Copyright 2014 by The American Association for Clinical Chemistry

Transkript

1 Anders Grubb, 1* Masaru Horio, 2 Lars-Olof Hansson, 3 Jonas Björk, 4 Ulf Nyman, 5 Mats lodin, 3 Anders Larssson, 3 Arend Bökenkamp, 6 Yoshinari Yasuda, 2 Hester Blufpand, 6 Veronica Lindström, 1 Ingrid Zegers, 7 Harald Althaus, 8 S ren Blirup-Jensen, 1 Yoshi Itoh, 9 Per Sjöström, 10 Gunnar Nordin, 11 Anders Christensson, 12 Horst Klima, 13 Kathrin Sunde, 14 Per Hjort-Christensen, 15 David Armbruster 16 a Carlo errero 17 Odvození nové rovnice pro odhad glomerulární filtrace z koncentrace cystatinu C pomocí sedmi metod stanovení, standardizovaných podle mezinárodního kalibrátoru VÝCHODISKA: Existuje mnoho rùzných rovnic pro odhad glomerulární filtrace z cystatinu C. Hlavními pøíèinami této situace je døívìjší absence mezinárodního kalibrátoru pro cystatin C a neekvivalentnost výsledkù získaných rùznými metodami stanovení cystatinu C. METODY: Nedávné zavedení certifikovaného referenèního materiálu ERM-DA471/I CC umožnilo spoleènì s dalšími opatøeními pro dosažení vysoké shody a ekvivalence sedmi komerènì dostupných testù pro stanovení cystatinu C podstatné snížení CV (variaèní koeficient), definované jejich úèinností v externím vyhodnocení kvality pro použití v klinických laboratoøích. Pomocí dvou z tìchto stanovení a populace probandù s velkými dílèími populacemi dìtí, dospìlých Asiatù a bìlochù, u nichž byla G R (glomerulární filtrace) stanovena pomocí renální nebo celkové clearance inulinu nebo celkové clearance iohexolu, jsme se pokusili vytvoøit jednoduchou rovnici pro odhad G R z koncentrace cystatinu C, která je prakticky nezávislá na metodì stanovení. VÝSLEDKY: Vyvinuli jsme jednoduchou rovnici pro odhad G R z cystatinu C, obsahující pouze 2 promìnné koncentraci cystatinu C a vìk. Pro její optimální diagnostickou úèinnost nejsou nutné èleny urèující rasu a pohlaví. Rovnice eg R = 130 cystatin C -1,069 vìk -0,117-7 je také biologicky orientovaná, s jedním èlenem pro teoretickou renální clearance malých molekul a jednou konstantou pro extrarenální clearance cystatinu C. ZÁVÌRY: Byla odvozena jednoduchá rovnice pro odhad G R z koncentrace cystatinu C, prakticky nezávislá na metodì stanovení, bez èlenù urèujících pohlaví a rasu. Znalost glomerulární filtrace (G R) 18 je nezbytná pro detekci a sledování poruch renálních funkcí, pro zajištìní bezpeènosti užívání potenciálnì nefrotoxických farmak a radiologických kontrastních látek, stejnì jako pro správné dávkování lékù vyluèovaných ledvinami. K mìøení G R u lidí jsou nutné invazivní postupy, a proto se už témìø celé století jako marker G R využívá koncentrace endogenních látek, zejména kreatininu, v séru èi plazmì (1). Vyšlo však najevo, že samotná koncentrace cirkulujícího kreatininu není jako marker G R ani zdaleka ideální, protože je znaènì ovlivòovaná nejen G R, ale i jinými faktory, mezi nìž patøí svalová hmota, množství požitého masa a tubulární sekrece (2-8). Copyright 2014 by The American Association for Clinical Chemistry 14 Labor Aktuell 01/15

2 1 Department of Clinical Chemistry, Laboratory Medicine, University Hospital, Lund, Sweden; 2 Department of unctional Diagnostic Science, Osaka University Graduate School of Medicine, Suita, Osaka, Japan; 3 Department of Medical Sciences, Uppsala University, Uppsala, Sweden; 4 Department of Occupational and Environmental Medicine, Lund University, Lund, Sweden; 5 Department of Radiology, Central Hospital, Kristianstad, University of Lund, Sweden; 6 Department of Pediatric Nephrology, VU University Medical Center, Amsterdam, The Netherlands; 7 Institute for Reference Materials and Measurements, Joint Research Centre, European Commission, Geel, Belgium; 8 Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH, Marburg, Germany; 9 Department of Laboratory Medicine, EIJU, General Hospital, Tokyo, Japan; 10 Department of Medicine, Örebro University Hospital, Örebro, Sweden; 11 Equalis, Uppsala, Sweden; 12 Department of Nephrology and Transplantation, Sk ne University Hospital, Lund, Sweden; 13 Roche Diagnostics GmbH, Penzberg, Germany; 14 Gentian Technology AS, Moss, Norway; 15 Dako Denmark A/S, Glostrup, Denmark; 16 Abbott Diagnostics, Lake orest, IL; 17 Sentinel CH. SpA, Milan, Italy. * Korespondenci tomuto autorovi zasílejte na adresu: Department of Clinical Chemistry, Laboratory Medicine, University Hospital, SE Lund, Sweden. ax ; anders.grubb@med.lu.se. A. Grubb, V. Lindström, H. Althaus, S. Blirup-Jensen, a Y. Itoh jsou èlenové Pracovní skupiny I CC SD pro standardizaci cystatinu C (Working Group for Standardisation of Cystatin C). Doruèeno 24. prosince 2013; pøijato 7. dubna Døíve publikováno online na DOI: /clinchem Nestandardní zkratky: G R, glomerular filtration rate = glomerulární filtrace; eg R, estimated G R; JRC-IRMM, Joint Research Centre Institute for Reference Materials and Measurements; WG-SCC, pracovní skupina pro vytvoøení mezinárodního kalibrátoru cystatinu C; CAPA, Caucasian, Asian, pediatric, and adult cohorts (kohorty bìlochù, Asiatù, pediatrických pacientù a dospìlých); LCS, Lund Cystatin C standardization cohort (kohorta standardizace cystatinu C z Lundu); mg R, mìøená G R; CKD-EPI, Chronic Kidney Disease Epidemiology Collaboration; P30, procento odhadù do 30 %; BMI, index tìlesné hmotnosti. Rovnice pro odhad G R založené na kreatininu (eg R kreatinin) obsahující demografické a antropometrické faktory (9 11) mohou vliv svalové hmoty èásteènì kompenzovat. Cystatin C byl jako alternativní marker G R navržený v roce 1979 (12 14) a od zavedení první automatizované metody v roce 1994 (15) probíhaly rozsáhlé výzkumy jeho využití. Koncentraci cirkulujícího cystatinu C neovlivòuje konzumace masa (1, 16) ani tubulární sekrece a svalová hmota na ni má podstatnì menší vliv než na koncentraci kreatininu (18 23). Díky tomu mohou jednoduše formulované rovnice pro odhad G R založené na cystatinu C (eg R cystatin C ) nahradit složitìjší rovnice eg R kreatinin s vágními a špatnì definovanými antropometrickými promìnnými, jako napø. rasou (2). Bylo tedy navrženo nìkolik rovnic eg R cystatin C. Hlavním dùvodem bylo používání rozdílných kalibrátorù. Ke zlepšení této situace proto I CC a standardizaèní úøad Evropské komise Joint Research Centre Institute for Reference Materials and Measurements (JRC- IRMM) zøídily a podporovaly Pracovní skupinu pro vytvoøení mezinárodního kalibrátoru cystatinu C (WG-SCC). Tato skupina zmiòovaný kalibrátor (ERM- DA471/I CC) nedávno vytvoøila a nyní jej mají k dispozici dodavatelé diagnostik i výzkumné skupiny (24 26). Dostupnost certifikovaného referenèního materiálu sice umožòuje rùzným dodavatelùm diagnostik pøicházet se stanoveními cystatinu C vykazujícími nižší variabilitu mezi stanoveními, je ale nutná další optimalizace, aby bylo dosaženo co nejvìtší shody. Tato práce byla uskuteènìna ve snaze dosáhnout pomocí certifikovaného referenèního materiálu (spolu s dalšími úpravami stanovení cystatinu C) dostateènì dobré shody mezi stanoveními u testù od 7 mezinárodních dodavatelù diagnostik tak, aby je všechna bylo možné použít k vývoji prakticky shodných rovnic eg R cystatin C z kohorty osob se známou glomerulární filtrací. Rovnice eg R cystatin C, která byla prakticky nezávislá na metodì stanovení, byla vyvinutá s použitím vzorkù kohort sestavených z bìlochù, Asiatù, pediatrických pacientù a dospìlých (CAPA) o celkovém poètu jedincù s rùznou G R, urèenou pomocí renální nebo celkové clearance inulinu nebo celkové clearance iohexolu. Rovnice byla provizornì nazvaná CAPA. Materiál a metody Kohorta použitá k odvození mezinárodní rovnice pro odhad G R z koncentrace cystatinu C u dospìlých a dìtí K vývoji a interní validaci mezinárodní rovnice eg R cystatin C (tabulka 1) byly použity vzorky plazmy od švédských [kohorta standardizace cystatinu C z Lundu (LCS)] a 763 japonských dospìlých, a od smíšené kohorty 262 holandských a 440 švédských dìtí (LCS). Všechny postupy, jež zahrnovaly pacienty a data, byly v souladu s Helsinskou deklarací z roku 1975, revidovanou v roce 2000, která se týká etických zásad lékaøského výzkumu za úèasti lidských subjektù. Urèení G R Ke stanovení G R u dospìlé a pediatrické švédské populace byla použita celková clearance iohexolu (27, 28) (viz èást Doplòkové metody, doprovázející online verzi tohoto èlánku na clinchem.org/content/vol60/issue7); ke stanovení G R u japonské dospìlé populace to byla renální clearance inulinu a u holandské pediatrické populace bylo mìøení stanovováno vymizením inulinu z plazmy po jedné injekci (29, 30). Podle nedávné metaanalýzy poskytují tyto 3 metody srovnatelné hodnoty G R (31). Výpoèet plochy tìlesného povrchu byl proveden podle vzorce Dubois-Dubois (32). Labor Aktuell 01/15 15

3 Snaha o optimalizaci shody mezi šesti komerènì dostupnými stanoveními cystatinu C Aby pracovní skupina WG-SCC zajistila shodu mezi stanoveními, spolupracovala se šesti dodavateli diagnostik (Abbott, Dako, Gentian, Roche, Sentinel a Siemens), kteøí nabízejí stanovení cystatinu C. Stanovení firem Abbott a Sentinel jsou totožná. Pìt z tìchto stanovení je založené na èásticemi zesílené imunoturbidimetrii (15) a jedno (Siemens) na èásticemi zesílené imunonefelometrii (33) (technické parametry viz online Doplòkové metody). Z dùvodu optimalizace shody mezi metodami stanovení byly studovány vzorky plazmy dospìlých pacientù (vìk nad 18 let), odebrané do Li-heparinu jako antikoagulaèního prostøedku, a to pomocí odbìrového systému Vacutainer Becton Dickinson. Vzorky byly následnì odeslané do Univerzitní nemocnice v Lundu ke stanovení G R mìøením clearance iohexolu. Dùvody odeslání pacientù k vyšetøení byly manifestní nebo suspektní diabetická nefropatie, intersticiální nefritida, glomerulonefritida, nefrotický syndrom, proteinurie, refluxní nefropatie, myelom, vaskulitida, úvaha o zahájení hemodialýzy, kontrola po transplantaci ledviny a stanovení G R u pacientù pøed zahájením podávání lékù vyluèovaných ledvinami. V japonské kohortì dospìlých mìlo 21 % diabetes, 1,4 % transplantovanou ledvinu a 1,4 % byli dárci ledvin. Holandskou kohortu dìtí tvoøilo 49 % onkologických pacientù a 51 % pacientù s glomerulonefritidou èi glomerulopatií. Odpovídající èísla ze švédských kohort nebyla k dispozici. Jednoduchá rovnice eg R založená na cystatinu C, nezávislá na metodì stanovení Japonští výrobci se snažili o optimalizaci nìkolika stanovení cystatinu C a dosažení maximální shody použitím certifikovaného referenèního materiálu. Jedno z tìchto stanovení, homogenní sol èástic imunoanalýza (SPIA) k mìøení sérového cystatinu C (34) od firmy Alfresa, bylo použito k vyšetøení sérového cystatinu C v japonské kohortì. Byla tedy zjiš ována také shoda mezi tímto stanovením a stanoveními používanými u švédských a holandských kohort. Vývoj a interní validace nových rovnic pro odhad G R z cystatinu C Všechny statistické analýzy byly zpracované pomocí aplikací SPSS verze (IBM Corp.) a Microsoft Excel. Z úplného datového souboru obsahujícího stanovení G R a cystatinu C u dospìlých a dìtí byl odvozen vývojový soubor obsahující náhodnì vybraných švédských dospìlých, 413 japonských dospìlých a 456 švédských a holandských dìtí. Zbývajících pacientù tvoøilo 3 soubory pro interní validaci, obsahující švédských dospìlých, 350 japonských dospìlých (shromáždìných do èervence 2007) a 246 švédských a holandských dìtí. Mezi vývojovými soubory a odpovídajícími soubory pro interní validaci nebyly významné rozdíly obecných charakteristik (tabulka 1). Všechny regresní analýzy byly u vývojového souboru provedené pomocí statistické váhy (viz Doplòkové metody online). Úèelem bylo znovu zvážit všechny regresní analýzy a dodat pøi odhadu regresních koeficientù rovnocenný význam populaci švédských a japonských dospìlých navzdory nerovné velikosti jejich vzorkù (2 295, respektive 413 jedincù). Nejprve byla odhadnuta extrarenální eliminace E jako úsek v lineárním regresním modelu s namìøenou G R (mg R) jako závislou promìnnou a cystatinem C jako nezávislou promìnnou (35). Následnì byl odhadnut regresní koeficient (a, b, a c) rovnice: ln(mg R + E) = ln(a) + b ln(cystatin C) + c ln(vìk), (Rov. 1) kde ln oznaèuje pøirozený logaritmus, koncentrace cystatinu C se uvádí v miligramech na litr a vìk je vyjádøený poètem let. Ke zvýšení významu pacientù s nízkou G R byla použita lineární regrese s mg R jako váhou (11). Výše uvedená regresní rovnice odpovídá rovnici eg R v tomto tvaru: eg R = a cystatin C b - vìk c - E. (Rov. 2) Jako dodateèný kovariát regresní rovnice byl hodnocen úèinek pøidání pohlaví (0-mužské, 1-ženské). Rovnice s koeficienty urèenými na zá- Tab. 1: Charakteristiky pacientù z vývojového a validaèního souboru ve švédské kohortì dospìlých, japonské kohortì dospìlých a smíšené holandsko-švédské kohortì dìtí a 16 Labor Aktuell 01/15

4 kladì vývojového souboru byly validovány samostatnì ve 3 souborech v porovnání s rovnicí Chronic Kidney Disease Epidemiology Collaboration (CKD-EPI) založené na cystatinu C (36). Validace rovnic se zamìøovala na bias (vychýlení) a správnost (37). Bias byl definován jako medián jednotlivých rozdílù mezi eg R a mg R (eg R mg R), vyjádøený v ml min -1 (1,73 m 2 ) -1. Správnost (accuracy) byla vyjádøena jako medián absolutních procentních rozdílù mezi eg R a mg R vztažených k mg R. Správnost dále odrážela také hodnota P30, tj. procento odhadù nelišících se od mg R o více než 30 %. Aby byla eg R považována za dostateènou pro správné klinické rozhodování, mìlo by být alespoò 75 % eg R v rozmezí do 30 % od mg R (38). Neparametrické a asymptomatické intervaly spolehlivosti (CI) byly vypoèteny jako míry statistické nejistoty v mediánech, respektive podílech (P30), ze všech výsledkù. K usnadnìní porovnávání byly výsledky validace rovnice CKD-EPI pro odhad z cystatinu C uvedeny i u dìtí, pøestože je tato rovnice urèena jen k odhadu G R u dospìlých. U švédských dospìlých a dìtí a holandských dìtí byly použity prùmìrné hodnoty dvou dostupných mìøení cystatinu C získané dvìma rùznými metodami stanovení, aby se zvýšila statistická pøesnost odhadovaných regresních koeficientù. Validace rovnic byla nicménì založená na jednom mìøení cystatinu C, aby se napodobila oèekávaná správnost v klinické praxi. Koeficienty uvedené finální rovnice byly získány použitím celkového datového souboru (n = 4960) se stejným schématem vážení (rovnocenná váha švédské a japonské dospìlé populace) jako u vývojového souboru, aby se dále zvýšila statistická pøesnost. Výsledky Optimalizace shody mezi šesti komerènì dostupnými stanoveními cystatinu C WG-SCC a šest dodavatelù diagnostik (Dako, Siemens, Gentian, Roche, Abbott a Sentinel) spoleènì usilovali o zlepšení shody mezi stanoveními cystatinu C dodávanými jednotlivými spoleènostmi. Bylo zmìnìno nìkolik faktorù, o nichž je známo, že ovlivòují vlastnosti stanovení cystatinu C (viz online Doplòkové metody, tabulka 1), aby se zvýšila shoda mezi stanoveními, ale pouze dvì z nich byly systematicky studovány. Týkaly se použití stejného celkového objemu a celkového objemu antiséra u všech standardù a vzorkù (39) a výbìru polohy kalibraèních bodù použitých k sestrojení køivek odpovìdi na dávku zahrnující nejdùležitìjší intervaly stanovení (viz online Doplòkové výsledky, doplòující obr. 1 a 2). Jednoduchá rovnice eg R založená na cystatinu C, nezávislá na metodì stanovení V tabulce 2 jsou uvedeny lineární rovnice a korelaèní koeficienty šesti stanovení upravených na maximální shodu, kde jsou Tab. 2: Demingova regresní analýza každého z 5 stanovení cystatinu C (Siemens, Gentian, Roche a Sentinel/Abbott) upravená pro maximální shodu a vyjádøená jako lineární rovnice (y = smìrnice x + úsek) ve vztahu ke stanovení cystatinu C Dako (x; mg/l)a Tab. 3: Celkový bias, pøesnost a správnost rovnic CAPA a CKD-EPI založených na cystatinu C [Inker et al. (36)] ve validaèních souborech švédských dospìlých (n = 1 200), japonských dospìlých (n = 350) a smíšené kohorty holandských a švédských dìtí (n = 246) Labor Aktuell 01/15 17

5 cystatinu C za posledních 17 rùzných zkušebních období v prùbìhu let se pohybovaly od 6 % do 14 %, s prùmìrným CV 9,7 %, pøièemž k výpoètu CV byly použity prùmìrné hodnoty cystatinu C z každého typu stanovení (viz doplòující obr. 3A online). Aplikujeme-li na tyto výsledky rovnice z tabulky 2, sníží se pøíslušné CV na 1 % až 5 %, pøi prùmìrném CV 2,8 % (viz doplòující obr. 3B online). Použijeme-li výsledky cystatinu C k odhadu G R podle rovnice pro odhad G R z cystatinu C vyvinuté v této práci (viz dále), je vidìt odpovídající zvýšení shody (viz doplòující obr. 4 online). CV u rovnice eg R se pohybuje mezi 9 % a 19 % pøi prùmìrném CV 13,9 % a po aplikaci rovnic z tabulky 2 se sníží na 2,0 % až 7,1 % pøi prùmìrném CV 3,7 %. Doplòující obr. 5 online demonstruje praktické dùsledky této skuteènosti pro celé spektrum G R. Deset vzorkù smìsné plazmy s rùznými koncentracemi cystatinu C bylo analyzováno pomocí metody Alfresa a dvou výše popsaných pøizpùsobených stanovení pomocí pìtinásobných testù. Shoda mezi dvìmi pøizpùsobenými stanoveními cystatinu C (Dako a Gentian) na jedné stranì a testem Alfresa na stranì druhé byla vynikající. Výsledky ukazuje tabulka 2. Tab. 4: Srovnání rovnic CAPA a CKD-EPI založených na cystatinu C, provedené pomocí bias a správnosti, stratifikované podle intervalù mg R, vìku a BMI u validaèních souborù švédských dospìlých (n = 1200) a japonských dospìlých (n = 350). V tabulce jsou uvedeny hodnoty mediánu mg R pro rùzné intervaly G R a vìku. jako nezávislá promìnná použity hodnoty získané pomocí metody Dako. Tabulka 2 ukazuje také stejná data metody Alfresa získaná pomocí pìtinásobných testù deseti smìsí plazmy o rùzné koncentraci cystatinu C. Rovnice z tabulky 2 pak byly použity k vyhodnocení dosažitelného zvýšení shody mezi stanoveními vyjádøenými výsledky od švédského poskytovatele externího vyhodnocení kvality klinických laboratorních vyšetøení Equalis ( Spoleènost Equalis monitorovala kvalitu stanovení cystatinu C po dobu 10 let tak, že laboratoøím provádìjícím vyšetøení cystatinu C pøidìlovala vzorky plazmy s neznámými koncentracemi cystatinu. Za poslední 3 roky se hodnocení kvality zúèastnilo 35 laboratoøí. CV zjištìných koncentrací Vyhodnocení rovnic u vývojového souboru Rovnice eg R neobsahující faktor pohlaví dávala pøi vyhodnocení pomocí statistických vah podobný záporný bias u žen i mužù [-2,6 a -4,0 ml min -1 (1,73 m 2 ) -1 u mediánu] ve vývojovém souboru (n = 3164). Celková správnost byla také podobná (P30 = 79 % u obou pohlaví). U dìtí, z nichž vìtšina mìla G R v referenèních intervalech, skupina vykazovala rozdílné bias mezi pohlavími [medián bias u chlapcù, respektive dívek, -8,5 a -0,8 ml min -1 (1,73 m 2 ) -1 ]. Po pøidání pohlaví jako promìnné do rovnice eg R byl nicménì získán opravný faktor 0,99 pro ženské pohlaví, což naznaèuje, že odhady vypoètené pomocí rovnic s faktorem pohlaví a bez nìj budou podobné. Níže uvedené výsledky interní validace se tedy týkají pouze rovnice eg R z vývojového souboru bez faktoru pohlaví (v tabulkách oznaèené CAPA ). 18 Labor Aktuell 01/15

6 a dìtí [-9 a -11 ml min -1 (1,73 m 2 ) -1 u mediánu]. Bias a správnost obou dvou rovnic byly obecnì podobné u mužù i žen ve všech tøech validaèních kohortách. U švédských dospìlých byla hodnota P30 u rovnice CAPA u mužù a žen 81 %, respektive 84 %, a u rovnice CKD-EPI 81 % a 78 % (není uvedeno v tabulkách). Odpovídající èísla u japonských dospìlých byla 77 % a 78 % u CAPA a 77 % a 81 % u CKD-EPI. Rovnice CKD-EPI byla ménì pøesná u dívek (P30 = 74 %) než u chlapcù (P30 = 86 %), zatímco rovnice CAPA mìla podobné vlastnosti u obou pohlaví (P30 = 81 % u chlapcù a 79 % u dívek). Tab. 4: Srovnání rovnic CAPA a CKD-EPI založených na cystatinu C, provedené pomocí bias a správnosti, stratifikované podle intervalù mg R, vìku a BMI u validaèních souborù švédských dospìlých (n = 1200) a japonských dospìlých (n = 350). V tabulce jsou uvedeny hodnoty mediánu mg R pro rùzné intervaly G R a vìku. Interní validace Celková správnost rovnice CAPA byla ve všech 3 validaèních kohortách uspokojivá (P30 = 83 %, 78 %, a 80 % u švédských dospìlých, respektive japonských dospìlých a dìtí) a srovnatelná s rovnicí CKD- -EPI založené na cystatinu C (tabulka 3). Rovnice CAPA i CKD-EPI vykazovaly urèitý záporný bias u švédských dospìlých [-5 a -6 ml min -1 (1,73 m 2 ) -1 u mediánu] Stratifikace podle G R u dospìlých Ve švédské kohortì vykazovaly rovnice CAPA i CKD-EPI pøi hodnotách mg R 90 ml min -1 (1,73m 2 ) -1 se stoupajícími namìøenými hodnotami mg R stoupající záporný bias, s maximem kolem -15, respektive -9 ml min -1 (1,73m 2 ) -1 (tabulka 4). Se zvyšující se mg R se zároveò zvyšovala správnost vyjádøená jako P30 (tabulka 4). V japonské kohortì nebyla zaznamenána žádná nápadná hodnota bias kromì záporného bias [11 ml min -1 (1,73m 2 ) -1 u mediánu] pøi použití rovnice CAPA pøi mg R 90 ml min -1 (1,73m 2 ) -1. U obou rovnic byly zaznamenány substandardní hodnoty P30 pøi <30 ml min -1 (1,73m 2 ) -1 v japonské dospìlé populaci. Stratifikace podle vìku u dospìlých Ve švédské kohortì vykazovaly rovnice CAPA i CKD-EPI záporný bias [4 až 6 ml min -1 (1,73m 2 ) -1 ] ve všech vìkových intervalech, zatímco v japonské kohortì nevykazovala ani jedna z rovnic prakticky žádný bez ohledu na vìk (tabulka 4). Ve švédské kohortì byly zaznamenány substandardní hodnoty P30 u starších osob (>80 let) u obou rovnic, ale v japonské kohortì pouze u rovnice CAPA. Struktura substandardních hodnot P30 v této vìkové skupinì byla podobná u mužù i žen (není uvedeno v tabulkách). Tab. 5: Srovnání rovnic CAPA a CKD-EPI založených na cystatinu C, provedené pomocí bias a správnosti, stratifikované podle intervalù mg R a vìku u souboru smíšené kohorty holandských a švédských dìtí (n = 246) pro interní validaci. V tabulce jsou uvedeny hodnoty mediánu mg R pro rùzné intervaly G R a vìku.a Stratifikace podle indexu tìlesné hmotnosti u dospìlých Ve švédské kohortì vykazovaly rovnice CAPA i CKD-EPI ve všech intervalech indexu tìlesné hmotnosti (BMI) záporný bias [3 až 7 ml min -1 (1,73m 2 ) -1 ], zatímco v japonské kohortì nevykazovala ani Labor Aktuell 01/15 19

7 Rovnice CAPA cystatin C Rovnice CKD-EPI cystatin C Rovnice CKD-EPI cystatin C Rovnice CAPA cystatin C Rovnice CAPA cystatin C Rovnice CKD-EPI cystatin C Obr. 1: Jednotlivé odchylky (eg R - mg R) rovnic CAPA a CKD-EPI cystatin C pøi rùzných hodnotách mg R v kombinovaných datových souborech (vývojových + validaèních). (A a B), švédští dospìlí, n 3 495; (C a D), japonští dospìlí, n 763; (E a ), dìti, n 702. Èáry pøedstavují 30% limity vztažené k mg R. Rovnice CKD-EPI není urèena k použití u dìtí, výsledky jsou uvedeny pouze pro srovnání. jedna z rovnic prakticky žádný bias v žádném intervalu BMI s výjimkou rovnice CKD-EPI pøi BMI <20 kg/m 2 [+4 ml min -1 (1,73m 2 ) -1 ] (tabulka 4). Rovnice ukázaly P30 = 75 % ve všech intervalech BMI v obou kohortách. Stratifikace podle glomerulární filtrace u dìtí Rovnice CAPA i CKD-EPI vykazovaly záporný bias [2 až 6 ml min -1 (1,73m 2 ) -1 ] pøi namìøených hodnotách G R <120 ml min -1 (1,73m 2 ) -1, zatímco pøi G R vyšší než tato hodnota byl záporný bias výrazný a u obou rovnic pøekraèoval 25 ml min -1 (1,73m 2 ) -1 (tabulka 5). P30 se pøesto pøi všech namìøených hodnotách G R pohyboval u obou rovnic mezi 77 % a 83 %. Stratifikace podle vìku u dìtí Rovnice CAPA i CKD-EPI vykazovaly se zvyšujícím se vìkem zvýšený záporný bias, který dosahoval -12 a -13 ml min -1 (1,73m 2 ) -1 ve vìku >12 let (tabulka 5). P30 se pøesto ve všech vìkových intervalech pohyboval u obou rovnic mezi 76 % a 86 %. inální rovnice inální rovnice CAPA s koeficienty odhadnutými z kompletního souboru dat je eg R = 130 cystatin C -1,069 vìk -0, (Rov. 3) Hodnota P30 finální rovnice CAPA v celém datovém souboru byla 80,6 % u švédských dospìlých, 77,5 % u japonských dospìlých a 82,2 % u dìtí. Na obr. 1 je vidìt rozdíl mezi eg R a mg R pøi rùzných úrovních mg R, získaný pomocí rovnic CAPA a CKD-EPI z celého datového souboru švédské a japonské kohorty dospìlých i dìtí, spolu s limity správnosti vyjádøenými jako P30. Diskuse Tato studie se zabývá tím, zda použití certifikovaného referenèního materiálu a dalších menších úprav šesti komerènì dostupných stanovení cystatinu C mùže zvýšit shodu mezi stanoveními tak, aby bylo možné pomocí populace cca jedincù se známou G R urèit obecnou 20 Labor Aktuell 01/15

8 a na stanovení prakticky nezávislou rovnici pro odhad G R z cystatinu C. CV 9,7 % u pùvodních stanovení, dosahované po nìkolik let v systému vyhodnocování kvality, se použitím certifikovaného referenèního materiálu a dalších optimalizací stanovení snížil na 2,8 %. Rovnici eg R vygenerovanou pomocí prùmìrných hodnot cystatinu C, získaných dvìma upravenými stanoveními aplikovanými v populaci pacientù, bylo možné použít u všech šesti stanovení vèetnì Alfresa jen s drobnými rozdíly ve výsledných odhadech G R (doplòující obr. 4B online ukazuje výsledky ètyø tìchto stanovení). Zbývající rozdíly v odhadech G R pomocí všech sedmi stanovení jsou celkovì pøíliš malé, než aby ovlivòovaly klinické rozhodování ve vìtšinì pøípadù. Napøíklad pøi klinicky významných koncentracích cystatinu C 1,22; 2,1 a 3,5 mg/l, které pøibližnì odpovídají hodnotám eg R 15, 30, a 60 ml min -1 (1,73 m 2 ) -1, byla celková rozmezí eg R urèená 7 stanoveními v této studii 14-16, respektive a ml min -1 (1,73 m 2 ) -1. Nìkteré z provedených úprav lze snadno aplikovat i u jiných stanovení než tìch, která byla používána v této studii, a snížit tak variabilitu. To je zvláštì patrné z umístìní kalibraèních bodù (viz online doplòující obrázek è. 2). Nejèastìjší rozhodování se týká toho, zda má urèitý jedinec normální, nebo sníženou G R, a proto by se zdálo vhodné mít vìtšinu kalibraèních bodù v odpovídajícím intervalu koncentrací cystatinu C 0,8 2,0 mg/l. Toto odpovídá odhadùm G R asi od 100 smìrem dolù na 30 ml min -1 (1,73 m 2 ) -1, vypoèteným pomocí rovnice CAPA z této práce. unkèní charakteristiky rovnice CAPA byly porovnány s jinou novou rovnicí využívající cystatin C (CKD-EPI) s použitím stanovení cystatinu C, jehož výsledky jsou vysledovatelné k certifikovanému referenènímu materiálu ERM-DA471/I CC (36). Populace použité k vygenerování obou rovnic se znaènì lišily. Zatímco populace použitá k vygenerování rovnice CKD-EPI zahrnovala dospìlé bìlochy a Afroamerièany, populace použitá k vývoji rovnice CAPA zahrnovala velké podskupiny dospìlých a dìtí, Asiatù i bìlochù. V generování obou rovnic je ještì další rozdíl. Rovnice CKD-EPI je založená na nalezení matematicko-statistické souvislosti mezi mg R a cystatinem C, pohlavím a vìkem jedincù ve studované populaci bez snahy vyjádøit rovnici tak, aby byla možná její biologická interpretace. Pøi vývoji rovnice CAPA jsme se pokusili použít nejen výše popsaný matematicko-statistický postup, ale také postup podléhající podmínkám, které by mohly vygenerovat rovnici s možnou biologickou interpretací. V takové rovnici všechny èleny nebo jejich vìtšina odpovídají nìjakému fyziologickému procesu (35, 40). Tìmito podmínkami bylo, že by rovnice mìla obsahovat èlen blízký cystatinu C do síly -1, což odpovídá vyluèování volnì filtrované látky, a že by mìla obsahovat èlen pro nerenální clearance cystatinu C, protože víme, že taková clearance existuje. Byly vygenerovány oba typy rovnic a porovnána jejich diagnostická úèinnost. Protože se nelišila, bylo rozhodnuto o použití rovnice umožòující biologickou interpretaci. Zajímavý rozdíl mezi rovnicemi CKD-EPI a CAPA je, že rovnice CAPA nevyžaduje faktor pohlaví. To by mohlo mít praktický význam, protože pohlaví, stejnì jako rasa, není vždy jasnì definováno. Nìkolik zemí dnes napøíklad rozeznává více než dvì pohlaví (41). Pøestože univerzální rovnice mají mnoho praktických výhod, v urèitých podskupinách vymezených napø. hodnotami G R, BMI nebo vìkem mají nevyhnutelnì nižší úèinnost. V této studii byly zaznamenány podhodnocené odhady u pacientù s G R v referenèních intervalech, zejména u dìtí. Správnost P30 byla i pøesto pøijatelná, nelze ale vylouèit, že rovnice specifické pro jednotlivé populace by úèinnost dále zvýšily. Pøestože rovnice CAPA a CKD-EPI založené na cystatinu C byly vytvoøeny odlišným zpùsobem, vykazovaly podobnou dostateènou správnost jak celkovou, tak napøíè podskupinami. Rovnice CAPA má tu výhodu, že byla vyvinuta na základì odlišnìjších populací. Další výhodou je, že rovnice CAPA má ménì složitì vyjádøený vzorec, který neobsahuje faktor pohlaví. Je tøeba upozornit, že faktor pohlaví se u CKD-EPI nepodílí na snížených rozdílech úèinnosti mezi muži a ženami. Postupy generování rovnice CAPA a CKD-EPI se sice v nìkolika ohledech výraznì lišily, mìly však jeden spoleèný prvek, a to použití metod pro stanovení cystatinu C pøizpùsobených certifikovanému referenènímu materiálu ERM-DA471/I CC. Vìøíme, že toto je rozhodující krok ke snížení poètu rovnic pro odhad G R z cystatinu C, které budou v budoucnu nutné pro klinické použití a k dosažení plného využití potenciálu cystatinu C pøi klasifikaci onemocnìní ledvin (42). Pøíspìvky autorù: Všichni autoøi potvrdili, že pøispìli k intelektuálnímu obsahu této práce a splnili tyto tøi požadavky: (a) významné pøispìní ke koncepci a designu, získávání dat nebo analýze a interpretaci dat; (b) koncipování nebo revize èlánku, který je souèástí intelektuálního obsahu práce; (c) finální schválení publikovaného èlánku. Zveøejnìní informací o autorech nebo potenciálních støetech zájmù: Pøi odevzdání rukopisu vyplnili všichni autoøi formuláø zveøejnìní informací o autorovi Zveøejnìné informace a/nebo potenciální støety zájmù. Zamìstnání nebo vedoucí funkce: K. Sunde, Gentian; D. Armbruster, Abbott Diagnostics; C. errero, spoleènost Sentinel CH. Konzultaèní nebo poradenská funkce: Y. Yasuda, Astellas. Vlastnictví cenných papírù: K. Sunde, Gentian; D. Armbruster, Abbott Diagnostics. Honoráøe: Nedeklarováno. inancování výzkumu: Nedeklarováno. Znalecké svìdectví: Nedeklarováno. Patenty: Nedeklarováno. Sponzorství: Nebyl deklarován žádný sponzor. Podìkování: Jsme vdìèni za pøíspìvky Güntera Trefze, Marka Schmida, B rda Sundrehagena, Erlinga Sundrehagena, Toma Justa, abia Magra, Magnuse Jonssona a Gunnara Sternera do tohoto rukopisu a za významnou èást obsažených dat. Labor Aktuell 01/15 21

9 Literatura: 1) Rehberg PB. Studies on kidney function: the rate of filtration and reabsorption in the human kidney. Biochem J 1926;20: ) Grubb, A. Non-invasive estimation of glomerular filtration rate (G R). The Lund model: simultaneous use of cystatin C- and creatinine-based G R prediction equations, clinical data and an internal quality check. Scand J Clin Lab Invest 2010;70: ) Shannon JA. The renal excretion of creatinine in man. J Clin Invest 1935;14: ) Perrone RD, Madias NE, Levey AS. Serum creatinine as an index of renal function: new insights into old concepts. Clin Chem 1992;38: ) Bauer JH, Brooks CS, Burch RN. Clinical appraisal of creatinine clearance as a measurement of glomerular filtration rate. Am J Kidney Dis 1982;2: ) van Acker BA, Koomen GC, Koopman MG, Krediet RT, Arisz L. Discrepancy between circadian rhythms of inulin and creatinine clearance. J Lab Clin Med 1992; 120: ) Burry HC, Dieppe PA. Apparent reduction of endogenous creatinine clearance by salicylate treatment. Br Med J 1976;2: ) Blackwood WS, Maudgal DP, Pickard RG, Lawrence D, Northfield TC. Cimetidine in duodenal ulcer. Controlled trial. Lancet 1976;2: ) Levey AS, Coresh J, Greene T, Stevens LA, Zhang YL, Hendriksen S, et al. Chronic Kidney Disease Epidemiology Collaboration. Using standardized serum creatinine values in the modification of diet in renal disease study equation for estimating glomerular filtration rate. Ann Intern Med 2006;145: ) Levey AS, Stevens LA, Schmid CH, Zhang YL, Castro A, eldman HI, et al. CKD-EPI. A new equation to estimate glomerular filtration rate. Ann Intern Med 2009; 150: ) Nyman U, Grubb A, Larsson A, Hansson LO, lodin M, Nordin G, et al. The revised Lund-Malmö G R estimating equation outperforms MDRD and CKD-EPI across G R, age and BMI intervals in a large Swedish population. Clin Chem Lab Med 2014 Jun;52(6): ) Löfberg H, Grubb A. Quantitation of γ- trace in human biological fluids: indications for production in the central nervous system. Scand J Clin Lab Invest 1979;39: ) Grubb A, Simonsen O, Sturfelt G, Truedsson L, Thysell H. Serum concentration of cystatin C, factor D and β 2-microglobulin as a measure of glomerular filtration rate. Acta Med Scand 1985;218: ) Simonsen O, Grubb A, Thysell H. The blood serum concentration of cystatin C (γtrace) as a measure of the glomerular filtration rate. Scand J Clin Lab Invest 1985; 45: ) Kyhse-Andersen J, Schmidt C, Nordin G, Andersson B, Nilsson-Ehle P, Lindström V, et al. Serum cystatin C, determined by a rapid, automated particle-enhanced turbidimetric method, is a better marker than serum creatinine for glomerular filtration rate. Clin Chem 1994;40: ) Preiss DJ, Godber IM, Lamb EJ, Dalton RN, Gunn IR. The influence of a cooked-meat meal on estimated glomerular filtration rate. Ann Clin Biochem 2007;44: ) Tangri N, Stevens LA, Schmid CH, Zhang YL, Beck GJ, Greene T, et al. Changes in dietary protein intake has no effect on serum cystatin C levels independent of the glomerular filtration rate. Kidney Int 2011; 79: ) Thomassen SA, Johannesen IL, Erlandsen EJ, Abrahamsen J, Randers E. Serum cystatin C as a marker of the renal function in patients with spinal cord injury. Spinal Cord 2002;40: ) Jenkins MA, Brown DJ, Ierino L, Ratnaike SI. Cystatin C for estimation of glomerular filtration rate in patients with spinal cord injury. Ann Clin Biochem 2003;40: ) Viollet L, Gailey S, Thornton DJ, riedman NR, lanigan KM, Mahan JD, et al. Utility of cystatin C to monitor renal function in Duchenne muscular dystrophy. Muscle Nerve 2009;40: ) Young, Ensom MH. Pharmacokinetics of aminoglycosides in patients with chronic spinal cord injury. Am J Health Syst Pharm 2011;68: ) Segarra A, de la Torre J, Ramos N, Quiroz A, Garjau M, Torres I, et al. Assessing glomerular filtration rate in hospitalized patients: a comparison between CKD-EPI and four cystatin C-based equations. Clin J Am Soc Nephrol 2011;6: ) iller G, Gharib M, Casier S, Lödige P, Ehrich JH, Dave S. Prevention of chronic kidney disease in spina bifida. Int Urol Nephrol 2012;44: ) Grubb A, Blirup-Jensen S, Lindström V, Schmidt C, Althaus H, Zegers I, on behalf of the I CC Working Group on standardisation of cystatin C (WG-SCC). irst certified reference material for cystatin C in human serum ERM-DA471/I CC. Clin Chem Lab Med 2010;48: ) Zegers I, Auclair G, Schimmel H, Emons H, Blirup-Jensen S, Schmidt C, et al. Certification of cystatin C in the human serum reference material ERM -DA471/I CC, Certified Reference Material ERM -DA471/I CC. Luxembourg: Publications Office of the European Union; EUR EN. 26) Blirup-Jensen S, Grubb A, Lindström V, Schmidt C, Althaus H. Standardization of cystatin C: development of primary and secondary reference preparations. Scand J Clin Lab Invest 2008; 68(Suppl. 241):S ) Krutzen E, Bäck SE, Nilsson-Ehle I, Nilsson-Ehle P. Plasma clearance of a new contrast agent, iohexol: a method for the assessment of glomerular filtration rate. J Lab Clin Med 1984;104: ) Jacobsson L. A method for calculation of renal clearance based on a single plasma sample. Clin Physiol 1983;3: ) Matsuo S, Imai E, Horio M, Yasuda Y, Tomita K, Nitta K, et al. Revised equations for estimating glomerular filtration rate (G R) from serum creatinine in Japan. Am J Kidney Dis 2009;53: ) Blufpand HN, Tromp J, Abbink CH, Stoffel-Wagner B, Bouman AA, Antoinette YN, et al. Cystatin C more accurately detects mildly impaired renal function than creatinine in children receiving treatment for malignancy. Pediatr Blood Cancer 2011;57: ) Swedish Council on Health Technology Assessment. Methods to estimate and measure renal function (glomerular filtration rate). unction.pdf (Accessed April 2014). 32) DuBois D, DuBois E. A formula to estimate the approximate surface area if height and weight be known. Arch Intern Med 1916;17: ) inney H, Newman DJ, Gruber W, Merle P, Price CP. Initial evaluation of cystatin C 22 Labor Aktuell 01/15

10 measurement by particle-enhanced immunonephelometry on the Behring nephelometer systems (BNA, BN II). Clin Chem 1997; 43: ) Tanaka M, Matsuo K, Enomoto M, Mizuno K. A sol particle homogeneous immunoassay for measuring serum cystatin C. Clin Biochem 2004;37: ) Horio M, Imai E, Yasuda Y, Watanabe T, Matsuo S, on behalf of the Collaborators Developing the Japanese Equation for Estimated G R. G R estimation using standardized serum cystatin C in Japan. Am J Kidney Dis 2013;61: ) Inker LA, Schmid CH, Tighiouart H, Eckfeldt JH, eldman HI, Greene T, et al. Estimating glomerular filtration rate from serum creatinine and cystatin C. N Engl J Med 2012;367: ) Stevens LA, Zhang Y, Schmid CH. Evaluating the performance of equations for estimating glomerular filtration rate. J Nephrol 2008;21: ) National Kidney oundation. K/DOQI clinical practice guidelines for chronic kidney disease: evaluation, classification, and stratification. Part 5. Evaluation of laboratory measurements for clinical assessment of kidney disease. Am J Kidney Dis 2002;39:S76 S ) Blirup-Jensen S. Protein standardization III: Method optimization. Basic principles for quantitative determination of human serum proteins on automated instruments based on turbidimetry or nephelometry. Clin Chem Lab Med 2001;39: ) Sjöström P, Tidman M, Jones I. Determination of the production rate and non-renal clearance of cystatin C and estimation of the glomerular filtration rate from the serum concentration of cystatin C in humans. Scand J Clin Lab Invest 2005;65: ) Daily News. Germany to add third gender option to birth certificates. com/life-style/health/ger- many-gender-birthcertificates-article (Accessed April 2014). 42) Shlipak MG, Matsushita K, Ärnlöv J, Inker LA, Katz R, Polkinghorne KR, et al. Cystatin C versus creatinine in determining risk based on kidney function. N Engl J Med 2013;369: Zázraèný bílý prášek Pøed více než 80 lety vynalezl švýcarský chemik Tadeus Reichstein proces, kterým bylo možné synteticky vyrábìt vitamin C. Švýcarský chemik a botanik Tadeus Reichstein spustil v roce 1933 nevìdomky trend, který ve zdravotnictví trvá dodnes. Výroba vitaminu C laboratorním procesem, jenž je po svém vynálezci pojmenován Reichstein, byla pøedpokladem toho, aby se vitamin C zaèal masivnì využívat v potravinových doplòcích jako záruka pevnìjšího zdraví a jako forma dostupná každému. Tadeus Reichstein pak za jiný svùj objev získal v roce 1950 Nobelovu cenu v oblasti fyziologie a lékaøství. Reichsteinùv objev se zrodil v období ekonomické krize pøedcházející druhé svìtové válce. Jak krize, tak posléze válka mìly vliv na to, že se prùmyslová produkce vitaminu C setkala s komerèním úspìchem. Roche koupilo Reichsteinùv patent a vyvinulo fermentaèní proces v hlubokém tanku s pomocí vinných kvasinek, které použil už Reichstein. V tomto procesu sorbitol oxiduje na sorbózu. Úspìch spoleènosti Roche pøedstavoval senzaci bylo to poprvé v historii, kdy farmaceutická firma využila ve velkovýrobì biotechnologii. Tento technologický prùlom uèinil z Roche významného hráèe v oblasti syntetické chemie. Pøijmeme chemiky se speciálním vzdìláním Na švýcarské národní výstavì v roce 1939 pøedstavila spoleènost Roche model výrobního zaøízení na vitamin C v mìøítku 1:10. Doprovodný leták, vydaný asociací švýcarských farmaceutických a chemických výrobcù, zdùrazòoval, že pouze chemici speciálnì vzdìlaní v použitých technologiích mohou kontrolovat a øídit takto komplexní proces. Reichsteinùv proces byl na výstavì oslavován jako vzor pokroku ve švýcarské vìdì. Vzhledem ke globálnímu politickému dìní doby vnesl tento dùraz na švýcarský pùvod do výstavy novou dimenzi Roche se distancovalo od Tøetí øíše. Bìhem druhé svìtové války produkovala spoleènost nìkolik tun vitaminu C mìsíènì a po mnoho dekád zùstala pøedním producentem tohoto vitaminu. Spoleènost Roche sice divizi na výrobu vitaminù krátce po zaèátku nového milénia prodala, ovšem souèasné technologie pro masovou výrobu vitaminu C zùstávají i nadále založeny na pùvodním Reichsteinovì procesu. Christiane Wild Raidt. MyRoche, 2014/5 Labor Aktuell 01/15 23