cdna a GENOMOVÉ KNIHOVNY

Transkript

1 cdna a GENOMOVÉ KNIHOVNY je to soubor náhodně klonovaných fragmentů genomové DNA nebo cdna, připravené zpětnou transkripci mrna, příslušného organismu do vhodného vektoru, ve kterém může být tento soubor DNA klonů uchováván a množen

2 cdna a GENOMOVÉ KNIHOVNY slouží především ke hledání nových genů a jejích klonování pro další funkční analýzu knihovny lze sestrojit pro všechny živé organismy, pro vědecky významné existují komerčně dostupné knihovny genomová knihovna obsahuje veškerou informaci obsaženou v genomu (geny a nekódující sekvence) cdna knihovna obsahuje pouze geny exprimované v určitém stádiu vývoje organismu popř. ve specifické tkáni či pletivu jako klonovací vektory pro konstrukci knihoven se používají především vektory odvozené od bakteriofága λ, fazmidy, kosmidy nebo BAC

3 lytický a lysogenní cyklus virů

4 struktura lambda bakteriofága

5 lysogenní selekce bakteriofágových vektoru LAMBDA FIX II VEKTOR ( bakteriofágový vektor) - selekce se provádí na speciálním kmeni E.coli (lysogenní pro P2 bakteriofága, tzn. že hostitelská buňka je již napadená jiným bakteriofágem) - Pokud má vektor genotyp red/gam+ na daném kmeni neroste je tzv. Sensitivní k P2 interferenci (Spi + fenotyp) - red a gam geny se nacházejí ve střední části (stuffer) a jsou nahrazeny inzertem. Bakteriofág s inzertem je tudiž Spi- a může být vyselektován na P2 lysogenním kmeni red/gam+ 12 kb red/gampříliš malý nesbalí se do kapsidy inzert (genomová knihovna)

6 genomové knihovny lambda FIX II (Stratagene) XhoI Sau3A I 4-místné GATC substituční vektor Spi + selekce klonované fragmenty 9-23kb částečné štěpení RE zaručuje překryvy (kontigy)

7 genomové knihovny lambda FIX II Avian Baboon Bacterial Bovine Canine Cephalopod Chicken Drosophila Feline Fungus Gorilla Guinea Pig Hamster Horse Human Lobster Marsupial Monkey Mouse Nematode Plant Porcine Rabbit Rat Salamander Xenopus Yeast Zebrafish Product: Horse Genomic, Leukocytes Library Arabian, adult stallion, heterozygous for immunodeficiency, Vector: Lambda FIX II vector, Insert Size: 9-23 kb Arabidopsis thaliana Nicotiana Plumbaginifolia barley corn pea soybean zebrafish (první transgenní ryba) Xenopus (drápatka)

8 cdna knihovny lambda ZAP II Linker-primer 5' - CTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTT 3' - AAAAAAAAAAAAA - 5' mrna Reverse transcriptase, nucleotides XhoI site 5' - CTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTT 3' - AAAAAAAAAAAAA - 3' cdna - 5' mrna RNase, DNA Polymerase, nucleotides XhoI site 5' - CTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTT 3' - GAGCTCAAAAAAAAAAAAAA - 3' cdna - 5' cdna Add EcoRI adaptors, T4 DNA ligase EcoRI XhoI 5' - AATTC...CTCGAGTTTTTTTTTTTTTTT 3' - G...GAGCTCAAAAAAAAAAAA EcoRI...G - 3'...CTTAA - 5' Digest with XhoI XhoI 5' - TCGAGTTTTTTTTTTTTTTT 3' - CAAAAAAAAAAAA Clone into cdna vector with 5' EcoRI and 3' XhoI EcoRI...G - 3'...CTTAA - 5' inzerční vektor fazmid blue/white screening klonované fragmenty 0-10kb

9 Způsob zachování pouze full-lenght cdna CIP calf intestine phosphatase TAP tobacco alkaline phosphatase

10 cdna knihovny lambda ZAP II Výhody: vysoká efektivnost fágové infekce plazmid (pblueskript) se vyštěpuje z fazmidu (s plazmidem se lépe manipuluje a sekvenuje) zvýšené zastoupení málo abundantních transkriptů: pomocí metody SSH (supressive and subtractive hybridization) se sníží množství vysoce abundantních transkriptů (např. transkripty Rubisco tvoří často 10% z celkové rostlinné cdna) pomocný fág f1 (má mutaci tak, že se sám nereplikuje ale po koinfekci s fazmidem mu umožní vytvořit infekční částice, tím že vytvoří sbalovací proteiny, jejichž genetická informace na klonovaném fazmidu chybí. Navíc nese aparát pro tvorbu ssdna.

11 supressive and subtractive hybridization (SSH) studovaná RNA srovnávací RNA studovaná RNA raritní molekuly zůstávají více nehybridizované hybridizace kinetika druhého řádu, abundantní molekuly hybridizují velice rychle spolu další využití: zjišťování nebezpečných genů u patogenních organismů

12

13

14 cdna knihovny lambda ZAP II Algae Baboon Bovine Canine Chicken Feline Fish Fungus Hamster Human Fetal Human Human Neuron and Teratocarcinoma Insect Lobster Marsupial Monkey Mouse Nematode Plant Porcine Rabbit Rat Salamander Sheep Xenopus Human cdna, Aortic Smooth Muscle Cell Library Human cdna, Brain (Cerebellum) Library Human cdna, Brain (Frontal cortex) Library Human cdna, Breast Carcinoma Library Human cdna, Erythroleukemia cell Library Human cdna, Heart Library Human cdna, Kidney Library Human cdna, Uterus Library (8 pooled normal whole specimens, Caucasian, years, Vector: Uni-ZAP XR vector, Primer: UdT, Average Insert Size: 1.3 kb) atd. celkem 57 Plant cdna, Arabidopsis thaliana Library Plant cdna, Barley Library Plant cdna, Soybean Library Plant cdna, Tobacco Leaf Library Plant cdna, Tomato Library Plant cdna, Spinach Library (var. Melody, actively growing leaves, Primer: OR, Vector: Lambda ZAP II vector, Average Insert Size: 1.0 kb)

15 EST klony (Expressed Sequence Tags) Co to je EST? krátká DNA sekvence (okolo bp) odvozená z cdna reprezentuje geny exprimované ve tkáních ze kterých je odvozena cdna knihovna - TRANSKRIPTOM pletivově specifické cdna knihovny listy, kořeny, semena, plody, pyl, květy.. specifické cdna knihovny po infekci patogenem, po působení hormonů, stresu atd. Výhody EST sekvenci zdroj informaci o genech exprimovaných ve specifických tkáních, nebo v závislosti na odpovědi vůči vnějším vlivům základní srovnávání mezi různými organismy základ pro rozlišování genových rodin a identifikace alelických variací popř. alternativniho sestřihu Nedostatky EST klonů cdna neobsahuje regulační oblasti a celé kompaktní geny často jenom 3 a 5 konce cdna klonů ( bp, jedna sekvenační reakce) syrová data, chyby

16 hledání genů in silico v internetové databazí GeneBank Výsledky hledání v GenBank...

17 výsledek hledání pro polygalakturonasu z rajčete počty EST klonů v databázích k roku 2003 Člověk přes pět miliónů EST klonů milionů EST v NCBI

18 hledání genů in silico v internetových databazích Ensembl a GeneBank

19

20 cdna a GENOMOVÉ KNIHOVNY VELIKOST KNIHOVNY vyjadřuje kolik rekombinatních fágu (plaků) musíme screenovat abychom prošli celý genom nebo cdna pool. P.pravděpodobnost, že je klon zastoupen (99% = 0.99) n.poměr průměrné velikosti klonovaného inzertu k velikosti genomu např. při screeningu lidského genomu o velikosti Mbp který je v λ genomové knihovně s velikosti fragmentů 20 kbp musíme na Petriho miskách vypěstovat pro následnou analýzu alespoň 6.5 x 10 5 plaků abychom s 99% pravděpodobnosti zaručili, že je analyzován celý genom

21 SCREENING cdna a GENOMOVÝCH KNIHOVEN otisk plaků na nitrocelulosovou membránu denaturace DNA na filtru inkubace s hybridizační sondou vyvolání otisku detekce plaku obsahují požadovaný gen vyříznutí a namnožení požadovaného klonu

22 SCREENING BACových knihoven pomocí poolování Colony PCR

23 cdna a GENOMOVÉ KNIHOVNY DALŠÍ TYPY KNIHOVEN: EXPRESNÍ GENOMOVÁ KNIHOVNA vychází z cdna knihovny, která je ale umístěna v expresních vektorech (klonovací vektory, které navíc transgen v nich obsažený exprimují do proteinu) Používají se pro hledaní genů pokud známe pouze protein, který kódují (pomocí protilátky) CHROMOZOMOVÉ KNIHOVNY obsahují informaci pouze z jednoho chromozomu (jsou menší) HYBRIDNÍ KNIHOVNY systém pro studium interakce protein - protein, bait vektor (návnada) obsahuje gen pro protein, který studujeme a fish (prey) vektor (obsahuje danou cdna expresní knihovnu) s pomocí genomových knihoven se uskutečnila sekvenace celých genomů několika organizmů. díky tomu ale genomové knihovny v současné době ztrácejí na významu (veškerá genetická informace je obsažena in silico a pomocí vhodných primerů si lze kdykoli daný úsek amplifikovat Využití např. u BAC reporter cell lines

24 YEAST TWO HYBRID SYSTÉM PRO STUDIUM PROTEIN-PROTEIN INTERAKCÍ význam pro studium regulačních a signálních drah konstitutivní promotor naklonovaná cdna knihovna z libovolného euk.organismu kvasinkový chromozom

25 CIP calf intestine phosphatase TAP tobacco alkaline phosphatase

26 N-terminal in frame cloning 1. 2.

27 YEAST THREE HYBRID SYSTÉM PRO STUDIUM INTERAKCÍ PROTEIN-NÍZKOMOLEKULÁRNÍ LIGAND Hledaný protein cdna ligand expres.knihovna DHFR DIHYDROFOLÁT REDUKTASA (markerový protein)