HPV - Lidský papilomavirus průkaz DNA typů s vysokým rizikem kancerogenity. MUDr. Petra Novotná Laboratoře Mikrochem

Transkript

1 HPV - Lidský papilomavirus průkaz DNA typů s vysokým rizikem kancerogenity MUDr. Petra Novotná Laboratoře Mikrochem

2 Lidský papilomavirus v elektronovém mikroskopu Neobalený DNA virus z čeledi Papillomaviridae Existuje více než 150 genotypů, které mají 90% shodné DNA Každý genotyp má specifickou afinitu buď ke kůži nebo ke sliznici

3 HPV jsou epiteliotropní, napadají pouze buňky kůže a sliznic. Způsobují lokální infekce, kdy vstupní branou infekce jsou trhlinky ve sliznici nebo v pokožce. Virus se replikuje v pouze bazálních buňkách epitelu. Viriony se vytváří spolu s diferenciací epiteliálních buněk, takže kompletní virové částice můžeme nalézt v nejvyšší vrstvě buněk diferencovaných keratinocytů. Důležité pro dobu a způsob odběru.

4 Každý typ HPV se množí jen na predilekčních místech a má vztah k určitým klinickým projevům: Nejběžnější infekce jsou infekční bradavice (verruca vulgaris, plana a plantaris) Následují perigenitálně lokalizovaná condylomata accuminata Dále dysplázie děložního čípku Vzácně se vyskytuje laryngeální papillomatóza a epidermodysplasia verruciformis

5 Nejčastější lokalizace nákaz lidskými papilomaviry: Lokalizace: Onemocnění: Typy HPV: KŮŽE ANOGENITÁLNÍ OBLAST Verruca vulgaris Verruca plana Verruca plantaris Epidermodysplasia verr. Condyloma accuminatum Dysplasie děložního čípku (adenokarcinom) 2,4, 1,7,26,29 3,10,27,28,41 1,2,4 5,8,17,20, 36,9,12,14,15,19,21-25,38,46 6,11, 1,2,10,16,30,44,45,54,55 16, 18, 31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,66,68 ÚSTNÍ DUTINA Hyperplasie epitelu 13,32 LARYNX Papilom 6, 11 OČNÍ SPOJIVKA Papilom 11

6 Epidemiologie HPV Přenos papilomavirů usnadňuje jejich rezistence k zevnímu prostředí. Při pokojové teplotě vydrží vyschlé nejméně týden. Nedají se inaktivovat alkoholem a zachovávají si infekčnost i po hodině zahřívání na 56 o C. Jak již bylo zmíněno, vstupní branou infekce HPV jsou trhliny kůže a sliznic. V oblasti genitálu jsou k přenosu postačující koitální frikční mikrotraumata. Uvádí se, že infekce papilomaviry je nejčastější sexuálně přenosnou nemocí.

7 Etiologie karcinomu děložního čípku - KDČ 19. stol. italský lékař Rigoni-Stern si povšiml výskytu KDČ u prostitutek oproti jeptiškám 60.léta 20.stol. podezření na HSV2 vyvrátila prospektivní studie prof. Vonky ( ) 1983 prof. Hausen z Heidelbergu vyslovil na základě svých studií hypotézu, že virem hrajícím velkou etiologii u KDČ je genotyp 16 popř. 18 viru HPV

8 Důkazy pro etiologický vztah HPV a karcinomu děložního čípku jsou následující: Důkazy molekulárně-biologické - téměř všechny KDČ obsahují DNA HPV Důkazy epidemiologické - DNA HPV je zjišťována mnohem častěji u pacientek s KDČ nebo prekancerózními stavy - toto spojení je nezávislé na jiných faktorech zvyšujících riziko vzniku KDČ - předchozí infekce HPV zvyšuje riziko vzniku nemoci

9 Etiologie karcinomu děložního čípku - KDČ Důkazy imunologické - pacientky s KDČ mají častěji protilátky k HPV než kontrolní osoby - existuje vztah mezi přítomností protilátek k HPV a stavem nemoci - existuje vztah mezi přítomností protilátek a prognózou nemoci Důkazy virologicko-biologické - HPV jsou schopny imortalizovat lidské buňky kultivované in vitro

10 Etiologie karcinomu děložního čípku - KDČ Definitivním důkazem kauzálního spojení mezi HPV a KDČ je fakt, že preventivní vakcinace zabraňuje vzniku prekanceróz vyvolaných HPV (prof. V.Vonka Časopis pro celoživotní vzdělávání lékařů č.4 r. 2006) Infekce HPV působí jako iniciátor maligního procesu, nicméně ke vzniku KDČ jsou potřebné další příčinné faktory: kouření, imunodeficit, imunosuprese, hormonální terapie aj.

11 Diagnostika HPV vysokého rizika v naší laboratoři Hybrid Capture 2 HPV DNA Test

12 Diagnostika HPV vysokého rizika v naší laboratoři - 13 typů: 16, 18, 31,33,35,39, 45, 51,52,56,58,59,68 Principem metody, kterou používá naše laboratoř a která je doporučována NRL pro papilomaviry a která nese jméno Hybrid Capture 2 HPV DNA Test firmy Quiagene, je mikrodestičkový test se zachycující protilátkou proti hybridizovanému amplifikovanému signálu používající ke stanovení chemiluminiscentní detekci.vzorky obsahující cílovou DNA hybridizují se specifickým koktejlem sond HPV RNA. Výsledné hybridy RNA:DNA jsou zachycovány na povrchu jamek mikrodestičky, které jsou potažené specifickými protilátkami proti RNA:DNAhybridům. Zakotvené hybridy potom reagují s konjugátem specifických protilátek proti RNA:DNAhybridům a alkalické fosfatázy a jsou následně prokazovány pomocí chemiluminiscentního substrátu. Ke každé protilátce je konjugováno několik molekul alkalické fosfatázy. Mnohočetně konjugované protilátky se váží na každý zachycený hybrid, což vede k podstatnému zesílení signálu. Při rozkládání substrátu navázanou alkalickou fosfatázou je emitováno záření, které je měřeno luminometrem jako relativní jednotky záření (RLU). Intenzita emitovaného záření ukazuje na přítomnost či nepřítomnost cílové DNA ve vzorku.

13 Diagnostika HPV vysokého rizika v naší laboratoři Výsledky jsou udávány v indexu pozitivity, což je poměr naměřené hodnoty RLU vzorku k průměrné RLU cut-off. Stanovení klinické cutt-off je důležité pro predikci onemocnění Klinická citlivost (schopnost detekovat léze) počet žen s ONEMOCNĚNÍM správně identifikovaných jako HPV pozitivní Analytická citlivost

14 Nastavení hranice analytické citlivosti metody pro klinickou využitelnost HPV testu Snijders et al 2003: J.Pathol 201:1

15

16

17

18 Hodnocení výsledků HPV vyšetření v naší laboratoři RLU/cutt-off: < 0,7 negativní 0,7 a <1,0 hraniční ŠEDÁ ZÓNA 1,0 a <2 hraničně pozitivní ŠEDÁ ZÓNA 2 a <10 slabě pozitivní 10 a <100 pozitivní 100 a <1000 silně pozitivní 1000 velmi silně pozitivní

19 Klinická progrese HPV infekcí lokální infekce intraepiteliální neoplázie karcinom

20 Speciální odběrová souprava pro genové sondy Odběry se provádějí speciálním kartáčkem pro stěr z děložního čípku tak, aby se na kartáček nachytalo co nejvíce buněk z přechodu dlaždicového do cylindrického epitelu, který se nachází v endocervixu. Tento přechod z epitelu do epitelu je rizikovým místem vzniku ca děložního čípku, proto je důležité udělat razantní odběr právě odtud a to tak, že se kartáček vsune do ektocervixu asi 1 až 1,5 cm a 3x se otočí proti směru hodinových ručiček. Po odběru se kartáček opatrně vloží do přepravní zkumavky se speciálním odběrovým médiem a přitom se dbá na to, aby nedošlo k dotyku mezi štětinkami kartáčku a stěnou zkumavky Vzorky mohou být skladovány po dobu 2 týdnů při pokojové teplotě a poté odeslány do laboratoře, kde mohou být uskladněny další týden při teplotě 2-8 C, nebo mohou být zamrazené na teplotu 20 C po dobu 3 měsíců před testováním Odběr se provádí nejdříve za měsíc po předpokládané infekci Odběrová souprava a způsob odběru pro průkaz Chlamydia trachomatis a Neisseria gonorrhoeae ze stěru z děložního čípku je stejná jako pro stěr u HPV všechno se dá udělat z jedné odběrovky.

21 Prevence KDČ 1x ročně cytologický stěr z děložního hrdla - problémem je docházka 56% žen chodí na pravidelné preventivní prohlídky (máme kvalitní cytologické laboratoře). návrh pro vyšetření HPV je 1x za 3 roky (nejasná cytologie, časná prevence) KDČ je zařazen mezi tři základní screeningové onkologické programy (ca mammy, ca recta)

22 Prevence KČD

23 Státem podporované screeningové programy ( Screeningový program Počet pozvaných 1.čtvrtletí 2014 Míra účasti 1.pololetí 2014 (%) cervikální ,1% (16 930) mamografický ,6% kolorektální ,2%

24 (Speciální odběrová souprava pro samoodběr) tato odběrová souprava je nově k dispozici filozofie tohoto výrobku je taková, že by se tato odběrová souprava rozeslala pacientkám, které by nereagovaly na zvací dopis, pacientka by se odebrala sama podle návodu a odebraný vzorek by odnesla přímo do laboratoře k vyšetření

25 Očkování Na trhu jsou tyto vakcíny: Cervarix 16,18 (fa GSK) Silgard 6,11,16,18 (fa Merck) Obě jsou bezpečné a mají klinicky ověřenou účinnost (v současné době 15 let) Obě mají cross protect (zkříženou ochranu) proti dalším typům karcinogenních HPV (zkoumáno na genotypech 31,33,45,51), která trvá 4 roky K dispozici již je nová nonavalentní vakcína Gardasil 9 (fa Merck), která obsahuje 9 genotypů (6,11,16,18,31,33,45,52,58)

26 Dávkovací schéma Bivalentní vakcína Cervarix je indikována ve dvoudávkovém schématu pro dívky ve věku 9-14 let ideálně ve schématu měsíc 0-6, druhá dávka se může podat 5-7 měsíců po první dávce. Pokud se druhá dávka podá dříve než za 5 měsíců po dávce první, je nutno aplikovat tři dávky. Kvadrivalentní vakcína Silgard je ve dvoudávkovém schématu určena pro dívky ve věku 9-13 let ve schématu měsíc 0-6. Pokud se druhá dávka podá dříve než za 6 měsíců po první dávce, je nutno aplikovat tři dávky.

27 Vyšetření HPV vysokého rizika v naší laboratoři negativní pozitivní a a a více více více

28 Děkuji za pozornost