VLIV POLYMORFIZMÙ GENU PRO METABOTROPNÍ GLUTAMÁTOVÝ RECEPTOR 3 (GRM3) NA KLINICKÉ

Transkript

1 VLIV POLYMORFIZMÙ GENU PRO METABOTROPNÍ GLUTAMÁTOVÝ RECEPTOR 3 (GRM3) NA KLINICKÉ A NEUROANATOMICKÉ CHARAKTERISTIKY U PACIENTÙ SE SCHIZOFRENIÍ ASSOCIATION BETWEEN METABOTROPIC GLUTAMATE RECEPTOR 3 GENE (GRM3) POLYMORPHISMS AND THE CLINICAL AND NEUROANATOMICAL CHARACTERISTICS IN PATIENTS WITH SCHIZOPHRENIA TOMÁŠ NOVÁK 1,2, TOMÁŠ PÁLENÍÈEK 1,2, FILIP ŠPANIEL 1,2, MAREK MINÁRIK 3, JIØÍ HORÁÈEK 1,2 1 Psychiatrické centrum Praha 2 Klinika psychiatrie a lékaøské psychologie, 3. lékaøská fakulta, Univerzita Karlova v Praze 3 Genomac International., s.r.o., Praha SOUHRN Asociace nìkterých polymorfizmù genu pro metabotropní glutamátový receptor 3 (GRM3) se schizofrenií a s nìkterými endofenotypy pro schizofrenii, jako jsou kognitivní deficit, odchylky v aktivitì korových oblastí nebo markery aktivity glutamátu, byly publikovány, dosavadní nálezy nicménì zùstávají nejednoznaèné. Abychom zhodnotili vztah mezi polymorfizmy GRM3 a klinickými neurobiologickými charakteristikami u pacientù se schizofrenií, provedli jsme prùøezovou studii s devadesáti ètyømi pacienty se schizofrenií. Zvolili jsme tøi jednonukleotidové polymorfizmy (SNP), které byly v pøedchozích studiích asociovány se schizofrenií a úrovní funkcí spojených s prefronální oblastí (rs , rs , rs ). Pacienti byli vyšetøeni stupnicí PANSS, podstoupili vyšetøení neuropsychologickou testovou baterií a podskupina pacientù byla dále vyšetøena pozitronovou emisní tomografií s 18-fluorodeoxyglukozou (18-FDG PET; n = 84) a 1,5 T strukturální magnetickou rezonancí (MR; n = 56) s následnou automatizovanou morfometrií založenou na voxelech (VBM). Nenalezli jsme žádný signifikantní nález, který by podporoval existenci souvislosti mezi testovanými polymorfizmy pro GRM3 (genotypy a haplotyp) a klinickými charakteristikami onemocnìní, výkonem v neuropsychologických testech, specifickými vzorci mozkového metabolizmu èi regionálními odchylkami v objemech mozku. Naše studie nepøinesla podporu pro genetickou souvislost polymorfizmù pro GRM3 a klinickým fenotypem a neurozobrazovacími nálezy u pacientù se schizofrenií. Klíèová slova: mglur3, GRM3, kognitivní funkce, magnetická rezonance, morfometrie založená na voxelech, pozitronová emisní tomografie, polymorfizmus SUMMARY The metabotropic glutamate 3 receptor gene (GRM3) polymorphisms were reported to be associated with schizophrenia, and with schizophrenia-related endophenotypes such as impaired cognition, cortical activation and glutamate markers, but the existing findings have remained inconsistent. To evaluate the association between GRM3 polymorphisms and the clinical and neuroimaging profiles in patients with schizophrenia, we conducted cross-sectional study with ninety-four subjects. We selected three SNP (rs , rs , rs ), previously reported to be associated with schizophrenia, and with prefrontal brain functioning. Subjects completed ratings of the PANSS and neurocognitive testing and subset of patients underwent 18-fluorodeoxyglucose positron emission tomography (18-FDG PET; n = 84) and 1.5 T structural magnetic resonance imaging (MRI; n = 56) followed by automated voxel-based morphometry (VBM). No significant evidences for association between tested GRM3 polymorfisms genotypes and haplotypes and clinical characteristics, neurocognitive functioning, specific metabolic patterns as well as regional brain volumes differences were found. Our study of GRM3 gene polymorphisms did not provide support for genetic association with clinical and neuroimaging profiles in patients with schizophrenia. Key words: mglur3, GRM3, cognitive functions, magnetic resonance imaging, voxel-based morphometry, positron emission tomography, polymorfism Novák T, Páleníèek T, Španiel F, Minárik M, Horáèek J. Vliv polymorfizmù genu pro metabotropní glutamátový receptor 3 (GRM3) na klinické a neuroanatomické charakteristiky u pacientù se schizofrenií. Psychiatrie 2012;16(2):

2 Úvod Pøestože je etiopatogeneze schizofrenního onemocnìní doposud neznámá, pøevládající teorie ukazují na dysfunkci glutamátergního systému, pøedevším na hypofunkci ionotropních N-metyl-D-aspartátových (NMDA) glutamátových receptorù (Faber, 2003; Horacek et al., 2006). Metabotropní glutamátové receptory (mglur) se mohou svou modulaèní rolí na této dysfunkci NMDA receptorù podílet. Pøedevším mglur skupiny II (mglur 2 a 3) byly intenzivnì studovány jako potenciální modulátory narušené aktivity NMDA receptorù a souèasnì i jako cíle terapeutického ovlivnìní pøíznakù schizofrenie (Moreno et al., 2009). mglur3 se nacházejí presynapticky, kde inhibují výdej glutamátu do synaptické štìrbiny a na gliích, kde modulují mimosynaptický výdej glutamátu (Krivoy et al., 2008; Moreno et al., 2009). Gen pro mglur3 (GRM3) je lokalizovaný v oblasti 7q21.1 q21.2, která se nachází v tìsné blízkosti oblasti, která byla ve døívìjších vazebných studiích identifikována jako kandidátní pro schizofrenii (Ekelund et al., 2000; Wedenoja et al., 2008). Polymorfizmy (jednonukleotidové SNP, haplotypy) GRM3 byly v nìkolika studiích asociovány se schizofrenií (Chen et al., 2005; Egan et al., 2004; Fujii et al., 2003; Marti et al., 2002; Mossner et al., 2008; Schwab et al., 2006), jiné studie však asociaci nenašly (Albalushi et al., 2008; Jonsson et al., 2009; Norton et al., 2005; Tochigi et al., 2006). Jiný smìr výzkumu se orientoval na testování polymorfizmù GRM3 ve vztahu k nìkterým klinickým a neurobiologickým charakteristikám schizofrenního onemocnìní. Reportovány jsou nálezy o asociaci jednotlivých SNP s odpovìdí na olanzapin (Bishop et al., 2005) a celkovì závažnìjší psychopatologií (Bishop et al., 2011). Nìkolik studií nalezlo možný vliv polymorfizmù na úroveò výkonu v testech pozornosti (Mossner et al., 2008), na úroveò verbální pamìti (Egan et al., 2004) èi epizodické pamìti (Jablensky et al., 2011) u pacientù se schizofrenií, ale též na úroveò exekutivních funkcí u zdravých osob (Egan et al., 2004; Baune et al., 2010). Jiné práce konstatují odlišné nálezy v hladinách N-acetylaspartátu (NAA) a odlišné aktivaèní vzorce v oblasti prefrontálního kortexu pøi vyšetøení magnetickou rezonanèní spektroskopií, resp. funkèní magnetickou rezonancí v závislosti na variantách GRM3 u pacientù se schizofrenií (Egan et al., 2004; Tan et al., 2007) i zdravých osob (Marenco et al., 2006). GRM3 byl také jedním z genù, jehož varianty v kombinaci se závažnými porodnickými komplikacemi zvyšovaly riziko rozvoje schizofrenie (Nicodemus et al., 2008). Potenciálnì terapeutický význam mglur3 navíc dokládá kontrolovaná klinická studie s agonistou mglur2/3 (LY ) v léèbì schizofrenie, který vykazoval srovnatelný antipsychotický efekt s olanzapinem pøi nízkém výskytu nežádoucích úèinkù (Patil et al., 2007). Lze tedy konstatovat, že varianty GRM3 mohou asociovat se schizofrenií nebo, a dosavadní výzkum ukazuje spíše na tuto variantu, mohou modifikovat klinické a neurobiologické charakteristiky onemocnìní a souviset tak s endofenotypy pro schizofrenii, jako jsou výkon v kognitivních funkcích èi aktivita prefrontální oblasti. Cílem naší práce bylo hodnotit asociaci polymorfizmù GRM3 s nìkterými endofenotypy pro schizofrenii. Proto jsme realizovali prùøezovou studii u pacientù se schizofrenií, která kombinovala klincká a neurozobrazovací vyšetøení. Pro analýzu byly zvoleny 3 polymorfizmy (rs , rs , rs , genu GRM3, které byly v pøedchozích genetických studiích a) asociovány se schizofrenií: rs (Fujii et al., 2003); rs (marti et al., 2002); rs (Egan et al., 2004; Mössner et al., 2008); b) spojeny s alternativním sestøihem GRM3 a vlivem na funkci mglur3: rs (Sartorius et al., 2008); c) spojeny s výkonem v kognitivních funkcích: rs (Mössner et al., 2008); d) spojeny s redukcí hladiny N-acetylaspartátu (NAA) prefrontálnì: rs (Marenco et al., 2006). Jako rizikové polymorfizmy byly reportovány pro SNP rs genotyp AA, pro rs CT/TT a pro rs AA. Pøedpokládali jsme tedy, že homozygoti AA pro SNP rs proti heterozygotùm AG a homozygotùm GG budou vykazovat závažnìjší prùbìh onemocnìní (zaèátek onemocnìní, délka léèby, dávky antipsychotik, poèet hospitalizací), závažnìjší úroveò psychopatologie (celkové, pozitivní a negativní pøíznaky), výraznìjší narušení kognitivních funkcí (pracovní pamìś a exekutivní funkce), nižší regionální objemy šedé hmoty dle morfometrie založené na voxelech (specificky v oblasti prefrontálního kortexu) a snížený regionální metabolizmus dle úrovnì vychytávání 18-fluorodeoxyglukózy (specificky v oblasti prefrontálního kortexu) pøi vyšetøení pozitronovou emisní tomografií (18-FDG PET). Dále jsme pøedpokládali, že nositelé haplotypu 3 SNP (rs , rs , rs ) A-T-A proti nositelùm haplotypu non A-T-A budou vykazovat závažnìjší prùbìh onemocnìní (zaèátek onemocnìní, délka léèby, dávky antipsychotik, poèet hospitalizací), závažnìjší úroveò psychopatologie (celkové, pozitivní a negativní pøíznaky), výraznìjší narušení kognitivních funkcí (pracovní pamìś a exekutivní funkce), nižší regionální objemy šedé hmoty dle morfometrie založené na voxelech (specificky v oblasti prefrontálního kortexu) a snížený regionální metabolizmus dle úrovnì vychytávání 18-fluorodeoxyglukozy (specificky v oblasti prefrontálního kortexu) pøi vyšetøení pozitronovou emisní tomografií (18-FDG PET). Metodika Pùvodní práce Subjekty Pacienti byli získáni z databáze pacientù se schizofrenií, která vznikla v rámci Centra neuropsychiatrických studií s cílem testovat vliv polymorfizmù kandidátních genù pro schizofrenii na klinické a neurobiologické charakteristiky onemocnìní (Horáèek et al., 2009; Španiel et al., 2011). Pøi zaøazení do databáze pacienti absolvovali diagnostické interview pro potvrzení diagnózy schizofrenie (F20.x) èi akutní schizoformní psychotické poruchy (F23.2) dle MKN-10, dále interview dle M.I.N.I. (Sheehan et al., 1998) k zachycení jiných duševních komorbidních poruch a dále byla získána základní demografická data a relevantní informace o prùbìhu a léèbì onemocnìní. U pacientù, u kterých byla v dobì vstupu do databáze stanovena diagnóza F23.2, probìhlo s odstupem 3 mìsícù pøešetøení stavu k potvrzení onemocnìní schizofrenního okruhu. Dále pacienti podstoupili vyšetøení zobrazovacími metodami, konkrétnì strukturální a funkèní magnetickou rezonancí (MR/fMR) a/nebo pozitronovou emisní tomografií (PET). Obvykle v den vyšetøení (nejvýše však s týdenním odstupem) nìkterou ze zobrazovacích metod pacienti podstoupili hodnocení závažnosti psychopatologie standardní posuzovací stupnicí, byli vyšetøeni baterií kognitivních testù a byly zaznamenány informace o léèbì. Do aktuální studie bylo zaøazeno 94 pacientù (47 žen, 47 mužù) splòujících diagnostická kritéria pro schizofrenii (pøípadnì diagnózu F23.2 v dobì vyšetøení MR èi PET) dle MKN-10 (1996), prùmìrného 75

3 vìku 29,1 ± 9,3 let a prùmìrného trvání nemoci 5,1 ± 5,8 let, od kterých byla získána krev ke genotypizaci. Vstupními kritérii byl vìk mezi lety, nepøítomnost komorbidních duševních onemocnìní dle M.I.N.I. vèetnì závislosti na návykových látkách v posledním roce, nepøítomnost závažných somatických a specificky neurologických onemocnìní, absence kontraindikací k vyšetøení magnetickou rezonancí (MR) a schopnost udìlit informovaný souhlas. Z 94 pacientù podstoupilo 84 vyšetøení PET a 56 MR. Úèastníci studie byli podrobnì seznámeni s prùbìhem a cíli studie a následnì podepsali informovaný souhlas. Studie byla schválena Etickou komisí Psychiatrického centra Praha. Genotypizace DNA byla z krevních vzorkù pacientù (N = 94) izolována s užitím standardního spin-column protokolu. Po izolaci byly polymerázovou øetìzovou reakcí (PCR) amplifikovány cílové úseky DNA za použití specificky navržených primerù a v získaných fragmentech genotypizovány polymorfizmy rs , rs , rs pomocí denaturaèní kapilární elektroforézy (DCE). Tato metoda umožòuje separaci DNA fragmentù za podmínek jejich èásteèné denaturace a její výhodou jsou nízké nároky na kvalitu a množství DNA a vysoká citlivost. Pro separaci byl použit 96kapilární sekvenátor (MegaBACE 1000, Amersham Biosciences, NJ). Postup pøi optimalizaci a následné genotypizaci metodou DCE byl popsán v pøedchozí publikaci (Minarik et al., 2006). Pro jednotlivé polymorfizmy byla kalkulována Hardy-Weinbergova rovnováha (HWE), provedena analýza vazebné nerovnováhy v programu GOLD a analýza a odhady frekvencí haplotypù pomocí EM (expectation-maximization) algoritmu a permutaèního testu v programu EH plus. Hodnocení psychopatologie a kognitivních funkcí Závažnost pøíznakù schizofrenie byla hodnocena zkušeným psychiatrem pomocí stupnice Positive and Negative Symptom Scale (PANSS; Kay et al., 1987) obvykle v den vyšetøení (nejvýše však s týdenním odstupem) MR a/nebo PET. Vedle závažnosti pozitivních, negativních a všeobecných pøíznakù byla z položek PANSS stanovena úroveò tøí faktorù dle Liddleho (1987), tj. narušení reality, dezorganizace a psychomotorické ochuzení. Úroveò kognitivních funkcí byla vyšetøena baterií kognitivních testù pod vedením klinického psychologa èi zacvièeného administrátora kognitivních testù (modifikovaná Neuropsychologická baterie Psychiatrického centra Praha; Preiss et al., 2007) rozšíøena o poèítaèovì administrované testy. Vyšetøení kognitivních funkcí zahrnovalo následující testy: Trail Making test, èást B (TMT-B), Wisconsinský test tøídìní karet (WCST) exekutivní funkce; Pamìśový test uèení (AVLT) krátkodobá a oddálená verbální pamìś; Trail Making test èást A (TMT-A), Continuous Performance Test (CPT) pozornost a pracovní pamìś; Test verbální fluence (VFT) verbální fluence a dlouhodobá pamìś; Reyova-Osterriethova komplexní figura (ROCF) vizuomotorika a oddálená vizuální pamìś. Vyšetøení probìhlo bìhem jednoho sezení. Vyšetøení magnetickou rezonancí Magnetickou rezonanci podstoupilo 58 pacientù (62 % souboru) pacientù prùmìrného vìku 28,9 ± 10,1 let a prùmìrného trvání nemoci 3,2 ± 4,2 let. MR øezy byly získány na 1,5 Tesla pøístroji Magnetom Vision (Siemens, Erlangen, Germany). Ze sagitálních øezù byla verifikována pozice hlavy a lokalizován sagitální øez ve støedové èáøe. Následnì bylo s použitím 3D-MPRAGE sekvence s TR 2000 ms, TE 4,4 ms, flip angle 40, pøi velikosti matice pixelù, získáno 160 T1 vážených sagitálních øezù celého mozku o tloušśce 1 mm. Morfometrie založená na voxelech (VBM) Data byla zpracována podle protokolu optimalizované VBM pomocí programu Statistického parametrického mapování, SPM5 ( spm5). SPM5 bylo implementováno do programu Matlab 7.3 (Math Works, Natick Massachusetts, USA). Vlastní VBM probìhla v následujících krocích: každý 3D objem T1 vážených zobrazení byl segmentován na šedou hmotu (GM), bílou hmotu (WM), a likvor (CSF). Parametry pro prostorovou normalizaci byly odhadovány podle míry shody se standardními vzory, které poskytuje SPM5. Parametry normalizace byly následnì aplikovány na pùvodní T1 vážená zobrazení. Normalizovaná T1 zobrazení byla následnì segmentována na hlavní složky (GM, WM a CSF). Aby došlo k zachování pùvodních objemù tkání, které byly transformovány do standardizovaného prostoru v prùbìhu normalizace, byla aplikována modulace (Jacobian) na normalizované segmenty šedé a bílé hmoty. Koneènì na modulovaná, normalizovaná a segmentovaná zobrazení šedé a bílé hmoty jsme aplikovali 10 mm zahlazení (smoothing FWHM full width at half maximum10 mm). Souèasnì byla provedena segmentace v nativním (nenormalizovaném) prostoru a byly spoèítány reálné objemy GM, WM a CSF pro jednotlivé subjekty. Jejich souètem byl pro každého jedince stanoven celkový objem mozku, který vstoupil do dalších analýz jako kovariáta. Srovnání šedé a bílé hmoty mezi skupinami pøi VBM analýze bylo provedeno pomocí analýzy kovariance s vìkem, trváním nemoci a délkou expozice antipsychotiky jako kovariátami. Získaná testová statistika (F hodnota) pro každý voxel byla pøevedena na Z hodnotu. Koordináty MNI používané v programu SPM5 byly pøevedeny do koordinát Talairachových (Talairach a Tournoux, 1988) pomocí programu mni2tal.m. Pomocí programu Talairach Daemon verze 1.1 (Lancaster et al., 2000) byly pro jednotlivé koordináty lokálních maxim stanoveny odpovídající anatomické oblasti. Vedle nekorigované hladiny významnosti (p 0,001) byla pro možnost falešnì pozitivních nálezù následnì provedena analýza s korekcí pro mnohoèetná srovnání FWE (Family-wise error) s hladinou významnosti na p < 0,05. Pozitronová emisní tomografie Pozitronovou emisní tomografií bylo vyšetøeno 84 pacientù (89 % souboru) prùmìrného vìku 29,3 ± 9,4 let a prùmìrného trvání nemoci 4,8 ± 5,2 let. Pacienti byli pøed vyšetøením nalaèno. Vyšetøení probíhalo v tiché místnosti s tlumeným osvìtlením. Pøed vyšetøením byla pacientùm cestou venózního katétru aplikována 18 FDG v dávce 3 MBq/kg. Pacienti byli vyšetøování v klidu po dobu 30 minut za podmínek definovaných jako náhodné epizodické tiché pøemýšlení (Random Episodic Silent Thinking (REST). Data byla získána na ECAT EXACT 922 (CTI/Siemens, Knoxville, TN) PET skeneru. Snímání bylo provedeno transmisním skenerem (10 min, ve 2D modu) pro korekci absorpce záøení. Následnì byly snímány emisní skeny po dobu 15 min. v 3D modu. Rekonstrukce dat probìhla podle OS-EM algoritmu (matice: 1,282, mozkový režim, 47 øezù, zvìtšení: 2, subsety: 16, iterace: 6, filter: 5 mm) v softwaru ECAT 7.2. Analýza získaných dat byla provedena za využití softwaru SPM5 (Statistical Parametric Mapping, v prostøedí 76

4 Tabulka 1: Poèty a frekvence jednotlivých genotypù a alel pro SNP rs , rs a rs genu GRM3 u pacientù se schizofrenií (n = 94) SNP Genotyp počet (frekvence) Alely počet (frekvence) HWE p rs AA AT TT A T 49 (0,52) 37 (0,39) 8 (0,09) 135 (0,72) 53 (0,28) 0,96 rs CC CT TT C T 86 (0,91) 8 (0,09) 0 (0,00) 180 (0,96) 8 (0,04) 0,66 rs AA AG GG A G 56 (0,60) 33 (0,35) 5 (0,05) 145 (0,77) 43 (0,23) 1,00 HWE p: Hardy-Weinbergovo ekvilibrium, p hodnota; SNP: jednonukleotidový polymorfizmus Pùvodní práce haplotyp (A-T-A) se v souboru nevyskytoval pøedevším pro nízké zastoupení nositelù alely T u SNP rs Pro hodnocení vlivu polymorfizmù GRM3 na klinické, neuroanatomické a metabolické charakteristiky byli dále pacienti rozdìleni dle genotypu pro SNP rs : AA (N = 56) vs. AG+GG (N = 38) a pøítomnosti nejèetnìjšího haplotypu: A-C-A (N = 64) vs. non A-C-A (N = 30). Matlab (Mathworks, USA). PET skeny byly normalizovány v standardizovaném stereotaktickém prostoru a vyhlazeny (smoothing) v izotropickém Gausovském kornelu ke zvýšení pomìru signálu vùèi šumu (FWHM 12 mm). Celkové rozdíly v intenzitì byly korigovány pomocí proporcionálního škálování (celkový prùmìr = 50, práh pro analýzu = 0,8) a celkový výpoèet byl vyjádøen prùmìrnou hodnotou voxelu. K urèení vlivu GRM polymorfizmù na zmìny vychytávání 18-FDG byly použity nepárové t-testy pro srovnání každého voxelu (prostorová jednotka mm) s vytvoøením statistické parametrické mapy t-statistik SPM(t) pøevedených do jednotkové normalizované hodnoty SPM(z). Každá oblast byla definována v koordinátách Montrealského neurologického institutu (MNI) s uvedením poètu voxelù, ve kterých byl rozdíl signálu významný. Koordináty MNI používané v programu SPM5 byly pøevedeny do koordinát Talairachových (Talairach a Tournoux, 1988) analogicky jako v pøípadì MRI. Za významný výsledek byla považována p hodnota 0,001 (tkrit = 3,20) na úrovni voxelu za podmínky minimálnì 10 signifikantních voxelù v klastru v oblasti. Pro možnost falešnì pozitivních nálezù byla za prokazatelný výsledek nicménì považována až detekce signifikantního rozdílu (p < 0,05) po korekci pro mnohoèetná srovnání FWE (Family-wise error). Statistické metody Srovnání demografických a klinických dat (vèetnì hodnocení psychopatologie dle PANSS a výkonu v kognitivních testech) ve skupinách rozdìlených dle genotypu a haplotypu bylo provedeno nepárovým t-testem nebo Mann-Whitneyho U testem dle charakteru rozložení u kontinuálních dat a Fischerovým testem èi chí-kvadrát testem u dat kategoriálních. Objemy mozku (celkový, GM, WM, CSF) byly mezi skupinami v závislosti na genotypu èi haplotypu porovnány pomocí analýzy kovariance s vìkem, trváním nemoci a délkou expozice antipsychotiky jako kovariátami. Objemy GM, WM a CSF vystupovaly do analýzy jako pomìry k celkovému objemu mozku. Statistické analýzy byly provádìny v programu STATISTICA, verze 9.0. Výsledky Nenalezli jsme odchylku od HWE v žádném ze SNP (tabulka 1). Analýza vazebné nerovnováhy ukázala témìø úplnou vazbu mezi SNP (D = 0,89 1,00 pro jednotlivé dvojice SNP). Dále byly identifikovány pouze 2 haplotypy pro kombinaci všech 3 SNP s odhadovanou frekvencí vyšší než 0,1 (A-C-A, T-C-G) (tabulka 2). Potenciálnì nejrizikovìjší Klinické charakteristiky, psychopatologie, kognitivní funkce Skupiny pacientù rozdìlených dle genotypu pro SNP rs , stejnì tak skupiny rozdìlené dle pøítomnosti haplotypu A-C-A se vzájemnì nelišily v základních demografických ukazatelích ani v charakteristikách popisujících závažnost a prùbìh onemocnìní (vìk pøi zaèátku onemocnìní, trvání onemocnìní, délka léèby, dávka užívaného antipsychotika) (tabulka 3). Pøi analýze závažnosti psychopatologie dle PANSS a výkonu v kognitivních testech jsme mezi definovanými skupinami také nenalezli žádný významný rozdíl (tabulka 4, 5). Morfometrie založená na voxelech (VBM) Srovnání objemových zmìn šedé hmoty, bílé hmoty, komorových prostor a celkového objemu mozku u podskupiny pacientù vyšetøených MR s korekcí na vìk, trvání nemoci, délku expozice antipsychotiky a celkový objem mozku ukázalo signifikantnì vìtší objem šedé hmoty u homozygotù AA pro SNP rs proti nositelùm G alely (tabulka 6). Vlastní VBM nicménì nedetekovala žádný regionální rozdíl Tabulka 2: Odhady frekvencí haplotypù pro SNP rs , rs a rs genu GRM3 u pacientù se schizofrenií (n = 94) Haplotypy Odhadnutá frekvence rs rs rs haplotypů A C A 0,701 A C G 0,017 A T A 0 A T G 0 T C A 0,070 T C G 0,169 T T A 0 T T A 0,043 A C 0,718 A T 0 T C 0,239 T T 0,043 A A 0,666 A G 0,027 T A 0,085 T G 0,222 C A 0,771 C G 0,186 T A 0 T G 0,043 77

5 Tabulka 3: Demografická a klinická data pacientù se schizofrenií v závislosti na polymorfizmu pro SNP rs (AA vs AG+GG) a haplotypu A-C-A (n = 94) AA AG+GG Rozdíl p hodnota Haplotyp A-C-A Haplotyp non A-C-A Počet Muži:ženy 29:27 18:20 0, :30 13:17 0,51 1 Věk, roky 30,0 (9,8) 27,8 (8,5) 0, ,8 (9,9) 27,5 (8,4) 0,08 2 Vzdělání: Z:S:V 11:34:11 9:25:4 0, :40:11 7:19:4 0,28 3 Diagnóza, F20:F23 39:17 33:5 0, :18 26:4 0,13 1 Věk při začátku onemocnění, roky 24,5 (7,2) 23,5 (5,8) 0, ,1 (7,5) 23,0 (5,6) 0,12 2 Délka expozice AP, měsíce 49,2 (63,3) 37,5 (45,7) 0, ,2 (61,2) 40,7 (52,7) 0,52 4 Současná dávka AP, CPZ ekvi 420,6 (358,7) 440,6 (301,3) 0, ,6 (352,7) 458,7 (317,6) 0,25 4 Počet hospitalizací 2,7 (3,0) 3,2 (3,1) 0,34 4 2,8 (3,2) 3,0 (2,9) 0,68 4 Rozdíl p hodnota Data jsou prezentována jako průměr (směrodatná odchylka) nebo počet případů F20 schizofrenie, F23 akutní polymorfní psychotická porucha, Z:S:V vzdělání základní: střední: vysoké, AP antipsychotika, CPZ ekvi chlorpromazinový ekvivalent (dle Woods, 2003), 1 Fisherův test, 2 nepárový t-test, 3 chí-kvadrát test, 4 Mann-Whitneyho U test. Tabulka 4: Srovnání psychopatologie v závislosti na polymorfizmu pro SNP rs (AA vs. AG+GG) a haplotypu A-C-A (n = 94) Haplotyp A-C-A Haplotyp non stupnice AA AG+GG Rozdíl Rozdíl p hodnota 1 A-C-A p hodnota 1 PANSS P 15,9 (5,2) 15,3 (5,0) 0,80 16,4 (4,9) 14,9 (5,3) 0,18 PANSS N 15,4 (5,7) 17,8 (7,6) 0,18 15,7 (5,2) 17,0 (7,4) 0,62 PANSS T 63,5 (17,8) 68,2 (20,5) 0,31 65,1 (16,3) 65,7 (21,5) 0,96 Narušení reality* 9,0 (3,4) 8,6 (3,7) 0,63 9,3 (3,4) 8,3 (3,6) 0,19 Dezorganizace* 8,7 (3,2) 9,1 (3,5) 0,61 8,9 (3,1) 8,9 (3,6) 0,83 Psychomotorické ochuzení* 14,8 (6,0) 17,6 (8,1) 0,11 15,1 (5,7) 16,8 (8,1) 0,43 Data jsou prezentována jako průměr (směrodatná odchylka) PANSS stupnice pro hodnocení pozitivních a negativních příznaků schizofrenie; N část pro hodnocení negativních příznaků, P část pro hodnocení pozitivních příznaků, T celkový skór; *dimenze dle Liddleho, skór počítán z položek PANSS; 1Mann-Whitneyho U test Tabulka 5: Srovnání výkonu v kognitivních testech v závislosti na polymorfizmu pro SNP rs (AA vs. AG+GG) a haplotypu A-C-A (n = 94) Test AA AG+GG Rozdíl p hodnota Haplotyp A-C-A Haplotyp non A-C-A Rozdíl p hodnota AVLT ROCF TMT I-V 45,8 (12,1) 42,4 (10,1) 0, ,8 (11,0) 44,6 (11,9) 0,79 1 VI 9,1 (3,5) 8,0 (3,1) 0,26 1 8,6 (3,4) 8,6 (3,3) 0,94 1 Kopie 32,0 (6,5) 32,9 (3,8) 0, ,4 (7,1) 33,2 (3,5) 0,25 1 Repro 3 17,2 (7,0) 18,0 (6,5) 0, ,0 (6,5) 18,8 (6,7) 0,14 1 A 46,8 (14,6) 42,4 (25,6) 0, ,9 (14,7) 41,5 (26,9) 0,20 2 B 106,8 (47,3) 105,6 (55,6) 0, ,0 (46,3) 98,6 (51,2) 0,20 2 VFT 47,0 (18,9) 48,5 (13,3) 0, ,1 (17,8) 51,1 (14,5) 0,08 1 WCST CPT CatCompl 4,4 (2,0) 4,5 (2,1) 0,87 1 4,1 (2,0) 4,7 (2,0) 0,31 1 Corr 67,4 (15,8) 74,7 (17,0) 0, ,7 (15,2) 73,9 (17,2) 0,11 1 TotErr* 43,1 (12,9) 46,6 (15,5) 0, ,4 (13,7) 47,2 (14,2) 0,13 2 PersErr* 47,5 (17,3) 51,0 (19,7) 0, ,5 (19,0) 51,0 (18,0) 0,37 2 NPersErr* 44,8 (10,5) 45,8 (14,5) 0, ,8 (11,3) 46,3 (13,3) 0,48 2 Omm* 79,7 (51,9) 76,1 (54,1) 0, ,8 (56,6) 72,4 (49,5) 0,39 2 Comm* 54,6 (12,1) 50,4 (9,3) 0, ,3 (12,7) 50,0 (10,2) 0,08 2 Hit RT* 59,3 (15,4) 56,2 (11,3) 0, ,6 (16,9) 55,8 (11,4) 0,23 2 Data jsou prezentována jako průměr (směrodatná odchylka) AVLT paměťový test učení, I-V počet správně vybavených slov celkem, VI oddálené vybavení; ROCF Reyova-Osterriethova komplexní figura, Repro 3 reprodukce po 3 minutách; TMT test cesty, verze A a B; VFT test verbální fluence; WCST Wisconsinský test třídění karet, CatCompl počet kategorií, Corr počet správných odpovědí, TotErr celkový počet chyb, PersErr perseverační chyby, NPersErr neperseverační chyby; CTP Continuous Performance Test, Omm chyby z opomenutí, Comm nadbytečné odpovědi, Hit RT reakční čas *hodnoty uvedeny jako T skór, 1 Mann-Whitneyho U test, 2 nepárový t-test 78

6 Pùvodní práce v koncentraci (objemu) šedé hmoty mezi homozygoty AA pro SNP rs a nositeli G alely na korigované hladinì významnosti (FWE). Na nekorigované hladinì významnosti analýza ukázala vìtší objemy šedé hmoty v oblasti levého cunea (BA 30) a pravého horního frontálního gyru (BA 6) (tabulka 7, obrázek 1). Srovnání skupin pacientù dle haplotypù nepøineslo žádný signifikantní rozdíl. Pozitronová emisní tomografie Na nekorigované hladinì významnosti jsme nalezli 3 oblasti zvýšeného (levý gyrus fusiformis, BA 20; pravý støední Obrázek 1: Srovnání regionálních objemù šedé hmoty pomocí morfometrie založené na voxelech pøi srovnání homozygotù AA proti nositelùm genotypu AG a GG (rs ). L levá strana, R pravá strana. Lokalizace signifikantní oblasti viz tabulku 7. frontální gyrus, BA 10; levý støední frontální gyrus, BA 6) a jednu oblast sníženého (horní frontální gyrus bilaterálnì; BA 6) vychytávání 18-FDG u homozygotù AA proti nositelùm genotypu AG a GG (tabulka 8 a obrázek 2A,B). Po korekci na mnohoèetná srovnání (FWE) však tyto rozdíly zanikly. Srovnání skupin pacientù dle haplotypù nepøineslo žádný signifikantní rozdíl. Diskuze Nenalezli jsme žádný signifikantní rozdíl v relevantních klinických a demografických charakteristikách pacientù rozdìlených dle polymorfizmu pro SNP rs (AA vs. AG+GG) ani rozdìlených dle haplotypu pro tøi pøedem definované SNP genu GRM3 (A-C-A vs. non A-C-A). Podobnì jsme nedetekovali rozdíly mezi skupinami v úrovni psychopatologie a výkonu v kognitivních funkcích. Srovnání celkových objemù (šedá hmota, bílá hmota, likvorový prostor) mozku konstatuje signifikantnì vìtší objem šedé hmoty u homozygotù AA proti nositelùm G alely pro rs pøi korekci na relevantní klinické charakteristiky, nicménì následné srovnání regionálních objemových rozdílù šedé hmoty pomocí morfometrie založené na voxelech nenalezlo mezi skupinami po korekci na mnohoèetná srovnávání žádný signifikantní rozdíl. Podobnì analýza rozdílu v regionálním vychytávání 18-FDG mezi stejnými skupinami detekuje rozdíly na nekorigované hladinì významnosti, které však pøi korekci na mnohoèetná srovnání zanikají. Velikost souboru jak pro klinické charakteristiky (N = 94), tak pro zobrazovací metody (N = 56 u MR, N = 84 u PET) byla dostateèná i pro detekci malého, respektive støednì velkého standardizovaného rozdílu, a tudíž možnost falešnì negativních výsledkù je dostateènì nízká. Pøedností naší studie je vedle velikosti souboru pøedevším kombinace zobrazovacích vyšetøení a analýz, které dosud ve studiích vlivu variant GRM3 na profil schizofrenie nebyly použity (18-FDG PET a MR s VBM) a jejich spojení s èasovì blízkým Obrázek 2: A: Zvýšené vychytávání 18-FDG u homozygotù AA proti nositelùm genotypu AG a GG (rs ) na nekorigované hladinì významnosti (p 0,001); B. snížené vychytávání 18-FDG u homozygotù AA proti nositelùm genotypu AG a GG na nekorigované hladinì významnosti (p 0,001). L levá strana, R prává strana. Lokalizace signifikantních zmìn viz tabulku 8. 79

7 Tabulka 6: Objemy šedé hmoty, bílé hmoty, likvoru a celkový objem mozku v závislosti na polymorfizmu pro SNP rs (AA vs. AG+GG) a haplotypu A-C-A a základní klinická data u podskupiny pacientu vyšetøených MR (n = 56) AA AG+GG Rozdíl Haplotyp A-C-A Haplotyp non Rozdíl (n = 34) (n = 22) p hodnota (n = 39) A-C-A (n = 17) p hodnota Věk, roky 30,0 (10,8) 27,1 (8,9) 0, ,7 (11,0) 26,1 (8,5) 0,07 1 Trvání nemoci, měsíce 57,1 (67,3) 36,7 (46,0) 0, ,1 (70,6) 31,6 (42,4) 0,11 2 Délka expozice AP, měsíce 46,5 (56,0) 26,0 (37,6) 0, ,3 (62,4) 23,0 (27,7) 0,12 2 Objem GM v cm 3 680,87 (99,49) 641,69 (72,41) 0, ,08 (86,51) 661,50 (96,59) 0,11 3 Objem WM v cm 3 508,55 (76,18) 486,45 (70,33) 0, ,06 (72,47) 493,63 (76,35) 0,63 3 Objem CSF v cm 3 527,45 (114,72) 491,09 (82,25) 0, ,62 (115,28) 511,26 (93,49) 0,91 3 Objem TOT v cm ,87 (179,13) 1619,23 (185,73) 0, ,75 (150,95) 1666,39 (217,32) 0,41 3 Objemy jsou prezentovány jako průměr (směrodatná odchylka). CFS likvorový prostor, GM šedá hmoty, TOT celkový objem mozku, WM bílá hmota, 1 nepárový t-test, 2 Mann-Whitneyho U test, 3 ANCO- VA, srovnání je korigováno na věk, trvání nemocí a délky expozice antipsychotiky, u GM, WM a CSF objemy adjustovány k celkovému objemu mozku (TOT). Tabulka 7: Regionální objemové zmìny šedé hmoty pøi srovnání homozygotù AA (n = 34) proti nositelùm genotypu AG a GG (n = 22) pro rs Ke x y z p uncor p FWE L/P Mozková BA oblast AA > AG+GG < 0,001 0,834 L Cun ,001 0,997 P SFG 6 AA < AG+GG Poznámky: AA > AG+GG zvýšený objem šedé hmoty u homozygotů AA proti genotypu AG a GG, AA<AG+GG snížený objem šedé hmoty u homozygotů AA proti genotypu AG a GG, BA Brodmannova area, Cun Cuneus, Ke počet signifikantních voxelů v klastru, L levá hemisféra, P pravá hemisféra, p uncor nekorigovaná hladina významnosti, p FWE korigovaná hladina významnosti, SFG horní frontální gyrus, xyz koordináty v MNI prostoru pro každé maximum. Tabulka 8: Srovnání vychytávání 18-FDG u homozygotù AA (n = 49) proti nositelùm genotypu AG a GG (n = 35) pro rs Ke x y z p uncor p FWE L/P Mozková BA oblast AA > AG+GG < 0,001 0,710 L FG < 0,001 0,827 P MFG ,001 0,894 L MFG 6 AA < AG+GG ,001 0,872 L/P SFG 6 Poznámky: AA > AG+GG zvýšené vychytávání 18-FDG u homozygotů AA proti genotypu AG a GG, AA<AG+GG snížené vychytávání 18-FDG u homozygotů AA proti genotypu AG a GG, BA Brodmannova area, FG gyrus fusiformis, Ke počet signifikantních voxelů v klastru, L levá hemisféra, MFG střední frontální gyrus, P pravá hemisféra, p uncor nekorigovaná hladina významnosti, p FWE korigovaná hladina významnosti, SFG horní frontální gyrus, xyz koordináty v MNI prostoru pro každé maximum. hodnocením psychopatologie a úrovnì kognitivních funkcí, jejichž výsledky následnì vstupovaly do analýz zobrazovacích vyšetøení jako potenciálnì zavádìjící promìnné. Nepotvrdili jsme nicménì pøedchozí nálezy, které specificky u polymorfizmu rs konstatují potenciální vliv na výkon v kognitivních testech (Egan et al., 2004; Mössner et al., 2008) a na aktivitu prefrontálního kortexu (Egan et al., 2004; Marenco et al., 2006) u homozygotù AA proti nositelùm G alely. Tan et al. (2007) proti tomu nachází neefektivní aktivaci prefrontální oblasti pøi testech pracovní pamìti u homozygotù AA pro rs , ale pouze u tìch, kteøí byli souèasnì i Val/Val homozygoty genu pro katechol-o-metyl-transferázu (COMT), což je další kandidátní gen pro schizofrenii. Jedno z možných 80 vysvìtlení pro negativní nálezy v naší studii tak lze hledat v interakci rùzných genù (resp. jejich produktù) na výsledném klinickém a neurobiologickém profilu pacientù, kdy se vliv rùzných polymorfizmù sèítá èi naopak kompenzuje. Nutno je také uvést, že rs , dosud nejvíce testovaný SNP, se nachází v intronu 2 GRM3, a jeho vliv na funkci mglur3 není jasný. Spekuluje se o možném vlivu intronových (tichých) polymorfizmù na trojrozmìrné uspoøádání transkribované mrna, tím na její degradaci a také na prostorové uspoøádání výsledných proteinù se zmìnou jejich funkce (Kimchi-Sarfaty et al., 2007), pøímý dùkaz pro GRM3 však chybí. SNP rs je také intronový polymorfizmus a byl asociován se schizofrenií (Fujii et al., 2003), následné studie však nález nereplikovaly (Chen et al., 2005; Albalushi et al., 2008). Poslední testovaný SNP rs je lokalizován v exonu 3 a v pøedchozí studii pøítomnost T alely predikovala výskyt alternativního sestøihu GRM3 (delece 4. exonu, tzv. GRM3 4), jehož produktem je receptor s chybìjící transmembránovou èástí a pravdìpodobnì narušenou funkcí (Sartorius et al., 2008). Testovat hypotézu o vlivu genotypu CT/TT a haplotypu s T alelou na klinické a neurobiologické charakteristiky však nebylo v našem souboru možné pro nízké zastoupení nostitelù varianty v souboru (n = 8). V dosavadních studiích byly také nacházeny asociace mezi endofenotypy pro schizofrenii a jinými polymorfizmy GRM3, než námi zvolenými, napø. mezi rs a epizodickou pamìtí (Jablensky et al., 2011), rs /rs a celkovou psychopatologií a odpovìdí na léèbu (Bishop et al., 2011), rs a exekutivními funkcemi u zdravých osob (Baune et al., 2010). Proti tomu rs nebyl spojen s úrovní výkonu v øadì kognitivních testù u pacientù se schizofrenií (Schwab et al., 2008). Volba SNP tedy mùže být dalším vysvìtlením pro negativní nálezy v naší studii a v pøípadì

8 rs a rs ji lze považovat za diskutabilní. V pøípadì rs však jde o nejèastìji studovaný polymorfizmus (Egan et al., 2004; Marenco et al., 2006; Mossner et al., 2008; Tan et al., 2007; Tsunoka et al., 2011) s øadou pozitivních nálezù. Dùvody k testování GRM3 v psychopatologii schizofrenie byly mimo jiné vedeny nálezy antipsychotického efektu agonistù mglur2/3 v animálních a klinických studiích (Krivoy et al., 2008; Patil et al., 2007). Recentní nálezy nicménì ukazují, že øada mglur2/3 agonistù ve skuteènosti agonizuje selektivnì mglur2 a nikoli mglur3 (Woolley et al., 2008). Podobné studie s GRM2 jsou však výraznì ménì èetné a pøevážnì s negativními nálezy (Moreno et al., 2009). Další skuteèností èásteènì zpochybòující významnìjší vliv GRM3 na klinické a neurobiologické charakteristiky schizofrenie je absence zmìn úroveò exprese mrna mglur3 v mozcích pacientù se schizofrenií ve vìtšinì studií (Moreno et al., 2009). Významu GRM3 v patofyziologii schizofrenie tak zùstává nejasný. Za omezení studie, vedle výše uvedených (volba SNP a nezahrnutí polymorfizmù jiných kandidátních genù), lze v pøípadì hodnocení psychopatologie a kognitivních funkcí považovat prùøezový charakter šetøení odrážející pouze aktuální klinický stav, který se mùže v èase mìnit. Pøi opakovaném pøešetøení stavu by bylo možno lépe definovat stabilnìjší fenotyp onemocnìní vèetnì odpovìdi na léèbu, která nebyla, s ohledem na charakter dat do našich analýz zahrnuta. Závìr Pùvodní práce Nenalezli jsme žádný signifikantní nález, který by podporoval vztah mezi testovanými polymorfizmy pro GRM3 (genotypy a haplotyp) a klinickými charakteristikami onemocnìní, výkonem v neuropsychologických testech, specifickými vzorci mozkového metabolizmu èi regionálními odchylkami v objemech mozku. Naše studie nepøinesla podporu pro genetickou souvislost polymorfizmù pro GRM3 a klinickým fenotypem a neurozobrazovacími nálezy u pacientù se schizofrenií. Práce byla podpoøena grantem IGA MZ ÈR è. NS MUDr. Tomáš Novák, PhD. Psychiatrické centrum Praha Ústavní Praha 8 Bohnice novak@pcp.lf3.cuni.cz Do redakce došlo: K publikaci pøijato:

9 LITERATURA Albalushi T, Horiuchi Y, Ishiguro H et al. Replication study and metaanalysis of the genetic association of GRM3 gene polymorphisms with schizophrenia in a large Japanese case-control population. American Journal of Medical Genetics Part B-Neuropsychiatric Genetics 2008; 147B: Baune BT, Suslow T, Beste C et al. Association between genetic variants of the metabotropic glutamate receptor 3 (GRM3) and cognitive set shifting in healthy individuals. Genes Brain and Behavior 2010; 9: Bishop JR, Ellingrod VL, Moline J, Miller D. Association between the polymorphic GRM3 gene and negative symptom improvement during olanzapine treatment. Schizophrenia Research 2005; 77: Bishop JR, Miller DD, Ellingrod VL, Holman T. Association between type-three metabotropic glutamate receptor gene (GRM3) variants and symptom presentation in treatment refractory schizophrenia. Human Psychopharmacology-Clinical and Experimental 2011; 26: Chen Q, He G, Chen QY et al. A case-control study of the relationship between the metabotropic glutamate receptor 3 gene and schizophrenia in the Chinese population. Schizophrenia Research 2005; 73: Egan MF, Straub RE, Goldberg TE et al. Variation in GRM3 affects cognition, prefrontal glutamate, and risk for schizophrenia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2004; 101: Ekelund J, Lichtermann D, Hovatta I, Ellonen P, Suvisaari J, Terwilliger JD, Juvonen H, Varilo T, Arajarvi R, Kokko-Sahin ML, Lonnqvist J, Peltonen L. Genome-wide scan for schizophrenia in the Finnish population: evidence for a locus on chromosome 7q22. Hum Mol Genet 2000;9: Farber NB. The NMDA receptor hypofunction model of psychosis. Ann. N.Y. Acad. Sci. 2003; 1003: Fujii Y, Shibata H, Kikuta R et al. Positive associations of polymorphisms in the metabotropic glutamate receptor type 3 gene (GRM3) with schizophrenia. Psychiatric Genetics 2003; 13: Ghose S, Crook JM, Bartus CL et al. Metabotropic Glutamate Receptor 2 and 3 Gene Expression in the Human Prefrontal Cortex and Mesencephalon in Schizophrenia. International Journal of Neuroscience 2008; 118: Horacek J, Bubenikova-Valesova V, Kopecek M, Palenicek T, Dockery C, Mohr P, Hoschl C. Mechanism of action of atypical antipsychotic drugs and the neurobiology of schizophrenia. CNS Drugs 2006; 20: Horáèek J, Španiel F, Novák T, Brunovský M, Minárik M, Mohr P, Páleníèek T, Bubeníková-Valešová V, Vrajová M, Höschl C. The influence of polymorphism for gene RGS4 (Regulator of G-protein signaling 4) on regional brain metabolism (18FDG PET) and phenotypic variables in schizoprenia. Psychiatrie 2009; 13(S3): Jablensky A, Morar B, Wiltshire S et al. Polymorphisms associated with normal memory variation also affect memory impairment in schizophrenia. Genes Brain and Behavior 2011; 10: Jonsson EG, Saetre P, Vares M et al. Dtnbp1, Nrg1, Daoa, Dao and Grm3 Polymorphisms and Schizophrenia: An Association Study. Neuropsychobiology 2009; 59: Kay SR, Fiszbein A, Opler LA. The positive and negative syndrome scale (PANSS) for schizophrenia. Schizophr Bull 1987; 13(2): Kimchi-Sarfaty C, Oh JM, Kim IW, Sauna ZE, Calcagno AM, Ambudkar SV, Gottesman MM. A silent polymorphism in the MDR1 gene changes substrate specificity. Science 2007;315: Krivoy A, Fischel T, Weizman A. The possible involvement of metabotropic glutamate receptors in schizophrenia. European Neuropsychopharmacology 2008; 18: Lancaster JL, Woldorff MG, Parsons LM, Liotti M, Freitas CS, Rainey L, Kochunov PV, Nickerson D, Mikiten SA, Fox PT. Automated Talairach atlas labels for functional brain mapping. Hum Brain Mapp. 2000;10(3): Liddle PF.Schizophrenic syndromes, cognitive performance and neurological dysfunction. Psychological Medicínì 1987; 17: Marenco S, Steele SU, Egan MF et al. Effect of metabotropic glutamate receptor 3 genotype on N-acetylaspartate measures in the dorsolateral prefrontal cortex. American Journal of Psychiatry 2006; 163: Marti SB, Cichon S, Propping P, Nothen M. Metabotropic glutamate receptor 3 (GRM3) gene variation is not associated with schizophrenia or bipolar affective disorder in the German population. American Journal of Medical Genetics 2002; 114: Mezinárodní klasifikace nemocí. 10.revize. Duševní poruchy a poruch chování. Diagnostická kritéria pro výzkum. Praha, Psychiatrické centrum s - Zprávy è Minarik M, Benesova L, Fantova L, Horacek J, Heracek J, Loukola A. Parallel optimization and genotyping of multiple single-nucleotide polymorphism markers by sample pooling approach using cycling-gradient CE with multiple injections. Electrophoresis 2006; 27(19): Moreno JL, Sealfon SC, Gonzalez-Maeso J. Group II metabotropic glutamate receptors and schizophrenia. Cellular and Molecular Life Sciences 2009; 66 : Mossner R, Schuhmacher A, Schulze-Rauschenbach S et al. Further evidence for a functional role of the glutamate receptor gene GRM3 in schizophrenia. European Neuropsychopharmacology 2008; 18: Nicodemus KK, Marenco S, Batten AJ et al. Serious obstetric complications interact with hypoxia-regulated/vascular-expression genes to influence schizophrenia risk. Molecular Psychiatry 2008; 13: Patil ST, Zhang L, Martenyi F, Lowe SL, Jackson KA, Andreev BV, Avedisova AS, Bardenstein LM, Gurovich IY, Morozova MA, Mosolov SN, Neznanov NG, Reznik AM, Smulevich AB, Tochilov VA, Johnson BG, Monn JA, Schoepp DD. Activation of mglu2/3 receptors as a new approach to treat schizophrenia: a randomized Phase 2 clinical trial. Nat Med 2007;13: Preiss M, Rodriguez M, Kawaciuková R, Laing H. Neuropsychologická baterie Psychiatrického centra Praha. Klinické vyšetøení základních kognitivních funkcí. 2., pøepracované vydání. Praha 2007; 84 s. Sartorius LJ, Weinberger DR, Hyde TM, Harrison PJ, Kleinman JE, Lipska BK. Expression of a GRM3 splice variant is increased in the dorsolateral prefrontal cortex of individuals carrying a schizophrenia risk SNP. Neuropsychopharmacology 2008; 33: Sheehan DV, Lecrubier Y, Sheehan KH, Amorim P, Janavs J, Weiller E, Hergueta T, Baker R, Dunbar GC. The Mini-International Neuropsychiatric Interview (M.I.N.I.): the development and validation of a structured diagnostic psychiatric interview for DSM-IV and ICD-10. J Clin Psychiatry 1998; 59 (Suppl. 20): Sullivan PF, Kendler KS, Neale MC. Schizophrenia as a complex trait: evidence from a meta-analysis of twin studies. Arch Gen Psychiatry 2003;60: Schwab SG, Plummer C, Albus M et al. DNA sequence variants in the metabotropic glutamate receptor 3 and risk to schizophrenia: anassociation study. Psychiatric Genetics 2008; 18: Španiel F, Horáèek J, Tintìra J, Ibrahim I, Novák T, Cermák J, Klírová M, Höschl C. Genetic variation in FOXP2 alters grey matter concentrations in schizophrenia patients. Neuroscience Letters 2011;493: Talairach J, Tournoux P. Co-planar stereotaxic atlas of the human brain, Thieme, New York, Tan HY, Chen Q, Sust S et al. Epistasis between catechol-o-methyltransferase and type II metabotropic glutamate receptor 3 genes on working memory brain function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2007; 104: Tsunoka T, Kishi T, Ikeda M et al. No Association Between GRM3 and Japanese Methamphetamine-Induced Psychosis. Current Neuropharmacology 2011; 9: Wedenoja J, Loukola A, Tuulio-Henriksson A, Paunio T, Ekelund J, Silander K, Varilo T, Heikkila K, Suvisaari J, Partonen T, Lonnqvist J, Peltonen L. Replication of linkage on chromosome 7q22 and association of the regional Reelin gene with working memory in schizophrenia families. Mol Psychiatry 2008;13: Woods SW. Chlorpromazine equivalent doses for the newer atypical antipsychotics. J Clin Psychiatry 2003; 64: Woolley ML, Pemberton DJ, Bate S, Corti C, Jones DNC. The mglu2 but not the mglu3 receptor mediates the actions of the mglur2/3 agonist, LY379268, in mouse models predictive of antipsychotic activity. Psychopharmacology 2008; 196: