VLLM0421c Lékařská mikrobiologie I, praktická cvičení. Protokol k tématu J10+11

Transkript

1 Téma J10+11: Molekulárně biologické metody + Klinická virologie I (hepatitidy, HIV) K nastudování (web, učebnice): Průkaz mikrobiálních nukleových kyselin + protokoly z předchozích praktik Úkol J10/1: Izolace DNA původce lymeské borreliózy z klinického materiálu Z předloženého klinického materiálu se izolovala DNA Borrelia burgdorferi pomocí komerční soupravy. Konkrétní postup závisí na typu použité soupravy. Prohlédněte si videoklip, přečtěte si následující text (vhodný text byl k disposici pouze v angličtině, to vám však jako vysokoškolským studentům nemůže činit potíže) a vysvětlete funkci jednotlivých složek v tabulce. DNA isolation is a routine procedure to collect DNA for subsequent molecular or forensic analysis. There are three basic steps in a DNA extraction: Breaking the cells open, commonly referred to as cell disruption, to expose the DNA within, such as by grinding or sonicating the sample. Removing membrane lipids by adding a detergent. Precipitating the DNA with an alcohol usually ethanol or isopropanol. Since DNA is insoluble in these alcohols, it will aggregate together, giving a pellet upon centrifugation. This step also removes alcohol-soluble salt. Refinements of the technique include adding a chelating agent to sequester divalent cations such as Mg 2+ and Ca 2+. This stops dnase enzymes from degrading the DNA. Cellular and histone proteins bound to the DNA can be removed either by adding a protease or by having precipitated the proteins with sodium or ammonium acetate, or extracted them with a phenol-chloroform mixture prior to the DNA-precipitation. If desired, the DNA can be resolubilized in a slightly alkaline buffer. ( detergent etanol či isopropanol chelatační činidlo Úkol J10/2: Amplifikace specifických úseků DNA původce lymeské borreliózy PCR Prohlédněte si videoklip, ilustrující postup polymerázové řetězové reakce (PCR). Přečtěte si následující text a vysvětlete pojmy v tabulce. Polymerázová řetězová reakce (PCR, z angického Polymerase Chain Reaction) je metoda rychlého a snadného zmnožení stejného úseku DNA. Úseky DNA, které se mají namnožit, musí být předem označeny na začátku a na konci přidáním primerů. PCR slouží k vytvoření až mnoha milionů exaktních kopií vzorového fragmentu DNA o maximální délce 10 tisíc nukleotidů (v některých případech bylo dosaženo délky až 40 tisíc), což umožňuje provést analýzu DNA i z velmi malého vzorku. K syntéze nového vlákna DNA se používá nejčastěji DNA polymeráza bakterie Thermophilus aquaticus, odtud označení Taq polymeráza. PCR sestává z několika kroků: Denaturace DNA se po dobu sekund zahřívá na teplotu C. Při této teplotě se kvůli zrušení vodíkových můstků rozvolňuje dvoušroubovice a odděluje se od primerů. Vzniká tak jednovláknová DNA Nasednutí primerů teplota se sníží na C, což umožňuje nasednutí primerů na specifická místa DNA. Na primery se váže polymeráza. Prodlužovací fáze teplota použitá při této fázi závisí na použité DNA polymeráze. Nejběžnější Taq polymeráza má optimum aktivity na C. Při tomto kroku dochází k samotné syntéze DNA. Ve směru od 5' ke 3' přirůstá vlákno komlementární k původní molekule DNA ( primer Taq polymeráza snížení teploty na C Jméno Směr všeobecný Datum Str. 1/5

2 Úkol J10/3: Detekce PCR produktu gelovou elektroforézou V úkolu č. 1 byla z klinického materiálu izolována nukleová kyselina B. burgdorferi, v následujícím úkolu byl specifický úsek DNA tohoto mikroba mnohonásobně zmnožen pomocí PCR. Přítomnost specifického úseku DNA prokážeme jejich separací v 1,5% agarosovém gelu s obsahem ethidiumbromidu, který se váže na DNA a v UV-světle fluoreskuje. Při detekci PCR produktu se připraví v elektroforetické vaně gel s jamkami pro napipetování vyšetřovaného vzorku. Gel se přelije roztokem tris-borátového pufru. Do prvního důlku v připraveném gelu se napipetuje 10 µl pozitivní kontroly, do následujícího důlku velikostní standard, který umožní měření velikosti produktů PCR. Do zbývajících důlků se nanese 10 µl směsi produktů PCR s nanášecím pufrem. Elektroforetická vana se zapojí do elektrického zdroje. Zkontroluje se správné zapojení elektrod. Důlky se vzorky musí být na straně katody, aby amplikony mohly migrovat směrem k anodě. Přístroj se spustí na 1 hodinu (100 mv). Po skončení elektroforézy se gel umístí na UV-transiluminátor, přiklopí se krycí deska a prohlédne se výsledek. Při práci se používá ochranný štít proti UV-záření a gumové rukavice. Zakreslete a interpretujte výsledek reakce (u negativních reakcí zaškrtejte horní a dolní raménko křížku). Nákres: Pacient číslo Vlastní reakce Interní kontrola Závěr Úkol J10/4: Srovnání výsledků průkazu specifické sekvence DNA s výsledky průkazu protilátek Úkol J10/4a) PCR nukleové kyseliny u lymeské borreliózy Zapište, který pacient je pozitivní v PCR. Všimněte si pozitivní a negativní kontroly. Pozitivní je pacient č. Úkol J10/4b) Průkaz protilátek proti původci lymeské borreliózy Tento úkol se ve spojeném praktiku nedělá. V úkolu 4c máte již rovnou k dispozici výsledky Úkol J10/4c) Porovnejte výsledky průkazu specifické sekvence DNA z úkolu 4a s výsledky průkazu protilátek proti původci lymeské borreliózy z úkolu 4b. Pacient Výsledek PCR ELISA IgM ELISA IgG Interpretace Jméno Směr všeobecný Datum Str. 2/5

3 Úkol J10/5: Průkaz DNA Mycobacterium tuberculosis pomocí PCR s detekcí produktu technikou ELISA Vedle gelové elektroforézy se pro detekci produktu PCR reakce, tzv. amplikonů, využívá technika ELISA. V tomto případě probíhá PCR reakce s biotinylovanými primery. Amplikony jsou imobilizovány na stěně důlku mikrotitrační destičky pomocí specifických záchytných hybridizačních sond. Na biotin na 5 -konci amplikonu se pevně naváže avidin s enzymem. Po přidání substrátu se reakce vizualizuje a odečítá na spektrofotometru. Odečtěte výsledky této reakce u jednotlivých pacientů na základě měření optické denzity jednotlivých důlků spektrofotometrem. Pozor, jde sice o využití techniky ELISA, jinak však nemá tento případ nic společného s použitím této techniky k průkazu protilátek či antigenu (J09, úkol 4a dnešního praktika). Cut off: Pacient č. Produkt reakce Interní kontrola Závěr Úkol J10/6: Real-time PCR Real-time PCR (RT-PCR) je variantou PCR, ve které je produkt reakce detekován fluorecenčními sondami. Množství reakčního produktu je měřeno kontinuálně, nikoli pouze na konci reakce. Tak je možno sledovat tvorbu produktu v reálném čase (odtud název metody). Metoda se také nazývá kvantitativní PCR, protože umožňuje kvantifikaci sledovaného úseku DNA. Nicméně některé klíčové principy zůstávají stejné jako u jiných typů PCR, zejména úloha a význam interních kontrol. Vyhodnoťte pozitivní a negativní kontroly a čtyři obrázky RT-PCR, které máte na pracovním stole. Osa x ukazuje počet cyklů; osa y naznačuje množství produktu. Pozitivní křivka by měla dosáhnout limitní linie (to je ta vodorovná čára, která nepatří do měřítka) před 42. cyklem. Plná čára označuje produkt vlastní reakce, čerchovaná čára ukazuje interní kontrolu. Nehodící se škrtněte: K+ pozitivní? ano ne K negativní? ano ne Pacient č. 1 pozitivní negativní inhibice Pacient č. 3 pozitivní negativní inhibice Pacient č. 2 pozitivní negativní inhibice Pacient č. 4 pozitivní negativní inhibice Ke všem úkolům z tématu J11 Odečtěte vždy výsledky vyšetření, nezapomeňte ověřit kontroly, pokuste se učinit závěr, je-li to možné. U reakcí ELISA pacienty zapisujte ve tvaru např. E1, H2, C5 a podobně. Pro urychlení byly už u jednotlivých úkolů vypočteny hodnoty cut off, 90 % cut off a 110 % cut off Úkol J11/1: Diagnostika viru hepatitidy A(HAV) a) vyšetření IgM: Cut off = C1 + D1 /2. Cut off = (0, ,707)/2 = 0,707 b) vyšetření celkových protilátek: Cut off = C1 + D1 /2 Cut off = (0, ,422)/2 = 0,424 0,636 0,778 0,382 0,466 Negativní(!) pacienti: Konečný závěr (učiněný z obou částí): Jméno Směr všeobecný Datum Str. 3/5

4 Úkol J11/2: Diagnostika viru hepatitidy B(HBV) a) vyšetření HBsAg: Cut off = C1 + D1 /2. Cut off = (0, ,603)/2 = 0,588 b) vyšetření HBeAg: Cut off = C1 + D1 /2 Cut off = (0, ,481)/2 = 0,477 0,529 0,647 0,429 0,525 c) vyšetření anti-hbs: Cut off = C1 + D1 /2. Cut off = (0, ,343)/2 = 0,347 d) vyšetření anti-hbe: Cut off = C1 + D1 /2 Cut off = (0, ,827)/2 = 0,821 0,312 0,382 0,739 0,903 Poznámky k jednotlivým markerům hepatitidy B: Jméno Směr všeobecný Datum Str. 4/5

5 Úkol J11/3: Diagnostika viru hepatitidy C(HCV) Úkol J11/3a) Polymerázová řetězová reakce v diagnostice HCV Vyhodnoťte výsledek PCR (gelová elektroforéza), zakreslete a vyhodnoťte důsledky Obrázek: 1 = pozitivní kontrola OK (pozitivní) není OK (negativní či inhibice) 2 = výsledek pacienta A: 3 = výsledek pacienta B: 4 = výsledek pacienta C: 5 = negativní kontrola OK (negativní) není OK (pozitivní či inhibice) Úkol J11/3b) Průkaz protilátek anti-hcv metodou ELISA Cut off = B1 + C1 + D / 3 Závěr: Cut off = (0, , ,370) /3 = 0, % cut off 110 % cut off 0,353 0,431 Úkol J11/4: Diagnostika viru lidského imunodeficitu (HIV) Pozitivní či hraniční séra je třeba konfirmovat (= zaslat do NRL v Praze k ověření) Cut off = C1 + D1 /2 Cut off = (0, ,601)/2 = 0, % cut off 110 % cut off 0,537 0,657 Pacienti, kteří mají být konfirmováni (pozitivní, hraniční): V Česku registrujeme HIV-pozitivních pacientů (k..20, včetně cizinců). Jméno Směr všeobecný Datum Str. 5/5