Kapaliová chroaografie růzýi ypy deekce pro aalýzu biologicky výzaých láek Teoreická čá: vyvěleí základů kapaliové chroaografie, růzé ypy deekorů. Prakická čá: ukázka aalýzy a elekrocheické, U/IS a hooí deekoru. I. ÚOD 1. Chroaografické eody 1.1 Pricip chroaografie Chroaografie je eparačí eoda, edy eoda, při keré e oddělují - eparují ložky obažeé ve vzorku. Svý určeí je o předevší eoda kvaliaiví a kvaiaiví aalýzy vzorku. Chcee-li od ebe odděli dvě láky příoé ve vodé rozoku, z ichž jeda je rozpuá v orgaické rozpoušědle eíielé vodou a druhá láka v ě rozpuá eí, ůžee rozpuou láku do ohoo rozpoušědla vyexrahova. Pokud jou však rozpuoi ěcho dvou láek podobé, doáhee exrakcí pouze oho, že e obě láky rozdělí ezi vodou a orgaickou fázi, přičež jejich poěr e v obou fázích poěkud zěí: v orgaické fázi bude více rozpuější láky, zaíco ve vodé fázi zůae více láky éě rozpué. Po doaečé poču ěcho kroků e dvě láky zcela oddělí. Takovýo poup je ovše prakicky eprovedielý, ěžkopádý a zdlouhavý, rooucí objee pojeých podílů vodé a orgaické fáze bycho děleé láky aky eúoě zředili. Daleko elegaější řešeí je iobilizova jedu z fází a vhodé ierí oiči, a echa druhou fázi, obahující dvě oddělovaé láky, zvola proéka podél éo iobilizovaé fáze. Dvě láky, keré chcee odděli a keré uáší ekoucí fáze, budou řídavě přecháze z jedé fáze do druhé, jedolivé exrakčí kroky však již ebudou odděleě defiováy. Tak e poupě láky od ebe proorově oddělí, v důledku výše popaého děje, kerý e azývá diferečí igrace. Too je základí pricipe chroaografie [67].
Na oo základě fugují veškeré chroaografické eody, i když echaiy děleí jou rozaié - růzé afiiy děleých láek ke dvěa fází ohou bý založey eje a rozpuoi, ale i a adorpci, cheiorpci, íťových efekech, ioové výěě a a kobiaci uvedeých echaiů. Iobilizovaé uhé či kapalé fázi e říká fáze acioárí či zakoveá, ekoucí fázi, kerou ůže bý kapalia, ply či adkriická ekuia, e říká fáze obilí. Děleé láky rozpušěé v obilí fázi e běžě azývají oluy. Zázau záviloi kocerace oluů a objeu proeklé obilí fáze ebo a čae e říká chroaogra [67]. Pricip chroaografického děleí i ůžee přiblíži poocí áledujícího příkladu ze živoa. Předave i, že kupia vodáků a kaoích jíždí řeku, jde o volě proudící ok, kerý zde předavuje obilí fázi. Je pozdí leí odpolede, vodáci jou uavei a epádlují, jejich axiálí rychlo je edy dáa rychloí oku řeky. Tu a břehu uzří kupiu luících e, epříliš oděých kraavic, v aší aalogii je ůžee považova za acioárí fázi. Jak budou reagova aši vodáci? Někeří, předevší dáké oádky a přílušíci 4% užké ešiy, e v klidu echají uáše dále, eboť jejich afiia ke acioárí fázi je ulová. Oaí poádky začou brzdi, aby alepoň prodloužili dobu vé vizuálí ierakce e acioárí fází. Někeré lodě pravděpodobě zaaví a poádky vyoupí a břeh, došlo k adorpci, kdy pevá ierakce ůže bý zrušea až zěou vějších podíek (úěk kraavic, průrž rače apod.). ůžee edy očekáva, že původě jedoě e pohybující kupia čáic (plavidel) e rozdělí a podkupiy a o podle vé afiiy vůči acioárí fázi, vou roli ůže hrá i afiia k obilí fázi, reprezeovaá zde apříklad pořebou bý vča a ábořiši, a ádraží či v reauraci.(šcht, Laboraorí echiky biocheie). 1.2 eečí charakeriiky Zadržováí rozpušěé láky acioárí fází způobuje, že igruje eší rychloí, ež je průěrá rychlo obilí fáze. olekula ložky ráví v koloě určiou dobu, kerá e azývá reečí ča. Tao doba e dělí a ča, kerý olekula ervává v obilí fázi rvý reečí ča a ča ráveý ve acioárí fázi redukovaý reečí ča. Tyo čay plňují reečí rovici:
= + Pro ier, kerý e epouá a acioárí fázi a puuje ejou rychloí jako obilí fáze, je reečí ča oožý rvý reečí čae. Tyo charakeriiky e používají ke kvaliaiví aalýze, proože v daých podíkách ůžee kokréí ložku charakerizova její reečí ebo redukovaý reečí čae. elaiví zadržeí ložky v koloě vyjádříe reečí fakore. Je-li reečí ča ložky a koloa á délku L, je průěrá rychlo igrace éo zóy ložky v = L/. Průěrá rychlo ieru u = L/. eečí fakor je rove poěru ěcho rychloí. Po doažeí za rychloi e délka koloy vykráí. v u Noá obilí fáze proudící koloou á určiý objeový průok F. yáobíe-li jí reečí ča ložky, doaee obje pořebý k eluci ložky reečí obje. = F yáobíe-li rečí rovici objeový průoke, doaee: = F = F + F = + kde je rvý reečí obje, redukovaý reečí obje. Složka á při uaveí rovováhy ve acioárí fázi koceraci c a v obilí fázi c. Poěr ezi ěio koceracei je v ideálí případě koaí a azývá e diribučí koaa K D, proože charakerizuje diribuci rozděleí ložky ezi obě fáze: c K D c Zadržeí ložky v koloě vyjadřujee reečíi charakeriikai, keré ůžee uvádě buď aboluě poocí čaů ebo objeů a ebo relaivě rováí e adardy ebo iere. Láková kocerace ložky ve acioárí fázi c je defiováa jako poěr lákového ožví koloy ložky ve acioárí fázi a objeu acioárí fáze. Obdobě je kocerace ložky v obilí fázi c defiováa jako poěr lákového ožví ložky v obilí fázi a volého objeu koloy:
c c Běhe pohybu koloou olekula ložky čá reečího čau ervává ve acioárí fázi (redukovaý reečí ča) a čá v obilí fázi (rvý reečí ča). S rooucí dobou pobyu olekul ve acioárí fázi roe i jejich lákové zaoupeí ve acioárí fázi. Tuo úvahu lze rověž vyjádři ak, že poěr lákového ožví ložky ve acioárí fázi ku lákovéu ožví ložky v obilí fázi je ejý jako poěr redukovaého reečího a rvého reečího čau ložky: e vzahu pro diribučí koau doadíe za kocerace z jejich defiičích výrazů: D c c K Pro reečí ča bude využií obou výše uvedeých vzahů plai: D K 1 1 yáobíe-li uo rovici objeový průoke F, doaee výraz pro reečí obje: D K F F F F F, edy D K Čí je eparace účiější, í lépe dokážee od ebe ložky ěi odděli. Účio eparace v koloové chroaografii charakerizujee poče eoreických paer. Teoreické paro je poylá čá koloy, ve keré dochází k uaveí rovováhy ezi obilí a acioárí fází. Délka éo čái koloy e azývá výškový ekvivale eoreického para H. Pro kolou o délce L je výškový ekvivale eoreického para H = L/.
Poče eoreických paer lze urči z chroaograu z šířky píku v jeho základě Y ebo z šířky píku v poloviě jeho výšky Y 1/2 a reečího čau podle vzahů: 16 Y 2 5,54 Y Podle va Deeerovy eorie vedou k rozšiřováí zóy v koloě, a í k růu výškového ekvivaleu eoreického para, ři děje: urbuleí difůze H A, olekulárí difůze H B a odpor proi převodu hoy H C. ýledý výškový ekvivale je podle éo eorie dá ouče ěcho přípěvků: H = H A +H B + H C 1/ 2 2 1.3 ozděleí chroaografických eod Chroaografických eod je velké ožví. Proo je účelé jejich rozděleí do určiých kupi. zhlede ke začé růzorodoi e dělí podle ěkolika hlediek [67]: 1) Podle kupeví obilí fáze * Kapaliová chroaografie (Liquid Chroaography - LC) - obilí fází je kapalia * Plyová chroaografie (Ga Chroaography - GC) - obilí fází je ply. 2) Podle upořádáí acioárí fáze * Koloová chroaografie - acioárí fáze je uíěa v rubici (koloě). * Plošé echiky: Papírová chroaografie (Paper Chroaography - PC) - acioárí fáze je oučáí chroaografického papíru. Tekovrvá chroaografie (Thi Layer Chroaography - TLC) acioárí fáze je uíěa a pevé ploché podkladu (apř. kleěé dece ebo hliíkové fólii).
3) Podle povahy děje, kerý převládá při eparaci Obvykle e při eparaci uplaňuje ěkolik fyzikálě-cheických dějů oučaě, ale jede z ich převládá. * ozdělovací chroaografie - o eparaci rozhoduje odlišá rozpuo ložek vzorku ve acioárí fázi (kapalia) a obilí fází (kapalia a ply) * Adorpčí chroaografie - o eparaci rozhoduje růzá chopo ložek poua e (adorbova e) a povrch acioárí fáze (uhá láka). * Ioově-výěá chroaografie - o eparaci rozhodují růzě velké elekroaické přiažlivé íly ezi fukčíi kupiai acioárí fáze (iooěič) a ioy vzorku. * Gelová chroaografie - ložky e eparují podle velikoi a pórovié acioárí fázi (gelu); eší olekuly vzorku e v pórech gelu zdržují déle (olekulově íťový efek). * Afiií chroaografie - acioárí fáze je chopa váza ze vzorku právě určié ložky, ke kerý á úzce elekiví vzah (afiiu). 1.4 Kapaliová chroaografie kapaliové chroaografii je obilí fází kapalia. Na rozdíl od plyové chroaografie rozhodují o eparaci ložek vzorku eje jejich ierakce e acioárí fází, ale veli výrazě i použiá obilí fáze. Běhe eparace e aaly rozděluje ezi obilí a acioárí fází. Ča, jaký ráví v jedé ebo druhé fázi, závií a afiiě aalyu ke každé z ich. Jou využielé všechy ožé echaiy eparace - adorpce, rozdělováí a základě růzé rozpuoi, ioová výěa, olekulově íťový efek ebo pecifické ierakce v afiií chroaografii [67]. Proože je ožo pracova za laboraorí eploy bez uoi převádě vzorek a ply, je kapaliová chroaografie vhodá i pro eparaci epelě eálých a eěkavých loučei. Srováe-li kapaliovou a plyovou chroaografii z hledika účioi, je v kapaliové chroaografii ižší přípěvek olekulárí difůze ložky, proože kapalia á o hodě vyšší
vikoziu ež ply. e va Deeerově rovici je eo přípěvek ožo zaedba. aopak, v plyové chroaografii je zaedbaelý přípěvek odporu převodu hoy v obilí fázi, ale v kapaliové chroaografii e projevuje a číá e přípěvke odporu proi převodu hoy ve acioárí fázi [67]. Podle upořádáí acioárí fáze rozlišujee koloovou a ekovrvou či papírovou kapaliovou chroaografii. U plaárích echik kapaliové chroaografie je acioárí fáze uíěa v ploše. Je oučáí chroaografického papíru (PC) ebo eké vrvy a vhodé podložce ze kla, hliíku ebo polyeeru (TLC). Sacioárí fázi v papírové chroaografii je voda jako vlhko pouaá a celulózu, proo jde o chroaografii LLC. ekovrvé chroaografii e podle použié eké vrvy, kerá je obvykle a bázi ilikagelu ebo oxidu hliiého, uplaňuje adorpce (LSC), případě kokuruje rozdělováí. Pro veli adou práci, eáročou a laboraorí vybaveí, jou yo eody hojě využíváy. oderí odifikací TLC je HPTLC (High perforace TLC vyoce účiá ekovrvá chroaografie), kde e používá vrva říděého ikropóroviého orbeu (ilikagelu). HPTLC dovoluje zpracováva i 20 vzorků a jedé dece oučaě. K dávkováí a vyhodocováí e využívá irueálích eod. zorek e aáší poocí kapiláry ebo ikropipey a ar, kerý je blízko jedou koci plochy. U vyoce účiých ekých vrev e aášeí provádí auoaickýi dávkovači. Tío koce e po vychuí rozpoušědla pooří papír ebo podložka ekou vrvou do obilí fáze. Syé e uíí v prooru ayceé parai obilí fáze. obilí fáze vzlíá papíre ebo ekou vrvou poocí kapilárích il, pohybuje e pře ar a uáší ebou ložky vzorku í rychleji, čí éě e pouají a acioárí fázi a čí jou lépe rozpué v obilí fázi. Proo e vzorek rozdělí a zóy obahující jedolivé ložky. yvíjeí e ukočí před doažeí koce plochy. Čelo e ihed ozačí, po odpařeí rozpoušědla již euí bý rozezaelé[67]. klaické koloové chroaografii je acioárí fází zriý orbe velký průěre čáeček (apř. oxide hliiý) a je uíě ve kleěé rubici dlouhé ai 0,5 a průěru cca 2 c dole zakočeou friou a kohoue. Na horí vrvu áplě dávkujee alé ožví
vzorku a pak přidáváe obilí kapalou fázi. Půobeí graviačí íly obilí fáze poupuje koloou, ložky vzorku e od ebe eparují a v růzých čaech opoušějí podí čá koloy[67]. Klaické koloové provedeí eá pořebou účio, ale alo e základe vyoce účié kapaliové chroaografie. 1.5 yoce účiá kapaliová chroaografie pricipu je ao eoda hodá klaickou koloovou chroaografií. HPLC e vyviula z plyové chroaografie v počácích 70. le. yokých účioí e doahuje použií acioárích fází, keré obahují alé čáice pravidelého varu a jedoé velikoi, keré hoogeě vyplňují kolou. Tí e doahuje účioí řádově deíek iíc paer a er koloy. Průok obilí fáze je zajišě vyoký lake (jedoky až deíky Pa) proo aké bývá ao eoda ěkdy azýváa vyokolaká kapaliová chroaografie (high-preure liquid chroaography). Dávkují e alá ožví vzorku (řádově ikroliry). K deekci jou ué cilivé deekory, keré uožňují koiuálí oiorováí láek a výupu z koloy. Sigál deekoru e zpracovává počíače. Z výše uvedeého je zřejé, že HPLC vyžaduje poěrě áročou irueaci [67]. ezi výhody HPLC paří zejéa široká obla použieloi: lze aalyzova ioy, láky polárí i epolárí, álo ěkavé, epelě eabilí i vyokoolekulárí (cca 80% veškerých záých láek je ožé aalyzova eodou HPLC). Další výhodou je ožo ovlivňova eparaci ložeí obilí fáze, kerá a rozdíl od GC eí ierí, ale výzaě e podílí a eparaci. Kroě aalyických aplikací e HPLC čao používá k preparací. Nevýhodou ve rováí GC je áročější irueace a ložiější echaiu eparace. Teorie HPLC je již vypracováa, rověž aplikace HPLC jou doaečě popáy. Irueálí vývoj HPLC ále probíhá a ěřuje zejéa k iiaurizaci kolo (ikroáplňové a kapilárí koloy) i celkového zařízeí [67]. Obecé eoreické pojy uvedeé výše plaí aké pro HPLC. eece e éěř vždy vyjadřuje poocí reečího fakoru k, popř. reečí objee. Na rozdíl od reece (zadržováí láek) e jejich vyýváí z koloy azývá eluce. obilí fáze je proo azýváa éž
elučí čiidlo či elue a chopo vyýva láky z koloy elučí ilou. Čí rychleji jou vyýváy láky z koloy, í á obilí fáze vyšší elučí ílu. ozpoušědla eřazeá podle elučí íly voří eluoropickou řadu. Láky lze eluova: a) obilí fází o koaí ložeí (koaí elučí íla) - izokraická eluce, b) elučí ílu lze zěi koke, c) elučí ílu je ožé ěi koiuálě podle určiého prograu (lieárího či elieárího) - gradieová eluce. Při gradieové eluci ěíe běhe aalýzy ložeí obilí fáze. Gradieová eluce e používá pro láky velkýi rozdíly v reečích fakorech (10 < k < 1). ezi její hlaví výhody paří kraší doba aalýzy a zvýšeí cilivoi deekce pro později eluující láky. Gradiey ohou í růzý var: lieárí, kovexí, kokáví ad. Nejběžější je lieárí gradie - koiuálí zvyšováí kocerace ilějšího elueu B v rozpoušědle A [67]. Gradie je charakerizová: počáečí a kocovou kocerací, vare, ěricí v případě lieárího gradieu. eečí fakor k i při gradieové eluci lze odhadou z reečího fakoru k 0 v čié rozpoušědle A, z doby od začáku gradieu, ze ěrice gradieu b a rvého čau : log k i = log k 0 - b (/ Při lieárí gradieové eluci ají všechy píky ejou šířku. 1.6 Sacioárí fáze v HPLC Z eorie chroaografie vyplývá, že rozhodující vliv a eparaci při použií áplňových kolo á veliko a upořádao čáic (čley A a C va Deeerovy rovice). Je zřejé, že čí jou čáice eší, í je H ižší a eparace účiější. Běžě e používají čáice velikoi 5 až 10 µ, ale v oučaoi jou koerčí áplě velikoí 2 µ i ešíi. Dále vyplývá z eorie,
že eparace je účiější ehdy, pokud ají čáice pravidelý (kulový) var, jedoou veliko a koloa je jii hoogeě aplěa. Tyo acioárí fáze však ají i ěkeré evýhody: I při ejdokoalejší aplěí koloy zaujíají čáice je ai 75% jejího objeu a v průběhu používáí e půobeí vyokých laků áplň eedá a koloy e zehodocují [67]. Kopakější zaplěí prooru v koloě abízejí ooliické acioárí fáze. Koloa je zcela vyplěa polyere o defiovaé pórovioi, buď orgaického ebo aorgaického původu, kerý e uviř koloy vyvoří vhodou polyeračí reakcí v rozoku. Kvalia kolo e ak zlepší ve rováí koloai áplňovýi. ooliické koloy e vyzačují velkou echaickou abiliou a odoloí vůči zěá ph a velkou účioí eparace i při velkých průocích obilí fáze. praxi jou však ále ejpoužívaější radičí áplňové koloy [67]. Při aalyických aplikacích bývá délka koloy ezi 5 a 25 c, průěr kolo ěkolik ilierů, obje vzorku 1-20 µl a průok obilí fáze věšiou kole 1 l.i -1. Při preparacích, kde je hlaví požadavke axiálí výěžek a produkivia při ejižších fiačích ákladech a v ejkraší době, e průěr kolo pohybuje v ceierech, obje vzorku v ililirech a průok v deíkách l.i -1. Zcela ový yp acioárí fáze předavují višěé polyery (ipried polyer). Jou obdobou ooliických kolo, ale avíc je do áplě zabudová obik aalyu, kerý chcee odděli. Při přípravě polyeru i iu v koloě e přidá aalyzovaá láka (apř. jede izoer valiu, L-vali) a po ukočeí polyerace e eo aaly vyyje z koloy. Po jeho olekule zůae v ápli charakeriická duia, příupá pouze pro L-vali. D-vali e ouo acioárí fází ezadrží. išěé polyery jou vhodé předevší pro obížé eparace, jako jou apř. chirálí eparace léčiv [67]. 1.7 obilí fáze v HPLC obilí fáze v kapaliové chroaografii eí ierí, ale a rozdíl od plyové chroaografie e výzaě podílí a eparačí proceu. ožoi zěy ložeí obilí fáze jou prakicky eoezeé a je vždy jedodušší zěi ložeí obilí fáze ež poží jiou acioárí fázi. obilí fáze je předevší charakerizováa polariou a elekiviou[67].
Polaria je chopo rozpoušědla podíle e a polárích ierakcích. Paraer polariy P o je defiová jako ua přípěvků ierakcí proo-akceporových, x e, proo-doorových, x d, a dipól-dipólových, x : P o = x e P + x d P + x P Selekivia je defiováa jako relaiví reece dvou ouedích láek: r 1,2 = α 1,2 = 2 / 1 = k 2 /k 1 laoi obilí fáze jou důležié z hledika eparace i deekce. obilí fáze by ěla dáva v deekoru iiálí igál, a í uožňova co ejcilivější deekci oluů. ikozia, lačielo, oxicia a aborpce ulrafialového zářeí by ěly bý co ejižší. kapaliové chroaografii e pro eparace využívá adorpce, rozdělováí ezi dvě fáze a základě růzé rozpuoi (e paří eparace a cheicky vázaých fázích), ioová výěa, biopecifické ierakce (olekulové rozpozáváí) a íťový efek. S výjikou íťového efeku jde o pricip erodyaické rovováhy. Terodyaické rovováhy je doažeo, když jou cheické poeciály aalyzovaé láky v obou fázích ejé. reálé chroaografické yéu e obvykle uplaňuje více ypů ierakcí oučaě, apř. a cheicky vázaých fázích je rozpoušěí kobiováo adorpcí, případě ioovou výěou [67]. Adorpčí chroaografie poláríí adorbey jako acioáríi fázei hioricky předchází chroaografii epoláríi acioáríi fázei, kerá e začala rozvíje až rozvoje přípravy cheicky odifikovaých fází. Aby e yo dva základí ypy kapaliové chroaografie odlišily, začalo e klaické adorpčí chroaografii polárí acioárí a epolárí obilí fází čao říka chroaografie orálíi fázei, a obráceéu ypu epolárí acioárí a polárí obilí fází chroaografie obráceýi fázei či běžěji reverzí chroaografie. deší aalyické praxi je reverzí chroaografie ohe běžější, proože je aplikovaelá a podaě širší okruh aalyů a ypů vzorku ež chroaografie orálíi fázei.
1.8 Irueace v HPLC Příroje v HPLC jou ohe ložiější ež pro klaickou loupcovou LC, kde obilí fáze e pohybuje graviačí ilou. Odplyěá obilí fáze e přivádí ze záobíku obilí fáze (při HPLC e používají oxická rozpoušědla, proo záobíky obilí fáze uí bý uzavřeé ádoby a každý HPLC příroj by ěl bý připoje a odah) pře filr (zachycuje echaické ečioy eveuálě příoé v obilí fázi) do čerpadla. Odplyěí je důležié proo, aby e v deekoru v důledku velkého lakového pádu v yéu evořily bubliy. K odplyěí e používá podlak, ulrazvuk či probubláváí helie, popř. kobiace ěcho poupů [67]. Čerpadla uí bý vyokolaká, proože koloy velikoí čáic okolo 10 µ a eší kladou velký odpor a k doažeí opiálích průoků jou ué vyoké vupí laky, až deíky Pa. Průok uí bý koaí, reprodukovaelý a bezpulzí. Jeho hodoy e pohybují v l.i -1 pro kapilárí koloy, v µl.i -1 pro ikroáplňové koloy, kole 1 l.i -1 pro běžé áplňové koloy a v deíkách l.i -1 pro preparaiví koloy. Pro alé průoky e používají píová čerpadla, což jou v podaě ijekčí říkačky. Jejich výhodou je bezpulí chod. Pro běžé aalyické koloy e ejčaěji používají píová dvoučiá (reciprokačí) čerpadla. Jejich evýhoda, pulí chod, e kopezuje použií dvou ebo více čerpadel oučaě, přičež jejich píy e epohybují rovoěrě, ale parabolicky čae a jejich čio je fázově pouua. Pro gradieovou eluci e používají v záadě dva způoby: ěšováí obilích fází za ízkého laku a za vyokého laku. Prví způob je levější, eboť poačí jedo čerpadlo. Jeho evýhodou je, že k íšeí dochází daleko od koloy. Druhý způob vyžaduje dvě čerpadla, ložky e íí ěě před koloou, akže kuečé ložeí fáze v koloě odpovídá prograovaéu ložeí [67]. Z čerpadla e vede obilí fáze do dávkovacího zařízeí. Téěř výhradě e používají dávkovací veily e yčkou. Nejčaěji jou o šeiceé veily vyěielou yčkou, kerá e plí ijekčí říkačkou. Obje yčky e pohybuje od deíek aolirů po ikroliry. Dávkováí je reprodukovaelé (opakovaelo ářiků e pohybuje kole 0,2 %) a lze je ado auoaizova. Dávkovaé vzorky jou vedey do koloy [67].
Koloy jou obvykle vyrobey z erezové oceli, avšak ohou bý i kleěé či plaové. Jejich viří průěr e pohybuje řádově od deíek ikroerů do cca 1 c pro aalyické koloy až po ěkolik ceierů pro preparaiví koloy [67]. Z koloy je eluá vede do deekoru. Sigál deekoru e vyhodocuje počíače ebo jiý vyhodocovací zařízeí. Jedolivé čái kapaliového chroaografu jou propojey pojovacíi kapilárai, obvykle z erezové oceli ebo PTFE. uí í co eješí viří obje, aby jejich přípěvek k rozýváí elučích křivek byl co eješí. aeriál používaý v HPLC uí bý echaicky i cheicky odolý a eí bý povrchově akiví. úvahu přicházejí erezová ocel, klo a ěkeré play [67]. 2. Deekory v kapaliové chroaografii Obecé požadavky a deekory v HPLC jou prakicky hodé GC. Deekor by ěl í alý viří obje, aby co ejéě připíval k rozyí elučích křivek. Sigál deekoru by ěl bý abilí a reprodukovaelý, lieárě závilý a koceraci v co ejširší rozahu (ěl by í široký lieárí dyaický rozah), cilivo (ěrice záviloi odezvy a koceraci) by ěla bý co ejvěší, ez deekce (obvykle e vyjadřuje jako kocerace aalyu, kerá způobí igál, jež je určiý áobke průěré hodoy šuu - dvoj- až čyřáobke) co ejižší. Sigál by ěl í šu co eješí (jak vyokofrekvečí, ak ízkofrekvečí) a eobahova drif (poalý úik ulové liie) [67]. K deekci e využívá aalyická vlao yéu, kerá je ve záé a reprodukovaelé vzahu ke koceraci aalyu. Podle oho rozlišujee deekory buď uiverzálí (ěří vlao yéu jako celku, j. idex lou, epelou vodivo, relaiví periiviu) ebo elekiví (ěří aborbaci při určié vlové délce, elekrolyický proud při určié poeciálu ad.). Selekiví deekce je obvykle cilivější a vhodější zejéa při aalýze ložek příoých v koplikovaých aricích. ezi běžé deekory používaé v HPLC paří pekrofooerické, fluorierické, refrakoerické, hooí a elekrocheické.
Spekrofooerické deekory paří k ejpoužívaější v HPLC, eboť jou poěrě jedoduché, provozě polehlivé, lze jii deekova velký poče láek a jou kopaibilí gradieovou elucí. Základí požadavke je ízká aborbace obilí fáze při použié vlové délce deekce. Nejčaěji e používají dvoupaprkové pekrofooery průokovou deekčí celou. Cela uí bý doaečě alá při doaečě dlouhé opické dráze (pro zachováí pořebé cilivoi deekce). Složiější yé předavují rychlé keovací pekrofooerické deekory. Deekor diodový pole opakovaě zazaeává celá pekra běhe průchodu láek kyveou. Zíkají e ak rojrozěré chroaogray (reečí ča v. aborbace v. vlová délka). Tyo deekory ají výza předevší při určeí hoogeiy píku (ejé pekru při keováí píku zaeá, že ejde o jedu láku, zěa pekra vědčí o uě erozlišeých aalyů). Fluorierické deekory jou veli elekiví pro láky, keré ají přirozeou fluorececi ebo je lze a fluorekující deriváy převé. Jou rověž veli cilivé, zhruba o ři řády cilivější ež U pekrofooerické (deekčí lii v pg. l -1 ). Aaly je ozařová zářeí o určié vlové délce (exciující zářei ze zdroje, j. ruťové výbojky, deueriové, wolfraové či xeoové lapy či laeru) a produkuje zářeí o věší vlové délce (eiovaé zářeí). Teo deekor je využívá ehdy, je-li vyžadováa oučaě vyoká elekivia a cilivo ěřeí, j. při opových aalýzách láek v koplikovaých aricích, apř. při ledováí eaboliů léčiv, při aalýze aiokyeli, ložek ukleových kyeli ad. efrakoerické deekory paří ezi uiverzálí deekory. ěří e rozdíl idexů lou oluu v obilí fázi proi obilí fázi. Proože yo rozdíly jou alé, je refrakoerický deekor álo cilivý. Nevýhodou je i začá závilo idexu lou a eploě a eožo použí gradieovou eluci. efrakoerické deekory e využívají zejéa ehdy, pokud oaí deekory epokyují pro aalyzovaé láky odezvu (apř. při aalýze cukrů). Hooí pekroerie je všeraá, rychlá a cilivá aalyická eoda, kerá je čao využíváa ke kvaliaiví i kvaiaiví cheické aalýze, proože pokyuje velké ožví iforací o vzorku a jeho ložeí.
yoce účiá kapaliová chroaografie ve pojeí elekrocheickou deekcí Podle oho, jakou fyzikálě-cheickou vlao aalyu ěříe a využíváe pro aalyické aoveí, rozlišujee ED a: apéroerické či volapéroerické (proud) poecioerické (poeciál) kodukoerické (vodivo) vyokofrekvečě ipedačí (kapacia) couloerické (áboj) ezi ejrozšířeější ED ve pojeí HPLC paří y, keré pracují koaí poeciále (apéroerické, volapéroerické). ykazují vyokou cilivo, vyokou elekiviu a široký lieárí koceračí rozah. Nejčaěji e elekrocheická deekce v průokových yéech realizuje ak, že e a pracoví elekrodě udržuje koaí poeciál v oblai liiího proudu pro daý aaly a leduje e hodoa proudu jako fukce čau. Tao echika e přío ozačuje jako průoková apéroerie (flow aperoery). Proudová odpověď při průokové apéroerii přío odpovídá koceraci elekroakiví láky procházející deekore [69]. efereí a poocá elekroda uí bý po proudu (dowrea) kapaliy vzhlede k pracoví elekrodě, aby reakčí produky difudující z poocé a refereí elekrody erušily aoveí a elekrodě pracoví [68-71]. Kroě vlaího uíěí elekrody v průokové upořádáí hraje výzaou roli aké korukce vlaí elekrocheické ádobky (cely). průběhu elekrocheické deekce je pořebé zajii pokud ožo laiárí prouděí. Při vyšší průoku obilí fáze dochází ke vziku urbulecí a zhoršeí deekce udovaého aalyu.
II. PAKTICKÁ ČÁST 3. Elekrocheický deekor Deekce gluahiou Syé vyoce účiá kapaliová chroaografie elekrocheickou deekcí (HPLC-ED) je lože ze dvou chroaografických pup odel 582 ESA (ESA Ic., Chelford, A, USA) (pracoví rozah 0.001-9.999 l/i), a chroaografické koloy reverzí fází Polari C18A (150 4,6; 3 µ veliko čáic, aria Ic., CA, USA) a dvaáci-kaálového CoulArray elekrocheického deekoru (odel 5600A, ESA, USA). Deekor je lože z dvaáci průočých aalyických koůrek (odel 6210, ESA, USA), přičež každá obahuje refereí (hydroge paládiovou), poocou a porézí grafiovou elekrodu. řídící odulu je uložea chroaografické koloa, elekrocheický deekor, proor je eroaová a 30 C. Jedolivé vzorky jou ijekováy auoaplere (odel 542, ESA, USA) při eploě 4 C. Ijekovaý obje je axiálě 10 µl. eálé vzorky roli (průěrě 0.2 g věží hooi) jou zražey kapalý duíke z důvodu derukce buěk. Zražeé čái roli jou rozeřey v řecí ice a poé je do iky přidáo 2 l fofáového pufru o ph 7.0. ziklý rozok je hoogeizová poocí řepáí a orex 2 Geie po 45 i při 4 C (Scieific Idurie, USA). Hoogeá byl cerifugová (3 000 g) 30 i při 4 C poocí Uiveral 32 cerifugy (Heich-Zerifuge GbH, Něecko). Sadard redukovaého a oxidovaého gluahiou připravíe z ACS cheikálií a vody o ACS čioě v koceraci 100 µ. Pracoví rozoky připravíe podle pokyů vedoucího cvičeí. 4. Elekrocheický deekor + U deekor Deekce flavooidů HPLC-ED yé je lože ze dvou chroaografických pup odel 582 ESA (ESA Ic., Chelford, A) (pracoví rozah 0.001-9.999 l i -1 ) a chroaografické koloy reverzí fází Zorbax SB C18 (150 4.6; 5 µ veliko čáic, Agile Techologie, USA) a dvou deekorů v adeu U/ED. Byl použi U deekor (odel 528, ESA, USA).
K elekrocheické deekci byl použi deekor Couloche III (ESA, USA) aperoerickou průokovou deekčí celou (odel 5040, ESA, USA). Průočá cela obahuje plaárí elekrodu ze kelého uhlíku, hydroge-paládiovou jako referečí a a uhlíkovou jako poocou elekrodu. zorek (15 µl) byl ijeková auoaicky poocí auoapleru (odel 542, ESA, USA), kerý á v obě zabudová i eroaovaý proor pro kolou. Koloa byla eroaováa a 30 C. Průok obilí fáze byl 1 l i -1. obilí fáze e kládala z A: kyeliy ocové (50 ) a B: kyeliy ocové (50) v čié Aceoirilu. Láky byly eluováy áledující gradiee: 0-0.2 i ( 5% B), 0,2->1 i (10 %B), 1->5,5 i ( 13 % B), 5,5->8 i ( 20 % B), 8->9 i ( 20 % B), 9->13 i ( 50 % B), 13->15 i ( 100 % B), 15- >19 i ( 100 % B). Deekce věšiy eparovaých láek probíhala a U deekoru při 260. Deekce kyeliy Aceyl-Salicylové probíhala a Elekrocheické deekoru při aplikovaé poeciálu 950. eálé vzorkyovoce (průěrě 0.5 g věží hooi) jou zražey kapalý duíke z důvodu derukce buěk. Zražeé čái roli jou rozeřey v řecí ice a poé je do iky přidáo 2 l ehaolu. ziklý rozok je hoogeizová poocí řepáí a orex 2 Geie po 45 i při 4 C (Scieific Idurie, USA). Hoogeá je áledě cerifugová (3 000 g) 30 i při 4 C poocí Uiveral 32 cerifugy (Heich-Zerifuge GbH, Něecko). Sadard flavooidů připravíe z ACS cheikálií a vody, a ehaolu o ACS čioě v koceraci 100 µ. Pracoví rozoky připravíe podle pokyů vedoucího cvičeí. 5. U/IS a hooí deekor Aalýza fyohoroů olié fyohoroy budou aalyzováy poocí příroje vyoce účié kapaliové chroaografie U/IS deekore SpecraSYSTE U 2000 (Thero eparaio produc Ic.) a hooí deekore Fiiga AQA (TheroQue). Pro eparaci fyohoroů budou využiy chroaografické koloy reverzí fází Pheoeex C18, 250 2.1, veliko čáic 5 μ, Polari C18, 250 2.1, veliko čáic 5 μ ad Aquail C18 250 2.1, veliko čáic 5 μ.