripční faktor E2F1 Poškození DNA ovlivňuje genovou expresi. Jeden z hlavních cílů ATM je transkripční faktor, protein p53. Jiným transkripčním faktorem, který ATM fosforyluje a stabilizuje, je E2F1. Tento protein hraje centrální roli v kontrole buněčného cyklu (Lin, 2001). Dráha odpovídající na stres (stres-response pathway) je aktivována ATM independentním způsobem prostřednictvím transkripčního faktoru NF-κB anebo mitogen-activated protein kinázy. Součástí této dráhy je ale také část reagující na poškození DNA (Pearce, 2001). Pokud je dráha odpovídající na stres aktivována 28

29 DSBs, odpověď se stává ATM dependentní (Bar-Shira, 2002; Wang, 2000; Li, 2001). Přesné propojení ATM s touto dráhou není zatím objasněno ATM a poškození nezávislé na genomové stabilitě ATM pomáhá udržovat genomovou stabilitu i jinými mechanismy než těmi, které reagují na DSBs, způsobené škodlivými agens. Buňky A-T (buňky od pacientů s A-T syndromem) mají abnormálně zkráceny telomery a vykazují i další změny, jako abnormální spojování konců chromozómů, shlukování telomer a změněné interakce mezi telomerami a nuklearní matrix (Pandita, 2001). ATM se funkčně podílí na procesech udržování délky telomer a integrity chromozómů. Tyto procesy jsou důležité při stárnutí buněk a vzniku nádorů (Pandita, 2001; Maser, 2002; Kim, 2002; Chan, 2002). ATM možná v tomto případě spíše plynule reaguje na pokračující změny v buňkách, než že by náhle a silně zareagoval na akutní poruchu (Karlseder, 1999). Funkční vztahy mezi ATM a systémem udržujícím délku telomer byl osvětlen ve studii, kde byla použita myš bez ATM genu a telomerázových RNA součástí (Wong, 2003). Tato zvířata vykazovala zvýšenou genomickou nestabilitu, zrychlené stárnutí, předčasnou smrt a také celkovou zvýšenou proliferaci. Očekávala se vyšší míra T-buněčných malignit, ale to se neprokázalo. Substrát ATM dependentních fosforylací v systému, který udržuje telomery, je TRF1. TRF1 negativně reguluje prodlužování telomer a jeho fosforylace potlačuje TRF1 zprostředkovanou apoptósu vyvolanou poškozením DNA (Kishi, 2001). Inhibice TRF1 v A-T buňkách chrání buňku před zkracováním telomer a snižuje radiosenzitivitu těchto buněk. Je to další důkaz propojení mezi telomerázovým metabolismem a odpovědi na poškození DNA (Kishi, 2002). ATM je aktivní i v místech pravidelně se vyskytujících zlomů a znovuspojení DNA. Přítomnost molekul ATM byla zjištěna v místech V(D)J rekombinací (Perkins, 2002). ATM fosforyluje protein p53, který se pak vyskytuje v místech V(D)J rekombinací, což dokazuje, že ATM nepřetržitě dohlíží na V(D)J rekombinační proces, a může vyvolat odpověď na poškození DNA, pokud není V(D)J rekombinační proces zastaven včas. Důkazem jsou A-T pacienti, u kterých absence této kontroly způsobuje častý výskyt translokací v genech pro 29

30 imunoglobuliny a pro receptory T- buněk. Tyto translokace často upozorňují na počátek lymfoidní malignity (Xu, 1999) Syndromy genomové instability Ataxia telagienctasia je řazena do nemocí tzv. syndromů genomové instability. Příčinou syndromů genomové instability jsou chybné odpovědi na specifická poškození DNA. U klinicky podobných syndromů byly nalezeny poškozené proteiny, které nemohou interagovat s dalšími proteiny. Příkladem jsou nemocní A-T a nemocní s chybami v různých proteinových členech MRN-komplexu (Nijmegen breakage syndrom, A-T-like disease, Fanconiho anemie). Nijmegen breakage syndrom (NBS) Jeden z členů MRN-komplexu je NBS1 protein. Ten je substrátem pro protein ATM v dráze intra-s kontrolního bodu buněčného cyklu (Obr. 5). Gen, který ho kóduje, je mutován u pacientů s Nijmegen breakage syndromem (NBS) (Tauchi, 2002). Onemocnění NBS je charakterizováno imunodeficiencí, mentální deficiencí, genomovou instabilitou, radiosenzitivitou a akutní predispozicí k lymfoidním malignitám. Fenotyp NBS se překrývá s fenotypem A-T, s důležitou výjimkou, že u pacientů s NBS se nevyskytuje cerebelární degenerace. U pacientů s fenotypem NBS byla nalezena mutace i v dalším členu MRN-komplexu, a to v RAD50. A-T-like disease (ATLD) Nemocní s A-T-like disease (ATLD) vykazují fenotyp, který je blízký fenotypu A-T (Stewart, 1999). Pacienti mají mutovaný MRE11 gen. U pacientů s ATLD se rozvíjí mnoho znaků A-T, i když onemocnění se projeví až v pozdějším věku, a s pomalejší progresí. Různé fenotypy, které jsou spojovány s deficiencemi v NBS1 a MRE11, mohou signalizovat, že tyto dva proteiny mají specifickou roli v dráze odpovědi na poškození DNA, ale s různým funkčním propojením na ATM. Kromě toho podobnost mezi A-T a ATLD zvyšuje pravděpodobnost, že chyba v MRE11 může ovlivnit aktivaci ATM, a tak způsobit chybnou fosforylaci ATM substrátů. 30

31 Fanconiho anemie (FA) ATM je funkčně spojen s MRN-komplexem i u Fanconiho anemie (FA). Spojení ATM-FANCD2 (Obr. 5) propojuje systém odpovědí na DSBs s FAkomplexem. FA-komplex se zapojuje v odpovědi na vznik vnitrořetězcových propojení v DNA (Joenje, 2001; D Andrea, 2003). MRN-komplex se podílí jak na reparaci DSBs, tak i na odpovědi na vznik příčných vazeb (crosslinks) v DNA. Buňky u pacientů s FA jsou stejně jako buňky pacientů s NBS hypersenzitivní nejen k činitelům indukujícím DSBs, ale také k chemikáliím, které indukují meziřetězcové spoje (Nakanishi, 2002). Do odpovědi na toto poškození se zapojuje MRN-komplex spolu s některými proteiny FA (Nakanishi, 2002; Pichierri, 2002). Bloomův syndrom ATM fosforyluje také protein BLM, DNA helikázu, která je poškozena při Bloomově syndromu (Beamish, 2002). Protein BLM je po zastavení replikace fosforylován prostřednictvím ATR. Přemístění MRN-komplexu do místa zastavení replikace vyžaduje funkční protein BLM (Franchitto, 2002). Je to důkaz významného funkčního spojení mezi oddělenými dráhami, které se společně podílejí na komplexní odpovědi na poškození DNA. 31

32 Cíl práce Geny predisponující ke vzniku maligní transformace přestavují skupinu protoonkogenů, supresorových genů a genů udržujících stabilitu genomu, neboli reparačních genů. Většina predisponujících genů řídí buněčné procesy úzce spojené s diferenciací, proliferací, dělením, buněčnou smrtí, odpovědí buňky na poškození DNA a reparací poškození genomu. Nádory prsu představují jednu z nejvýznamnějších malignit vůbec. Objev genů, jejichž konstituční mutace/inaktivace výrazně disponuje k malignitám, jako např. BRCA1 nebo BRCA2, znamenal pokrok v pochopení mechanismů maligní transformace, ale také možnost individuální predikce rozvoje mammárních karcinomů. Nezávislé studie ukazují, že v chromosomální oblasti cytogenicky definovaných proužků 11q22-q23 existuje jeden nebo více genů, které mohou predisponovat ke vzniku nádoru prsu. Analýza alelických imbalancí polymorfních lokusů naznačuje, že u sporadických nádorů prsu dochází ke ztrátě heterozygozity častěji než v jiných chromosomálních úsecích (Kerangueven, 1997; Laake, 1997). I když se snahy o deleční mapování nesetkaly s úspěchem při přesné identifikaci genomické oblasti, podařilo se oblast zúžit na velikost několika milionů párů bazí, které pravděpodobně obsahují predispoziční gen. Další podporu existence predisponujícího genu přinesly výsledky prací, v nichž byl do nádorových buněk vnesen relevantní genomický úsek, např. jako yeast artificial chromosome (Koreth, 1999). Po vnesení série genomických fragmentů do transformovaných buněk in vitro došlo k supresi nádorového růstu, která naznačuje existenci supresorického genu ve vnesené oblasti. Důležitost tohoto úseku pro vznik nádorů prsu podporuje i popis konstitučních chromosomálních translokací zahrnujících dlouhé rameno chromosomu 11 u rodin s mammárními karcinomy (Limblom, 1994). I když několik kandidátních komplementárních DNA bylo analyzováno (Monaco, 1998; Luo, 1998), nebyl doposud identifikován cílový gen. Jedním z kandidátních genů, který se vyskytuje v chromozomální oblasti může být gen ATM. Gen je zodpovědný za odpověď buňky na poškození DNA a také ovlivňuje funkci kontrolních bodů buněčného cyklu. Tento gen je inaktivován u recesivního autosomálního genetického onemocnění člověka, které se nazývá Ataxia 32

33 telangiectasia (A-T). Mezi příznaky tohoto onemocnění patří i zvýšená predispozice ke vzniku nádoru a T- buněčné leukemie. Nemocní s A-T mají až 100x větší riziko vzniku nádoru. Tento objev se stal základem dalších studií A-T rodin (Janin, 1999; Inskip, 1999; Olsen, 2001; Geoffroy-Perez, 2001), kde bylo popsáno 3-7x vyšší riziko vzniku nádoru prsu pro příbuzné z A-T rodin. Na základě počátečních odhadů výskytu A-T nosičů (A-T heterozgot) v populaci kolem 1 % a 3x vyššího rizika vzniku nádoru prsu u těchto nosičů, bylo odhadnuto, že A-T heterozygoti mohou tvořit až 5 % všech případů nádorů prsu (Easton, 1994). Byly vytipovány dvě mutace, které by mohly být predisponující pro nádor prsu s podobným rizikem jako mutace v genu BRCA1 a genu BRCA2. Je to mutace ATM 7271T>G a ATM IVS10-6T>G (Stankovic, 1998; Broeks, 2000). Byly stanoveny dva cíle práce: 1. cílem práce bylo pokusit se zjistit, zda tyto mutace (ATM 7271T>G a ATM IVS10-6T>G) opravdu zvyšují riziko vzniku nádoru prsu. Výskyt těchto mutací byl testován v genomické DNA od pacientek a nádorem prsu, u kterých nebyly prokázány patologické mutace v BRCA1 a BRCA2 genu. 2. cílem práce bylo pokusit se vyhledat další mutace v genu ATM, které by mohly být predisponující pro nádor prsu. Mutace byly vyhledávány ve vzorcích s LOH v oblasti 11q22-q23. Pro vyhledávání nových mutací (screening vzorků) bylo nutno zoptimalizovat metodu PCR-SSCP tak, aby její citlivost byla co nejvyšší. 33

34 2. MATERIÁL A METODY 2.1. DETEKCE MUTACÍ Detekce mutace ATM 7271T>G Vyšetřované skupiny Vyšetřovanou skupinu tvořily ženy z české populace. Byla použita DNA izolovaná z krve od žen s nádorem prsu, které byly diagnostikovány na Masarykově onkologickém ústavu v Brně. U těchto pacientek se nevyskytoval nádoru prsu v rodinné historii. Ve vzorcích nebyly prokázány mutace v genech BRCA1 a BRCA2. Věkový průměr pacientek byl 52,3 let (s rozmezím let). Celkem bylo použito 272 vzorků DNA. Z toho 207 vzorků pocházelo od pacientek s duktálním nádorem prsu a 65 vzorků od pacientek s lobulárním nádorem prsu. Jako kontrola bylo použito 88 vzorků DNA izolované z krve od žen z české populace. Tyto ženy byly dárkyně krve a pocházely z Moravy ze spádové oblasti Masarykova onkologického ústavu. Věk těchto žen byl nižší než 40 let. Ani u kontrolní skupiny se nevyskytoval nádor prsu v rodinné historii a rovněž vyšetření patogenních mutací v BRCA1 a BRCA2 bylo negativní. Vyšetření mutací v BRCA1 a BRCA2 genech bylo provedeno ve Švédsku Karolinska Hospital, Department of Clinical Genetics, Stockholm (Dr. A. Lindblom). Byla testována DNA izolovaná z krve. Z genu BRCA1 byl testován exon 11 použitím PTT (protein trunction test) a ostatní exony byly analyzovány metodou SSCP, CDGE a sekvenováním. V genu BRCA2 byly exony 10 a 11 testovány použitím PTT a pro analýzu ostatních exonů byla použita RNA a metoda sekvenování. Odběr vzorků Vzorky krev byla odebrána do EDTA. Rozplněna po 1 ml, označena a poté uložena při - 20 o C. 34

35 Izolace DNA z krve 1. Krev od pacientek byla rozmražena 2. DNA byla izolována z 2 x 200 µl krve od každé pacientky za použití soupravy QIAamp DNA Blood Mini Kit (Quiagen) dle přiloženého návodu 3. Vždy byly izolovány 2 vzorky (po 200 µl) od každé pacientky 4. Ve vzorcích byla stanovena koncentrace izolované DNA a čistota izolované DNA (UV-spektrofotometr Perkin Elmer) (poměr A 260 a A 280 musel být v rozmezí 1,7-1,9) 5. Koncentrace DNA byly upraveny na koncentraci 20 ng/µl přidáním potřebného množství 1x TE pufru 6. Vzorky DNA byly uchovávány při - 80 o C ROZTOKY A CHEMIKÁLIE 0,5M EDTA ph=8,0 EDTA (Sigma) 93 g NaOH (Fluka) 8 g Doplnit deionizovanou vodou do 500 ml EDTA a NaOH se pečlivě nechaly rozpustit ve 450 ml vody, bylo upraveno ph = 8,0 a roztok byl doplněn deionizovanou vodou na objem 500 ml. Roztok byl uchováván při 4 o C po dobu 1 měsíce. 1M Tris HCl (ph = 7,8) Tris (Fluka) 24,2 g HCl (Fluka) 4 ml Doplnit deionizovanou vodou do 200 ml Tris se rozpustil ve 180 ml vody, byla přidána HCl, upraveno ph=7,8 a roztok byl doplněn na objem 200 ml. Roztok byl uchováván při 4 o C po dobu 1 měsíce. 10x TE pufr (ph=8,0) 0,5 M EDTA 100 ml 1 M Tris 100 ml Oba roztoky byly smíchány v poměru 1:1 a ph bylo upraveno na hodnotu ph=8,0. 35

36 Tento roztok je 10x koncentrovaný (byl rozplněn a uchováván při 20 o C po neomezeně dlouhou dobu). Pro pracovní pužití byl pufr naředěn 1:9 sterilní Milli-Q vodou (naředěný pufr byl autoklávován 120 o C/20 min. a ihned spotřebován) PCR 1. Byla namíchána směs pro PCR reakci pro potřebné množství vzorků 2. Směs byla rozpipetována do označených PCR zkumavek (Perkin Elmer) po 20 µl 3. Do každé označené zkumavky se směsí pro PCR byl přidán vzorek DNA (5 µl = 100 ng DNA) 4. Zkumavky byly umístněny do přístroje (thermocycler) GeneAmp PCR 9600 (Perkin Elmer) s vyhřívaným víkem 5. Byla provedena PCR reakce dle podmínek: Program: Počet cyklů 94 o C/5 minut 1x 94 o C/20 sekund 55 o C/20sekund 72 o C/20 sekund 35x 72 o C/5 minut 1x 6. Kontrola PCR produktů byla provedena na 2% agarózovém gelu Postup pro přípravu 2% agarózového gelu pro kontrolu PCR produktů 1. Navážená agaróza byla vsypána do Erlenmayerovy baňky (100ml) 2. Byl přilit 10x TBE pufr a voda 3. Směs byla promíchána a zahřáta v mikrovlnné troubě až se agaróza rozpustila a nebyly v ní žádné bubliny 4. Rozpuštěná agaróza se nechala mírně zchládnout 5. Přidal se ethidium bromid a agaróza se opatrně zamíchala 6. Roztok agarózy se vlil do připravené nalévací vany pro horizontální ELFO s připraveným hřebenem pro vzorky a nechal se ztuhnout 36

37 7. Ztuhlý agarózový gel se vyjmul z nalévací vany, byl odstraněn hřeben a gel byl vložen do vany pro horizontální ELFO 8. Přilil se 1x TBE pufr (takové množství, aby byl gel zcela ponořen) 9. Na gel byly naneseny vzorky v objemu 5 µl (které se před nanášením smíchaly se vzorkovým pufrem pro agarózové ELFO v poměru 5:1) 10. Do jedné dráhy v gelu byl nanesen velikostní standard v objemu 3 µl 11. Byla spuštěna elektroforéza - za podmínek 75 V, po dobu 30 minut (horizontální elektroforéza Bio-Rad) 12. Po proběhnutí elektroforézy byl přístroj vypnut, gel vyjmut a opláchnut deionizovanou vodou 13. Gel byl vizualizován na transluminátoru - vyfotografován (KODAK 1D Image Analysis Software) ROZTOKY A CHEMIKÁLIE Primer Byl použit speciální primer, kde je AGGA místo je rozeznáváno restrikčním enzymem Forward TGAAAAGAGCCAAAAGGAAG Reverse TAACTGGTGAACATAAAATTGTCAC Velikost PCR produktu : 101 (bp) T a 55 o C Směs pro PCR reakci na 1 vzorek 20 µl PCR směsi obsahuje: 10x PCR Buffer (Amersham Pharmacia) 2,5 µl MgCl 2 [25 mm] (Perkin Elmer) 1,5 µl Směs dntp [100 mm] (Perkin Elmer) 0,5 µl Primer F [5 µm] (Oligo Genset) 1 µl Primer R [5 µm] (Oligo Genset) 1 µl TAQ polymerasa 5UI (Perkin Elmer) 0,12 µl Sterilní Milli-Q voda 13,4 µl 37

38 + Vzorek DNA [20 ng/µl] 5 µl Agarózový gel 2% Agaróza (Serva) 1 g 10x TBE 4,5 ml Ethidium bromid (Top-Bio) 10 µl Doplnit deionizovanou vodou do 50 ml 1% Roztok bromfenolové modři Bromfenolová modř (Sigma) 100 mg Deionizovaná voda 10 ml Barva byla rozpuštěna a přefiltrována přes filtr 0,4 µm (Millipore). Byla uchovávána při 4 o C po neomezeně dlouhou dobu. 1% Roztok xylencyanolu Xylencyanol (Sigma) 100 mg Deionizovaná voda 10 ml Barva byla rozpuštěna a přefiltrována přes filtr 0,4 µm (Millipore). Byla uchovávána při 4 o C po neomezeně dlouhou dobu. Vzorkový pufr pro agarózové ELFO 1% roztok bromfenolové modři 250 µl 1% roztok xylencyanolu 250 µl Glycerol (Fluka) 300 µl Deionizovaná voda 200 µl Velikostní standard HyperLadder IV (Bioline) 3 µl 38

39 10x TBE (Tris borátový pufr) ph = 8,3 Kys. boritá (Fluka) 61,8 g Tris (Sigma) 121 g EDTA (Sigma) 7,5 g Doplnit deionizovanou vodou do 1000 ml Všechny chemikálie se rozpustily, bylo upraveno ph = 8,3. Roztok byl uchováván při 4 o C po dobu 1 měsíce. Pro ELFO se používá ředěný 1: 10 (1x TBE) RFLP Pozitivní kontrola byla poskytna Dr. I. Vořechovským (Department of Biosciences at NOVUM, Karolinska Instituet, Huddinge, Švédsko) Postup pro štěpení vzorků: 1. Byla namíchána směs pro štěpení podle množství analyzovaných vzorků, enzym byl vmíchán jako poslední (až do doby těsně před použitím byl enzym uložen při -20 o C) 2. Do označených sterilních PCR zkumavek (Perkin Elmer) bylo napipetováno 23 µl směsi pro štěpení. Do každé zkumavky byl přidán vzorek - PCR produkt (2 µl) 3. Uzavřené zkumavky se nechaly inkubovat při 37 o C po dobu 2-3 hodiny (v termocycleru GeneAmp PCR 9600 (Perkin Elmer) 4. Kontrola produktů po štěpení byla provedena na 4,5% agarózovém gelu Postup pro přípravu 4,5% agarózového gelu a agarózové ELFO pro detekci produktů po štěpení restrikčním enzymem 1. Navážená agaróza byla vsypána do Erlenmayerovy baňky (100ml) 2. Byl přilit 10x TBE pufr a voda 3. Směs byla promíchána a zahřáta v mikrovlnné troubě až se agaróza rozpustila a nebyly v ní žádné bubliny 4. Rozpuštěná agaróza se nechala mírně zchládnout 5. Přidal se ethidium bromid a agaróza se opatrně zamíchala 39

40 6. Roztok agarózy se vlil do připravené nalévací vany pro horizontální ELFO s připraveným hřebenem pro vzorky a nechal se ztuhnout 7. Ztuhlý agarózový gel se vyjmul z nalévací vany, byl odstraněn hřeben a gel byl vložen do vany pro horizontální ELFO 8. Přilil se 1x TBE pufr (takové množství, aby byl gel zcela ponořen) 9. Na gel byly naneseny vzorky v objemu 5 µl (které se před nanášením smíchaly se vzorkovým pufrem pro agarózové ELFO v poměru 5:1) 10. Do jedné dráhy v gelu byl nanesen velikostní standard v objemu 3 µl 11. Byla spuštěna elektroforéza - za podmínek 50 V, po dobu 30 minut (horizontální elektroforéza Bio-Rad) 12. Po proběhnutí elektroforézy byl přístroj vypnut, gel vyjmut a opláchnut deionizovanou vodou 13. Gel byl vizualizován na transluminátoru - vyfotografován (KODAK 1D Image Analysis Software) Postupy a soupis roztoků a chemikálií pro přípravu vzorkového pufru pro agarózové ELFO (gel pro detekci produktů po štěpení restrikčním enzymem), přípravu 10x TBE pufru a agarózového ELFO jsou uvedeny v kapitole ROZTOKY A CHEMIKÁLIE Roztok BSA (bovinní sérový albumin) c = 1mg/ml BSA (Invitrogen) 1 mg Sterilní Milli-Q voda 1 ml BSA se nechal rozpustit (byl uchováván zamražený při dlouhou dobu) -20 o C po neomezeně Směs (23 µl ) pro 1 vzorek pro štěpení Restrikční enzym Mnl I (New England Biolabs) 2,5 U (0,5 µl) 10 x New England Biolabs buffer 2 2,3 µl (New England Biolabs) Roztok BSA (koncentrace 1mg/ml) 2,5 µl Sterilní Milli-Q voda 18 µl 40

41 + PCR produkt (vzorek) 2 µl Agarózový gel 4,5% Agaróza (Serva) 2,25 g 10x TBE 4,5 ml Ethidium bromid (Top-Bio) 10 µl Doplnit deionozovanou vodou do 50 ml Detekce mutace ATM IVS10-6T> G Vyšetřované skupiny Byly použity stejné vzorky jako pro detekci mutace 7271T>G. Soubor byl navíc rozšířen o dalších 18 vzorků DNA izolované z krve.věkový průměr pacientek byl v tomto souboru 54,7 let (s rozmezím let). Celkem bylo použito 291 vzorků DNA. Z toho 225 vzorků pocházelo od pacientek s duktálním nádorem prsu a 66 vzorků od pacientek s lobulárním nádorem prsu. Jako kontrolní skupina byl použit stejný soubor vzorků DNA od dárkyň krve jako při testování mutace 7271T>G. Vyšetření na mutace v BRCA1 a BRCA2 genech u 18 nových vzorků bylo rovněž provedeno ve Švédsku - Karolinska Hospital, Department of Clinical Genetics, Stockholm (Dr. A. Lindblom) za použití stejných metod. Postupy a soupis roztoků a chemikálií pro odběr vzorků a izolaci DNA z krve jsou uvedeny v kapitole

42 PCR 1. Byla namíchána směs pro PCR reakci pro potřebné množství vzorků 2. Směs byla rozpipetována do označených PCR zkumavek (Perkin Elmer) po 20 µl 3. Do každé označené zkumavky se směsí pro PCR byl přidán vzorek DNA (5 µl = 100 ng DNA) 4. Zkumavky byly umístněny do přístroje (thermocycler) GeneAmp PCR 9600 (Perkin Elmer) s vyhřívaným víkem 5. Byla provedena PCR reakce dle podmínek: Program: Počet cyklů 94 o C/5 minut 1x 94 o C/20 sekund 53 o C/20sekund 72 o C/20 sekund 35x 72 o C/5 minut 1x 6. Kontrola PCR produktů byla provedena na 2% agarózovém gelu Postupy a soupis roztoků a chemikálií pro přípravu 2% agarózového gelu (pro kontrolu PCR produktů), vzorkového pufru pro agarózové ELFO, přípravu 10x TBE a agarózového ELFO jsou uvedeny v kapitole ROZTOKY A CHEMIKÁLIE Primer Forward ACAGCGAAACTCTGGCTCAAA Reverse TGATCTTTTATTACTTCCCAGCCTAGT Velikost PCR produktu : 193 (bp) T a 53 o C 42

43 Směs pro PCR reakci na 1 vzorek 20 µl PCR směsi obsahuje: 10x PCR Buffer (Amersham Pharmacia) 2,5 µl MgCl 2 [25 mm] (Perkin Elmer) 1,5 µl Směs dntp [100 mm] (Perkin Elmer) 0,5 µl Primer F [5 µm] (Oligo Genset) 1 µl Primer R [5 µm] (Oligo Genset) 1 µl TAQ polymerasa 5UI (Perkin Elmer) 0,12 µl Sterilní Milli-Q voda 13,4 µl + Vzorek DNA [20 ng/µl] 5 µl RFLP Pozitivní kontrola byla poskytnuta od Dr. Thilo Dörke (Department of Biochemistry and Tumor Biology, Clinic of Obstetrics and Gynecology, Medical School Hannover) Postup pro štěpení vzorků: 1. Byla namíchána směs pro štěpení podle množství analyzovaných vzorků, enzym byl vmíchán jako poslední (až do doby těsně před použitím byl enzym uložen při -20 o C) 2. Do označených sterilních PCR zkumavek (Perkin Elmer) bylo napipetováno 20 µl směsi pro štěpení 3. Do každé zkumavky byl přidán vzorek - PCR produkt (3 µl) 4. Uzavřené zkumavky se nechaly inkubovat při 37 o C po dobu 2-3 hodiny (v termocycleru GeneAmp PCR 9600 (Perkin Elmer) 5. Kontrola produktů po štěpení byla provedena na 2% agarózovém gelu Postupy a soupis roztoků a chemikálií pro přípravu 2% agarózového gelu (gel pro detekci produktů po štěpení restrikčním enzymem), vzorkového pufru pro agarózové ELFO, přípravu 10x TBE a agarózového ELFO jsou uvedeny v kapitole

44 ROZTOKY A CHEMIKÁLIE Roztok BSA (bovinní sérový albumin) c = 1mg/ml BSA (Invitrogen) 1 mg Sterilní Milli-Q voda 1 ml BSA se nechal rozpustit (byl uchováván zamražený při -20 o C po neomezeně dlouhou dobu) Směs (20 µl) pro 1 vzorek pro štěpení Restrikční enzym Rsa I ( Promega) 4 U (2,5 µl) 10 x Promega buffer C ( Promega) 2 µl Roztok BSA (koncentrace 1mg/ml) 2,5 µl Sterilní Milli-Q voda 13 µl + PCR produkt (vzorek) 3 µl 2.2. LOH (Loss of Hetrozygosity = Ztráta heterozygotnosti) Vyšetřovaná skupina Vzorky DNA byly získány od pacientek s nádorem prsu. Všechny nádory byly maligní karcinomy, které byly histopatologicky identifikovány a klasifikovány (věk, histotyp, stádium tumoru, estrogenový a progesteronový receptor). DNA byla vyizolována paralelně, jak z krve, tak z nádorové tkáně (byly použity nádorové tkáně z parafínových bločků). Celkem byly vzorky izolovány od 257 pacientek pocházejících z České republiky (poskytnuty z Masarykova onkologického ústavu v Brně) a Švédska (vzorky pocházely z Cancer Counseling Clinic, Karoliska Hospital, Stockholm a Huddinge University Hospitals, Stockholm). Z nádorové tkáně vyšetřené histopatologicky byly z oblastí s výskytem více než 80% nádorové tkáně odebrány vzorky pro izolaci DNA (za spolupráce MUDr. E.Jandákové MOU 44

45 Brno a Dr. A. Lindblom Karolinska Hospital, Department of Clinical Genetics, Stockholm, Švédsko) Ve vzorcích byla analyzována LOH v oblastech D11S927, D11S2179, D11S1347, D11S1345, D11S1391, D11S1778 a D11S Izolace DNA z krve Postupy a soupis roztoků a chemikálií pro odběr vzorků a izolaci DNA z krve jsou uvedeny v kapitole Izolace DNA z parafinových bločků Metoda byla prováděna ve spolupráci s Dr. Haixin Lei (Department of Biosciences at NOVUM, Karolinska Instituet, Huddinge, Švédsko). Pracovní postup byl poskytnut od Prof. Massimo Negrini (Jefferson Cancer Institute and Jefferson Cancer Center, Jefferson Medical College, Philadelphia, Pennsylvania, USA), kde byla metoda vyvinuta. 1. Parafínové bločky byly nařezány na řezy asi o rozměrech x 10 µm, z každého vzorku tkáně bylo provedeno řezů 2. Řezy (každý zvlášť) byly vloženy do sterilních mikrozkumavek o objemu 1,5 ml (Eppendorf) 3. Do každé mikrozkumavky byl přidán 1 ml xylenu 4. Mikrozkumavky byly inkubovány při teplotě 55 o C po dobu 15 minut 5. Vzorky byly zcentrifugovány po dobu 2 minut při maximálním výkonu - centrifuga MiniSpin (Eppendorf) 6. Byl odsát supernatant 7. Byl zopakován krok 3., 4., a Byl přidán asi 1,2 ml 100% etanolu 9. Vzorky byly inkubovány 15 minut při laboratorní teplotě 10. Vzorky byly centrifugovány po dobu 2 minut při maximálním výkonu - centrifuga MiniSpin (Eppendorf) 11. Byl odsát roztok etanolu 45

46 12. Byl zopakován krok 8., 9., 10. a Pelet se nechal usušit na vzduchu při laboratorní teplotě na dně otevřené mikrozkumavky 14. Ke vzorkům byl přidán 1ml štěpícho pufru s Proteinásou K (konečná koncentrace Proteinásy K by měla být 0,3 0,5 mg/ml, to znamená přídavek 25 µl zásobní Proteinásy K o koncentraci 20 mg/ml do 1 ml štěpícího pufru) 15. Vzorek se nechal inkubovat přes noc při teplotě 55 o C 16. Ke vzorku byla přidána další Proteinása K ve stejném množství jako v bodě 14 (to znamená asi 25 µl zásobní Proteinásy K o koncentraci 20 mg/ml), ale bez štěpícího pufru (předchozí roztok štěpícího pufru s Proteinásou K se neodstraňoval) 17. Vzorek se nechal inkubovat přes noc při teplotě 55 o C 18. Opakoval se krok 16. a K štěpící směsi se vzorkem bylo přidáno objemově stejné množství PCI roztoku (Amresco) asi 1 ml 20. Mikrozkumavky se centrifugují po dobu 2 minut při maximálním výkonu centrifugy MiniSpin (Eppendorf) 21. V mikrozkumavce vznikly 2 fáze. Pipetou byly odebrána vodní fáze a přenesena do nové mikrozkumavky 22. K vodní fázi byl opět přidán PCI roztok ve stejném objemu jako v bodě Byl opakován bod 20. a Z poslední vodní fáze z kroku č. 21 bylo do mikrozkumavky odebráno 330 µl 25. Dále bylo přidáno 165 µl amonium acetátu (7,5 M) a 1 až 1,2 ml 100% etanolu 26. Vzorky se nechaly inkubovat minimálně 2 hodiny (lépe přes noc) při 20 o C 27. Vzorky byly centrifugovány při G po dobu 20 minut při 4 o C (centrifuga Hettich - MICRO 22R) 28. Byl odstraněn roztok etanolu 29. Pelet se nechal usušit na vzduchu při laboratorní teplotě na dně otevřené mikrozkumavky 46

47 30. K suchému peletu bylo přidáno malé množství TE pufru (15-20 µl) a pelet se nechal rozpouštět přes noc při laboratorní teplotě, nebo 2 hodiny při teplotě 55 o C 31. Byly smíchány zkumavky z téhož vzorku 32. Ve vzorcích byla stanovena koncentrace vyizolované DNA a čistota vyizolované DNA (UV- spektrofotometr Perkin Elmer) (poměr A 260 a A 280 musel být v rozmezí 1,7-1,9) 33. Koncentrace DNA byly upraveny na koncentraci 20 ng/µl přidáním potřebného množství 1x TE pufru 34. Vzorky DNA byly uchovávány při - 80 o C ROZTOKY A CHEMIKÁLIE Xylen (Sigma) 50 ml Komerčně dodávaný roztok určený k přímému použití. Byl uchováván při laboratorní teplotě. 5M NaCl NaCl (Fluka) 146,1 g Deionizovaná voda 500 ml NaCl bylo rozpuštěno v 500 ml vody. Roztok byl uchováván při 4 o C po dobu 1 měsíce. 0,5 M EDTA (ph=8,0) EDTA (Sigma) 93 g NaOH (Fluka) 8 g Doplnit deionizovanou vodou do 500 ml EDTA a NaOH se nechaly pečlivě rozpustit ve 450 ml vody. Bylo upraveno ph = 8,0 a roztok byl doplněn deionizovanou vodou na objem 500 ml. Roztok byl uchováván při 4 o C po dobu 1 měsíce. 47

48 1M Tris HCl (ph=7,8) Tris (Fluka) 24,2 g HCl (Fluka) 4 ml Doplnit deionizovanou vodou do 200 ml Tris se nechal rozpustit ve 180 ml vody, byla přidána HCl a upraveno ph=7,8. Roztok byl doplněn deionizovanou vodou na objem 200 ml. Roztok byl uchováván při 4 o C po dobu 1 měsíce. 10% SDS SDS (Fluka) 10 g Deionizovaná voda 100 ml SDS se nechal rozpustit ve vodě. Roztok byl chováván se při laboratorní teplotě po dobu 3 měsíců. Štěpící pufr ph=8,0 (pufr pro Proteinásu K) 5M NaCl l4 ml 1M Tris-HCl l4 ml 0,5M EDTA 4 ml 10% SDS 5 ml Doplnit deionizovanou vodou do 100 ml Roztoky byly smíchány a objem byl doplněn do 100 ml.roztok byl připravován před každou izolaci vždy čerstvý. Před použitím byla do pufru přidána Proteinása K, tak aby byla v konečné koncentraci 0,3-0,5 mg/ml (přibližně 25 µl zásobní Proteinásy K o koncentraci 20 mg/ml do 1 ml štěpícího pufru). Proteinása K (Roche) Dodává se jako lyofilizát (byla naředěna na koncentraci 20 mg/ml sterilní Milli-Q vodou pro PCR, nechala se rozpouštět při 37 o C asi 1 hodinu, pak byla rozplněna do sterilních mikrozkumavek). Rozplněná Proteinása K byla uchovávána při 20 o C po dobu 3 let. 48

49 7,5M roztok ammonium acetátu Ammonim acetát (Merck) 116,7 g Deionizovaná voda 200 ml Ammonium acetát se nechal rozpustit ve 200 ml deionizované vody. Roztok byl uchováván při laboratorní teplotě po dobu 1 měsíce. 10x TE pufr (ph=8,0) 0,5 M EDTA 100 ml 1 M Tris 100 ml Oba roztoky byly smíchány v poměru 1:1 a ph bylo upraveno na hodnotu ph=8,0 Tento roztok je 10x koncentovaný (byl rozplněn a uchváván při 20 o C po neomezeně dlouhou dobu). Pro pracovní pužití byl pufr naředěn 1:9 sterilní Milli-Q vodou (naředěný pufr byl autoklávován 120 o C/20 min. a ihned spotřebován) Phenol:Chloroform: Isoamylalcohol S/P premixed - PCI (Amresco) 100 ml Komerčně dodávaný určený pro přímé použití. Byl uchováván 4 o C po neomezeně dlouhou dobu. Jedná se o směs: Fenol/chloroform/izoalmylalkohol v poměru 25:24:1 100% etanol (Fluka) 100 ml Byl uchováván při laboratorní teplotě PCR 1. Byla namíchána směs pro PCR reakci pro potřebné množství vzorků 2. Směs byla rozpipetována do označených PCR zkumavek (Perkin Elmer) po 20 µl 3. Do každé označené zkumavky se směsí pro PCR byl přidán vzorek DNA (5 µl = 100 ng DNA) 4. Zkumavky byly umístněny do přístroje (thermocycler) GeneAmp PCR 9600 (Perkin Elmer) s vyhřívaným víkem 49

50 5. Byla provedena PCR reakce dle podmínek: Podmínky PCR: primery pro D11S927, D11S2179, D11S1347 Program: Počet cyklů 94 o C/5 minut 1x 94 o C/20 sekund 56 o C/20sekund 72 o C/20 sekund 20x 72 o C/5 minut 1x Podmínky PCR: primery pro D11S1345, D11S1391, D11S1778 Program: Počet cyklů 94 o C/5 minut 1x 94 o C/20 sekund 54 o C/20sekund 72 o C/20 sekund 20x 72 o C/5 minut 1x Podmínky PCR: primer pro D11S1818 Program: Počet cyklů 94 o C/5 minut 1x 94 o C/20 sekund 52 o C/20sekund 72 o C/20 sekund 20x 72 o C/5 minut 1x 6. Kontrola PCR produktů byla provedena na 2% agarózovém gelu Postupy a soupis roztoků a chemikálií pro přípravu 2% agarózového gelu (gel pro kontrolu PCR produktů), vzorkového pufru pro agarózové ELFO, přípravu 10x TBE a agarózového ELFO jsou uvedeny v kapitole

51 ROZTOKY A CHEMIKÁLIE Primery Sekvence primerů a data pro optimalizace PCR byly poskytnuty Prof. Massimo Negrini (Jefferson Cancer Institute and Jefferson Cancer Center, Jefferson Medical College, Philadelphia, Pennsylvania, USA) D11S2179 Forward primer: TAGGCAATACAGCAAGACCCTG Reverse primer: GCACTGGAATACGATTCTAGCAC Velikost PCR produktu : 130 (bp) T a 56 o C D11S1778 Forward primer: TAACCTNCTACACAGTGTCGTT Reverse primer: GCTTCAGCAGAGAAGCCAT Velikost PCR produktu : (bp) T a 54 o C D11S1391 Forward primer: TGCATGCATACATACATACATACA Reverse primer: CATCCATCCCTCTGTCTCTG Velikost PCR produktu : (bp) T a 54 o C D11S1347 Forward primer: AGCTATGATTGCACCACTTC Reverse primer: GGTGTCCAAAGTTGTCACAT Velikost PCR produktu : (bp) T a 56 o C D11S1345 Forward primer: AGCTAAGATGTGCCACAGTAA Reverse primer: TCAGTGCTGAGCCCATATAT Velikost PCR produktu : (bp) T a 54 o C 51

52 D11S927 Forward primer: ATCTTTGGCTACACTGGGTC Reverse primer: TGCTCCGGTTTGGTTCAG Velikost PCR produktu : (bp) T a 56 o C D11S1818 Forward primer: AAAAATCTTTCCACTCCCTG Reverse primer: TATCTGTCACCGGTCTTCAC Velikost PCR produktu : 144 (bp) T a 52 o C Směs pro PCR reakci Pro primery markerů D11S1818, D11S1345, D11S µl PCR směsi obsahuje: 10x PCR Buffer (Amersham Pharmacia) 2,5 µl MgCl 2 [25 mm] (Perkin Elmer) 1,5 µl Směs dntp [100 mm] (Perkin Elmer) 0,5 µl [α 32 P] dctp [3000 Ci/mmol] 1 µci/reakci Primer F [5 µm] (Oligo Genset) 1 µl Primer R [5 µm] (Oligo Genset) 1 µl TAQ polymerasa 5UI (Perkin Elmer) 0,12 µl Sterilní Milli-Q voda 13,4 µl Vzorek DNA [20 ng/µl] 5 µl Pro primery markerů D11S927, D11S1347, D11S1391, D11S µl PCR směsi obsahuje: 10x PCR Buffer (Amersham Pharmacia) 2,5 µl MgCl 2 [25 mm] (Perkin Elmer) 2,5 µl Směs dntp [100 mm] (Perkin Elmer) 0,5 µl [α 32 P] dctp [3000 Ci/mmol] 1 µci/reakci Primer F [5 µm] (Oligo Genset) 1 µl Primer R [5 µm] (Oligo Genset) 1 µl TAQ polymerasa 5UI (Perkin Elmer) 0,12 µl 52

53 Sterilní Milli-Q voda 12,4 µl Vzorek DNA [20 ng/µl] 5 µl LOH v oblasti 11q22-q Příprava skel Pro ELFO byl použit přístroj Genomyx (Bekmann Coulter) určený pro sekvenaci s skel (37 x 63 cm). Tento přístroj byl použit jako elektroforéza i jako sušička gelů před radiovizualizací. Mezi skla byly vloženy spacery s tloušťkou 0,04cm. Pro vzorky byl použit hřebínek pro 64 vzorků o tloušťce 0,04 cm. Mytí skel 1. Skla byla umyta roztokem 1,5% Alkonoxu za použití mycí houbičky speciálně určené jen pro mytí skel na ELFO 2. Skla byla opláchnuta deionizovanou vodou 3. Skla byla opláchnuta etanolem 4. Skla se nechala uschnout při laboratorní teplotě Příprava spodního skla pro ELFO slouží k fixaci gelu (bylo nutno provést před každým ELFO) 1. Roztok Bind Silanu (asi 1ml) byl pomocí buničiny rovnoměrně nanesen na čisté spodní sklo pro ELFO 2. Sklo se nechalo zaschnout po dobu asi 4-5 minut při laboratorní teplotě 3. Ošetřené sklo se lehce otřelo etanolem (nesmí se tlačit) 4. Opět se sklo nechalo zaschnout při laboratorní teplotě příprava vrchního skla pro ELFO (bylo nutno provést před každým ELFO) 1. Roztok Repealu byl pomocí buničiny rovnoměrně rozetřen po vrchním skle pro ELFO 2. Sklo se nechalo zaschnout při laboratorní teplotě 53

54 ROZTOKY A CHEMIKÁLIE Mycí roztok 1,5% Alkonox Alkonox (Sigma) 3 g Deionizovaná voda 200 ml Alkonox byl rozpuštěn ve vodě. Pro urychlení byla použita míchačka. Roztok byl připravován před každým mytím skla. 10% Kyselina octová Kyselina octová -ledová (Fluka) 1 ml Deionizovaná voda 9 ml Obě komponenty byly smíchány. Roztok byl připravován vždy čerstvý. BIND-SILAN suspenze 96% Etanol (Fluka) 2 ml 10% Kyselina octová 0,5 ml Bind Silan (Pharmacia) 7,5 µl Všechny komponenty byly smíchány. Roztok byl vždy připravován čerstvý. Repael roztok (Pharmacia) Roztok je komerčně dodávaný a je určený k přímému použití Příprava vzorků na gel 1. Vzorky byly připravovány pro nanášení na gel až po přípravě gelu a připravovaly se znovu před každou analýzou. Nelze je připravit předem. 2. PCR produkt byl naředěn vodou pro PCR v poměru 1: µl naředěného PCR produktu bylo smícháno v PCR zkumavce s formamidovým pufrem v minimálním poměru 1:1 4. Vzorky byly zahřáty na teplotu 95 o C po dobu 3 minut v thermocycleru GeneAmp PCR 9600 (Perkin Elmer) s vyhřívaným víkem 54

55 5. Vzorky byly okamžitě po zahřátí zchlazeny ponořením do nádoby s vodou a ledem 6. Vzorky byly nanášeny na gel ROZTOKY A CHEMIKÁLIE 0,5M EDTA ph=8,0 EDTA (Sigma) 93 g NaOH (Fluka) 8 g Doplnit deionizovanou vodou do 500 ml EDTA a NaOH se pečlivě nechaly rozpustit ve 450 ml vody, bylo upraveno ph = 8,0 a roztok byl doplněn deionizovanou vodou na objem 500 ml. Roztok byl uchováván při 4 o C po dobu 1 měsíce. 1% Roztok bromfenolové modři Bromfenolová modř (Sigma) 100 mg Deionizovaná voda 10 ml Barva byla rozpuštěna a přefiltrována přes filtr 0,4 µm (Millipore). Byla uchovávána při 4 o C po neomezeně dlouhou dobu. 1% Roztok xylencyanolu Xylencyanol (Sigma) 100 mg Deionizovaná voda 10 ml Barva byla rozpuštěna a přefiltrována přes filtr 0,4 µm (Millipore). Byla uchovávána při 4 o C po neomezeně dlouhou dobu. Formamidový pufr Formamid (Pharmacia) 5 ml 0,5M EDTA 0,1 ml 1% roztok bromfenolové modři 0,25 ml 1% roztok xylencyanolu 0,25 ml Všechny součásti roztoku byly smíchány a roztok byl uchováván rozplněný po 1 ml při -20 o C po neomezeně dlouhou dobu. Rozmražený roztok už se znovu nepoužíval. 55

56 Polyakrylamidový gel a ELFO 1. Do deionizované vody byla vložena navážená urea 2. Roztok byl míchán na míchačce až do úplého rozpuštění urey. 3. Roztok se schladil v nádobě s ledem 4. Byl přidán 10x TBE pufr 5. Roztok byl přefitrován přes filtr s průměrem 0,4 µm (Millipore) 6. Byl přidán akrylamid 7. Směs byla odvzdušněna pod vakuuem 8. Byl přidán 10% APS a TEMED 9. Roztok byl opatrně promíchán a okamžitě vlíván do připravených skel ošetřených Bind silanem a Repealem 10. Byl vložen hřebínek (pro 64 vzorků o šířce 0,04 mm) a gel se nechal polymerizovat asi 1 hodinu při laboratorní teplotě 11. Skla s gelem byla vložena do přístroje pro sekvenaci Genomix (Beckmann Coulter) 12. Skla byla do přístroje připevněna a byly zapojeny elektrody 13. Do vrchní a spodní nádoby na pufr byl vlit 1x TBE pufr (přefiltrovaný) 14. Na gel byly naneseny připravené vzorky v objemu 3 µl (směs formamidového pufru a PCR produktu). Nanášení bylo provedeno velmi rychle. Nanášel se vedle sebe vždy vzorek DNA izolovaný z krve a vzorek izolovaný z nádorové tkáně od téhož pacienta. 15. Po nanesení vzorků se přístroj spustil pří výkonu 200 V a vzorky se nechaly zajet do gelu, pak byl přístroj přepnut na výkon 400 V. 16. Přístroj se nechal běžet až čelo vzorků doběhlo asi 10 cm od konce skla 17. Přístroj byl vypnut, skla s gelem vyjmuty 18. Pufry byly odstraněny do zvláštní nádoby pro radioaktivní odpad 56

57 ROZTOKY A CHEMIKÁLIE Roztok 10% APS APS (Fluka) 1 mg Deionizovaná voda 1 ml APS byl rozpuštěn ve vodě. Roztok byl vždy připravován čerstvý. 10x TBE (Tris borátový pufr) ph=8,3 Kys. boritá (Fluka) 61,8 g Tris (Sigma) 121 g EDTA (Sigma) 7,5 g Doplnit deionizovanou vodou do 1000 ml Všechny chemikálie se nechaly rozpustit, bylo upraveno ph = 8,3. Roztok byl uchováván při 4 o C po dobu 1 měsíce. Pro ELFO byl používán ředěný 1:10 (1x TBE) a přefitrovaný přes filtr 0,4 µm (Millipore). 6%-8% sekvenační gel s 8M UREOU (Samboorok, 1989) Urea (Gibco) 48 g 10x TBE 10 ml 10% APS 750 µl TEMED (Sigma) 50 µl Acrylamide/Bis Solution 40% (Bio Rad) ml (crosslinks ratio 37,5:1) Doplnit deionizovanou vodou do 100 ml Fixace a vizualizace gelu 1. Ze skel byl vyjmut hřebínek 2. Pomocí špachtle byla elektroforetická skla rozevřena a byly odstraněny spacery 3. Gel zůstal fixován na spodním skle (ošetřeném Bind Silanem) 4. Sklo s gelem bylo opatrně přemístěno do vany s fixačním roztokem (asi 1500 ml) 57

58 5. Gel se nechal fixovat po dobu 15 minut 6. Sklo s gelem bylo z vany vyjmuto a opět vloženo do přístroje Genomyx (Beckmann Coulter). Sklo bylo upevněno, připojeny elektrody a byl spuštěn program určený pro sušení gelů (gel na skle byl sušen při teplotě 80 o C po dobu asi 30 minut, pokud bylo třeba i déle 7. Sklo s vysušeným gelem bylo v temné místnosti vloženo do vyvolávací kazety 8. Na gel byl položen film a kazeta byla uzavřena 9. Film se nechal exponovat 1 až 3 dny 10. Vývoj filmu byl prováděn na pracovišti RTG (FN Bohunice) stejně jako u běžných Rtg snímků 11. Vyhodnocení filmu bylo provedeno pomocí programu Molecular Dynamics system a kvantifikace byla provedena za pomoci programu ImageQuaNT (obojí Applera) ROZTOKY A CHEMIKÁLIE Fixační roztok Metanol (Fluka) 200 ml Kyselina octová- ledová (Fluka) 200 ml Doplnit deionizovanou vodou do 2000 ml Všechny chemikálie byly smíchány. Roztok byl připravován vždy čerstvý. Film pro autoradiografii Hyperfilm-MP (Amersham) 2.3. PCR-SSCP Vzorky Byly analyzovány ty vzorky nádorové tkáně, u kterých byla zjištěna analýzou LOH (kapitola 2.2.) ztráta alely alespoň v jednom markeru z D11S927, D11S2179, D11S1347, D11S1345, D11S1391 D11S1778 a D11S1818. Celkem bylo vybráno pro další analýzu 42 vzorků. 58

59 Věkový průměr u pacientek, jejíchž nádorová DNA byla dále analyzována metodou PCR-SSCP, byl 56,2 let (s rozmezím 32-70). Ze 42 vzorků pocházelo 33 od pacientek s duktálním nádorem prsu, 6 od pacientek s lobulárním nádorem prsu a 3 od pacientek se směsným nádorem prsu PCR 1. Byla namíchána směs pro PCR reakci pro potřebné množství vzorků 2. Směs byla rozpipetována do označených PCR zkumavek (Perkin Elmer) po 20 µl 3. Do každé označené zkumavky se směsí pro PCR byl přidán vzorek DNA (5 µl = 100 ng DNA) 4. Zkumavky byly umístněny do přístroje (thermocycler) GeneAmp PCR 9600 (Perkin Elmer) s vyhřívaným víkem 5. Byla provedena PCR reakce dle podmínek: Podmínky PCR: primery č: 50, 51, 52, 55, 57, 58, 59, 61, 62 Program: Počet cyklů 94 o C/5 minut 1x 94 o C/30 sekund 54 o C/45sekund 72 o C/30 sekund 32x 72 o C/5 minut 1x primery č: 60, 63, 64, 65 Program: Počet cyklů 94 o C/5 minut 1x 94 o C/30 sekund 56 o C/45sekund 72 o C/30 sekund 32x 72 o C/5 minut 1x 59

60 primery č: 53, 54, 56 Program: Počet cyklů 94 o C/5 minut 1x 94 o C/30 sekund 52 o C/45sekund 72 o C/30 sekund 32x 72 o C/5 minut 1x 6. Kontrola PCR produktů byla provedena na 2% agarózovém gelu PCR produkty byly uchovávány při 4 o C po dobu 14 dní Postupy a soupis roztoků a chemikálií pro přípravu 2% agarózového gelu (pro kontrolu PCR produktů), vzorkového pufru pro agarózové ELFO, přípravu 10x TBE a agarózového ELFO jsou uvedeny v kapitole ROZTOKY A CHEMIKÁLIE Primery Oligonukleotidové primery pro amplifikaci jednotlivých exonů genu ATM Nukleotidová sekvence (5 ----> 3 ) Exon č.50 Forward primer: CCGTACATGAAGGGCAGTTGG Reverse primer: TTGATGAAAAGATGAAGCATA Velikost PCR produktu : 251 (bp) T a 54 o C Exon č.51 Forward primer: TTAAATTGGTTGTGTTTTCTT Reverse primer: ACCAAGTCACTCTTTCTATG Velikost PCR produktu : 323 (bp) T a 54 o C 60

61 Exon č.52 Forward primer: GTTCATGGCTTTTGTGTTTT Reverse primer: TAGAATATTGGGCTGAGTAAC Velikost PCR produktu : 278 (bp) T a 54 o C Exon č.53 Forward primer: ACTTGCTTAGATGTGAGAATA Reverse primer: GTTTGATTTTCAGGTTTACTT Velikost PCR produktu : 205 (bp) T a 52 o C Exon č.54 Forward primer: AAATCAATAGTTCTTTTCTT Reverse primer: CTGAATATCACACTTCTAAA Velikost PCR produktu : 228 (bp) T a 52 o C Exon č.55 Forward primer: GGGTAGTTCCTTATGTAATGT Reverse primer: TAACACAGCAAGAAAGTAAC Velikost PCR produktu : 223 (bp) T a 54 o C Exon č.56 Forward primer: AGTTTGTCACTAAAATCTCTTC Reverse primer: AATGGTTCAATCTAATAAAG Velikost PCR produktu : 177 (bp) T a 52 o C Exon č.57 Forward primer: GCAAATAGTGTATCTGACCTA Reverse primer: TAAAACTCTAAGGCTAACCAG Velikost PCR produktu : 225 (bp) T a 54 o C Exon č.58 Forward primer: TTTGCTATTCTCAGATGACTCT Reverse primer: ATATGTTTTTGGTGAACTAAC Velikost PCR produktu : 233 (bp) T a 54 o C 61

62 Exon č.59 Forward primer: AGGTCAACGGATCATCAAAT Reverse primer: TTAATTTTGGGTGTCACTC Velikost PCR produktu : 240 (bp) T a 54 o C Exon č.60 Forward primer: TGCCCCTATATCTGTCATA Reverse primer: CAAAGTGCTCAATCTACTAT Velikost PCR produktu : 299 (bp) T a 56 o C Exon č.61 Forward primer: TAGAAAGAGATGGAATCA Reverse primer: TCTTGGTAGGCAAACAACATT Velikost PCR produktu : 215 (bp) T a 54 o C Exon č.62 Forward primer: TCAAACCTCCTAACTTCACTG Reverse primer: ATTATTTCCCTCCTTTACTT Velikost PCR produktu : 185 (bp) T a 54 o C Exon č.63 Forward primer: CAGGCTCAGCATACTACACAT Reverse primer: GACGAGATACACAGTCTACCT Velikost PCR produktu : 224 (bp) T a 56 o C Exon č.64 Forward primer: ATGAAACTGGTTCTACTGTT Reverse primer: AAATCTGAAAAACTGACAAC Velikost PCR produktu : 261 (bp) T a 56 o C Exon č.65 Forward primer: TTAAACTGTTCACCTCACTGA Reverse primer: GTTAAAAATAAAGGCTAAAATA Velikost PCR produktu : 295 (bp) T a 56 o C 62

63 Směs pro PCR reakci na 1 vzorek 20 µl PCR směsi obsahuje: 10x PCR Buffer (Amersham Pharmacia) 2,5 µl MgCl 2 [25 mm] (Perkin Elmer) 1,5 µl Směs dntp [100 mm] (Perkin Elmer) 0,5 µl Primer F [5 µm] (Oligo Genset) 1 µl Primer R [5 µm] (Oligo Genset) 1 µl TAQ polymerasa 5UI (Perkin Elmer) 0.12 µl Sterilní Milli-Q voda 13.4 µl + Vzorek DNA [20 ng/µl] 5 µl SSCP Příprava skel Pro ELFO byla použita vertikální elektroforéza ELFO SE 660 (Hoefer). Byla používána skla o rozměrech 18 x 24 cm. Mezi skla byly vloženy spacery s tloušťkou 1 mm. Pro vzorky byl použit hřebínek pro 28 vzorků o tloušťce 1 mm. Mytí skel Postupy a soupis roztoků a chemikálií pro mytí skel jsou uvedeny v kapitole Příprava skel pro ELFO (bylo nutno provést před každým ELFO) 1. Roztok Repealu byl pomocí buničiny rovnoměrně rozetřen po obou sklech pro ELFO (po vnitřní straně, která bude v kontaktu s gelem) 2. Skla se nechala zaschnout při laboratorní teplotě 63

64 Příprava vzorků pro SSCP Vzorky byly připravovány pro nanášení na gel až po přípravě gelu a připravovaly se znovu před každou analýzou. Nelze je připravit předem µl PCR produktu bylo smícháno v PCR zkumavce s formamidovým pufrem v minimálním poměru 1:1 2. Vzorky byly zahřáty na teplotu 95 o C po dobu 3 minut v thermocycleru GeneAmp PCR 9600 (Perkin Elmer) s vyhřívaným víkem 3. Vzorky byly okamžitě po zahřátí zchlazeny ponořením do nádoby s vodou a ledem 4. Vzorky byly co nejrychleji nanášeny na gel 5. Jako pozitivní kontrola pro ELFO a barvení stříbrem byl použit PCR produkt o délce 263 bp (10. exon genu ATM). Vzorek byl připraven a poskytnut Dr. I. Vořechovským (Department of Biosciences at NOVUM, Karolinska Instituet, Huddinge, Švédsko). ROZTOKY A CHEMIKÁLIE Postupy a soupis roztoků a chemikálií pro přípravu formamidového pufru jsou uvedeny v kapitole Příprava polyakrylamidového gelu a ELFO 1. Do 10x TBE pufru byl v případě gelů s glycerolem přidán glycerol (v množství odpovídajícím 5 nebo 10%) a roztok dobře promíchán na míchačce, pro gely bez glycerolu byl použit jen 10x TBE pufr 2. Roztok byl přefitrován přes filtr 0,4 µm (Millipore) 3. Byl přidán akrylamid 4. Opatrně se vmíchal 10% APS a TEMED 5. Roztok se okamžitě vlíval do připravených skel ošetřených Repealem 6. Byl vložen hřebínek (pro 28 vzorků o šířce 1 mm) a gel se nechal polymerizovat asi 1 hodinu při laboratorní teplotě 64

65 7. Hřebínek byl vyjmut, jamky pro nanášení vzorků byly promyty pufrem, který byl použit pro přípravu gelu (0,6 x TBE nebo 1 x TBE) 8. Skla s gelem byla vložena do elektroforetické vany 9. Byl vlit předchlazený TBE pufr do obou van (byl použit takový pufr, jaký byl použit pro přípravu gelu - 0,6 x TBE nebo 1 x TBE) 10. Do gelu byly naneseny připravené vzorky (směs formamidového pufru a PCR produktu) 11. Byly zapojeny elektrody a spuštěno ELFO. Separace probíhala při 150 V po dobu asi 2 hodin při laboratorní teplotě (až bylo čelo vzdáleno asi 7 cm od startu) 12. Po té bylo ELFO vypnuto, rychle promyty jamky pro vzorky TBE pufrem a nanesena další řada vzorků 13. Vana byla zapnuta a separace probíhala při 150 V přes noc, při 4 o C ROZTOKY A CHEMIKÁLIE 6% PAGE s 0.6x TBS a s 0%, 5% nebo 10% glycerolem Acrylamide/Bis Solution 40% (Bio Rad) 5-6 ml (crosslinks ratio 37,5:1) 10x TBE 3 ml Glycerol (Fluka) 2,5 nebo 5 ml APS (Fluka) 10% 0,5 ml TEMED (Sigma) 35 µl Doplnit deionizovanou vodou do 50 ml 6% PAGE, 1xTBS a s 0%,5% nebo 10% glycerolem Polyacrylamid Polyacrylamid 40% směs (crosslinks ratio 37,5:1)(Bio Rad) 5-6 ml 10x TBE 5 ml APS (Fluka) 10% 0,5 ml TEMED (Sigma) 35 µl Glycerol (Fluka) 2,5 nebo 5 ml Doplnit deionizovanou vodou do 50 ml 65

66 10x TBE (Tris borátový pufr) ph=8,3 Kys. boritá (Fluka) 61,8 g Tris (Sigma) 121 g EDTA (Sigma) 7,5 g Doplnit deionizovanou vodou do 1000 ml Všechny chemikálie se nechaly rozpustit, bylo upraveno ph = 8,3. Roztok byl uchováván při 4 o C po dobu 1 měsíce. Pro ELFO byl používán pufr naředěný (1x TBE nebo 0,6 TBE), vychlazený na 4 o C. Pro každou elektroforézu se připravoval čerstvě naředěný pufr. 1x TBE 700 ml (10x TBE) bylo doplněno do 7000 ml deionizovanou vodou a přefiltrováno přes filtr 0,4 µm (Millipore) 0,6x TBE 420 ml (10x TBE) bylo doplněno do 7000 ml deionizovanou vodou a přefiltrováno přes filtr 0,4 µm (Millipore) Fixace a barvení polyakrylamidového gelu stříbrem Pro gel 18 x 24 cm Celá operace se provádí v rukavicích bez talku Citlivost metody barvení stříbrem je pg/band DNA, což je asi 5 x vyšší citlivost než při barvení ethidium bromidem Voda pro použití do všech roztoků, včetně promývání, musí mít vodivost nižší než 1 µs. Fixace gelu 1. Skla s gelem byla vyjmuta z elektroforetické vany 2. Pomocí špachtle byla elektroforetická skla rozevřena 3. Gel byl opatrně přemístěn do vany s FIX/STOP roztokem (asi 500 ml) 66

67 4. Celá vana i s gelem v roztoku byla mírně třepána buď ručně, nebo na třepačce (Bio- Rad) po dobu 20 minut 5. Gel se mohl ponechat ve FIX/STOP roztoku i přes noc (pak bylo potřeba gel opláchnout deionizovanou vodou a dát ho do čerstvého FIX/STOP roztoku) 6. Před barvením byl gel opláchnut 3x po 2 minutách v deionizované vodě za jemného třepání ručně nebo na třepačce (Bio Rad) Barvení gelu 1. Gel byl opatrně vložen do vany s BARVÍCÍM roztokem na dobu 30 minut, byl jemně třepán na třepačce (Bio Rad) 2. Byla připravena vana s roztokem vývojky (pro roztok vývojky je potřeba zvláštní vany), do vany byla vlita asi 1/3 objemu roztoku VÝVOJKY 3. Gel byl opláchnut v deionizované vodě (co nejrychleji asi 5 vteřin dlouhé promývání snižuje intenzitu signálu) a rychle vložen do vany s vývojkou (pokud bylo promývání delší, byl opakován krok-1) 4. Po několika minutách jemného třepání se začaly objevovat bandy, vývojka byla odsána a ke gelu byla přilita další, druhá třetina (nepoužité a chladné) vývojky a gel byl opět se jemně třepán na třepačce (Bio Rad) 5. Bylo zopakováno odsátí vývojky a přilita poslední třetina nepoužité chladné vývojky (bandy se nechaly vyvíjet do takové intenzity, aby byly méně kontrastní a aby nebylo příliš tmavé (šedé) pozadí důvodem je pomalá saturace gelu FIX/STOP roztokem). Proto nedochází k zastavení reakce ihned. Po tuto dobu pokračuje vybarvování bandů i tmavnutí pozadí. 6. Zastavení barvení bylo provedeno přidáním FIX/STOP roztoku (objem asi 500 ml) k poslední třetině vývojky v poměru 1:1, gel byl opět třepán v této směsi po dobu 5 minut třepačka (Bio Rad) 7. Jakmile přestaly při třepání ucházet z roztoku s gelem bubliny, všechen roztok byl odsát 8. Do vany ke gelu byla přilita deionizovaná voda a gel byl ve vodě ponechán asi 30 vteřin (dlouhá neutralizace způsobuje blednutí bendů) 9. Gel byl opatrně vyjmut z vany pomocí celofánu 10. Gel byl vypnut mezi 2 celofány a nechal se uschnout při laboratorní teplotě, nejlépe v temnu 11. Suchý gel byl digitalizován na SCANERU 67

68 ROZTOKY A CHEMIKÁLIE FIX/STOP roztok (7,5% kyselina octová) vždy připravován čerstvý: Kyselina octová ledová (Fluka) 150 ml Doplnit deionizovanou vodou do 2000 ml Roztok stačí na 2 gely, každý další gel, 1 litr roztoku navíc Barvící roztok (připravovat těsně před použitím): AgNO 3 (Fluka) Formaldehyd 37% (Fluka) Doplnit deionizovanou vodou do 2 g 3 ml 2000 ml Vyvíjecí roztok: Na 2 CO 3 (Fluka) Formaldehyd 37% (Fluka) Na 2 S 2 O 5. 5H 2 O (Fluka) Doplnit deionizovanou vodou do 60 g 3 ml 4 mg 2000 ml 68

69 3. VÝSLEDKY 3.1. Průkaz mutace ATM 7271T>G metodou RFLP Výskyt mutace ATM 7271T>G byl testován na dvou skupinách žen z české populace. První skupina žen s nádorem prsu, celkem 272 pacientek, byla bez rodinné historie nádoru prsu. Do této skupiny nebyly zařazeny pacientky, u kterých byly prokázány patogenní mutace v genech BRCA1 a BRCA2. Věkový průměr pacientek byl 52,3 let (s rozmezím let). Celkem bylo použito 272 vzorků DNA izolované z krve. Z toho 207 vzorků pocházelo od pacientek s duktálním nádorem prsu a 65 vzorků od pacientek s lobulárním nádorem prsu. Druhá skupina byla použita jako kontrola a byla tvořena 88 vzorky DNA izolované z krve od žen, dárkyní krve, jejíchž věk byl nižší než 40 let. Ani u kontrolní skupiny se nevyskytoval nádor prsu v rodinné historii. Detekce mutace ATM 7271T>G byla provedena metodou PCR-RFLP. Pro PCR byl použit speciálně navržený forward primer (TGAAAAGAGCCAAAAGGAAG); AGGA je místo, které je rozeznáváno restrikčním enzymem), který umožní detekci mutace následně provedenou metodou RFLP. PCR produkty byly smíchány s restrikčním enzymem a po proběhlé enzymatické reakci byly fragmenty analyzovány na 4,5% agarózovém gelu. Pro kontrolu reakce byla použita pozitivní kontrola, která byla poskytnuta Dr. I. Vořechovským (Department of Biosciences at NOVUM, Karolinska Instituet, Huddinge, Švédsko). Po použití forward primeru je po reakci s příslušným restrikčním enzymem 101 bp PCR produkt s mutací 7271T>G štěpen na 2 fragmenty 88bp a 13 bp (je odštípnut 13 bp fragment - začátek primeru). Nemutovaná alela nemá restrikční místo pro enzym, a proto zůstává neštěpená a velikost fragmentu je 101 bp. Výsledky jsou zobrazeny na obr. 6. Fragment o délce 13 bp je na agarózovém gelu špatně viditelný. U žádné ze skupiny pacientek s nádorem prsu ani z kontrolní skupiny nebyla ve vzorku DNA zachycena mutace 7271T>G. 69

70 A B 101 bp 88 bp 13 bp Obr.6 RFLP 4,5% agarózový gel velikostní standard, A - nemutovaná alela (T alela), B pozitivní kontrola - vzorek s mutací 7271T>G (homozygot) 3.2. Průkaz mutace ATM IVS10-6T> G metodou RFLP Výskyt mutace ATM IVS10-6T>G byl také testován na dvou skupinách žen z české populace. Byly použity stejné vzorky jako pro detekci mutace 7271T>G. Soubor byl navíc rozšířen o dalších 18 vzorků DNA izolované z krve.věkový průměr pacientek byl v tomto souboru 54,7 let (s rozmezím let). Celkem bylo použito 291 vzorků DNA. Z toho 225 vzorků pocházelo od pacientek s duktálním nádorem prsu a 66 vzorků od pacientek s lobulárním nádorem prsu. Jako kontrolní skupina byl použit stejný soubor vzorků DNA od dárkyň krve jako při testování mutace 7271T>G. Detekce mutace byla provedena metodou PCR-RFLP. PCR produkty byly smíchány s restrikčním enzymem a po proběhlé enzymatické reakci byly fragmenty analyzovány na 2% agarózovém gelu. Pro kontrolu reakce byla použita pozitivní kontrola. Na počátku této práce byl použit enzym, pufr a pozitivní kontrola, které 70

71 byly poskytnuty Dr. Thilo Dörke (Department of Biochemistry and Tumor Biology, Clinic of Obstetrics and Gynecology, Medical School Hannover). Práce byla dokončena za použití restrikčního enzymu Rsa I (Promega). Po použití příslušného restrikčního enzymu je 193 bp PCR produkt s mutací IVS10-6T>G štěpen na 2 fragmenty o délce 135bp a 58 bp. Nemutovaná alela (T alela) nemá restrikční místo pro enzym, a proto zůstává nerozštípnutá a velikost fragmentu je 193 bp. Výsledky jsou zobrazeny na obr. 7. Fragment o délce 58 bp není na agarózovém gelu viditelný. Ve skupině vzorků pocházející od pacientek s nádorem prsu nebyl nalezen žádný vzorek pozitivní na mutaci ATM IVS10-6T>G. V kontrolní skupině byl nalezen jeden vzorek s mutací IVS10-6T>G. Tento vzorek pro danou mutaci heterozygotní (Obr. 7, vzorek C). 71

72 A B C 193 bp 135 bp Obr.7 RFLP 4,5% agarózový gel, A - nemutovaná alela (T alela), B pozitivní kontrola vzorek s mutací IVS10-6>G (homozygot), C- vzorek s mutací IVS10-6T>G (heterozygot), velikostní standard 3.3. LOH v oblasti 11q22-q23 Vzorky DNA izolované z nádorové tkáně a vzorky DNA izolované z krve byly získány od skupiny 257 pacientek s nádorem prsu, nádory nebyly selektovány. Pacientky pocházely z České republiky a Švédska. Byly použity nádorové tkáně z parafinových bločků. Z nádorové tkáně vyšetřené histopatologicky byly z oblastí s výskytem více než 80 % nádorové tkáně odebrány vzorky pro izolaci nádorové DNA 72

73 Ve vzorcích byla analyzována LOH v polymorfních oblastech D11S927, D11S2179, D11S1347, D11S1345, D11S1391, D11S1778 a D11S1818. PCR produkty z DNA vyizolované z krve a tumorové DNA byly naneseny na sekvenační gel vždy tak, aby oba vzorky od téže pacientky byly naneseny vedle sebe. Po proběhlé elektroforéze byly bandy detekovány autoradiograficky. Výsledky z filmu byly počítačově digitalizovány pomocí programu Molecular Dynamics system. Analýza denzity (intenzity) bandů byla provedena pomocí programu ImageQuaNT (Applera). Byl stanoven vzájemný poměr mezi alelou z tumoru a normální alelou (z krve). Intenzita signálů dvou alel v normální DNA (pokud nedošlo k LOH) jsou přibližně stejné. Aby byla v tumoru určena ztráta jedné alely (LOH), musí být její signál ve vzorku tumoru jiný než u normální alely (z krve). Jako pozitivní byl vyhodnocen výsledek, pokud se denzita (intenzita) alely z nádorové tkáně lišila o více než 50% (D 0,50, kde D je rozdíl) od denzity (intenzity) alely normální (z krve). Takový vzorek byl označen jako pozitivní pro LOH v oblasti 11q22-q23 a byl zaslán ke konfirmaci na spolupracující pracoviště - Department of Biosciences at NOVUM, Karolinska Instituet, Huddinge, Švédsko (Dr. Haixin Lei). Celkem byly analyzovány vzorky od 257 pacientek. Byly vybrány ty vzorky, ve kterých byla prokázána LOH nejméně v jednom markeru. LOH byla nelezena u 42 z 257 vzorků (to je 16% případů). Nejčastěji chyběly markery D11S1391 (celkem 16x) a D11S1345 (celkem 13x). LOH v oblasti D11S2179 byla nalezena v 6 případech, v oblasti D11S1778 ve 4 případech, v oblasti D11S1818 v 9 případech, v oblasti D11S927 ve 2 případech a v oblasti D11S1347 ve 3 případech. Na obrázcích č jsou uvedeny příklady obrázků částí gelů po audiografii se vzorky s LOH pro oblasti D11S927, D11S2179, D11S1347, D11S1345, D11S1391, D11S1778 a D11S1818. Pro každý marker je vždy znázorněna normální (N) a tumorová (T) DNA. Změna v intenzitě bendů (LOH) je znázorněna šipkou. Z 257 vzorků nádorové tkáně bylo celkem 42 vzorků pozitivních, to znamená, že v nádorové tkáni došlo k LOH alespoň v jednom markeru. Tyto vzorky byly dále použity pro mutační analýzu metodou PCR-SSCP. 73

74 D11S927 N T Obr.8 Analýza mikrosatelitu D11S927 chromosomu 11. LOH ze vzorku nádorové DNA (T) a DNA z krve (N), LOH (ztráta alely) je označena šipkou D11S1391 N T Obr.9 Analýza mikrosatelitu D11S1391 chromosomu 11. LOH ze vzorku nádorové DNA (T) a DNA z krve (N), LOH (ztráta alely) je označena šipkou 74

75 D11S1818 N T Obr.10 Analýza mikrosatelitu D11S1818 chromosomu 11. LOH ze vzorku nádorové DNA (T) a DNA z krve (N), LOH (ztráta alely) je označena šipkou D11S1347 N T Obr.11 Analýza mikrosatelitu D11S1347 chromosomu 11. LOH ze vzorku nádorové DNA (T) a DNA z krve (N), LOH (ztráta alely) je označena šipkou 75

76 D11S1345 N T Obr.12 Analýza mikrosatelitu D11S1345 chromosomu 1. LOH ze vzorku nádorové DNA (T) a DNA z krve (N), LOH (ztráta alely) je označena šipkou 76

77 D11S1778 N T Obr.13 Analýza mikrosatelitu D11S1778 chromosomu 11. LOH ze vzorku nádorové DNA (T) a DNA z krve (N), LOH (ztráta alely) je označena šipkou D11S2179 N T Obr.14 Analýza mikrosatelitu D11S2179 chromosomu 11. LOH ze vzorku nádorové DNA (T) a DNA z krve (N), LOH (ztráta alely) je označena šipkou 77

78 3.4. Mutační analýza PCR-SSCP Vzorky nádorové DNA (celkem 42), které vykazovaly LOH (byly pozitivní viz kapitola 3.3.), byly dále analyzovány metodou PCR SSCP na mutace v posledních 16 exonech genu ATM (exony 50-65). Věkový průměr u pacientek, jejíchž nádorová DNA byla dále analyzována metodou PCR-SSCP, byl 56,2 let (s rozmezím 32-70). Ze 42 vzorků pocházelo 33 od pacientek s duktálním nádorem prsu, 6 od pacientek s lobulárním nádorem prsu a 3 od pacientek se směsným nádorem prsu. Byla provedena optimalizace PCR pro 16 párů primerů odpovídajících jednotlivým exonům. Primery byly navrženy tak, aby délka množeného fragmentu (PCR produktu) byla přibližně bp a citlivost metody SSCP byla co nejvyšší. Pro detekci neznámých mutací byla použita metoda SSCP. Podmínky pro SSCP byly optimalizovány (modifikovány) tak, aby bylo dosaženo co nejvyšší citlivosti metody. Do gelu byl pro zvýšení citlivosti metody přidáván glycerol (0 %, 5 % a 10 %) a různá koncentrace TBE pufru (0,6x a 1x). Byly připraveny kombinace gelů s různými koncentracemi glycerolu a TBE pufru. Každý exon byl analyzován na gelech se všemi kombinacemi glycerolu a TBE pufru. PCR produkty byly těsně před nanesením smíchány s formamidovým pufrem a zahřáty. Formamidový pufr zabraňuje renaturaci ds DNA po zahřátí a pomáhá k udržení oddělených ss DNA řetězců. Po elektoforéze byly gely vyzualizovány barvením stříbrem. I přesto, že jsme modifikovali metodu SSCP tak, aby se její citlivost byla co nejvyšší, nebyla nalezena žádná mutace v žádném ze vzorků. Na obrázcích jsou zobrazeny příklady gelů se vzorky, které byly analyzované metodou SSCP. Vzorky byly na gel nanášeny ve 2 řadách. Nejdříve 1. řada vzorků, kde byla vynechána 1. nebo poslední dráha. Poté, co byly vzorky vzdáleny od kraje jamek asi 10 cm, byla nanášena 2. řada vzorků a opět byla vynechána 1. nebo poslední dráha (opačná než v 1. řadě vzorků). V krajní jamce se nachází jen jeden vzorek podle jeho polohy je pak odečítána celá řada vzorků. 78

79 *Poznámka: Obrázky gelů neodpovídají přesně skutečnosti. Gely byly velice tenké a lepivé a bylo obtížné je položit na SCANER tak, aby nedošlo k deformaci bendů na obrázku. V praxi byly gely odečítány přímo po odstranění většiny fix-roztoku z vany, kde probíhalo barvení gelu. 2. Řada vzorků 1. Řada vzorků ss DNA (2) ss DNA (1) ds DNA (2) ds DNA (1) Obr.15 SSCP analýza vzorků na mutace v exonu č. 59, šipkou jsou označeny bandy ss DNA a nezdenaturované ds DNA. Z 1. řady vzorků - ss DNA(1) a ds DNA(1) a z 2. řady vzorků ss DNA(2) a ds DNA (2)* 79

80 2. Řada vzorků ss DNA (2) 1. Řada vzorků ss DNA (1) ds DNA (2) ds DNA (1) Obr.16 SSCP analýza vzorků na mutace v exonu č. 60, šipkou jsou označeny bandy ss DNA a nezdenaturované ds DNA. Z 1. řady vzorků - ss DNA(1) a ds DNA(1) a z 2. řady vzorků ss DNA(2) a ds DNA (2)* 80

81 1. Řada vzorků 2. Řada vzorků ss DNA (2) ss DNA (1) ds DNA (2) ds DNA (1) Obr.17 SSCP analýza vzorků na mutace v exonu č. 59, šipkou jsou označeny bandy ss DNA a nezdenaturované ds DNA. Z 1. řady vzorků - ss DNA(1) a ds DNA(1) a z 2. řady vzorků ss DNA(2) a ds DNA (2)* 81