Hmotnostní spektrometrie Kvalitativní analýza - Interpretace měkkých MS a MS/MS spekter

Transkript

1 Hmotnostní spektrometrie Kvalitativní analýza - Interpretace měkkých MS a MS/MS spekter

2 Identifikace molekul 1. Určení molekulové hmotnosti. 2. Určení velikosti náboje (hlavně v případě iontových sloučenin, biopolymerů). 3. Určení elementárního složení a náboje správná hmotnost a přítomnost charakteristických izotopických píků (izotopická obálka - charakteristické m/z distribuce a intenzity) hlavně při vysokém hmotnostním rozlišení HRMS (čím větší R FWHM tím lépe). 4. Strukturní informace na základě různých MS/MS (či MS n ) experimentů (charakteristické ztráty pro funkční skupiny, substituenty, atd.). 5. Využití různých identifikačních softwarů a databází. 6. V případě kombinace se separačními metodami informace o retenčním čase (LC, GC, SFC, CZE), driftový čas (v případě IMS). Možnost využití různých filtrovacích přístupů pro zjednodušení TICC rekonstruovaný iontový chromatogram, filtrování s ohledem na hmotnostní defekt, chromatogram neutrálních ztrát u LC/MS/MS měření, atd. 7. Kombinace s dalšími technikami NMR, rentgenová krystalografie, UV, IČ (pro kompletní určení struktury)

3 1. Určení molekulové hmotnosti

4 1. Určení molekulové hmotnosti na základě [M+H] +, [M-H] -, M +. iontů nebo aduktů s molekulou [M+Na] +, [M+K] +, [M+NH 4 ] +, [M+CH 3 C] -, [M+HC] - [M+Cl] -, někdy i dimerní ionty typu [2M+H] +, [2M+Na] +. typ a relativní intenzita aduktových iontů velmi výrazně závisí na složení mobilní fáze a obsahu solí v eluentu či vzorku (aduktové ionty se obvykle nevyskytují u fragmentů - jejich význam pro potvrzení správnosti určení M R je zásadní) závislé na použité ionizační technice - někdy je vhodné kombinovat více technik (ESI, APCI, APPI), kombinace oboru módů polarity pokud zcela chybí molekulární ion použít šetrnější ionizaci (ESI, MALDI) a, snaha o tvorbu molekulárních aduktů na základě přídavku vhodného iontu (NH 4+, Na +, K +, Ag +, Li +, CH 3 C -, Cl -, atd.), změna napětí na sprejovací jehle, vstupní elektrodě, iontové optice, změna průtoků sušících a zmlžujících plynů, změna teploty iontového zdroje Dm/z = 22 [M+H] + [M+Na] + [M+K] + Dm/z = 17 Dm/z = 38 [M+NH 4 ] + Dm/z = 16

5 Určení molekulové hmotnosti (API-MS) Positive-ion APCI MW = [M+H] Negative-ion 499 APCI [M-H] - Dm/z = 2 % [M+Na] % 0 [M+K] m/z m/z Dm/z = 22 [M+H] + [M+Na] + [M+K] + Dm/z = 17 Dm/z = 38 [M+NH 4 ] + Dm/z = 16

6 1. Určení M - Nejběžnější typy molekulárních aduktů + - M. Holčapek, R. Jirásko, M. Lísa, J Chromatogr A 1217 (2010) 3908.

7 1. Určení velikosti náboje

8 určení náboje M R = [M+H] + Δm/z = 1/1 2. Určení velikosti náboje Charakteristické rozdíly Dm/z mezi jednotlivými izotopy a potřebné R FWHM pro rozlišení izotopické obálky Náboj ± Dm/z (M M+1) R FWHM (m/z 1500) 1 0,5 0,33 0,2 0,1 0, [M+2H] 2+ Δm/z = 1/2 [M+3H] 3+ Δm/z = 1/3 kalkulace molekulové hmotnosti, když známe náboj např.: m/z 1696 (rozdíl mezi izotopy je 0,1 náboj je 10) molekula je 10x protonovaná [M+10H] 10+ m/z = (M R +10)/10 M=1696*10-10 =

9 2. určení velikosti náboje a M R proteinů Např.: m/z 1696 (rozdíl mezi izotopy je 0,1 náboj je 10) molekula je 10x protonovaná [M+10H] 10+ m/z = (M R +10)/10 M=1696*10-10 = V případě R FWHM >

10 2. určení velikosti náboje a M R proteinů Sousední ionty se liší v náboji o jednotku, můžeme tedy vyjádřit jako z a z+1 (náboj ale neznáme musí se dopočítat). V každém iontu charakteristická izotopická obálka (musíme mít ale vysoké R ) Příklad výpočtu MW a počtu nábojů (řešení 2 rovnic o 2 neznámých) Experimentálně určeno m/z dvou kladně nabitých iontů A (1049.8) a B (991.5) [M R +z] z+ = m/z A = = (M R + z) / z [M R +z+1] (z+1)+ = m/z B = = (M R + z + 1) / (z + 1) - řešením vyjde z = = 17 (náboj musí být celočíselná hodnota) - nyní přiřadíme náboje všech iontům ve spektru (lze ověřit výpočtem) - výpočet M R ze všech identifikovaných iontů, např.: A: M R = * = B: M R = * = , atd. - pak zprůměrování a výpočet M R (tzv. dekonvoluce), vše automaticky softwarově

11 3. Určení elementárního složení

12 3. Určení elementárního složení z kolika a z jakých atomů je molekula složena porovnání experimentální a teoretické izotopické distribuce charakteristické zastoupení M a M+2 izotopů - Cl (3:1), Br (1:1), polyizotopická obálka některých atomů Ge, Sn, Hg, Pd, Pt (organokovové sloučeniny) atd. využití analyzátoru s vysokou správností určení hmoty - čím menší chyba, tím je menší počet možných kombinací atomů pro danou m/z, návrhy pomocí softwaru, které jsou běžně dostupné (často součástí komerčních softwarů) výhodou je - analyzátor s vysokou RP - lze určit náboj iontu podle diference mezi izotopickými píky 1/z, tzn. 1/2 pro dvakrát nabitý ion, 1/3 třikrát nabitý (FT-ICR, orbitrap, QqTF) paracetamol C 8 H 9 N 2 atorvastatin C 33 H 35 FN 2 5 cisplatina Cl 2 PtN 2 H 6

13 3. Určení elementárního složení Defekty atomových hmotností Izotopické zastoupení Prvek Nominální atomová hmotnost [Da] Hmotnostní schodek [mda] Přírodní zastoupení izotopů M [%] M+1 [%] M+2 [%] Typ prvku H "M" C "M+1" N "M+1" "M+2" F "M" Si "M+2" P "M" S "M+2" Cl "M+2" Br "M+2" I "M"

14 3. Určení elementárního složení - izotopy Cl Cl 2 Cl 3 Cl 4 M M M M+2 M+2 M+2 M M+2 M+4 M+4 M+4 Br M M+2 Br 2 Br 3 Br 4 M+2 M+2 M+4 M+4 M M+4 M M+6 M M+2 M+6 M+8

15 3. Určení elementárního složení - izotopy Když v elementárním složení není prvek, který obsahuje M+1 izotop(např. NaCl), tak se tak se v izotopické distribuci nikdy neobjeví izotopy lichého typu M+1 M+3, M+5 apod.

16 3. Určení elementárního složení - izotopy [(AgCl) 10 Ag] [(C 6 H 10 5 ) 40 +H] [C 769 H 1212 N H] [C 769 H 1212 N H]

17 3. Určení elementárního složení - izotopy R. Jirásko & M. Holčapek, Mass Spectrom Rev 30 (2011)

18 3. Určení elementárního složení - izotopy 1*Sn 2*Sn 3*Sn 4*Sn R. Jirásko a kol., J Mass Spectrom 42 (2007)

19 Počet možných elementárních složení (C, H, N, ) 3. Určení elementárního složení Chyba určení správné m/z [ppm] Počet možných elementárních složení vzrůstá s m/z a chybou určení je potřeba definovat další pravidla (omezení) pro snížení počtu návrhů. T. L. Quenzer a kol., Automated accurate mass analysis using FTICR mass spectrometry. Proceedings of the 50 th Annual Conference on Mass Spectrometry and Allied Topics,, rlando FL, (2002)

20 3. Pravidla při určování elementárního složení Množství návrhů elementární složení roste s m/z a R nutná omezení hledání jen očekávaných (logických) prvků C, H,, N, S, P (u molekulárních aduktů + Na, K), pokud očekáváme, tak případně i halogeny většinou pouze sudý počet elektronů (radikály vyhledávány nejsou), N pravidlo. charakteristická isotopická distribuce - polyizotopické prvky - C, H, K, S, Cl, atd. H/C poměr výběr logických kombinací (většinou 0.5 < H/C < 2), ale jsou i extrémní poměry, např. CH 6 N 2 (methylhydrazin) nebo C 8 HN 5 (tetracyanopyrrol) poměr N,, P, S versus C R + DB (počet míst nenasycenosti) = x - ½ y + ½ z + 1 (x je počet čtyřvazných atomů např. C, Si; y je počet jednovazných atomů, např. H, halogeny; z je počet trojvazných atomů, např. N, P)

21 3. Pravidla při určování elementárního složení Element ratios Common range (covering 99.7%) Extended range (covering 99.99%) Extreme range (beyond 99.99%) H/C < 0.1 and 6 9 F/C > 1.5 Cl/C > 0.8 Br/C > 0.8 N/C > 1.3 /C > 1.2 P/C > 0.3 S/C > 0.8 Si/C > 0.5 Poměr H/C pro 42 tisíc různých molekul (obsahujících uvedené prvky) z Wiley MS knihovny T. Kind &. Fiehn, BMC Bioinformatics 8 (2007) 105.

22 Dusíkové pravidlo Pro ionty EE + lichá hodnota m/z (např. H 2 +H) znamená sudý počet dusíků, sudá hodnota m/z (např. NH 3 +H) lichý počet dusíků platí pro běžné organické prvky (C, H, N,, F, Si, P, S, Cl, Br, I) proč toto pravidlo? dusík je jediný z běžných organických prvků, který má sudé atomové číslo a lichou vaznost, všechny ostatní mají obojí buď liché nebo sued i v měkkých ionizačních technikách můžeme někdy pozorovat lichý počet elektronů tzn. M +. (u technik APCI, DART běžné) Počet dusíků m/z lichá m/z sudá 0, 2, 4,... (sudý) EE + E +. 1, 3, 5,... (lichý) E +. EE +

23 parametr sigma (Bruker) - správnost hodnoty m/z a relativní intenzity pro všechny izotopy (užitečné pro výběr spravného elementárního složení) Ukázka aplikace softwaru pro identifikaci elementárního složení iontů H C CH 2 H H C,H,N, H Doxorubicin C 27 H 29 N 11 M=543 NH 2 H Dusíkové pravidlo lichý počet N sudý počet elektronů

24 Vysoká správnost určení m/z a charakteristická izotopická distribuce H H Doxorubicin C 27 H 29 N 11 M= C H CH 2 H H NH mda [M-H] [M+Cl] [M-H+KCl] [M-H+2KCl] Dm/z exp = Dm/z teor = error = -0.2 mda Dm/z exp = Dm/z teor = error = 0.0 mda HCl K-H KCl Dm/z exp = Dm/z teor = error = -0.5 mda [M-H] - [M+Cl] - [M-H+KCl] - [M-H+2KCl] -

25 4. MS/MS pro získání strukturních informací

26 4. MS/MS pro získání strukturních informací strukturní části molekuly určíme na základě fragmentových iontů funkční skupiny - většinou poskytují charakteristické ztráty (např. -H: Δm/z=18, -CH: Δm/z=44) větší celky molekuly - např. postranní řetězce, neutrální ztráty mastných kyselin z esterů (cholesterolestery), konjugační substituenty u metabolitů II fáze (glukoronidace ztráta 176 C 6 H 8 6 či 194 C 6 H 8 6, sulfatace ztráta 80 S 3 či 98 H 2 S 4 ) analyzátory, kde je možné dělat MS/MS nebo ještě lépe MS n kompletní struktura molekuly ve většině případů nelze pomocí MS rozlišit izomery (polohové, optické, atd.) u polohových izomerů někdy rozdílné intenzity fragmentových iontů, využití vysokoenergetických kolizí (určení poloh dvojných vazeb, větvení) nebo speciálních aduktů, které poskytují charakteristické fragmentové ionty (Li + ) nutná kombinace s dalšími spektrálními technikami, které dokážou rozlišit izomerie, uspořádání v prostoru, atd. - NMR, rentgenová krystalografie, UV, IČ kombinace se separačními technikami (t R, retenční chování) - separace izomerů

27 Vliv vybraných funkčních skupin na ionizaci pro uhlovodíky bez funkčních skupin nejvhodnější APCI / APPI v kladném módu (spektra velmi podobná EI s výjimkou [M+H] + místo M +. ), v ESI jen pomocí tvorby aduktů (Li, Ag, Na, apod.) anionické funkční skupiny (sulfát, fosfát, sulfo, karboxy) - výborná ionizační účinnost a tím i citlivost v záporném módu (obecně vhodnější ESI než APCI), signál v kladném módu horší nebo žádný, částečně může vylepšit jiná protonovatelná skupina (např. NH 2 ) Funkční skupiny obsahující dusík (nitráty, nitro, N-oxidy) - poměrně častý výskyt radikálových iontů, což komplikuje využití dusíkového pravidla pro polysulfatované látky rozsáhlá fragmentace, nízká intenzita nebo absence [M-H] - iontu (opakované ztráty H 2 S 4 a/nebo S 3 ), násobně nabité ionty, intenzivní adukty se sodným iontem (popř. K +, NH 4+ ), typicky zasolené vzorky kationické funkční skupiny (např. kvartérní aminy) vynikající signál v kladném ESI módu, pozor na silné paměťové efekty (lépe se těmto látkám zcela vyhnout), signál v záporném módu obvykle neposkytuje

28 Vliv zavedení iontové funkční skupiny (sulfát) APCI+ (alkohol) S 2 NH(CH 2 ) 6 H [M+H] APCI+ MS 1 ESI- (sulfát) MS/MS [M+H-NH (CH ) H-S ] [M+H-NH 2(CH 2) 6H] [M+H-H2] S 2 NH(CH 2 ) 2 S 3 H - [M-H-S3-CH3CH] [M-H-S 3 ] 2 MS of m/z 404 [M-H]

29 4. MS/MS - vliv funkčních skupin na fragmentaci minimum nebo absence fragmentových iontů v MS 1 (určení M R ), fragmentace pomocí MS/MS nebo MS n (odvození struktury), zaleží i na použitých napětích v hmotnostním spektrometru štěpení menšího počtu labilních vazeb ve srovnání s EI ve velké většině ionty se sudým počtem e - orientační pravidlo - čím polárnější je funkční skupina, tím větší vliv na ionizační a fragmentační chování lze očekávat místo (de)protonace často iniciuje mechanismus časné ztráty vliv funkčních skupin na fragmentaci lze orientačně seřadit: nitrát > fosfát ~ sulfát >> sulfonová kyselina > karboxylová kyselina > hydroxy skupina > nitro skupina > halogeny > ostatní funkční skupiny polyfunkční sloučeniny - konkurenční mechanismy fragmentace. Spojení HPLC/MS se obecně používá pro složitější molekuly (vyšší M R, více polárních funkčních skupin) ve srovnání s GC/EI-MS = složitější spektra i jejich interpretace

30 4. MS/MS - vliv funkčních skupin na fragmentaci Funkční skupina / Substituent Neutrální ztráta / Produktový ion (m/z) Alkyl a aryl alken, alkan (zejména u druhé ztráty), C 6 H 4 (76) nebo C 6 H 6 (78) Fosfáty (RP 4 H 2 ) HP 3 (80) a H 3 P 4 (98), m/z 97 [H 2 P 4 ] -, m/z 79 [P 3 ] - Sulfát (RS 4 H) S 3 (80) a H 2 S 4 (98), m/z 97 [HS 4 ] - Amid (R 1 CNH 2, R 1 CNHR 2, R 1 CNR 2 R 3 ) Amin (R 1 NH 2, R 1 NHR 2, R 1 NR 2 R 3 ) [M+H-NH 3 ] +, [M+H-R 2 NH 2 ] +, [M+H-R 2 R 3 NH] + [M+H-NH 3 ] +, [M+H-R 2 NH 2 ] +, [M+H-R 2 R 3 NH] +, [M+H-HCN] + Azo (R 1 N=NR 2 ) [M+H-N 2 ] +, [M+H-R i ] +, [M+H-R i NH] +, [M+H-R i N 2 ] + Nitril (RCN) [M+H-HCN] + Nitrát (RN 3 ) [M-H-N] -., [M-N 2 ] -, [M-H-N 2 ] -., [M-H-N 2 ] -. Nitro (RN 2 ) 17 [M+H-H] +., [M+H-H 2 ] +, [M+H-N] +., [M+H-N 2 ] +., [M-H] -, [M-N] -, [M-H-N] -., [M-H-HN] -, [M-H-H] -., [M-N 2 ] -, [M-H N ] -., [N ]

31 Funkční skupina / Substituent Nitroso (RN) [M+H-N] + Neutrální ztráta / Produktový ion (m/z) N-oxid (RN + - ) [M+H-] +, [M+H-H] +., [M+H-H 2 ] + Halogenid (RX) [M+H-X] +., [M+H-HX] +, [M-H-X] -., [M-H-HX] -, [F] -, [Cl] -, [Br] -, [l] - Ester (R 1 CR 2 ) [M+H-R 2 H] +, [M+H-R 2 H-C] +, (např. [M-C 2 H 5 H-C] + ) Keton (R 1 CR 2 ) [M+H-H 2 ] +, [M+H-C] +, [R i C] + Aldehyd (RCH) [M+H-C] +, [M-H-C] - Karboxyl (RCH) [M+H-H 2 ] +, [M+H-C 2 ] +, [M+H-H 2 -C] +, [M-H-C 2 ] - Hydroxyperoxid (RH) 30 Epoxid/Alkohol (R/RH) [M+H-H 2 ] [M+H-H 2 ] +, [M+H-H 2 2 ] + (pozn. Dm/z 34 je i u SH skupiny) Fenol (RH) [M+H-H 2 ] +, [M+H-C] +, [M-H-H 2 ] -, [M-H-C] Methoxy (RCH 3 ) [M+H-CH 3 ] +., [M+H-CH 3 ] +., [M+H-CH 3 H] +, [M+H-HCH] HR-MS rozliší

32 Uhlovodíky (C x H y ), alkyl/aryl substituce alkany, alkeny, alkiny, aromáty pro alkyl substituci na aromatickém nebo obecně cyklickém systému očekávány ztráty alkenu (nebo alkanu, zejména u druhé a další ztráty pro více přítomnost více alkylů) podobně pro aryl substituci jsou obvyklé neutrální ztráty C 6 H 4 (Dm/z 76) nebo C 6 H 6 (Dm/z 78) ztráty alkyl/aryl radikálů jsou méně obvyklé, někdy se vyskytují v záporném módu (zejména pro APCI / APPI) pro uhlovodíky bez funkčních skupin nejvhodnější APCI / APPI v kladném módu, v ESI jen pomocí tvorby aduktů (Li, Ag, Na, apod.)

33 Příklady fragmentací - Halogeny Cl, Br - HCl (- 36) Cl H 100% % 37 m/z Poměr izotopů 35 Cl : 37 Cl = 3 : 1 n * Cl = (3a + b) n Br Poměr izotopů 79 Br : 81 Br = 1 : 1 - HBr (- 80) H m/z n * Br = (a + b) n pro poly- a perhalogenované sloučeniny opakované ztráty HX nebo X. (zejména Br. ), což vede k výraznému poklesu [M+H] + či [M-H] - iontů

34 Fosfátová skupina Fosfor je monoizotopický H H H H R P R + P R P (R-H) + P [M-H-HP 3 ] - H [H 2 P 4 ] - H

35 Příklady MS/MS - fosfátová skupina (RP 3 H 2 ) časté u biomolekul (peptidů, lipidů, cukrů) lze měřit nejlépe v ESI-, někdy i ESI+ (fosfolipidy), labilní iontová skupina adukty se sodným iontem a dalšími kationty diagnostické fragmenty m/z 79 [P 3 ] -, 97 [H 2 P 4 ] - [H 2 P 4 ] - [M-H] - [P 3 ] - [M-H-H 2 ] - C. Antonio et al, J. Chromatogr. A 1172 (2007) 170

36 Sulfátová skupina (RS 3 H) [HS 4 ] - m/z 97 - S 3 (- 80) S H S - H H - H 2 S 4 (- 98) pro polysulfatované látky rozsáhlá fragmentace, nízká intenzita nebo absence [M-H] - iontu (opakované ztráty H 2 S 4 a/nebo S 3 ), násobně nabité ionty výborný signál v negativním módu: ideální pro ESI -, popř. MALDI -

37 Příklady fragmentací - sulfátová skupina M ( 32 S) = 100% M+1 ( 33 S) = 0.79% M+2 ( 34 S) = 4.4% R S R + S R S (R-H) + S [M-H-S 3 ] - H [HS 4 ] - H

38 Karboxylové kyseliny (RCH) H H R C H R C + H R C R [M+H-H 2 ] + + C [M-H-C 2 ] -

39 Karboxylové kyseliny (RCH) C H APCI- ESI- C - - C 2 (- 44) lze použít záporný mód všech API technik i MALDI, v případě dalších funkčních skupin možný i záznam kladných iontů naprosto charakteristická ztráta Dm/z 44 = C 2, může být intenzivní již v MS 1, typické pro záznam záporných iontů, často i v kladném módu (další ztráty H 2, C, H 2 +C), u alifatických kyselin ztráta C 2 méně výrazná v oblasti nízkých m/z může být pozorován ion m/z 44 [C 2 ] -, jiné ztráty nejsou polykarboxyláty (nebo kombinace karboxy + sulfo skupin) tvoří aduktové ionty záměnou kyselých protonů za sodné ionty podobně jako sulfo kyseliny falešná interpretace Dm/z 44 téměř vyloučena, jediná možná záměna je ztráta radikálu NH 2 C. pro dusíkaté heterocykly obsahující karbonylovou skupinu, avšak tato ztráta nebývá jednotně 44 v obou módech polarity, ale doprovázena Dm/z 43 = NHC

40 Kyslíkaté sloučeniny ztráta vody Dm/z 18 - teoreticky možná téměř pro všechny kyslíkaté sloučeniny diagnostická hodnota je malá, nutno posuzovat i intenzitu iontu alifatické alkoholy velice intezivní ztráta vody již v MS 1, v APCI většinou 100% intenzitu již v MS 1 (často i v ESI), v MS/MS ion [M+H-H 2 ] + opět převládá fenoly a chinony ztráta vody může být patrná, ale oproti alkoholům nižší relativní intenzita, někdy ztráta radikálu H. (např. nitro látky), přesmyková ztráta Dm/z 28 = C polyhydroxylované sloučeniny (např. cukry) nutné použít ESI, opakované ztráty vody, pokles intenzity [M+H] + / [M-H] - ketony - analogicky a-štěpení u EI vznikají [R 1 C] + a [R 2 C] +, někdy též ztráta vody [M+H-H 2 ] + s velmi malou intenzitou aldehydy ztráta C pozorovaná v obou módech polarity (nespecifické, běžné např. pro karbonyl v cyklické struktuře), někdy ztráta Dm/z 30 = HCH estery při absenci dalších funkčních skupin vhodnější záznam kladných iontů, typická ztráta alkoholu R 2 H z esterové funkční skupiny R 1 CR 2 (např. ztráta methanolu u methylesteru) následovaná ztrátou C, dále vznik karbonylových iontů [R 1 C] + obecně výrazné analogie s EI, zejména při použití APCI

41 Shrnutí vlivu funkčních skupin na fragmentaci K. Levsen et al., J. Mass Spectrom.,42 (2007) 1024

42 rbitrap MALDI-MS (MSI) identifikace sulfatidů (sacharid, sfingoidní báze a N-acyl) H S H H H -404 (Hex 2 S 3 H) H H X H R NH H -RC Dm/z Sfingoidní báze ceramidu d16:1 (X=H, n=4) d18:1 (X=H, n=5) t18:0 (X=H, no DB, n=5) d20:1 (X=H, n=6) t20:0 (X=H, no DB, n=6) n N-acyl Dm/z of R chain :0 (H) :0 (H) :0 (H) :1 (H) :2 (H) :1 (H) :0 (H) :1 (H) -sfingoidní báze ceramidu Neutrální ztráta R (jen hydroxylovaný N-acyl řetězec) Nejčastější neutrální ztráta RC společně s H 2 N-acyl Dm/z of RC chain : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : :0

43 Vliv funkčních skupin na fragmentaci vybraná literatura

44 5. Využití různých identifikačních softwarů a databází

45 5. Databáze a softwary využívané v MS identifikaci Prohledávání a porovnávání v databázích (nutné vysoké R) - knihovny sloučenin (zadávání správně naměřené přesné m/z nebo elementárního složení) nebo knihovny spekter (spektrální databáze o několik řádu menší než databáze sloučenin) knihovny sloučenin např. PubChem, ChemSpider, LipidSearch, KEGG, HMDB, atd.; spektrální knihovny např. MassBank, m/zcloud (spektrální stromy), Metlin atd. Softwary umožňující hledání ve strukturních databázích sloučenin + počítačem simulované (in silico) fragmentace - predikce MS 2 spektra na základě definovaných pravidel fragmentace (např. MassFrontier, ACD/MS Fragmenter) - kombinační fragmentace kombinuje, buď všechny možné fragmenty nebo zohledňuje, že některé vazby se štěpí lépe (vazebná disociační E), např. MetFrag. Softwary kombinující porovnávání se spektrální databází a generování in silico fragmentací např. MetFusion, Metlin.

46 Nejprve konverze a správné procesování MS dat Firemní nebo sdílený otevřený software - nahrávání surových raw dat nebo export do univerzálního formátu: - export binárních dat obsahujících jednotlivé m/z a intenzity pro každý sken (čas) nebo zprůměrované spektrum - konverze raw dat - např. mzml, mzxml, netcdf, ASCII, mgf, mzdata, atd. export MS spekter (čárové nebo profilové) m/z 1 INT 1 m/z 2 INT 2 Relative Abundance eryt_neg_9aa_le20_l10 #1-28 RT: AV: 28 NL: 1.15E7 T: FTMS - p MALDI Full ms [ ] m/z Procesování MS dat - správný sběr MS píku, odečet pozadí, vyhlazování m/z 3 INT 3 m/z n. INT n (je třeba jen opatrně), zarovnání píků v rámci všech záznamů (synchronizace retenčních časů i m/z), kalibrace hmoty, izotopická korekce (lipidy), normalizace (na IS), odstranění m/z s nulovými hodnotami intenzity, odstranění shoulder píků, atd., často jsou součástí i napojení na databáze sloučenin a knihovny spekter

47 Příklad hledání v databázi sloučenin - mmass

48 Hledání a porovnávání v knihovnách spekter Knihovna sloučenin a naměřených MS/MS spekter porovnání spekter Měřené MS/MS spektrum Výhodou u HRMS je, že známe elementární složení prekurzoru. Porovnáme MS/MS spektra měřená stejným principem fragmentace (např. CID, HCD). Spektrální knihovny jsou řádově menší než knihovny sloučenin. Bodování na základě podobnosti či odlišnosti spekter (informace, které spektrum z databáze se nejvíce shoduje se změřeným spektrem) - např. počet spárovaných píků. Strukturně podobné látky mají podobnou fragmentaci stejné neutrální ztráty či produktové ionty, je potřeba interpretovat všechny píky ve spektru (nejlépe pokud fragmentujeme pouze jednu látku kvalitní separace nebo jednoduchý vzorek jinak hrozí falešně pozitivní přiřazení píků).

49 Porovnávání s in silico fragmentací Strukturní databáze molekul Fragmentace s pravidly + Definovaná pravidla Kombinační fragmentace No hit Aplikace pravidel Skóre fragmentace pro každou vazbu (číslo představuje náročnost štěpení) simulované MS skóre: 5 nepřiřazené píky: 2 F. Hufsky a kol., Trends in Analytical Chemistry 53 (2014) 41. Měřené MS

50 5. kombinační fragmentace - software MetFrag

51 Software MetFrag kombinační fragmentace

52 Sowtware MetFusion M. Gerlich & S. Neumann, J. Mass Spectrom. 48 (2013) 291. naměřené spektrum KEGG PubChem spektrální databáze (MassBank, Metlin) ChemSpider databáze sloučenin porovnání podobnosti MS/MS in silico Fragmenter (MetFrag) Kandidáti sloučenin Chemická podobnost Integrace Kandidáti sloučenin Integrovaný souhrn výsledků s ohledem na obě cesty

53 Přehled MS/MS databází - metabolomika M.Vinaixa a kol., Trends in Analytical Chemistry 78 (2016)

54 Přehled MS/MS databáze malé molekuly T. Kind a kol.,, Mass Spectrometry Reviews 37 (2018)

55 Softwary pro procesování dat + napojení na databáze ukázka MZmine T. Pluskal, S. Castillo, A. Villar-Briones and M. resic, Bmc Bioinformatics 11 (2010) 395..

56 Procesování dat přehled softwaru využívaného v metabolomice J.-L. Ren, A.-H. Zhang, L. Kong and X.-J. Wang, RSC Advances 8 (2018)

57 6. Různé přístupy filtrování pro zjednodušení interpretace LC/MS a LC/MS/MS dat

58 Filtrování informací z LC/MS a LC/MS/MS dat Z chromatogramu celkového iontového proudu (TICC) v LC/MS a LC/MS/MS analýze (pokud očekáváme určité typy iontů např. metabolity léčiv, degradační produkty, deriváty, atd.) extrakce pouze určitých iontových proudů (určitých m/z), tzn. chromatogramy rekonstruovaných (extrahovaných) iontových proudů (RIC neboli EIC) filtrování s ohledem na hmotnostní defekt (smysl hlavně u HRMS) extrakce takových produktových spekter, ve kterých se vyskytuje určitá neutrální ztráta (charakteristická pro určité typy sloučenin), tzn. chromatogramy konstantních neutrálních ztrát (pouze u LC/MS/MS)

59 LC/MS měření základních skenů v každém bodě LC/MS analýzy se měření hmotnostních spekter v plném rozsahu m/z v závislosti na nastaveném rozsahu hmotnostní stupnice (tzv. základní skeny) - kompletní informace o iontech analyzované látky - možnost vyvolání spektra v určitém čase - průměrování spekter za určitý čas - všechny typy analyzátorů - velké množství dat

60 Sken produktových iontů (Product Ion Scan PR) zastaralý název sken dceřiných (Doughter ion scan) nebo fragmentových (Fragment ion scan) iontů měří se produktové ionty po fragmentaci vybraného iontu prekurzoru jedná se o měření MS/MS nebo MS n spekter z vybraných iontů manuálně nebo plně automaticky v průběhu HPLC/MS/MS analýzy informace o struktuře látky, identifikace všechny analyzátory s možností MS/MS (QqQ, IT, sektorové analyzátory, hybridní analyzátory, atd.) 1. 2.

61 Identifikace koeluce píků triacylglycerolů TIC

62 Identifikace koeluce píků triacylglycerolů látky [M 2 +H] + [M 1 +H] [M 2 +NH 4 ] + [M NH 4 ] + 900

63 Identifikace koeluce píků triacylglycerolů TIC RIC m/z = 883 RIC m/z = 857

64 pozadí signál signál pozadí signál TIC [M+H] [M+H] RIC m/z = 883 SLL [M+H] [SL] [LL] [M+NH 4 ] RIC m/z = 857 [P] [LP] [L] LP [M+H] [M+NH 4 ] + 874

65 Identifikace stopových látek TIC

66 Identifikace stopových látek TIC 689 RIC m/z = 689 t R = min ECN = 56 Lg [] [Lg] [M+NH 4 ] [M+H] + 971

67 Metabolismus léčiv princip konverze na deriváty s vysokou rozpustností ve vodě s cílem odstranit cizí látky (xenobiotika) z organismu biotransformace léčiv (xenobiotik) 2 základní procesy: N fáze I fáze II N H N H H CH H Fáze I - reakční změny funkčních skupin: oxidační (hydroxylace, epoxidace) a redukční (redukce karbonylu) reakce, dealkylace na heteroatomu, hydrolýza esterů atd. Fáze II - konjugační reakce, např. glukuronidace, sulfatace, glykosylace, reakce s aminokyselinami, metylace atd.

68 Extrakce chromatogramu konstantní neutrální ztráty z LC/MS/MS záznamu TICC (ESI + ) studované léčivo (dimefluron) N Dm/z (C 6 H 8 6 ) typické pro glukuronidy chromatogram konst. neutr. ztráty t R [min] nalezené glukuronidy [M+H] + Elementární složení metabolitů Mass accuracy [ppm] C 28 H 31 N C 28 H 29 N C 28 H 31 N C 28 H 31 N C 28 H 31 N C 29 H 33 N C 29 H 33 N

69 EIC chromatogramy EIC EIC EIC Fáze I Fáze II -CH 2 demethylace +H 2 redukce karbonylu +C 6 H 8 6 glukuronidace N MW Glukuronid Neutrální ztráta Elementární složení Metabolit I. fáze Parentní sloučenina Rozdíl 539 C 28 H 29 N 10 C 22 H 21 N 4 -CH C 28 H 31 N 10 C 6 H 8 6 C 22 H 23 N 4 C 23 H 23 N 4 C (-CH 2 +H 2 ) 555 C 29 H 33 N 10 C 23 H 25 N 4 +H 2

70 Defekty atomových hmotností Element Nominal atomic mass [Da] Mass defect [mda] H C 12 0 N F Si P S Cl Br I Nejběžnější metabolické reakce I. fáze Nominal mass shift [ΔDa] Metabolic reaction (elemental composition change) Exact mass shift [mda] -44 Decarboxylation (-C 2 ) Alcohol dehydration (-H 2 ) Demethylation (-CH 2 ) Ring formation (-H 2 ) Ring opening (+H 2 ) Hydroxylation and cyclization (+-H 2 ) Hydroxylation (+) -5.1 Epoxidation (+) -5.1 xidation (+) Epoxidation and hydration (+H 2 2 ) +5.5

71 Nejběžnější metabolické reakce II. fáze Nominal mass shift [ΔDa] Conjugation reaction (elemental composition change) Drug functional group Exact mass shift [mda] +14 Methylation (+CH 2 ) NH 2, H, SH Acetyl conjugation (+C 2 H 2 ) NH 2, NHNH 2, S 2 NH 2, H Glycine conjugation (+C 2 H 3 N) CH Phosphorylation (+P 3 ) H Sulfation (+S 3 ) NH 2, S 2 NH 2, H Glucosylation (+C 6 H 10 5 ) H, CH Glucuronidation (+C 6 H 8 6 ) H Indirect carbamate glucuronidation of amines (+C 7 H 8 8 ) NH 2 + C X Glutathione conjugation halide substitution (-X+C 10 H 16 6 N 3 S) Halide (X) Glutathione conjugation via epoxidation (+C 10 H 15 6 N 3 S) Aromatic V review celkem popsáno 54 metabolických reakcí I. fáze a 25 reakcí II. fáze M. Holčapek, L. Kolářová, M. Nobilis, Anal. Bioanal. Chem, 216 (2008) 1962

72 Filtrování s ohledem na hmotnostní schodek m/z C 23 H 23 N 4 +H 2 +C 6 H ,2385 N 0,2385-0,17 = +0,0685 [M+H] + = 378,1700-2*CH 2 +S 3 430,095 0,095 0,17 = -0,075 0,17 +0,0685-0,075

73 Filtrování s ohledem na hmotnostní schodek TIC filtrování s ohledem na hmotnostní defekt EIC vybrané hodnoty m/z Zjednodušení chromatogramu se zvyšující specifikací extrakce iontového proudu J. M. Casro-Perez, Drug Discovery Today 12 (2007) 249.

74 Kombinace s dalšími technikami např. UV spektra DMF Redukovaný DMF CH 3 CH 3 H 3 C H 3 C N CH 3 N CH 3 H 3 C H 3 C H H Narušení konjugace mau 1000 mau nm nm

75 becný postup HPLC/MS/MS identifikace (analýza metabolitů, přírodních extraktů, syntetických produktů) A/ Hlavní (cílová, výchozí, parentní) látka struktura známá, dostatečné množství standardu - změření a detailní interpretace všech možných MS experimentů, lze využít i přímé infúze (různé ionizační techniky, obě polarity záznamu, různé typy analyzátorů, chromatografické chování, UV spektra z PDA detektoru) Cíl: a) znalost chování hlavní látky při ionizaci, fragmentaci a HPLC retenci kvůli uplatnění analogie pro identifikaci vedlejších látek (metabolitů, meziproduktů, nečistot, minoritních složek, atd.) b) volba optimálních podmínek pro vlastní analýzu vzorku B/ Standardy vedlejších látek pokud jsou k dispozici, provést vše viz A/ C/ HPLC/MS analýza vzhledem ke komplexnosti uvedených typů vzorků není vhodné vynechání separačního kroku, jinak ztráta informace - volba HPLC podmínek optimalizace separace, MS kompatibilní podmínky - měřit oba módy polarity, podle charakteristických iontů určení M R všech hlavních složek a maximálního počtu minoritních píků - ověřovat a rozlišovat koeluce pomocí rekonstrukce iontových proudů (RIC)

76 becný postup HPLC/MS/MS identifikace D/ HPLC/auto MS/MS experimentálně lze provést zároveň s C/ HPLC/MS - interpretace následně po určení M R z HPLC/MS - optimální volba podmínek (práh citlivosti threshold ), počet iontů pro kolize, kolizní energie, exkluze iontů, ukončení exkluze, atd.) by měla zajistit změření MS/MS spekter pro všechny píky včetně koelucí, obvykle pro ionty [M+H] + nebo [M-H] -, možnost interaktivní úpravy nastavení v průběhu analýzy - ne vždy se podaří, obtížné nastavení u koelucí, chvostování píků, stopových složek (případně využití MS all, SWATH) (D2/ HPLC/manuální MS/MS - dodatečné experimenty v případě chybějících důležitých MS/MS spekter, nutnosti doměření MS 3 či in-source CID +MS 2 ) E/ Měření přesných správných hmot pomocí QqTF, rbitrap, FTICR, určení elementárního složení pro prekurzorové i produktové ionty (kalibrace, <3 ppm) F/ Sumarizace a korelace všech dostupných dat retenční chování, UV spektra z PDA detekce, určení M R, interpretace MS/MS spekter, další spektrální informace + základní chemický cit = návrh struktury (nebo aspoň její části) G/ věření návrhu struktury pomocí identického standardu