. 0. 05 Petr Kozlík Katedra analytcké cheme e-mal: kozlk@natur.cun.cz htt://web.natur.cun.cz/~kozlk/ Vysokoúčnná kaalnová chromatografe Dstrbuční konstanta HPLC je založena na searac analytů na základě jejch dstrbuce mez staconární a moblní fáz. Během searace dochází k mnoha tyům nterakcí. Ulatňují se nterakce analytů s moblní fází, nterakce moblní fáze se staconární fází a sorce analytů na staconární fáz. Dstrbuční konstanta K D je oměr rovnovážné koncentrace analytu ve staconární fáz a moblní fáz As KD Am As je rovnovážná koncentrace analytu ve staconární fáz Am je rovnovážná koncentrace analytu v moblní fáz 4 Vysokoúčnná kaalnová chromatografe / Úvod do HPLC, její význam a využtí. JC 5.0. / Základní chromatografcké charakterstky. Teore chromatografckého atra. PK.0. 3/ Instrumentace v LC. Detektory v LC. PK 9.0. 4/ Searační systémy: Chromatografe s normálním a obráceným fázem. ZB 6.0. 5/ Searační systémy: Iontově výměnná chromatografe. Afntní chromatografe. Gelová chromatografe. Chrální searace ZB.. 6/ Praxe v LC. Vývoj kaalnové chromatografcké metody. PK 9.. 7/ Valdace chromatografcké metody. Problémy a jejch řešení v LC. PK. 6.. 8/ Kvaltatvní analýza v HPLC. Zůsoby kvaltatvní analýzy, PDA, S, N, dentfkace z retenčních dat. JC 3.. 9/ Využtí HPLC ro různé tyy analytů, alkace ve farmaceutcké analýze, analýze otravn a žvotního rostředí. JC 30.. 0/ Trendy a novnky v HPLC. Vícedmenzonální searační systémy. naturzace, mkrofludní systémy. Využtí očítačových rogramů ro otmalzace searačních systémů. JC 7.. / Exkurze do Qunta Analytca. ZB (termín bude uřesněn). ředtermín: 4..? t t, ', V V V, ', etenční charakterstky etenční čas t je doba, která ulyne od nástřku vzorku do dosažení maxma eluční křvky rtvý čas t je retenční čas analytu, který není v koloně zadržován. edukovaný retenční čas t je čas, který stráví analyt ve staconární fáz. etenční objem V je objem moblní fáze, který musí rojít kolonou, aby se říslušný analyt dostal od očatku ke konc searační kolony. rtvý objem V je objem moblní fáze, který musí rojít kolonou, aby se nezadržovaný analyt dostal od očátku ke konc kolony. t, 5 Sylabus řednášky: etenční charakterstky Základní chromatografcké charakterstky: dstrbuční konstanta retenční čas retenční objem růtok moblní fáze kaactní faktor searační faktor rozlšení symetre íku Teore chromatografckého atra: účnnost searačního rocesu Van Deemterova rovnce ovlvnění rozlšení 3 Lneární rychlost moblní fáze u [cm/mn] L u Objemová růtoková rychlost moblní fáze F m [ml/mn] Kaactní faktor Searační faktor - selektvta k t Fm V t t, ns k K * D, I nm k K k K Vs Vm D, D, 6
. 0. 05 ozlšení íků etenční charakterstky ( t, t,), *( wb, wb,) t, t, Teore chromatografckého atra Počet teoretckých ater N t, t, 6* 5.545* wb Výškový ekvvalent teoretckého atra L H N Tycký očet teoretckých ater za otmálních searačních odmínek w 0.5 Dva íky jsou rozděleny na základní ln, okud >.5 7 0 Faktor asymetre íku Symetre íku Talng faktor íku Van Deemterova teore H H Hm H Hm vířvá (turbulentní) dfúze v moblní fáz molekulární (axální) dfúze v moblní fáz odor rot řevodu hmoty v moblní fáz a staconární fáz Nesymetrcké ( frontng nebo talng ) íkí mohou zůsobt neřesnou kvantfkac zhoršení rozlšení zakrytí mnortních íků nererodukovatelnost retenčních časů Snažíme se o co možná nejsymetrčtější íky! 8 Teore chromatografckého atra Účnnost chromatografckého rocesu nám říká, jak hodně (málo) je zóna eluující látky rozšřována ř růchodu HPLC systémem a kolonou. H vířvá (turbulentní) dfúze v moblní fáz Díky nehomogentě staconární fáze roudí moblní fáze různým kanálky staconární fáze a tím urazí různou dráhu (analyty se roto navzájem oožďují nebo ředbíhají) Gaussova křvka tr střední hodnota δ směrodatná odchylka H * * d A geometrcký faktor velkost částc Jak mnmalzovat vířvou dfuz: oužívat dobře nalněné kolony oužívat malé částce oužívat kolony s malou dstrbucí velkost částc 9
. 0. 05 molekulární (axální) dfúze v moblní fáz mokolonové řísěvky k rozšřování zón olekuly analytu dfundují z místa s vyšší koncentrací do místa s nžší koncentrací. Jak mnmalzovat vířvou dfuz: * * D u m dfúzní koefcent B u lneární rychlost moblní fáze korekční faktor charakterzující tvar kanálků v náln kolony oužívat vyšší růtoky moblní fáze oužívat krátké sojovací kaláry s vhodným vntřním růměrem zavsí na objemu a geometr detekční cely celkem kolona njektor soje detektor sojovací kaláry mají být co nejkratší s malým vntřním růměrem objem vzorku má být co nejmenší Přísěvek molekulární dfúze v LC je ř běžných růtocích moblní fáze zanedbatelný 3 6 Hm odor rot řevodu hmoty v moblní fáz a staconární fáz růměr částc nálně kolony * d * d H * u C * u Dm D ntračástcový dfúzní koefcent dfúzní koefcent analytu v moblní fáz koefcent závslý na dstrbuc velkost částc a dstrbuc órů Jak mnmalzovat odor rot řevodu hmoty: oužívat nžší růtoky moblní fáze oužívat menší rozměry částc oužívat vyšší telotu na koloně 4 7 Van Deemterova rovnce H (µm) mnmální H lneární růtoková rychlost (cm) otmální růtoková rychlost 5 8 3
. 0. 05 ( t, t,), *( wb, wb,), Skutečná rovnce rozlšení N k * * 4 k, N k * * 4 k účnnost selektvta retence knetcký asekt termodynamcký asekt kaactní asekt rozlšení je římo úměrné druhé odmocnně z očtu teoretckých ater kolony rozlšení je římo úměrné selektvtě a blíží se k nule okud se selektvta blíží k jedné rozlšení je římo úměrné retenc a blíží se k nule okud se retence blíží k nule 9, N k * * 4 k, N k * * 4 k Faktory ovlvňující účnnost růtok moblní fáze délka kolony velkost částc největší efekt změny k ro k < ro k > 0 nemá smysl dále zvyšovat k 0 3, N k * * 4 k selektvta je nejúčnější nástroj jak ovlvnt rozlšení, N k * * 4 k Parametr Použtí organcká složka moblní fáze H moblní fáze síla moblní fáze + adtva moblní fáze staconární fáze změna organcké složky (acetontrl X metanol X tetrahydrofuran) změna stuně onzace analytů (změna hydrofobcty) změna oměru organcké a vodné složky moblní fáze největší vlv na selektvtu telota nejmenší vlv na selektvtu, často oužíván v chrálních searacích 4 4
. 0. 05 V růběhu gradentové eluce dochází ke změně složení moblní fáze. Příklad celkové doby gradentu na selektvty některých íku ke,3* b g strmost gradentu mrtvý čas kolony t S bg * eluční síla organckého modfkátoru 0 tg změna složení moblní fáze během gradentu doba trvání gradentu Píková kaacta tg P n * wb n 5 8 gradentový růběh je charakterzován gradentovým křvkam Použté zdroje a zároveň dooručená lteratura onografe: Snyder. L., Krkland J. J.: Practcal HPLC method develoment Snyder. L., Krkland J. J.: Introducton to modern chromatograhy Nováková L., Douša.: oderní HPLC searace v teor a rax (rvní a druhý díl) Snyder. L., Dolan J. W.: Hgh erformance gradent eluton eyer V..: Practcal hgh erformance lqud chromatograhy Dong. W.: odern HPLC for ractcng scentsts Kromdas S.: ore ractcal roblem solvng n HPLC Internetové zdroje: www.hst.cz www.waters.com www.chromacademy.com www.hlc.cz htt://web.natur.cun.cz/~coufal/ www.shmadzu.com 6 Časosy: Journal of Chromatograhy A, B Journal of Searaton Scence Analytcal Chemstry Chromatograha Journal of Lqud Chromatograhy LCGC 9 íky 8 a 9 jsou velm šroké a eluují ve vysokých retenčních časech vyřešen roblém s íky 8 a 9. Došlo ke zhoršení rozlšení íku a, které koeluují Problémy sokratcké eluce řeší gradentová eluce, kdy všechny íky jsou rozděleny na základní ln s krátkou dobou celkové analýzy 7 5