ANAÝZA PRŮMYSOVÝCH VZORKŮ KOMPEONŮ POMOCÍ IZOTACHOFORÉZY (ITP) NÁVOD PRO AORATORNÍ ÚOHU 1. ÚVOD Izotchoforéz je elektromigrční nlytická metod může být definován jko seprce směsi ionogenních látek v roztoku průchodem elektrického proudu n smosttné zóny jednotlivých látek. Principem rozdělení původní homogenní zóny vzorku n jednotlivé zóny jeho složek jsou rozdílné hodnoty pohyblivosti jednotlivých látek. V této úloze bude izotchoforéz využit pro nlýzu průmyslových vzorků komplexonů. Průmyslově vyráběná komplexční činidl obshují jko hlvní složky nitrilotrioctovou kyselinu (NTA) nebo etylendimintetroctovou kyselinu (EDTA), resp. jejich sodné soli. Kromě těchto komplexonů všk obshují v mlé míře i dlší látky, především nečistoty z výrobního procesu. Cílem lbortorní úlohy je provedení kvlittivní kvntittivní nlýzy předložených vzorků komplexonů typu A (NTA) (EDTA) pomocí izotchoforézy. Dílčím úkolem je výpočet efektivních pohyblivostí jednotlivých nlytů dle uvedeného postupu. Podrobnější informce o izotchoforéze nebo o průmyslově vyráběných komplexčních činidlech, zejmén jejich složení vlstnostech, lze njít v doporučené litertuře, která je volně dostupná n internetu. Před zčátkem lbortorního cvičení je vhodné se s touto literturou seznámit.. POMŮCKY A CHEMIKÁIE.1. CHEMIKÁIE Chelton 3, dihydrát, p.., CAS: 6381-9-6, M R = 37,4, chem rno Nitrilotrioctová kyselin, p.., CAS 139-13-9, M R = 191,14, Fluk Iminodioctová kyselin, CAS: 14-73-4, M R = 133,10, Sigm Glykolová kyselin, pure, CAS: 79-14-1, M R = 76,05, Prk Scientific imited Octn monný, p.., CAS: 631-61-8, M R = 77,08, chem rno Kyselin chlorovodíková, 1 mol l -1, p.., CAS: 7647-01-0, M R = 36,46, J.T. ker Octová kyselin, 99 %, p.., CAS: 64-19-7, M R = 60,05, chem rno Hydroxyetylcelulóz, CAS: 9004-6-0, Fluk Amonik, 5 %, p.., CAS: 1336-1-6, M R = 17,03, Pent Chrudim Mrvenčí kyselin, M R = 46,03, Pent Chrudim Sírn sodný, dekhydrát, M R = 3,19, chem rno 1
.. PŘÍSTROJOVÉ VYAVENÍ Izotchoforetický nlyzátor EA 10 s bezkontktním vodivostním detektorem, výrobce Vill beco, Spišská Nová Ves, Slovensko, sestvený pro jednokolonovou techniku s kolonou o průměru 300 m délce 90 mm s dávkovcím kohoutem pro injektáž 30 l vzorku. Řídící vyhodnocovcí softwre ITP PRO 3, výrobce KsComp, td. Pro nstvení ph elektrolytů lze použít ph-metr ph/ion 510, výrobce Eutech Instruments, Singpore. Přístroj se po kždém spuštění justuje klibrčními roztoky o ph 4,01, 7,00 10,00. K příprvě stndrdních roztoků lze použít nlytické váhy s odečittelnou hodnotou 0,0001 g, výrobce Ohus Pioneer, USA, typ PA114. Váhy je nutné před použitím vždy justovt dle návodu. 3. PRACOVNÍ POSTUP 3.1. PŘÍPRAVA EEKTROYTŮ VEDOUCÍ EEKTROYT (EADING) 0 mmol l -1 HCl + GY-GY + 0,05 % HEC, ph = 3,10 5000 l roztoku HCl o koncentrci 1,000 mol l -1 se pipetuje do nlyticky čisté kádinky o objemu 150 ml, ve které je přiměřené množství destilovné vody. Kádink se umístí n mgnetickou míchčku z neustálého míchání kontroly ph z pomocí ph-metru se po mlých dávkách přidává glycilglycin, ž do hodnoty ph = 3,10. Nkonec se roztok kvntittivně převede do odměrné bňky o objemu 50 ml, přidá se 1,5 ml 1 % roztoku hydroxyetylcelulosy doplní se po rysku destilovnou vodou. KONCOVÝ EEKTROYT (TERMINATING) 0 mmol l -1 HAc + NH 3, ph = 4,80 86 l octové kyseliny (99 %, ρ = 1,06 g cm -1 ) se pipetuje do nlyticky čisté kádinky o objemu 150 ml, ve které je přiměřené množství destilovné vody. Kádink se umístí n mgnetickou míchčku z neustálého míchání kontroly ph z pomocí ph-metru se po velmi mlých dávkách přidává zředěný roztok moniku, ž do hodnoty ph = 4,80. Nkonec se roztok kvntittivně převede do odměrné bňky o objemu 50 ml doplní se po rysku destilovnou vodou. 3.. PŘÍPRAVA STANDARDNÍCH ROZTOKŮ A VZORKŮ Pro účely kvntittivní nlýzy se připrví zásobní stndrdní roztoky nlyzovných látek o koncentrci 10 mmol l -1, které budou pro konkrétní nlýzy dále ředěny n poždovnou koncentrci. Stndrdní roztoky se připrví do odměrných bněk o objemu 100 ml, přehled nvážek jednotlivých látek je uveden v tbulce (viz Tbulk 1). V přípdě NTA je třeb roztok pro zvýšení rozpustnosti zlklizovt 6 ml roztoku hydroxidu sodného o koncentrci 1 mol l -1. Pokud některé osttní stndrdní látky budou tké šptně rozpustné, lze i k nim přidt přiměřené množství roztoku NOH.
Tbulk 1 Přehled nvážek pro příprvu stndrdních roztoků Stndrd Nvážk [g] N EDTA H O 0,37 NTA 0,1911 IDA 0,1331 GYA 0,0761 N SO 4 10H O 0,3 Stndrdní roztok mrvenčí kyseliny se připrví pipetováním 39 l jejího koncentrovného roztoku (96 %, ρ = 1, g cm -1 ) do odměrné bňky o objemu 100 ml. Zásobní roztok vzorku komplexonů se pro nlýzu připrví rozpuštěním 100 l kplného vzorku v destilovné vodě doplněním po rysku v odměrné bňce o objemu 10 ml. Vzhledem k tomu, že výsledný obsh jednotlivých komplexonů ve vzorku se uvádí v hmotnostních procentech, je třeb pipetovný vzorek zvážit n nlytických vhách. 3.3. PRÁCE S PŘÍSTROJEM Obrázek 1 Schém uspořádání izotchoforézy 1: rezervoár koncového elektrolytu; : dávkovcí kohout; 3: seprční 1 3 kpilár; 4: bezkontktní vodivostní detektor; 5: nádobk vedoucího elektrolytu; 6: membrán; 7: blok pro plnění systému vedoucím elektrolytem; 8: plnicí ventil. 4 5 6 7 8 3.3.1. PŘÍPRAVA PŘÍSTROJE Izotchoforetický nlyzátor se spustí hlvním vypínčem umístěným n zdní strně přístroje. Před plikcí prcovních elektrolytů je třeb nejprve všechny části přístroje promýt destilovnou vodou, to následujícím způsobem. Zásobník vedoucího elektrolytu se několikrát promyje destilovnou vodou, která se z něj odsává stříkčkou s nszenou hdičkou. Je třeb vše důkldně odsát i z prostoru před membránou. Kpilár se propláchne stříkčkou s destilovnou vodou, která se optrně plikuje přes plnící ventil. Ventil se povoluje pomlu z stálého tlku stříkčky, dokud není pozorován průtok kpliny v odpdní hdičce. Dávkovcí kohout při tom musí být v poloze 1 (viz Obrázek 3) musí v něm být stříkčk s destilovnou vodou. Tlk vyvíjený n stříkčku musí být přiměřený, jink by mohlo dojít k protržení membrány nebo k poškození kpiláry. Nkonec se destilovnou vodou promyje i zásobník s koncovým elektrolytem tk, že se obsh zásobníku vypouští přes dávkovcí ventil, který se otočí do polohy (viz Obrázek 3
3). Je vhodné před tímto krokem ndávkovt destilovnou vodu i místo vzorku odstrní se tím bublink, která by jink bránil odtoku kpliny ze zásobníku. Nebude-li kplin sm odtékt, uzvře se zásobník krytem kplin se vytlčí vzduchem pomocí stříkčky. Po provedení výše popsných úkonů je možné nplnit zásobníky příslušnými elektrolyty zároveň nplnit kpiláru vedoucím elektrolytem stejným způsobem jko při promývání. Před smotným nplněním zásobníků je vhodné propláchnout je mlým množstvím elektrolytu. 3.3.. NASTAVENÍ SOFTWARE Obrázek Nstvení prmetrů seprce v progrmu ITP PRO 3 Prmetry nlýzy se nství v progrmu ITP PRO 3 příkzem Method (viz Obrázek ). Polrit se nství n nionty, zvolí se spodní kolon, nejvyšší npěťový limit 15000 V elektrický proud 100 A. Mximální dob nlýzy se volí dle potřeby, obvykle 0 minut. Pro nlýzu je vždy zpnut vodivostní detektor. Stiskem tlčítk STOP lze nlýzu po průchodu vzorku detektorem ručně ukončit. 3.3.3. SPUŠTĚNÍ ANAÝZY Před první nlýzou se kpilár nplní vedoucím elektrolytem, dávkovcí kohout je v poloze 1 zároveň je v něm umístěn stříkčk se vzorkem. Při uzvírání plnícího ventilu musí být soustvně vyvíjen tlk n stříkčku, to ž do chvíle, kdy je ventil úplně uzvřen. Při tom je třeb pozorovt, zd se u něj nevytvořily bublinky vzduchu, které by rušily nlýzu. Tento postup se dále provádí vždy po skončení seprce nebo před zčátkem nové nlýzy, pokud došlo k vyjmutí stříkčky se vzorkem. 4
1 3 Obrázek 3 Polohy dávkovcího kohoutu Pro nlýzu se ze stříkčky ndávkuje mlé množství vzorku (si 100 l), přitom je kohout v poloze 1. Po ndávkování přebytečný objem vzorku odteče do odpdní hdičky kohout se otočí do polohy, ve které se ponechá jen několik málo sekund ze zásobníku odteče trochu koncového elektrolytu. Pk se kohout přepne do polohy 3 tím je vše připrveno pro seprci. Anlýz se spustí tlčítkem REC v progrmu ITP PRO 3, který je přepnut v módu run, kde jsou již zdány prmetry pro nlýzu (viz 3.3..). Pokud po spuštění nlýzy kolísá npětí, prvděpodobně se v kpiláře vyskytuje bublink vzduchu, v tom přípdě je třeb proces zstvit celý postup znovu opkovt. 3.3.4. UKONČENÍ PRÁCE Po skončení práce s přístrojem je třeb všechny části promýt destilovnou vodou, stejně jko n zčátku (viz 3.3.1.). Všechny zásobníky, kpilár dávkovcí blok se po promytí nplní destilovnou vodou stříkčky se ponechjí připevněné. Po ukončení řídícího softwre je možné vypnout přístroj. 3.4. ANAÝZA KOMPEONŮ 3.4.1. KVAITATIVNÍ ANAÝZA Chrkteristickým údjem pro kždou látku v dném elektrolytovém systému je reltivní výšk vlny (RSH, viz Rovnice 1). Porovnáním RSH zóny vzorku RSH zóny stndrdní látky lze jednoduše identifikovt neznámou látku. V prxi je všk vhodnější, zejmén pokud izotchoforegrm obshuje více zón s blízkými hodnotmi RSH, přidt přiměřené množství stndrdní látky přímo k smotnému vzorku. Konkrétní látk se pk zcel jsně přiřdí té zóně, jejíž délk se prodloužil. h h Rovnice 1 RSH = [ ] h h RSH... reltivní výšk vlny nlytu [ ] T h... výšk vlny nlytu [V] h... výšk vlny vedoucího elektrolytu [V] h T... výšk vlny koncového elektrolytu [V] 5
3.4.. KVANTITATIVNÍ ANAÝZA Anlýz průmyslových vzorků komplexonů se provede po identifikci jednotlivých zón metodou přídvku stndrdu. Postup pro příprvu roztoku pro nlýzu je následující. Do plstové vilky se pipetuje 100 l zásobního roztoku vzorku (viz 3..) roztok se doplní n objem 1000 l přidáním 900 l destilovné vody. Přídvky stndrdních látek se volí podle očekávné koncentrce nlytu vždy podle prvidel metody přídvku stndrdu. Při jedné nlýze lze pro urychlení práce přidávt i více stndrdních látek. Při příprvě roztoků s přídvkem stndrdu se postupuje tk, že se pipetuje 100 l zásobního roztoku vzorku, x l zásobního roztoku stndrdní látky (resp. látek) (900 x) l destilovné vody. 4. VYHODNOCENÍ VÝSEDKŮ 4.1. VYHODNOCENÍ ANAÝZY METODOU PŘÍPRAVKU STANDARDU Při nlýze reálných vzorků je vhodnější metodou pro kvntittivní nlýzu metod přídvku stndrdu. Princip této metody je stejný jko u metody klibrční křivky, ovšem v tomto přípdě se přidávjí známé koncentrce stndrdních látek přímo k nlyzovnému vzorku. Tím se předejde možnému rozdílnému chování stndrdního roztoku roztoku vzorku, které může být způsobeno npř. vlivem mtrice vzorku či odlišnou hodnotou ph. Anlýz vzorku metodou přídvku stndrdu se provádí vždy v několik bodech, vhodně zvolených vzhledem k předpokládné koncentrci nlytu ve vzorku. Vyhodnocení se provádí v progrmu MS Excel z nměřených hodnot se pomocí funkce linregrese vypočtou prmetry regresní rovnice b. Neznámá koncentrce nlytu odpovídá průsečíku regresní přímky s osou x, resp. jeho bsolutní hodnotě. Mtemticky lze tuto výslednou hodnotu vypočítt dle Rovnice. b b Rovnice x = c = [ mmol l ] c... koncentrce nlytu [mmol l -1 ]... směrnice přímky [s l mmol -1 ] b... souřdnice y průsečíku přímky s osou y [s] Reálný vzorek je pro nlýzu vždy zředěn redestilovnou vodou. Po stnovení látkové koncentrce nlytu ve zředěném roztoku metodou přídvku stndrdu se vypočte procentuální obsh nlytu ve vzorku dle Rovnice 3. 6
c V M % 100 m Rovnice 3 w = [%] w %... procentuální obsh nlytu ve vzorku [%] c... koncentrce nlytu ve zředěném roztoku [mol l -1 ] V... celkový objem zředěného roztoku [l] M... molární hmotnost nlytu [g mol -1 ] m... nvážk vzorku [g] 4.1.1. VÝPOČET NEJISTOT OSAHU ANAYTŮ VE VZORKU Metod pro výpočet nejistoty měření existuje několik. V přípdě vyhodnocení metody klibrční křivky, resp. metody přídvku stndrdu, se vychází ze stndrdních chyb regresních prmetrů b, které jsou vypočteny funkcí linregrese v progrmu MS Excel. Celková nejistot výsledku při stnovení koncentrce nlytu ve vzorku metodou přídvku stndrdu je dán součtem jednotlivých příspěvků nejistot dle Rovnice 4. Tyto příspěvky jsou tvořeny stndrdní chybou dné konstnty příslušného citlivostního koeficientu, který se vypočítá pomocí prciálních derivcí Rovnice (viz Rovnice 5 Rovnice 6). c c Rovnice 4 u( c) = s + s [ mmol l ] b b u (c)... nejistot koncentrce nlytu [mmol l -1 ] s... stndrdní chyb koeficientu [s l mmol -1 ] s b... stndrdní chyb koeficientu b [s]... citlivost n koeficient [mmol s -1 l - ] c... citlivost n koeficient b [mmol s -1 l -1 ] c b c b Rovnice 5 = [ mmol s l ] c... citlivost n koeficient [mmol s -1 l - ]... směrnice přímky [s l mmol -1 ] b... souřdnice y průsečíku přímky s osou y [s] 7
c 1 Rovnice 6 = [ mmol s l ] c b b... citlivost n koeficient b [mmol s -1 l -1 ]... směrnice přímky [s l mmol -1 ] Při výpočtu nejistoty procentuálního obshu nlytu ve vzorku je uvžován pouze příspěvek měřené koncentrce, neboť příspěvky vážení měření objemu jsou v tomto přípdě znedbtelné. Nejistot výsledku je rovn součinu nejistoty koncentrce nlytu ve zředěném roztoku příslušného citlivostního koeficientu (viz Rovnice 8) dle Rovnice 7. w % c % Rovnice 7 u ( w ) = u( c) [%] u ( w ) %... nejistot procentuálního obshu nlytu ve vzorku [%] u (c)... nejistot koncentrce nlytu ve zředěném roztoku [mmol l -1 ] w %... citlivost n koncentrci nlytu ve zředěném roztoku [% l mol -1 ] c w% V M Rovnice 8 = 100 [ l mol ] c m w %... citlivost n koncentrci nlytu ve zředěném roztoku [% l mol -1 ] c V... celkový objem zředěného roztoku [l] M... molární hmotnost nlytu [g mol -1 ] m... nvážk vzorku [g] Kromě bsolutních nejistot lze tké prezentovt nejistoty reltivní, které možná lépe vypovídjí o přesnosti stnovení. Reltivní nejistot látkové koncentrce nlytu ve zředěném roztoku vzorku se udává v procentech vypočítá se dle Rovnice 9. Vzhledem k tomu, že v tomto přípdě vychází výpočet nejistoty procentuálního obshu nlytu ve vzorku pouze z příspěvku látkové koncentrce, jsou reltivní nejistoty těchto dvou veličin totožné (viz Rovnice 10). u( c) = c Rovnice 9 ( c) 100 [%] u R u R (c)... reltivní nejistot koncentrce nlytu ve zředěném roztoku [%] u (c)... nejistot koncentrce nlytu ve zředěném roztoku [mmol l -1 ] c... koncentrce nlytu ve zředěném roztoku [mol l -1 ] 8
Rovnice 10 u ( w% ) u ( c) [%] R = R u R ( w% )... reltivní nejistot procentuálního obshu nlytu ve vzorku [%] u R (c)... reltivní nejistot koncentrce nlytu ve zředěném roztoku [%] Vypočtená nejistot (viz Rovnice 7) odpovídá intervlu, ve kterém se s si 67 % prvděpodobností nchází správná hodnot. Pro zhrnutí celého intervlu, který odpovídá skutečnosti s prvděpodobností 95 %, se nejistot násobí koeficientem k, jehož hodnot je v tomto přípdě (pro 99,7 % prvděpodobnost pltí k=3). Získá se tzv. rozšířená nejistot, která se prezentuje spolu s vypočtenou hodnotou bez níž je výsledek neúplný. Rovnice 11 U ( c) = k u( c) [ mmol l ] U (c)... rozšířená nejistot koncentrce nlytu ve zředěném roztoku [mmol l -1 ] u (c)... nejistot koncentrce nlytu ve zředěném roztoku [mmol l -1 ] k... koeficient rozšíření [ ] 4.. VÝPOČET EFEKTIVNÍ POHYIVOSTI ANAYTŮ Výpočet efektivní pohyblivosti pomocí izotchoforézy vychází z porovnání výšky zóny nlytu výšek zón stndrdních látek, jejichž pohyblivost je tbelován. Pro dosžení správného výsledku jsou nezbytné dvě stndrdní látky (viz Obrázek 4), pohyblivost se vypočítá dle Rovnice 1. Z jednu ze stndrdních látek je možné povžovt vedoucí elektrolyt, potom lze tuto rovnici uprvit do tvru Rovnice 13. SIGNÁ TERMINATING A h h EADING h A ASE INE ČAS Obrázek 4 Výpočet efektivní pohyblivosti porovnáním výšek zón nlytu stndrdů 9
ěžnější prmetr chrkterizující výšku zóny nlytu je reltivní výšk zóny RSH, kterou nvíc softwre vypočítá utomticky pro kždou zónu není třeb její hodnotu ručně odečítt z izotchoforegrmu. Výpočet efektivní pohyblivosti lze doszením z Rovnice 1 do Rovnice 13 uprvit do tvru Rovnice 14. Rovnice 1 ( h h ) ( h h ) 9 [ 10 m V ] h ha = A s A A 1 1 1 1 h 9 Rovnice 13 = + [ 10 V s m ] h 1 1 1 1 RSH 9 Rovnice 14 = + [ 10 V s m ] RSH... efektivní pohyblivost [10-9 m V -1 s -1 ] h... výšk zóny [V] RSH... reltivní výšk zóny [ ] A,... první druhá stndrdní látk s tbelovnou pohyblivostí... vedoucí elektrolyt... stnovovný nlyt Uvedeným způsobem se v této úloze stnoví pohyblivosti NTA, EDTA IDA z dných podmínek. Jko stndrdní látky, jejichž pohyblivosti jsou tbelovány, lze zvolit vedoucí chloridové ionty hydroxycetátový nion (viz Tbulk ). Tbulk Hodnoty pk chloridových hydroxycetátových niontů [10-9 m V -1 s -1 ] pk Cl - 79,1 - HOCH COO - 4,4 3,886 Kyselin chlorovodíková je silná kyselin při ph vedoucího elektrolytu je tedy plně disociovná. To ovšem nepltí u hydroxyoctové kyseliny, neboť při dné hodnotě ph jsou v roztoku zstoupeny obě její cidobzické formy. Její efektivní pohyblivost z podmínek použitého systému se vypočítá dle Rovnice 15. 1 9 Rovnice 15 = [ 10 m V s ] ph 1+ 10 pk ph A ph... efektivní pohyblivost iontu při dné hodnotě ph [10-9 m V -1 s -1 ]... tbelovná bsolutní pohyblivost iontu [10-9 m V -1 s -1 ] pk... disociční konstnt hydroxyoctové kyseliny 10
ph... hodnot ph zóny hydroxyoctové kyseliny Výpočet efektivních pohyblivostí jednotlivých nlytů se provede dle Rovnice 14 ze všech hodnot RSH nměřených při nlýzách. Jko výsledek se uvede průměr vypočtených hodnot jeho nejistot se stnoví ze směrodtné odchylky výběru souboru vypočtených efektivních pohyblivostí, uvede se též rozšířená nejistot pro k=. 5. PROTOKO Stndrdní údje (jméno, dtum...), úvod Stručný postup, v přípdě odchylky od návodu uvést důvod Nměřená kvlittivní kvntittivní dt přehledně zprcovná v tbulkách Výsledky vypočtené dle uvedeného postupu vč. grfů, přehledně prezentovné Diskuze jednotlivých částí úlohy včetně výsledků, závěr 6. DOPORUČENÁ ITERATURA 1. Kvsničk, F.: CITP v nlýze potrvin, dostupné n http://www.vscht.cz/ktk/www_34/lb/cze/cze_itp.pdf. řezin, J.: Elektromigrční techniky v nlýze cheltujících činidel, Diplomová práce, Msrykov univerzit, rno 010 11