v molekulárn rní mikrobiologické diagnostice R. Horváth

Transkript

1 Správn vná laboratorní praxe v molekulárn rní mikrobiologické diagnostice R. Horváth

2 Global Nucleic Acid Testing Market to Reach US$5.6 Billion by 2015, According to New Report by Global Industry Analysts, Inc. Global market for nucleic acid testing is projected to reach US$5.6 billion by the year Growing demand for nucleic acid testing in developing customized medicines and in enhancing the healthcare sector within the life sciences industry is expected to accelerate the market in the coming years. Nucleic Acid Testing: A Global Market Report San Jose, California (Vocus) June 3, 2010

3 Metody molekulárn rní biologické diagnostiky Detekce nukleové kyseliny mikroorganismů Z pohledu klinické diagnostiky se jedná o tzv. přímou diagnostickou metoda Mikroorganismus nebo jeho části (NK) musí ve vzorku být přítomnp tomné Převažuje metodický postup ověř ěření podezřen ení na přítomnost p konkrétn tního mikroorganismu (i v bakteriologii)

4 Work flow : Zamezení kontaminace amplifikačním produktem Zamezení kontaminace PCR izolovanou NK Efektivita práce (ergonomie) Vybavení: Zázemí PROSTOR 1 Uspořádání laboratoří a jejich vybavení pro detekci NK pomocí PCR. personální a materiálové propusti ; sklady ; úklid ; likvidace odpadu Úprava vzorku a izolace - provádí se v Biohazard boxu PROSTOR 2Příprava amplifikační reakce provádí se v laminárním nebo v tzv. PCR boxu PROSTOR 3vybavení pro gelovou elektroforézu NK (samostatný prostor; dobře oddělený od 1 a 2 a na konci work-flow) Další specifické vybavení Drobné lab.vybavení (pipety, centrifuga, termoblok,..) Termocykler (certifikovaný CE IVD, verifikovaný, validovaný) automatické izolátory / liquid handling systems / detekční automaty Prostory -specifické požadavky podle ISO (BL3 /UTZ3) a legislativa pro zajištění bezpečností zdraví při práci -Biologické zbraně / GMO

5 Správn vná laboratorní praxe kontrola kvality Účelem je snížen ení pravděpodobnosti podobnosti nesprávných výsledků Rizika nesprávných výsledků důsledkem v klinice může být nesprávná diagnóza, neodhalení příčiny onemocnění, chybný postup v průběhu léčby Nesprávné výsledky: Postupy QC Kontrola: Falešná pozitivita Falešná negativita Chybná specifita výsledku Chybná kvantifikace systém laboratorních kontrol systém laboratorních kontrol systém lab.kontrol ; EHK systém lab.kontrol ; EHK Vnitřní technologická kontrola kvality systém laboratorních kontrol všech kroků detekce Externí (mezilaboratorní) technologická kontrola kvality srovnání výsledků laboratoře s mezinárodními standardy (EHK) Vnitřní procesní kontrola kvality a externí kontrola kvality řízení procesů systém řízení jakosti (ISO); dokumentace; externí kontrola notifikovanou osobou; specifické legislativní předpisy na úrovni zemí a na úrovni EU Certifikace použitých materiálů a přístrojů výrobce odpovídá za správnost výsledků při správném použití ; nutná je Kontrola kvality vývoje, výroby Certifikace / akreditace prostředí laboratoře Normy ISO a ISO ; ISO ; ISO 9001

6 Mezilaboratorní kontrola kvality

7 Mezilaboratorní kontrola kvality Systém m externích kontrol v mikrobiologické diagnostice (EHK) Klíčovou roli v systému kontroly kvality práce hraje externí kontrola kvality. Za přípravu externích kontrol je zodpovědná specializovaná externí instituce státní zdravotní ústavy / instituce privátní a státní Mezinárodní instituce (Instadt, Německo; QCMD Skotsko aj.), Metodika: Umělé kontrolní vzorky jsou rozeslány účastnícím se laboratořím Laboratoře provedou příslušná kvalitativní či kvantitativní stanovení a výsledky pošlou zpět Instituce pak srovnáním výsledků zjistí rozptyl v naměřených hodnotách, stanoví přijatelnou míru odchylky a posoudí, které laboratoře se do této odchylky vešly. Těm pak vystaví certifikát, kterým laboratoř prokazuje kvalitu své práce.

8 Hybridizační metody Přehled metod užívaných u v rutinní klinické diagnostice hybridizace se značenou DNA sondou - Rutinní při i detekci streptokoků,, gonokoků či i chlamydií (známá jako GenProbe ) in situ hybridizace - patologické laboratoře e (HPV) bdna (branched DNA; využívan vaná například firmou BayerDiagnostics, USA) -namísto amplifikace sekvence NK využívá amplifikace signálu navázan zaného ligandu, ke kterému dojde pouze v případp padě pozitivního výsledku detekce hybrid capture assay - hybridizace s RNA sondou ; detekuje se hybrid RNA/DNA -poměrně spolehlivá a levná a méněm citlivá detekci virů HBV, HCMV a detekci a typizaci papilomavirů (výrobce Digene). Stripová metoda - kombinace hybridizačních metod se sondami nanesenými na proužcích ch papíru s chromatografií -výhodou je jednoduchost provedení daná čtením m výsledku jako čárového kóduk du -Nevýhodou je nízkn zká citlivost a opakovatelnost -Omezené orientační použit ití pro rozlišov ování typů virů hepatitid; HPV typizace, detekce ADeV, Rotavirů,

9 Přehled metod užívaných u v rutinní klinické diagnostice Amplifikační metody Polymerázov zová řetězová reakce (PCR) zcela převap evažující standardizovatelná automatizovatelná dostatek klinických studií NASBA (nucleic acid sequence based amplification) Ligázov zová řetězová reakce (LCR ligase chain reaction) a další. PCR podrobněji viz dále d

10 Amplifikační metody detekce NK. Polymerázov zová řetězová reakce (PCR) PCR - pro průkaz většiny mikroorganizmů, včetně bakterií, kvasinek, plísní, prvoků a DNA-virů reverzně-transkripční PCR (rtpcr) - pro průkaz nested PCR / single-tube nested PCR multiplex PCR kvantitativní PCR (qpcr) Způsob analýzy amplifikace Real-time PCR s detekcí amplifikačního produktu v reálném čase End-point PCR s elektroforetickou analýzou amplifikačního

11 Rutinní použit ití mol.dg. metod v klinické praxi KLINICKÉ PRACOVIŠTĚ Indikace k vyšet etření Odběr r vzorku Interpretace klinická Klinické využit ití výsledku Následný postup Transport Předání výsledku konzultace LABORATOŘ Uchování vzorku Úprava vzorku Izolace NK Analýza NK Laboratoní a klinická interpretace

12 Rutinní použit ití mol.dg. metod v klinické praxi DIAGNOSTICKÝ PROCES / DETEKCE KLINICKÉ PRACOVIŠTĚ Indikace k vyšet etření Odběr r vzorku Interpretace klinická Klinické využit ití výsledku Následný postup Transport Předání výsledku konzultace LABORATOŘ Uchování vzorku Úprava vzorku Izolace NK Analýza NK Laboratoní a klinická interpretace

13 Specifika odběrů: Metodika odběru a transportu klinických vzorků do laboratoře Metodami molekulárn rní diagnostiky lze vyšet etřit téměř jakékoliv koliv vzorky Zvýšen ené riziko kontaminace - hrozí zvláš áště při i odběru vzorku Správn vná volba vzorku pro přímou p dg.metodu - je nezbytné odebrat vzorek, ve kterém m lze předpoklp edpokládat dat v dané fázi onemocnění přítomnost sledovaného mikroorganizmu Není třeba zachovat mikroorganizmy životaschopné - vzorky lze zmrazit Nutnost již při i odběru rozlišovat ovat vzorky pro detekci DNA a RNA rozdíl l v technologii zpracování vzorku a rozdíln lná stabilita (transport a uchování vzorku) Nutnost přesnp esné specifikace vyšet etření již při i odběru vzorku - cílené vyšet etřování konkrétn tních mikroorganizmů nebo alespoň skupin mikroorganizmů (Je to dáno d nutností použit ití specifických komplementárn rních sekvencí ; specifickými technologiemi ; specifickými odběrovými materiály, apod.)

14 Zpracování vzorku před p izolací NK Vzorky před izolací NK převést do stavu vhodného pro zvolenou izolační metodu Převedení do formy roztoku nebo alespoň suspenze Koncentrace materiálu (zvýšení citlivosti detekce) Homogenizace vzorků (tkáně, sputum vyšší výtěžky NK a vyšší pravděpodobnost záchytu hledaného agens) Nutnost minimalizovat rizika pro laboratorní personál. rizikové mikroorganizmy: Mycobacterium tuberculosis, Francisella tullarensis, leptospiry, Coxiella burnetii, viry chřipky, SARS, Ebola, viry hepatitid, případně i viry HIV, HPV, apod. Izolovaná RNA HCV je považována za infekční!

15 Přehled nejčast astěji zpracovávaných vaných vzorků tělní tekutiny - 1 Periferní krev vkládá se do izolace NK přímo Je homogenní, ale obsah buněčných frakcí je variabilní V krvi lze NK inf.agens kvantifikovat Je možné izolovat frakce pro detekci NK bakterií a kvasinek při podezření na generalizovanou infekci nebo bakteriemii (například sepse, borelióza, kvasinky, toxoplazmóza či malárie apod.) při potřebě vyšetření virů, jejichž životní cyklus zahrnuje infekci buněk krve (parvovirus, cytomegalovirus, EBV apod.). Krev není zcela sterilní materiál! Obsahuje specifický inhibitor polymerázy Hem Plazma či sérum vkládá se do izolace NK přímo Je homogenní V plasmě lze NK inf.agens kvantifikovat Plazma je nejdůležitějším vzorkem pro detekci virů, které se uvolňují do krve, především virů hepatitid C a B. Plasma není zcela sterilní ; obsahuje volné NK Plazmu nezahřívat! Moč Vkládá se do izolace NK přímo Je homogenní / snadno homogenizovatelná / obsahuje variabilní koncentrace frakcí Pro detekci STD a močových infekcí : chlamydie, méně často gonokoky ; legionely, borelie, viry Lze koncentrovat centrifugací (C.trachomatis) Běžně odebraná moč je kontaminovaná / katetrizovaná moč Může obsahovat inhibitory PCR (produkty rozpadu krve)

16 Sputum Přehled nejčast astěji zpracovávaných vaných vzorků tělní tekutiny -2 Před izolací se ztekucuje a homogenizuje Nehomogenní viskózní materiál Obsahuje variabilní podíl buněčné frakce. Pro vyšetření respiračních patogenů mykobakterie, legionely, chlamydie a mykoplazmata, bordetely, vzácněji virů (cytomegalovirus, ) apod. Punkáty Vkládá se přímo do izolace NK Nehomogenní a variabilní; často obsahují inhibitory PCR punktáty synoviální tekutiny z kloubů - borelie ; punktáty perikardia, Sperma Vkládá se přímo do izolace NK Nehomogenní / variabilní při podezření na pohlavně přenosné choroby nebo pro vyloučení chlamydiové infekce u vzorku určeného pro in vitro fertilizaci. Mozkomíšní mok (CSF, likvor) Vkládá se přímo do izolace NK Homogenní primárně sterilní materiál / pro diagnostiku boreliózy ve stadiu napadení CNS, neurotropních virů (včetně HSV a VZV), méně často pak pro průkaz bakteriálních původců meningitid apod. lze centrifugací zkoncentrovat. Plicní aspiráty, výplach hrdla, BAL Vkládá se přímo do izolace NK Variabilní a nehomogenní Pro diagnostiku respiračních infekcí

17 Výtěry a stěry Provádějí se pomocí sterilního tamponu nebo kartáčku Přehled nejčast astěji zpracovávaných vaných vzorků ostatní materiály Stěry ze sliznic respiračního traktu - respirační patogeny Výtěry z pochvy, stěr z cervixu, výtěr s uretry - pro detekci původců STD (chlamydie, gonokoky, mykoplazmata, ureaplazmata, papilomaviry aj.) Předizolační úprava: tampony s výtěrem se vloží do fyziologického roztoku a třepáním se do něj uvolní zachycený klinický materiál / možno centrifugací zkoncentrovat Biopsie, vzorky pevných tkání Nehomogenní před izolací NK homogenizace biopsie jater pro detekci virů hepatitid, kožní biopsie pro detekci borelií nebo dermatomykóz, vzorky chlopní pacientů s infekční endokarditidou, plicní biopsie pro detekci mykobakterií nebo plísní apod Vzorky z katetrů, implantátů apod. Nehomogenní ; komplikovaný odběr mikroorganizmy uchycené v podobě biofilmu na površích Před izolací NK nutno mikroby z povrchu uvolnit do roztoku (seškrabováním či sonifikací) Z povrchů cévních katetrů lze detekovat původce septických stavů, mimo jiné i původce systémových mykóz u pacientů s febrilní neutropenií ; dále kloubní náhrady, umělé chlopně, cévní protézy,.. Stolice Vkládá se přímo do izolace NK vysoká míra inhibice ; speciální metody úpravy a izolace NK Pro detekce halikobaktera, rotaviru, ADeV,..

18 Izolace nukleových kyselin pro účely molekulárn rní mikrobiologické diagnostiky - 1 Účelem je purifikace NK vhodné pro vložení do PCR - izolovat NK -zkoncetrovat (zvýšení citlivosti detekce) -zbavit příměsí / inhibitorů

19 Izolace nukleových kyselin pro účely molekulárn rní mikrobiologické diagnostiky - 2 Metoda kolonková PRINCIP: vazba NK na amorfní SiO 2 1.Vzorek je lyzován 2.NK se zachytává na kolonkách na SiO 2 3.Navázané NK na fritě kolonky jsou proplachovány v proplachovacích roztocích s využitím separace na kolonce 4.Čistá NK je uvolněna elucí do roztoku o nízké iontové síle Metoda magnetická PRINCIP: vazba NK na Ab vázané na magnetickém nosiči 1.Vzorek je lyzován 2.NK se zachytává na magnetické kuličky ky pokryté specifickými anti-nk protilátkami 3.Navázané NK na kuličkách jsou propláchnuty s využitím separace magnetem v proplachovacích roztocích 4.Čistá NK je eluována specifickými roztoky PLUS Nízká cena MINUS Vyšší pracnost Nižší standardnost Obtížnější automatizace PLUS Automatizace Jednoduchost práce Standardní výsledky MINUS cena

20 Izolace nukleových kyselin pro účely molekulárn rní mikrobiologické diagnostiky vliv na citlivost detekce Citlivost molekulárních biologických metod je v diagnostice významně ovlivněna již ve fázi izolace NK Velkou roli zde hrají vstupní objem zpracovávaného vzorku míra zkoncentrování NK ve vzorku 1000 ul vzorku 100 ul izolátu NK PCR zkumavka (50 ul reakční objem) izolace zakoncentrování 10x 10 ul izolátu = 1/10 do PCR 2000 k/ml k/ml k/ul 200 k

21 Účelem je analýza izolované NK Analýza NK pro účely molekulárn rní mikrobiologické diagnostiky - 1 průkaz, případně i kvantifikace NK patogenních mikroorganismů PCR metoda - příprava Master Mixů a kontrolního materiálu V rutinní praxi - komerční PCR kity

22 In house metody a komerční metody detekce NK v klinické mikrobiologii - CE IVD Komerční diagnostika - zdravotnické přípravky pravky pro in vitro diagnostiku NK infekčních agens V současné době se v regionu EU nesmí na trh uvádět zdravotnické přípravky pro in vitro diagnostiku (tzv. in vitro devices, zkr. IVD) bez prohláš ášení o shodě. Toto prohlášení se rutinně označuje jako CE IVD a je vystavováno či vydáváno oprávněnými institucemi v souladu se směrnic rnicí Rady 98/79/ES ve znění pozdějších předpisů, jejichž požadavky jsou převzaty nařízen zením m vlády ČR č.. 453/2004 Sb. Certifikát se vydává pro každý typ diagnostika zvlášť a garantuje, že daný přípravek je vyráběn za podmínek splňujících požadavky citované směrnice. V současné době působí na evropském trhu řada výrobců in vitro diagnostických zdravotnických přípravků v oboru molekulární diagnostiky. Přípravky pro automatizované provozy velkých laboratoří dodávají zejména společnosti Roche, Abbott Laboratories, Siemens. Pro laboratoře zpracovávající menší objemy vzorků jsou určeny například výrobky od firem Digene, Nanogene, GeneProof, Quiagen aj. Výrobci přípravků pro humánní molekulární diagnostiku jsou podle nařízení vlády č. 453/2004 Sb. a 246/2009 Sb. povinni se registrovat a registrovat musí také své jednotlivé produkty. POZOR registrovat se musí i diagnostické laboratoře. Registrace se provádí u národních ministerstev zdravotnictví. In house metody V případě, že si laboratoř komerční diagnostika nekupuje, ale připravuje si je sama, hovoříme o tzv. in house nebo home-made diagnostice. Laboratoř, která se pro tento způsob práce rozhodla, musí provádět rozsáhl hlé validační studie a musí kontrolovat každou šarži i připravených p mastermixů i všech v kontrol. V případě, že tak nečiní, hrozí poměrně vysoké nebezpečí zkreslení výsledků vyšetření či vzniku chyb. To přímo ohrožuje pacienty a nese s sebou riziko eventuálních právních důsledků pro příslušné zdravotnické zařízení či laboratoř. Zkušenosti laboratoří pracujících s vlastními metodami však nejsou jednoznačně špatné a jejich výsledky mohou být i lepší než u laboratoří nakupujících diagnostika. Také náklady na samotnou reakci bývají nižší, než u komerčních diagnostik, ovšem za cenu vysokých nepřímých nákladů.

23 Správn vná laboratorní praxe - Riziko falešné pozitivity Základní problém: Vysoká citlivost (jednotky kopií) ) X zvýšen ené riziko kontaminace Křížová kontaminace (cross-contamination) při manipulaci silně pozitivních vzorků v blízkosti vzorků negativních (parvo, ADeV,..) Opatření - optimalizace work-flow ; systém kontrol Kontaminace amplifikačním m produktem Při nesprávném work-flow nebo nevyhovujícím prostorovém vybavení výborný specifický templát pro PCR Opatření optimalizace work-flow ; systém kontrol ; enzymatická ochrana PCR Princip metody: dutp v PCR reakci se začlení namísto části dttp ; po přidání enzymu uracil-dna-gylosylázy před započetím PCR reakce rozštěpí kontaminující amplikony (jež obsahují dutp), a poté se při prvním cyklu PCR enzym denaturuje a inaktivuje Nespecifická vazba oligonukleotidů v průběhu PCR Chybný design PCR (v důsledku polymorfizmů v cílové sekvenci templátu ) Selhání parametrů přístroje Opatření testy specifity během návrhu ; validace přístrojů ; účast na EHK ; CE IVD kity

24 Správn vná laboratorní praxe - Riziko falešné negativity Selhání izolace NK Izolace není zanedbatelná součást detekčního procesu! Příčiny: vada izolačního kitu ; vada izolačního automatu ; lidské selhání Opatření: CE IVD kity a validované přístroje ; systém kontrol Inhibice enzymů amplifikační reakce Klinické vzorky obsahují inhibitory (hem, soli, zbytky z izolace NK, příliš vysoká koncentrace NK,..) Závažný problém u vzorků stolice, moči, tkání, spermatu, biopsií a špatně odebrané krve Opatření: vhodná izolační metoda ; systém kontrol (interní standard) Pozor inhibice může být jen částečná ; přesto ovlivní výsledek kvantitativního stanovení! Polymorfismus cílových c nukleotidových sekvencí Chybný design PCR (v důsledku polymorfizmů v cílové sekvenci templátu ) Selhání parametrů přístroje nebo reakce (kitu) Opatření testy specifity během návrhu ; validace přístrojů ; účast na EHK ; CE IVD kity a validované přístroje ; neustálé inovace detekčního procesu Při návrhu - degenerované oligonukleotidy ; neustálé inovace detekční reakce s ohledem na vývoj poznatků Může dojít nejen k falešné negativitě, ale také jen k podhodnocení kvantifikace (jen částečná vazba oligonukleotidů snižuje efektivitu amplifikace) Ztráta ta cílovc lové sekvence Vlivem selekce, mutace nebo ztrátou plasmidu nesoucího cílovou sekvenci Opatření: CE IVD kity a/nebo neustálá inovace ; účast na EHK ; odbornost personálu.

25 Systém m reakčních kontrol NAT - 1 Pozitivní kontrola (PK) Testuje selhání amplifikace Provádí se min.1 na celou vyšetřovanou sadu vzorků Musí generovat pozitivní signál o určité očekávané intenzitě Jako pozitivní kontrola slouží uměle připravený vzorek (plasmid,..) Pozitivní izolační kontrola (PIK) Testuje celý detekční proces (přidává se do vzorku před izolací a projde celým procesem) Provádí se min.1 na celou vyšetřovanou sadu vzorků Musí generovat pozitivní signál o určité očekávané intenzitě Jako pozitivní kontrola slouží uměle připravený vzorek (plasmid, izolát kmene,..) Bývá nahrazována IS přidaným do vzorku před izolací Kvantitativní standard / sada kalibrátoru Několik ředění PK slouží ke generování kalibrační křivky Umožnuje kvantitativní stanovení NK ve vzorku Jeho kvalita určuje přesnost kvantifikace

26 Interní standard Systém m reakčních kontrol NAT - 2 Kontroluje rizika falešné negativity v důsledku inhibice reakce Je součástí KAŽDÉ jednotlivé reakce / detekce je zpravidla uměle připraven (plasmid / MIMICs) přidán přímo do amplifikační reakce - kontroluje inhibice PCR přidán do vzorku před izolací NK kontroluje izolaci a inhibici PCR zároveň (metodicky správnější ; u některých patogenů povinný postup) MIMICs metoda Interní standardy se připravují nejčastěji jako úseky NK ohraničené sekvencemi primerů používaných pro amplifikaci specifické sekvence NK hledaného patogenu. Při detekci mikroorganizmů s genomem tvořeným DNA se používají interní standardy připravené tzv. MIMICS metodu, kdy je uměle připravený úsek NK ohraničený sekvencemi specifických primerů začleněn do plazmidu a ten je pak používán jako interní standard. House-keeping kontrola V případě detekce RNA virů, zejména hepatitidy C a HIV, je výhodné používat namísto takto uměle připraveného klonovaného interního standardu koamplifikaci tzv. house-keeping genů či transkriptů (gen v eukaryotické buňce, který je exprimován ve všech typech buněk a ve všech vývojových stadiích; produkty kódované provozními geny jsou nezbytné pro základní funkce buňky).

27 Effective control of inhibition in each reaction Basic principle of quantitative kompetitive PCR system Pathogen DNA Primer 1 Primer 2 DNA of internal standard

28 Effective control of inhibition in each reaction Positive sample Negative sample Inhibition Specific signal Signal for internal standard

29 Kontrola falešně negativního výsledku - z důvodu inhibice nebo neúčinné izolace vzorku Pozitivní vzorek Negativní vzorek Inhibice, neúčinná izolace Fluorescency 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0, Fluorescency 1 0,8 0,6 0,4 0, Fluorescency 1 0,8 0,6 0,4 0, Specifický signál Cycle number Cycle number Cycle number Fluorescency 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0, Fluorescency 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0, Fluorescency 1 0,8 0,6 0,4 0, Signál pro interní standard Cycle number Cycle number Cycle number

30 Negativní kontrola (NK) Kontroluje rizika falešné pozitivity v důsledku kontaminace PCR, master mixu, při přidávání vzorků Provádí se min.1x na vyšetřovanou sadu vzorků přidání sterilní vody (zaručeně bez přítomnosti NK) do amplifikační reakce namísto vzorku Musí být negativní Izolační negativní kontrola (INK) Kontroluje rizika falešné pozitivity v důsledku kontaminace procesu izolace NK do procesu izolace NK je namísto vzorku vložena sterilní voda Musí být negativní Systém m reakčních kontrol NAT - 3 Na rozdíl od negativní kontroly indikuje nejen přítomnost kontaminace v samotné amplifikační reakci, ale také případnou kontaminaci při izolaci NK.

31 Molekulárn rní mikrobiologická diagnostika interpretace Interpretace je určena pro klinické pracovníky Laboratorní technologická interpretace vychází ze znalosti metod je nutné znát pozitiva a limity metod Klinická interpretace vyžaduje znalost klinické mikrobiologie prezentuje výsledky klinice ve využitelné podobě

32 Obecné zásady interpretace laboratorní diagnostiky Diagnózu nestanovují pracovníci ci laboratoře, ale ošeto etřující lékař! Využívá k tomu vedle poznatků o stavu pacienta i výsledky různých laboratorních vyšetření, a to včetně výsledků získaných molekulárněbiologickými metodami. Pro správnou interpretaci je tedy potřeba kombinovat výsledky molekulární diagnostiky s výsledky jiných laboratorních metod. Zejména jde o stanovení specifických protilátek (virové infekce, borelióza aj.) a nespecifických markerů infekce (například prokalcitonin, CRP). POZOR! Konečná interpretace výsledků a stanovení diagnózy musí být vždy prováděny v souvislosti s klinickým stavem pacienta. Neléčí se laboratorní výsledek, ale pacient!!!

33 negativní nález (-)( Laboratorní interpretace mol.dg. metod VÝSLEDKY LABORATORNÍHO VYŠET ETŘENÍ přítomnost nukleové kyseliny mikroorganizmu ve vyšetřeném vzorku nebyla prokázána kvalitativní pozitivní nález (+) přítomnosti nukleové kyseliny mikroorganizmu ve vzorku byla prokázána kvantitativní pozitivní nález přítomnost nukleové kyseliny mikroorganizmu ve vzorku byla prokázána a byla změřena kvantitativně (k/ml ; IU/ml ; IU/počet buněk ; k/g ; apod) inhibice reakce klinický vzorek nebylo možné vyšetřit z důvodu příliš vysokého obsahu inhibitorů PCR nevhodný odběr klinický vzorek nevyhovuje svou povahou nebo způsobem transportu požadovanému vyšetření (pro PCR není vhodná sražená krev; sérum transportované při vysoké teplotě nebo déle než 4 hodiny při +4 C nelze spolehlivě vyšetřit na virus hepatitidy C, apod.). Kontroly V případě, že kontroly nevycházejí, jak mají, by výsledky všech souběžně kontrolovaných reakcí měly být považovány za nevalidní a podle výsledků konkrétních kontrol by se měla opakovat buď PCR reakce, nebo i celá detekce.

34 Molekulárn rní mikrobiologická diagnostika interpretace 2a Vysoká senzitivita stanovení Výhodné při detekci obligátních patogenů, které se v zevním prostředí běžně nevyskytují (M. tuberculosis, borelie, viry hepatitid aj.), při testování krevních produktů (HCV, HBV, HIV) apod. Komplikace při interpretaci výsledků průkazu mikroorganizmů způsobujících latentní či inaparentní infekce bez klinického významu (EBV, cytomegalovirus, HHV6 aj.) nebo při detekci fakultativních patogenů a mikrobů vyskytujících se běžně v prostředí či jako součást mikroflóry (například stafylokoky, streptokoky, mykoplazmata, kvasinky a vláknité mikromycety), kde přílišná citlivost při nesprávné interpreataci může být zavádějící

35 Molekulárn rní mikrobiologická diagnostika interpretace 2b Teorie a praxe při p i dosažen ení maximáln lní citlivosti stanovení Citlivost detekce konkrétní metody je zásadní parametr, jehož znalost je nezbytná pro správnou indikaci vyšetření i interpretaci výsledků. Laboratoř musí znát t citlivost svých metod!!! Metody molekulární diagnostiky mohou teoreticky zachytit i jedinou kopii DNA ve vzorku vkládaném do detekce, čímž převyšují citlivost většiny ostatních diagnostických metod používaných v rutinní mikrobiologické diagnostice, v reálu tomu tak ale být nemusí Hlavním m limitem amplifikačních metod je maximáln lní možný ekvivalent vzorku, který lze do reakce vložit. Čím vyšší je koncentrace patogena ve výchozím vzorku, tím vyšší je pravděpodobnost jeho záchytu. Citlivost metody pak můžeme zvýšit zkoncentrováním patogena v klinickém materiálu. To do jisté míry lze u bezbuněčných materiálů (likvor, moč, sérum, plazma), velmi obtížné je to však u vzorků obsahujících buňky, například při vyšetření plné krve

36 Příklad: Na uvedeném příkladu je demonstrováno porovnání citlivosti PCR metody s klasickými kultivačními postupy při průkazu mikroorganizmů v plné krvi Limit při vyšetření plné krve metodou PCR je daný maximálním vkladem izolátu NK do reakce. Empirickou zkušeností je, že běžná reakce o objemu 50 µl je inhibována i čistou humánní NK, a to již koncentrací od 1 µg DNA výše. Toto množství NK zpravidla zizolujeme z asi 2 x 10 5 leukocytů, tedy běžně z ekvivalentu objemu 50 μl plné krve. Toto je tedy maximální možný vklad izolátu z periferní krve do PCR reakce. Pak ani při maximální možné citlivosti vlastní PCR reakce, tedy při schopnosti zachytit 1 10 kopií cílové sekvence na reakci s 95% pravděpodobností, nemůže být citlivost celé detekce vyšší než asi kopií cílové sekvence na 1 ml plné krve! Lepšího výsledku s 95% pravděpodobností dosáhnout nelze Srovnejme nyní tento teoretický výsledek s možnostmi kultivačními. Do kultivace metodou tzv. hemokultury se vkládá až 10 ml plné krve. Teoreticky může i jediná bakterie vyrůst a její růst může být pokročilými metodami detekce CO 2 detekován. Při zcela optimálních podmínkách je pak teoretická citlivost této metody 1 bakterie na 10 ml plné krve!

37 Molekulárn rní mikrobiologická diagnostika interpretace 3a Kvantitativní detekce Možnost exaktně kvantifikovat infekční agens Rozlišení latentní a aktivní infekce Popis průběhu infekce Hodnocení reakce na léčbu Kvantifikace je zásadním přínosem zejména pro diagnostiku infekcí HCV a HBV, HIV, dále pak herpesvirů, CMV a EBV u imunodeficientních pacientů. Zjištění množství viru v krvi, tzv. virové dávky, umožní sledovat účinnost terapie v reálném čase, což jiné virologické metody prakticky neumožňují

38 Molekulárn rní mikrobiologická diagnostika interpretace 3b Příklad využití kvantitativního stanovení Pro správnou interpretaci výsledků kvantitativní PCR je potřeba znát symptomaticky kritické kvantitativní koncentrace (hladiny) infekčních agens, které jsou specifické pro určité klinické situace a jsou spojené s určitými klinickými projevy. U některých virů je určitá hladina viremie s experimentálně stanovenou pravděpodobností asociována s jistými klinickými příznaky. Na základě těchto hodnot je také možno zahájit či změnit terapii. Příkladem použití může být sledování viremie, tzv. virové dávky (virus load), u infekce CMV, kdy bylo experimentálně zjištěno, že kopií DNA viru CMV na 2 x 10 5 leu periferní krve je spojeno v 92 % případů se syptomatickým onemocněním u pacientů po transplantaci jater. Průkaz takové viremie pak umožňuje včas nasadit léčbu gancyklovirem a zabránit dalšímu rozvoji této potenciálně velmi nebezpečné infekce. Bohužel, tyto hodnoty však nebyly dosud jednoznačně určeny či nejsou u řady mikroorganizmů k dispozici.

39 Molekulárn rní mikrobiologická diagnostika interpretace 3c Efekt přesnosti p kvantifikace pro klinické použit ití Aby bylo možno efektivně odlišit různé naměřené hodnoty, musí laboratoř znát rozptyl měření každé své metody Laboratoř musí variabilitu svého testovat a musí být připravena o ní informovat klinika.

40 Molekulárn rní mikrobiologická diagnostika interpretace 3d Příklad: Postupně každý den byla měřena virová dávka CMV v plazmě pacienta. Výsledky uvádí tabulka. Došlo skutečně k poklesu virové dávky, a tedy k účinku léčby? Pokud ano, kdy? Vyšetření Výsledek (kopií/ml) 1. den den den Experimentálně zjištěný rozptyl konkrétní metodiky kvantitativního stanovení virové nálože CMV byl: Vložená koncentrace (kopií/µl) Rozptyl měření (kopií/µl) Výsledky se porovnají se zjištěnými rozptyly použité metody qpcr. Analýza ukazuje, že mezi hodnotou z 1. a 2. dne vyšetření není rozlišitelný rozdíl, zatímco 3. den již došlo k významnému snížení virové nálože.

41 Molekulárn rní mikrobiologická diagnostika interpretace 3e Poznámky ke kvantifikaci metodou PCR Infekci nelze objektivně kvantifikovat když není možné získanou hodnotu standardizovat například vztáhnout na určitý objem, počet buněk, množství izolované NK apod. nebo nehomogenním rozložením agens (například biopsie, sputum,..)

42 Rychlost detekce Molekulárn rní mikrobiologická diagnostika interpretace - 4 může mít zásadní význam pro volbu efektivní terapie Příklady využití rychlosti stanovení: Septické stavy Invazivní infekce meningokoky, hemofily či streptokoky Virové infekce imunokompromitovaných pacientů Akutní infekce centrálního nervového sysytému Rychlost kompletní detekce: 3-4h ALE - vyšetření je nákladnější U méně závažných infekcí je zpravidla ekonomicky výhodnější vyšetřovat vzorky ve větších objemech najednou, a čeká se tedy na dostatek vzorků

43 Kultivačně nezávisl vislá detekce Molekulárn rní mikrobiologická diagnostika interpretace - 1 metody umožňují detekovat, identifikovat a kvantifikovat mikroorganizmy, které nelze standardními mikrobiologickými metodami kultivovat, nebo se kultivují obtížně. v porovnání s kultivačními metodami neumožňují tyto metody izolaci kultury životaschopného mikroorganizmu pro další testování včetně fenotypově vyjádřené citlivosti k antibiotikům Příklady: M. tuberculosis - lze sice v rutinních podmínkách kultivovat, ale na mikrobiologických půdách rostou velmi pomalu, a diagnostika se tak protahuje na několik týdnů (až 9 týdnů) Borelie - kultivace je možná, ale pro rutinní diagnostiku není prakticky použitelná Další obtížně kultivovatelná infekční agens - chlamydie, coxielly a původci infekčních endokarditid ze skupiny HACEK (Hemophillus sp., Actinobacillus actinomycetemcomitans, Cardiobacterium hominis, Eikenella corrodens, Kingella kingae). Mykologická dg. - pro průkaz původců dermatomykóz, aspergilů, kvasinek Kultivace virů je z hlediska rutinní diagnostiky omezeně využitelná. Metody molekulární diagnostiky se proto v jejich detekci hojně využívají. Mezi nejčastější detekované viry patří zejména herpesviry, viry hepatitid, HIV, parvoviry či papilomaviry. bakterie rostoucí v biofilmech

44 Molekulárn rní mikrobiologická diagnostika interpretace - 5 Nedostatek údajů ke klinické interpretaci - laboratorní a klinické dopady Vysoká citlivost mění pohled na životní cykly mikroorganizmů a patogenezi některých onemocnění. Jak vysvětlit přítomnost dlouhodobě přetrvávající nízké hladiny NK patogenů, které by neměly být přítomny, avšak v těle pacienta přesto dlouhodobě přetrvávají? Jsou to zachovalé části bakterií, nebo jde o bakterie živé, ale v tak malých koncentracích, že je předchozí kultivační metody nedokázaly odhalit? Jak dlouho přetrvává NK rozložených bakterií v hostiteli? A když už získáme poznatky o přetrvávání volných NK v periferní krvi, je tomu tak v jiných tkáních? Příklady: Jak se postavit k pozitivním detekcím gonokoků, a to i několik týdnů po ukončení standardní léčby, kdy by podle našich představ tyto patogeny měly být již dávno zlikvidovány? Jde o mrtvé patogeny, anebo se naopak mrtvé patogeny rychle rozloží a pozitivní výsledky skutečně značí přítomnost patogenů živých? Jak vysvětlit přítomnost NK borelií nebo herpesvirů v mozkomíšním moku pacientů bez příznaků infekčního onemocnění, u kterých by tento materiál měl být primárně sterilní. Mění se také pohled na význam detekce patogenů v moči. Ačkoliv v diagnostice chlamydií se jejich průkaz v moči již považuje za spolehlivý marker chlamydiové infekce, stále chybí dostatečná data pro interpretaci nálezů NK v moči u mnoha jiných patogenů zejména jde-li o stanovení gonokoků, borelií či legionel.

45 Molekulárn rní mikrobiologická diagnostika interpretace - 6 Species versus genospecies - Nomenklatura Nomenklatura a přejmenovp ejmenováváním m taxonů,, změny v klasifikaci, příklad: dnes zejména identifikovaná pohlavní stadia plísní Problém může nastat ve fázi sdělování výsledků klinickým pracovníkům, kteří nemají ani tušení, že namísto známého aspergila najednou mají pozitivní nález nějaké Emericelly. Genespecies a genotypy detekce cílové sekvence spíše respektuje genetické podobnosti a odlišnosti než fenotypové - často taková typizace ani pojmenování neodpovídá tradičním srotypům. příklad: Například se takto klasifikují skupiny legionel, kde je již dávno známo více patogenních legionel než jeden původně za patogenní druh označovaný Legionella pneumophilla. Podobně se na základě sekvenčních analýz popisují genotypy papilomavirů, leptospir, apod. Pro laboratoře to nemá valný význam, svou diagnostiku tím měnit nemusí. Klinikové jsou na terapii známých patogenů připraveni, nová jména ale často neznají. Je to logické a laboratoře by měly s tímto počítat.

46 Molekulárn rní mikrobiologická diagnostika - cena Cena - náklady laboratorního vyšet etření Metody molekulární diagnostiky se tradičně považují za drahé Důvody: Vysoké náklady na vývoj Vysoká cena vstupů Vysoká cena přístrojů Vysoké úhrady z pojistného Pokud je použití indikováno správně, vyplatí se Cena každého vyšetření je při nesprávné indikaci příliš vysoká

47 Nutnost neustálé inovace Správn vná laboratorní praxe Výrobce CE IVD diagnostika nebo v případp padě in-house metody odborný personál l laboratoře e odpovídaj dají za sledování nejnovější ších poznatků a za adekvátn tní inovace kitů nebo akreditované metody Jak na to? Studium, odborné články, konference Účast na EHK Zpětn tná vazba z kliniky Příklad ztráty ty plasmidu: při detekci C. trachomatis je mnoho rutinních metod cíleno do sekvence kryptického plazmidu, který je v buňce chlamydie obsažen v mnoha kopiích. To je sice výhodné kvůli zvýšení citlivosti detekce, na druhou stranu existuje významné procento kmenů chlamydií, které tento plazmid ztratily. Aby bylo možno detekovat takové kmeny, bylo potřeba metodu obohatit o současnou amplifikaci úseku genomové chromozomální DNA. Ta je v buňce přítomna vždy, ale jen v jedné kopii. Takto je možno detekovat s vysokou citlivostí kmeny s plazmidem a současně též kmeny bez plazmidu, i když někdy méně citlivě. Evoluční poznámka diagnostika samotná může e představovat p selekční tlak V poslední době se ukazuje, že systematická diagnostika zaměřená na určité konkrétní sekvence NK ve spojení s účinnou léčbou, eradikací nebo prevencí může představovat reálný selekční tlak. Díky němu pak může dojít k selekci populací mikroorganismů, které diagnostice unikají. Takové mikroorganismy pak mohou dlouhodobě unikat pozornosti. Řešením tohoto nebezpečí je zejména neustálé sledování epidemiologických údajů a nejnovějších poznatků klinické mikrobiologie a neustálé zlepšování diagnostických metod. Příkladem je tlak ATB na detekovatelné gonokoky, kdy výsledkem bylo zvýhodnění a následné dramatické rozšíření nedekovatelné mutanty.

48