Lidské papilomaviry a jejich laboratorní detekce

Transkript

1 RNDr. David Konvalinka 1, Mgr. Irena Urbanovská 1, Mgr. Radek Mìch 1, Mgr. Jarmila Šimová 1, RNDr. Magdalena Uvírová, Ph.D. 1, MUDr. Nina Dvoøáèková 1,3, doc. MUDr. Jana Dvoøáèková, Ph.D. 2,3 1 CGB laboratoø a.s., Ostrava 2 Ústav patologie, akultní nemocnice Ostrava 3 Lékaøská fakulta, Ostravská univerzita, Ostrava Lidské papilomaviry a jejich laboratorní detekce Lidské papilomaviry (human papillomaviruses, HPV) patøí do evoluènì staré a rozsáhlé skupiny papilomavirù (PV) z èeledi Papillomaviridae. Jejich adaptace na pøežívání v lidském organismu je dokonalá, jsou víceménì schopny dlouhodobì a možná i celoživotnì pøežívat v hostitelském organismu a efektivnì se replikovat vìtšinou bez ohrožení existence hostitele. Ale není tomu tak vždy. Úvod a klasifikace Kvalifikované odhady hovoøí o tom, že existuje více než 400 typù PV infikujících nejen èlovìka, ale i jiné savce. Nicménì jejich výskyt byl potvrzen také u ptákù a plazù, novì dokonce i u ryb (1), což nám umožòuje spekulovat o ještì starším pùvodu PV, než se dosud pøedpokládalo. Dále se ukazuje, že PV se vyvíjely spolu se svými hostiteli, nemìnily hostitelské druhy a udržely si základní organizaci genomu v témìø nezmìnìné podobì po více než 100 milionù let. Na základì fylogenetických výzkumù se ukazuje, že typy HPV16 a HPV18 pravdìpodobnì pocházejí z Afriky, odkud se rozšíøily spolu s expanzí lidské populace do celého svìta. V roce 2004 publikoval tým prof. Haralda zur Hausen studii popisující zhruba 100 typù HPV (2). Avšak o deset let pozdìji (ke konci roku 2014) identifikuje práce Bzhalava et al. již 202 HPV typù, zatøídìných ve 49 druzích celkem pìti rodù (α, ß, γ, µ, ν). Ale ve svých odhadech zmiòuje možnou existenci nejménì 400 typù HPV (3). Struktura virionù a organizace genomu HPV jsou malé (55 nm) neobalené viry s dvouvláknovou DNA, tvoøené kubickými viriony. Virová kapsida je sestavena z pentamerických kapsomer, které jsou tvoøeny proteiny L1 a L2, kódovanými virovými geny. Jejich genom je jednoduchý, s velikostí párù bází. Porovnání mnoha genomù lidských a zvíøecích papilomavirù ukazuje na zakonzervovanou základní organizaci virového genomu. Je totiž kódo- ván (v drtivé vìtšinì pøípadù) 8 geny: 6 z nich slouží jako geny èasné fáze (early, E) a 2 se úèastní pozdní fáze infekce (late, L). Geny E1, E2, E4 E7 kódují jaderné funkce viru, a to vèetnì E6 a E7 genù, které jsou zodpovìdné za bunìènou transformaci a lze je klasifikovat jako virové onkogeny. Geny L1 a L2 kódují proteiny virové kapsidy a øídí tak skládání virionu a jeho uvolnìní z hostitelské buòky (4). Genom dále obsahuje regulaèní elementy, jako jsou promotory exprese èasných i pozdních genù, a taktéž nekódující oblast. Patogeneze Papilomaviry jsou druhovì specifické, což znamená, že napadají pouze živoèišné druhy, se kterými se vyvíjely spoleènì v prùbìhu evoluce. Dále lze konstatovat, že jsou striktnì epiteliotropní (napadají pouze epitely) a tkáòovì specifické na základì tohoto tvrzení je lze rozdìlit na druhy kožní a sliznièní. Dalším možným rozdìlením je èlenìní na typy s nízkým onkogenním potenciálem (low-risk HPV, LR HPV) a typy s vysokým onkogenním potenciálem (high-risk HPV, HR HPV). 26 Labor Aktuell 01/18

2 Drobnými poranìními v epitelu dochází k proniknutí virù až na úroveò bazální membrány a následnì ke vstupu do hostitelských bunìk. Pøi infekci kožního epitelu nastává diferenciace napadených bunìk na keratinocyty, nicménì genom viru zùstává v buòce v epizomální formì. U infekcí sliznièního epitelu dochází v místì infekce k vývoji lézí. V tomto pøípadì mùže dojít k integraci virového genomu do genomu hostitelské buòky a tím k aktivaci exprese virových onkogenù E6 a E7, což mùže vést ve svém koneèném dùsledku k maligní transformaci buòky. V závislosti na typu HPV mùže dojít k vývoji dysplazií èi benigních genitálních bradavic. Díky aktivní imunitní odpovìdi dojde u zhruba 70 % žen s incidentní HPV infekcí k potlaèení infekce a spontánnímu vyléèení bìhem jednoho roku. Infekce HR HPV mohou naopak bìhem nìkolika mìsícù vést k rozvoji závažné dysplazie, nicménì progrese k prekancerózním lézím se objevuje pouze u pøípadù s dlouho pøetrvávající infekcí. Invazivnì rostoucí nádory vìtšinou nastupují po dlouhé prekancerózní fázi. Epidemiologie HPV HPV jsou považovány za pùvodce nìkterých nádorù, a to jak benigních, tak i maligních. Zároveò jsou pokládány za nejèastìjší virovou sexuálnì pøenosnou infekci (STI). S tím souvisí skuteènost, že celoživotní riziko infekce HPV se pohybuje okolo 80 %. Celkové odhady hovoøí kupøíkladu o 300 milionech žen, které jsou roènì infikovány HPV. V ìtšina tìchto genitálních infekcí je tranzientní, zùstává bez pøíznakù, a tudíž neodhalena. Je to nejpravdìpodobnìji zpùsobeno aktivací bunìèné imunitní odpovìdi v postižené tkáni. Pouze u 10 % infikovaných žen se vyvine chronická, perzistující infekce cervixu, což je hlavní podmínka pro možný vznik high-grade dysplastických zmìn a karcinomu. Aèkoli je vìtšina HPV infekcí benigních, odhaduje se, že infekce urèitými typy HPV jsou roènì celosvìtovì zodpovìdné za zhruba nádorových onemocnìní. Nejvìtší podíl na tomto poètu má cervikální karcinom, jímž dle odhadù onemocní každoroènì žen a jich zemøe (5). V zemích Evropské unie pak pøedstavuje cervikální karcinom pøípadù roènì a úmrtí na tuto diagnózu. Infekce LR HPV Skupina LR HPV je odpovìdná za vznik øady onemocnìní pokožky, jednak ve formì klasických bradavic rukou a nohou, jednak tzv. genitálních bradavic, ale vzácnì i orálních a laryngeálních papilomatóz, vèetnì rekurentní respiraèní papilomatózy a velmi vzácné fokální epiteliální hyperplazie. Genitální bradavice, tzv. condylomata acuminata, jsou nejèastìji se vyskytujícím následkem infekce (LR) HPV. Jsou lokalizovány v dolním genitálním traktu, perianální oblasti a análním kanálu. Toto onemocnìní je zpùsobeno ve více než 90 % pøípadù LR typy HPV6 a HPV11. Jsou vysoce infekèními nezhoubnými nádory s výskytem u obou pohlaví. Léèba je obtížná, založená na odstranìní všech viditelných lézí pomocí rùzných metod, pøípadnì kombinovaná s aplikací specifických léèiv. Nejspolehlivìjší prevencí je profylaktická vakcinace proti výše uvedeným LR HPV typùm. Rekurentní respiraèní papilomatóza (RRP) je nejèastìjší benigní, èasto multifokální neoplazie hrtanu a prùdušnice. Navzdory zaøazení mezi benigní tumory je RRP sice relativnì vzácným, ale nicménì život ohrožujícím onemocnìním, zpùsobeným infekcí LR HPV6 a HPV11. Je charakterizováno rùstem obvykle kvìtákovitì utváøených lézí v dýchacím traktu, což mùže vést až k obstrukci dýchacích cest. Léèba je založena na chirurgickém odstranìní lézí. Nìkteøí pacienti z dùvodu agresivní RRP musí bìhem života podstoupit více než 40 operací. Existuje sice nìkolik preparátù, které jsou podávány v rámci adjuvantní terapie, nicménì ani jeden z nich nevede k úplné eradikaci HPV infekce. Infekce HR HPV Naopak skupina HR HPV je v souèasnosti prokázaným pùvodcem cervikálního karci- Labor Aktuell 01/18 27

3 nomu a dále nádorù vaginálních, vulvárních, penilních, análních a v neposlední øadì nádorù orofaryngeálních. Podrobnìji je dále v textu popsán cervikální a orofaryngeální karcinom. Cervikální karcinom ko rozvoje HPV infekce smìrem k cervikálnímu karcinomu. Léèba tohoto závažného onemocnìní závisí na stadiu nemoci, jejím rozsahu a postižení pøilehlých uzlin a orgánù. Zahrnuje chirurgické zákroky, radio- èi chemoterapii a další léèebné postupy. Základním problémem tohoto onemocnìní je skuteènost, že raná stadia cervikálního karcinomu jsou bezpøíznaková. Pøitom v pøípadì èasného záchytu cervikálního karcinomu je hodnota 5letého pøežívání mezi % u stadia I, zatímco s rostoucím stadiem onemocnìní se doba 5letého pøežívání významnì snižuje (7). Z tohoto dùvodu se výraznì zvyšuje význam profylaktické vakcinace. Orofaryngeální karcinom V zemích rozvinuté èásti svìta tvoøí nádory hlavy a krku (HNSCC) okolo 5 % všech nádorù. Aèkoli incidence výše uvedených nádorù, asociovaných s konzumací Nejvìtší podíl na celkovém poètu nádorových onemocnìní zpùsobených HPV infekcemi má cervikální karcinom, jímž dle odhadù onemocní každoroènì žen a jich zemøe (5). V zemích Evropské unie pak pøedstavuje cervikální karcinom pøípadù roènì a úmrtí na tuto diagnózu. Cervikální karcinom (CxCa) je druhým nejèastìjším nádorem u žen ve vìkové skupinì let. V celkové populaci žen se øadí na ètvrté místo (5). Co se týèe jeho výskytu v ÈR, situace je dlouhodobì nepøíznivá témìø 900 pøípadù výskytu a okolo 400 úmrtí roènì nás øadí (po pøepoètu na poèet obyvatel) v rámci evropských zemí zhruba do druhé tøetiny, a to mezi Rusko a Bosnu a Hercegovinu. Ve srovnání s vyspìlými zemìmi západního svìta je tak u nás incidence a mortalita tohoto onemocnìní stále velmi vysoká. Témìø u 100 % CxCa byla prokázána pøítomnost HR HPV typù, které jsou dle Mezinárodní agentury pro výzkum rakoviny (IARC) prokázaným pùvodcem tìchto nádorù (6). Vždy jen typy HR HPV16 a HPV18 jsou zodpovìdné za více než 70 % pøípadù CxCa. Perzistující infekce tìmito HR HPV typy mùže vést k integraci virových onkogenù E6 a E7 do hostitelského genomu a tím k aktivaci kontinuální exprese virových onkoproteinù E6 a E7, které inaktivují tumorsupresorové proteiny p53 a prb. Tyto zmìny jsou spolu se somatickými mutacemi, které umožòují nekontrolovatelný rùst, invazi, angiogenezi a další procesy, podstatou a základními podmínkami pro vývoj zhoubného nádoru, jímž cervikální karcinom bezesporu je. Nejèastìjším zpùsobem pøenosu genitální HPV infekce je pohlavní styk. Byly popsány i jiné zpùsoby pøenosu, jako je perinatální, orální èi pomocí prstù a hygienických potøeb. Mezi rizikové faktory dále patøí èasný vstup do sexuálního života a vyšší poèet sexuálních partnerù. aktory jako imunosuprese, HIV infekce, kouøení, sexuální promiskuita èi dlouhodobé užívání orálních kontraceptiv zvyšují rizialkoholu a tabáku, v rozvinutých zemích dosti významnì poklesla, incidence orofaryngeálního karcinomu (OPC) roste. V nìkterých zemích je nárùst incidence za posledních 30 let i šestinásobný. V roce 2008 byl výskyt nádorù ústní dutiny a OPC odhadován celosvìtovì na pøípadù a úmrtí (8). V Èeské republice bylo v roce 2015 zaznamenáno 94 pøípadù výskytu OPC a 61 úmrtí na tuto diagnózu (9). HPV infekce se podílí na OPC zhruba 20 %. Dalšími etiologickými faktory jsou užívání alkoholu a tabáku, kouøení marihuany a další virové infekce, jako je infekce herpes simplex virem (HSV) èi virem Epstein-Barrové (EBV). 90 % tìchto nádorù pøedstavují spinocelulární karcinomy. Hlavní terapií je chirurgická léèba a radioterapie, v pozdních stadiích chemoterapie. Doba 5letého pøežívání je % u I. stadia, zatímco ve IV. stadiu mezi %. Laboratorní detekce HR HPV infekcí V souèasnosti probíhající cervikovaginální screening v ÈR využívá v první øadì gynekologické cytologie, která se vyznaèuje vysokou specificitou, ale nedosahuje požadované senzitivity. Tuto nevýhodu pøekonávají molekulárnì biologické metody detekce HR HPV, využívající napøíklad technologie pøímé hybridizace virové DNA s RNA sondou nebo metody založené na technologiích PCR v reálném èase. Metody PCR v reálném èase pøinášejí navíc i možnost genotypizace HR HPV, tudíž vypovídají nejen o tom, zda vzorek je 28 Labor Aktuell 01/18

4 nebo není pozitivní na pøítomnost HR HPV, ale zároveò umožòují urèit vybrané konkrétní typy HR HPV16 a HPV18, jejichž výskyt v premaligních lézích je spojován s nejzávažnìjší prognózou a nejvyšším rizikem maligní progrese. Tudíž detekce tìchto konkrétních typù HR HPV dává lékaøùm možnost personalizace a optimalizace léèebných postupù pøi léèbì výše uvedených nádorù a jim pøedcházejících stadií. V naší laboratoøi jsme v prùbìhu více než deseti let vyšetøování cervikovaginálních stìrù na pøítomnost HR HPV mìli možnost testovat a využívat rùzné detekèní systémy. Poèátky patøily zlatému standardu testování HR HPV systému Hybrid Capture 2 spolu s testem hc2 High-Risk HPV DNA Test spoleènosti Digene (nyní Qiagen). Jedná se o neamplifikaèní metodu (bez PCR amplifikace virové DNA) založenou na zesílení signálu pomocí pøímé hybridizace virové DNA s RNA sondou a chemiluminiscenèní detekcí. Metoda neprovádí izolaci virové DNA a detekuje 13 HR HPV typù. Za nevýhodu lze považovat absenci interní kontroly, která by umožòovala ovìøit adekvátnost odebraného vzorku, tj. dostatek bunìèného materiálu ve zpracovávaném vzorku. Kit využívá pouze sady kalibrátorù pro ovìøení správného prùbìhu zpracování série vzorkù. Taktéž základní test neumožòuje ani èásteènou genotypizaci, tj. urèení pøítomnosti konkrétního HR HPV typu, pouze uvádí pøítomnost èi nepøítomnost HR HPV. Test je schválen jako CE-IVD a také americkou DA jako US-IVD. Mezi testy, které jsme v laboratoøi vyzkoušeli a používáme je dodnes, patøí Inno-LiPA HPV Genotyping Extra II firmy Innogenetics (nyní ujirebio). Na rozdíl od pøedchozího tento kit neslouží ke screeningovým úèelùm, používá se jako diagnostický nástroj pro genotypizaci 32 LR a HR HPV typù. Principem je izolace a PCR amplifikace virové DNA s následnou reverzní hybridizací na nitrocelulózovém stripu, který nese komplementární úseky DNA ke všem testovaným HPV typùm. Test zahrnuje i interní kontrolu amplifikace a nese oznaèení CE-IVD. Další z technologií, se kterou jsme se v laboratoøi setkali, byl systém Panther firmy Gen-Probe (nyní Hologic) s testem Aptima HPV16 18/45 Genotype Assay. Test je na rozdíl od pøedchozích zamìøen na detekci virové mrna virových onkogenù E6 a E7, tudíž umožòuje stanovit jejich integraci do genomu hostitelské buòky a tím i riziko její maligní transformace. Test detekuje celkem 14 HR HPV typù vèetnì genotypizace HR HPV16 a HPV18/ /45 metodou Transcription Mediated Assay (TMA) a Hybridization Protection Assay (HPA) s využitím amplifikace mrna. Test používá interní kontrolu amplifikace a je oznaèen CE-IVD a US-IVD. Jednou z technologií, které v souèasnosti máme k dispozici, je GeneXpert firmy Cepheid s testem Xpert HPV. Test je založen na automatizované izolaci a amplifikaci DNA metodou PCR v reálném èase, provádí genotypizaci HR HPV16 a HPV18/45 a detekuje celkem 14 HR HPV typù. Systém používá interní kontrolu amplifikace. Modularita systému umožòuje zpracování malého i vìtšího poètu vzorkù v samostatných modulech. Vyšetøení jednoho vzorku tak trvá 60 minut. Nevýhodou systému je pomìrnì vysoká cena za vyšetøení jednoho vzorku. Test je schválen jako CE-IVD. Testem, který využíváme již nìkolik let a který pøedstavuje hlavní metodu pro vyšetøování vzorkù cervikálních stìrù na pøítomnost HR HPV typù, je cobas 4800 HPV Test spoleènosti Roche. Díky automatizaci s využitím systému cobas 4800 je práce s tímto testem jednoduchá, rychlá a komfortní. V jednom bìhu lze najednou analyzovat 22 vzorkù a provést 2 kontroly. Výsledek tìchto vyšetøení je možné obdržet bìhem 3,5 hodiny. Systém je založen na automatické izolaci virové DNA a pøípravì reakèní destièky v pøístroji cobas x 480 s následnou detekcí pomocí real- -time PCR v pøístroji cobas z 480. Test provádí genotypizaci HR HPV16 a HR HPV18 a detekuje celkem 14 HR HPV typù. V rámci série 22 vzorkù je zahrnuta i pozitivní a negativní kontrola. Test používá interní kontrolu pro ovìøení dostateèného množství virové DNA èi její amplifikovatelnosti a je schválen jako CE-IVD a americkou DA jako US-IVD. Navíc je cobas 4800 HPV test jako jediný diagnostický test schválen (od záøí loòského roku) DA pro HPV screening karcinomu dìložního èípku bez doprovodné cytologie. Komerèních testù a systémù používaných v rámci screeningu je celá øada, nicménì jejich správný výbìr je dùležitým krokem v procesu vyšetøování HPV infekce. Testy založené na detekci virové DNA, jako je cobas 4800 HPV Test (Roche), umožòují detekovat tuto virovou DNA v kterékoli fázi HPV infekce, a to od samotného prvotního výskytu virového agens v lidském organismu pøes období, kdy dochází k vývinu dysplastických zmìn, až po fázi rozvoje cervikálního karcinomu. Naopak systémy pracující na principu detekce mrna (napø. Aptima HPV mrna Assay, Hologic) jsou schopné zachytit pøítomnost HPV infekce teprve ve fázi, kdy se HPV inkorporuje do genomu hostitelské buòky a dochází k transkripci virových onkogenù E6/E7. Døívìjší fáze infekce jsou tímto testem nezachytitelné. Ve zkratce lze øíci, že DNA-based testy detekují HPV DNA od fáze akutní infekce pøes fázi replikace viru, inkorporace do hostitelského genomu, onkologické transformace bunìk až po fázi invazivního karcinomu, zatímco RNA-based testy dokážou detekovat mrna viru teprve od fáze zaèlenìní virové DNA do genomu hostitele. Vakcinace V neposlední øadì je nezbytné zmínit možnosti profylaktické vakcinace proti HPV infekci. Kvùli vysokému celoživotnímu riziku setkání s HPV infekcí (pøièemž se toto Labor Aktuell 01/18 29

5 riziko vzhledem k výše zmiòovaným 80 % jeví jako velice reálné) je jedinou úèinnou prevencí proti infekci lidskými papilomaviry aplikace vakcín vyvinutých na ochranu pøed infekcí vybranými typy HPV. V souèasnosti jsou na trhu komerènì dostupné tøi profylaktické vakcíny. Víceménì zároveò byly na trh uvedeny dvì profylaktické vakcíny. První z nich je bivalentní vakcína Cervarix proti HR typùm HPV16 a HPV18, zodpovìdným zhruba za 70 % všech CxCa. Druhou z vakcín je tetravalentní vakcína Silgard proti HPV16 a HPV18 a souèasnì proti LR typùm HPV6 a HPV11. Chrání tudíž nejen proti HR HPV typùm, ale i proti dvìma LR HPV typùm, zodpovìdným pøedevším za výskyt genitálních bradavic. Poslední v øadì je od roku 2014 nonavalentní vakcína Gardasil 9, chránící proti 9 typùm HPV: HR HPV16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV45, HPV52, HPV58 a LR HPV6 a HPV11. Výrobce udává vysokou úèinnost proti rozvoji CxCa, vaginálního, vulvárního a análního karcinomu a jim pøedcházejících lézí. V souvislosti s objevem komerènì dostupných profylaktických vakcín se celosvìtovì vyvíjí rozsáhlé úsilí o jejich aplikaci v rámci národních vakcinaèních programù. V nìkterých zemích, jako je napøíklad Austrálie, mají s tímto programem již témìø desetileté zkušenosti. V roce 2013 bìžela vakcinace proti HPV již ve 45 zemích svìta a v dalších 4 se pøipravovala (10). V Èeské republice také existuje národní vakcinaèní program proti HPV. Zapoèat byl roku 2012 a je urèen pro tøináctileté dívky (od roku 2018 i pro chlapce), u nichž se pøedpokládá, že se dosud s HPV infekcí nesetkaly. Úèast v tomto programu je dobrovolná a je zdarma. Náklady spojené s vakcínou a její aplikací jsou hrazeny z prostøedkù veøejného zdravotního pojištìní. Závìr HPV infekce provázejí èlovìka celou jeho existencí. Aèkoli je vìtšina tìchto infekcí doèasná, pøetrvávající onemocnìní HR HPV mùže být impulzem k rozvoji prekancerózních lézí a v nejzávažnìjších pøípadech i pøíèinou vzniku nádorového onemocnìní. Z tohoto dùvodu je nezbytná pøesná a dostupná diagnostika tìchto infekcí. Pro výbìr adekvátní vyšetøovací technologie je nejlepší zvolit si metodu provìøenou jak èasem a velkým poètem spokojených uživatelù, tak i øádnì validovanou a podloženou dostatkem klinických studií. Pøi hledání takové technologie mùže pomoci poznatek, že jde o metodu schválenou nejen jako CE-IVD, tj. in vitro diagnostiku vyhovující harmonizovaným evropským normám, ale také schválenou americkou DA (U.S. ood & Drug Administration) jako US-IVD. Poèet tìchto metod není velký, ale cobas 4800 HPV Test (Roche) spolu s automaty pro jeho použití cobas z 480 a cobas x 480 mezi nì rozhodnì a zcela oprávnìnì patøí. Literatura: 1) López-Bueno A., Mavian C., Labella A. M., Castro D., Borrego J. J., Alcami A., Alejo A. Concurrence of iridovirus, polyomavirus and a unique member of a new group of fish papillomaviruses in lymphocystis disease affected gilthead seabream. Journal of Virology. 90, (2016) 19: ) de Villiers E. M., auquet C., Broker T. R., Bernard H. U., zur Hausen H. Classification of papillomaviruses, Virology 324 (2004): ) Bzhalava D., Eklund C., Dillner J. International standardization and classification of human papillomaviruses types, Virology 476 (2015): ) Bernard, H. U., Burk, R. D., Chen, Z., van Doorslaer, K., Hausen, H. Z., & de Vil- liers, E. M. Classification of papillomaviruses (PVs) based on 189 PV types and proposal of taxonomic amendments. Virology, 401(1), (2010): DOI: / j.virol ) Bruni L., Barrionuevo-Rosas L., Albero G., Serrano B., Mena M., Gómez D., Munoz J., Bosch. X., de Sanjosé S. ICO Information Centre on HPV and Cancer (HPV Information Centre). Human Papillomavirus and Related Diseases in the World. Summary Report 27 July [Date Accessed] 6) Munoz N., Bosch. X., de Sanjosé S., Herrero R., Castellsagué X., Shah K. V., Snijders P. J., Meijer C. J. Epidemiologic classification of human papillomavirus types associated with cervical cancer. International Agency for Research on Cancer Multicenter Cervical Cancer Study Group. N Engl J Med eb 6; 348(6): ) Mouková L., eranec R. Lidský papillomavirus z pohledu onkologie, Onkologie 2010: 4(4): ) Chaturvedi A. K., Anderson W.., Lortet- Tieulent J., Curado M. P., erlay J., ranceschi S., Rosenberg P. S., Bray., Gillison M. L. Worldwide Trends in Incidence Rates for Oral Cavity and Oropharyngeal Cancers. J Clin Oncol (2013) 31: ) Dušek L., Mužík J., Kubásek M., Koptíková J., Žaloudík J., Vyzula R. Epidemiologie zhoubných nádorù v Èeské republice [online]. Masarykova univerzita, [2005], [cit ]. Dostupné z WWW: Verze 7.0 [2007], ISSN ) 30 Labor Aktuell 01/18