Laboratory parameters in the detection of the effect of anticancer therapy on immune system

Transkript

1 Univerzita Karlova v Praze Lékařská fakulta v Hradci Králové Doktorský studijní program Radioterapie a klinická onkologie Laboratorní parametry v detekci účinku protinádorové terapie na imunitní systém Laboratory parameters in the detection of the effect of anticancer therapy on immune system MUDr. Pavlína Králíčková Školitel: prof. MUDr. Bohuslav Melichar, Ph.D. Hradec Králové, 2014 Obhajoba dne:...

2 Prohlášení autora Prohlašuji tímto, že jsem doktorskou disertační práci zpracovala samostatně a že jsem uvedla všechny použité informační zdroje. Zároveň dávám souhlas k tomu, aby tato práce byla uložena v Lékařské knihovně Lékařské fakulty UK v Hradci Králové a zde užívána ke studijním účelům za předpokladu, že každý, kdo tuto práci použije pro svou publikační nebo přednáškovou činnost, se zavazuje, že bude tento zdroj informací řádně citovat. Souhlasím se zpřístupněním elektronické verze mé práce v informačním systému Univerzity Karlovy v Praze. Hradec Králové,

3 Poděkování: V první řadě jsem zcela mimořádným díkem zavázána svému školiteli prof. MUDr. Bohuslavovi Melicharovi, Ph.D., který byl nejen iniciátorem celé práce, ale bez jehož obětavé podpory, odborného vedení i lidského přístupu by moje dizertační práce jistě nevznikla. Upřímný dík patří i prof. MUDr. Stanislavu Filipovi, Ph.D., DSc zástupci přednosty kliniky onkologie a radioterapie pro vědu a výzkum za řadu cenných rad, které vedly ke zlepšení kvality dizertační práce jako celku. Dále bych velmi ráda poděkovala PharmDr. Doris Vokurkové, Ph.D. a Mgr. Vladimíře Vroblové, Ph.D. z laboratoří Ústavu klinické imunologie a alergologie za neúnavnou pomoc při hodnocení průtokové cytometrie. Můj dík patří i Ing. Jiřímu Havigerovi, Ph.D., Fakulta informatiky a managementu, Univerzity Hradec Králové za významnou pomoc při statistickém zpracování a tvorbě grafických příloh. Děkuji prof. RNDr. Janu Krejskovi, CSc, přednostovi Ústavu klinické imunologie a alergologie za vytvoření příznivých podmínek pro tvorbu práce i prof. MUDr, Jiřímu Peterovi, CSc., přednostovi Kliniky radioterapie a onkologie za možnost vykonávat výzkumné aktivity na jeho pracovišti. 3

4 Obsah: 1. Úvod do problematiky Imunitní odpověď organizmu na nádorové bujení Role imunitního systému v obraně proti nádorům Hlavní buněčné populace podílející se při protinádorové odpovědi organizmu Vztah imunitního systému a protinádorové léčby Neopterin Vztah CD14+CD16+ monocytů periferní krve, močového neopterinu a rizikových faktorů aterosklerózy u nemocných léčených pro karcinom prsu Cíle disertační práce Soubor, metodika a statistické zpracování Sledování změn vybraných buněčných subpopulací a neopterinu v moči u nemocných s karcinomem prsu v průběhu a po ukončení protinádorové chemoterapie soubor nemocných soubor nemocných Sledování změn vybraných buněčných subpopulací a neopterinu u nemocných s karcinomem prsu v průběhu a po ukončení protinádorové chemoterapie soubor nemocných - metodika řešení Metodika analýzy průtokové cytometrie Stanovení neopterinu v moči Korelace CD14+CD16+ monocytů periferní krve, močového neopterinu a rizikových faktorů aterosklerózy u nemocných léčených pro karcinom prsu soubor a metodika Statistické zpracování Výsledky 4.1. Deskriptivní statistika a vzájemné porovnání sledovaných skupin pro relativní i absolutní hodnoty jednotlivých parametrů před zahájením léčby Deskriptivní statistika a vzájemné porovnání sledovaných skupin pro relativní i absolutní hodnoty jednotlivých parametrů ve skupině žen bez známek aktivity základního onemocnění po 3 letech od zahájení neoadjuvantní léčby Lineární regresní model při sledování změn sledovaných paramerů v průběhu chemoterapie u žen léčených neoadjuvantní léčbou

5 4.4. Lineární regresní model při sledování změn sledovaných paramerů v průběhu chemoterapie u žen s metastatickým postižením Neopterin v moči deskriptivní statistika a regresní model ve sledovaných skupinách Korelační a faktorová analýza pro sledované buněčné subpoplace Výsledky korelace CD14+CD16+ monocytů periferní krve, močového neopterinu a rizikových faktorů aterosklerózy u nemocných léčených pro karcinom prsu Diskuze 5.1. Diskuze vzájemné porovnání sledovaných skupin žen v čase nule Diskuze vliv neoadjuvantní a paliativní léčby na rozložení sledovaných buněčných subpopulací Diskuze stupeň rekonstituce imunitního systému po 3 letech Diskuze - korelace CD14+CD16+ monocytů periferní krve, močového neopterinu a rizikových faktorů aterosklerózy u nemocných léčených Závěry Seznam literatury Přílohy Tabulky 5-8 (Deskriptivní statistika, porovnání jednotilivých skupin před zahájením léčby a po 3 letech) Informované souhlasy (grantový projekt GAUK 37808, IGA NR8392-3/2005) Kopie publikace (Králíčková P, et al: Correlation of peripheral blood CD14 + CD16 + monocytes, urinary neopterin and the risk factors of atherosclerosis in patiens with breast carcinoma. Pteridines, 2011, 22(3), 66-72) 5

6 Použité zkratky: ADCC: buněčná cytotoxicita závislá na protilátkách (antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity) APC: antigen prezentující buňky (antigen presenting cell) BALB/c myší linie Bcl-2 genová rodina genů odvozená od B-cell lymphoma BMI body mass index, podíl hmotnosti (kg) a druhé mocniny tělesné výšky (m) CCL2: chemokin2 CD: cluster of differentiation (cluster of designation or Classification Determinant) CDR: complementarity determining regions (variabilní část protilátky a T buněčného receptoru, které váží specifický antigen). CMV: cytomegalovirus COX2 cyklooxygenáza 2 CTL cytotoxin T lymphocytes, cytotoxický T lymfocyt CTLA-4: cytotoxic T-lymphocyte antigen-4 (CD152) CXCL Chemokine (C-X-C motif) ligand 1 cytokin náležející do chemokinové rodiny DC: dendritická buňka (dendritic cell) DNA: deoxyribonukleová kyselina (deoxyribonucleic acid) EGF: epidermální růstový faktor (epidermal growth factor) FAS transmembránový protein typu II z rodiny TNF cytokinů, Synonyma: apoptosis antigen 1 (APO-1 or APT), cluster of differentiation 95 (CD95) či tumor necrosis factor receptor superfamily member 6 (TNFRSF6) FasL: liganda pro FAS Fc receptor: receptor specificky vázající protilátky FGF: fibroblasty stimulující růstový faktor (fibroblast growth factor) FITC fluorescein isothiocyanate, barvivo pro průtokovou cytometrii Foxp3: transkripční faktor (forkhead box p3) G-CSF faktor stimulující kolonie granulocytů (granulocyte colony-stimulating factor) GITR: protein příbuzný s TNFR indukovaný glukokortikoidem (glucocorticoid-induced tumor necrosis factor) 6

7 GM-CSF: faktor stimulující kolonie granulocytů a monocytů (granulocyte-monocyte colonystimulating factor) GVHD reakce štěpu proti hostiteli (graft versus host disease) HIF- Iα : hypoxií indukovaný faktor (hypoxia inducibile factor-1) HIV:virus lidské imunodeficience (humane immune deficiency virus) HLA: histokompatibilní antigen (human leukocyte antigen) HMGB1 high-mobility group box I protien Hsp: protein teplotního šoku (heat shock protein) ICAM: mezibuněčná adhezivní molekula (intercellular adhesive molecule) IDO: indolamin-2,3 dioxygenasa IFN interferon IGF: insulínu podobný růstový faktor (insulin growth factor) IgG imunoglobulin třídy G IL: interleukin IL-2R: receptor pro interleukin 2 IMT intimo-mediální ztluštění (intima-media thickness) inos: indukovatelná syntáza oxidu dusnatého (inducible nitric oxide synthase) IPEX immunodysregulation polyendocrinopathy enteropathy X-linked syndrome IRI imunoregulační index (immunoregulatory index) MAC: komplementový komplex atakující membránu (membrane attack complex) M-CSF: faktor stimulující růst monocytů (monocyte colony-stimulating factor) MHC: hlavní histokompatibilní komplex (major histocompability complex) MMP: matrixová metaloproteináza (matrix metalloproteinase) NAG: N-acetyl-β-D-glukosaminidáza NFκB: nukleární faktor kappa B NK: přirozený zabíječ (natural killer) NO oxid dusnatý (nitric oxide) PAMP: struktury charakteristické pro patogenní mikroorganismy (pathogen-associated molecular pattern) PC5 r-phycoerythrin-cyanine 5 PC7 r-phycoerythrin-cyanine 7 PDGR: od destiček odvozený růstový faktor (platllet derived growth factor) PE phycoerythrin PGE: prostaglandin E 7

8 PI3K phosphatidylinositol 3-kináza RAG recombination activating genes RORγT RAR-related orphan receptor gamma ROS volné kyslíkové radikály STAT3: signal transducers and activators of transcription (přenašeč signálů a aktivátor transkripce) TAA: antigen asociovaný s nádorem (tumor associated antigen) TAM: s nádorem asociované makrofágy (tumor associated macrophages) TAP: peptidový transportér (transporter of antigenic peptides) TCR T cell receptor na T lymfocytech rozpoznávající molekuly MHC TGF: transformující růstový faktor (transforming growth factor) Th: pomocný T - lymfocyt ( helper T-cell) T/H skupiny vybraných žen léčena kombinací paxlitaxelu a trastuzumabu TIL: nádor infiltrující lymfocyty TK: tyrozin kináza TLR receptor podobný genu Toll (Toll like receptor) TMN klasifikace nádorů TNF: tumor nekrotizující faktor (tumor necrosis factor) TNFR: receptor pro tumor nekrotizující faktor TREG: regulační T-lymfocyt VCAM: cévní adhezivní molekula ( vascular cell adhesion molecule) VEGF: vaskulárně-endoteliální faktor (vascular-endothelial factor) 8

9 1.Úvod do problematiky - Imunitní odpověď organizmu na nádorové bujení Hlavním úkolem imunitního systému je obrana proti infekcím. Infekce byly v historii lidstva až do objevu účinných antimikrobiálních léků nejčastější příčinou smrti. S prodlužující se délkou života jsou před organizmus stavěny i další nástrahy, zejména pak boj s nádorovými onemocněními a autoimunitními chorobami. Imunitní reakci na nádorové buňky je nutné považovat za poslední obrannou bariéru, kterou organizmus staví vůči nádorovému bujení. Eukaryotické buňky mají mnoho možností, jak genetickou poruchu (ať již aktivaci onkogenů či inhibici antionkogenů) identifikovat a opravit ještě na úrovni DNA. Došlo-li však i přes tyto opravné mechanizmy k maligní transformaci buňky, může jen imunitní systém efektivně reagovat s cílem je eliminovat. 1.1 Role imunitního systému v obraně proti nádorům Myšlenka, že imunitní systém je schopen rozpoznat a odpovídat na nádorové bujení, byla formulována již na přelomu devatenáctého a dvacátého století, když americký chirurg W.Coley zaznamenal vzácné regrese nádorů v průběhu bakteriálních infekcí. V roce 1950 byly publikovány studie, které ukázaly, že inbrední myši mohou být imunizovány proti nádorům indukovanými karcinogeny, a že protilátky proti odvrženému tumoru byly specifické. Tyto objevy vedly v roce 1957 k formulaci hypotézy o protinádorovém imunitním dohledu. Hypotéza byla vyslovena Thomasem a Burnetem a předpokládala existenci strážných buněk pocházejících z thymu, které trvale monitorují přítomnost transformovaných nádorových buněk. Existence protinádorového dohledu by tedy měla znamenat, že imunodeficitní jedinci mají vyšší frekvenci nádorových onemocnění.[1] V rámci diskuze o existenci imunitního dohledu je v současnosti významnou měrou zohledňována další hypotéza Dunna et al. nazývaná Cancer Immune Editing, tj. editace nádoru imunitním systémem. Jde o rozvinutí původní teorie získané na RAG (recombinant actination gene) deficitních modelech. Nádory, které rostou v nepřítomnosti funkčního imunitního systému, jsou více imunogenní než tumory vytvořené v imunokompetentních hostitelích. Zdá se, že imunitní systém vyvíjí na nádorové buňky neustálý selekční tlak, který vede k selekci takových variant transformovaných buněk, které dokáží uniknout efektorovým 9

10 mechanizmům imunitního systému. Dunn navrhuje rozlišovat tři odlišné úrovně v procesu boje imunitního systému proti nádorovým buňkám eliminaci transformované buňky (elimination), ustanovení rovnováhy mezi transformovanou buňkou a organizmem (equilibrium) a únik transformované buňky před kontrolou imunitního systému (escape) [2] Ve většině případů je nádorová buňka rozpoznána v časných stádiích transformace a zničena imunitním systémem. Celý proces zde může končit nebo přejít do dalších fází. Ve fázi ustanovení rovnováhy hostitelský imunitní systém a přežívající nádorové buňky vcházejí do stádia dynamické rovnováhy. Nesmírná přizpůsobivost nádorových buněk vyplývající z rostoucí genetické nestability, vedoucí k celé kaskádě mutací, nakonec dá vzniknout novým genotypům, které zmenší imunogenicitu a může nakonec dojít k fázi úniku této buňky před vlivem imunitního systému. V tomto ději hrají důležitou roli s nádorem asociované onkogeny, které se podílejí nejen na genomové a chromozomální nestabilitě nádorových buněk, nýbrž se zdá, že jsou schopné zasahovat i do epigenomu nádorových buněk, včetně kmenových buněk a sekundárně tak měnit fenotyp těchto buněk [3]. Fáze ustanovení rovnováhy je nejdelší z těchto tří procesů a klinicky se nejvíce shoduje s preneoplastickým onemocněním, které nejčastěji zůstává nediagnostikované [4] Imunitní odpověď organizmu na nádorové buňky probíhá v analogii imunitní odpovědi v rámci infekčního zánětu. Nádorové buňky na svém povrchu nesou abnormálně sestavené mozaiky molekul, které se nemohou nacházet na buňce normální. Tyto jsou rozpoznány receptory na buňkách přirozené imunity i solubilními složkami přirozené imunity jako nebezpečné vzory. Aktivované buňky přirozené imunity, především dendritické buňky a makrofágy, zpracovávají nádorové antigeny a prezentují je v kontextu I. nebo II. třídy HLA molekul[5]. Rozpoznání antigenních fragmentů vázaných na molekuly HLA poskytuje T- lymfocytům I. aktivační signál, který musí být nezbytně doplněn o II. signály, tj. kostimulační, akcesorní a adhezní interakce mezi antigen prezentujícími buňkami (APC) a T-lymfocyty, doplněné o optimální cytokinové prostředí. Mezi klíčové kostimulační interakce patří CD28 (na povrchu T-lymfocytů) a CD80, CD86 na povrchu antigen prezentujících buněk [6]. Významnou, časnou molekulou vyjadřující aktivační stav většiny buněk vycházející z hematopoetické linie (T, B lymfocyty, NK buňky, myší makrofágy, neutrofily a eosinofily) představuje molekula CD69 [7]. Nádorové buňky však vykazují řadu únikových mechanizmů, které významnou měrou znevýhodňují organizmus při eliminaci nádorových buněk. Ve složitém nádorovém mikroprostředí pak směr odpovědi záleží na tom, zda převáží kostimulační či inhibiční signály [8;9]. 10

11 V nádorovém mikroprostředí se vyskytuje řada buněčných typů a faktorů, které ovlivňují nádorový růst a tvorbu metastáz [10]. V tomto mikroprostředí, hrají důležitou roli i endoteliální buňky, které mají intimní vztah k buňkám imunitního systému a současně vylučují kostimulační i koinhibiční signály. Vytvářejí tak důležitou imunologickou synapsi, která se spolupodílí na modulaci protinádorové odpovědi [11]. 11

12 1.2. Hlavní buněčné populace podílející se při protinádorové odpovědi organizmu T-lymfocyty: Zásadní úlohu v rozpoznávání a odstraňování buněk infikovaných nitrobuněčnými parazity hrají CD8 + T-lymfocyty, označované jako cytotoxické (CTL), které jsou zároveň klíčovými hráči při protinádorové odpovědi. Důvodem klíčové role CD8 + T-lymfocytů je skutečnost, že epitopy vytvořené s nádorem asociovanými antigeny (TAA), jsou převážně prezentovány společně s molekulami HLA I. třídy nádorových buněk [12]. Infiltrace nádoru CD8 + T lymfocyty představuje pozitivní prognostický marker, ať již v období diagnózy či po ukončené neoadjuvantní léčbě [13]. Vzestup počtu CD8 + T-lymfocytů lze indukovat i podávanou léčbou, včetně pokročilého stádia nádorového onemocnění [14]. V případě CD8 + TIL (tumor infiltrujících lymfocytů) se jedná o populaci buněk, jejichž vlastnosti a schopnosti jsou formovány přítomností dalších povrchových znaků. V kontextu práce budou zmíněny pouze některé z těchto receptorů, které jsou významné pro odpověď hostitele na nádorové onemocnění. Ko-receptor CD28 poskytuje řadu druhotných signálů, které snižují aktivační práh a zvyšují tak funkceschopnost T-lymfocytů. Toto se děje jednak zvýšením TCR signalizace a částečně prostřednictvím specifických mediátorů (PI3K,Grb2 a FLNa) [6]. Pokud je organizmus chronicky vystaven intenzivní antigenní stimulaci přirozeně v procesu stárnutí, v případě chronické virové infekce (CMV, HIV), toxického poškození (alkoholismus, hemochromatosa) či jiných chronických onemocnění, dochází k postupnému snižování povrchové molekuly CD28 na T lymfocytech [15-18]. Jak na povrchu tumor infiltrujících lymfocytů, tak i na lymfocytech periferní krve, byla zaznamenána snížená exprese molekuly CD28. Tyto nálezy podporují myšlenku systémové imunosuprese u nemocných s karcinomem, s ohledem na to, že právě nedostatek kostimulačních signálů vede k navození T- lymfocytární tolerance a anergie. [19] Četně se naopak objevuje exprese molekuly CD57. Subpopulace CD57 pozitivních lymfocytů je definována jako antigen specifická, vysoce oligoklonálně expandovaná, terminálně diferencovaná. Zmiňované buňky, podstoupily již řadu dělení, což se projevuje významným zkrácením telomer, mají sníženou schopnost proliferovat a jsou zvýšeně citlivé k proaptotickým signálům. CD57 + buňky lze dále dělit dle přítomnosti povrchové exprese molekuly CD27. CD57 pozitivní lymfocyty blízké terminální diferenciaci, které však na svém povrchu neexprimují molekulu CD27 vykazují schopnost vysoce specifické odpovědi na 12

13 antigenní stimul. [20]. Naopak exprese molekuly CD27 představuje intermediární stádium, kdy zníněná buněčná subpopulace CD57 + CD27 + nemá schopnost přímé odpovědi na daný antigen. Představuje molekulu především s kostimulačními vlastnostmi. Molekula CD27 patří do TNF receptorové rodiny. Tento receptor je odpovědný za tvorbu a dlouhé udržení T buněčné imunity, přispívá ke zrání CD4 + a CD8 + T lymfocytů. CD27 podporuje buněčnou expanzi naivních T lymfocytů, nezávisle na expresi molekuly CD28 a IL-2. Ligandou CD27 je molekula CD70, která hraje klíčovou úlohu při regulaci aktivace B lymfocytů a syntéze imunoglobulinů [21]. U nemocných s chronickými infekcemi, jako jsou tuberkulóza či infekce virem HIV, část CD8 + CD28 - CD57 + buněk vykazuje významnou cytotoxickou aktivitu (exprese perforinu, granzymů), paradoxně ve vyšší míře než jejich CD28 + protipartneři [22;23]. Produkují modulační IFNγ či prozánětlivý TNFα [24]. U nemocných s metastatickým maligním melanomem při analýze TIL byla zjištěna vysoký podíl subpopulace CD8 + CD28 + CD57 +,které mají sice zachovalou schopnost produkce granzymu B, avšak velmi nízkou produkci perforinu. In vitro lze tyto přimět proliferovat, produkovat vysoké hladiny IFNγ a diferencovat se do CD27 -, CD57 +, perforin high cytotoxické T lymfocyty. Naproti tomu TGFβ tuto proliferaci inhiboval, což může vysvětlovat jejich nízký podíl mezi TIL metatatického maligního melanomu [25]. Kromě těchto subsetů lze nalézt i buněčnou subpopulaci naopak s tlumivými vlastnosti (především CD8 + CD28 - FOXP3 + ) [26] Exprese CD8 + CD28 - (CD8 + CD57 + ) byla popsána i na NK a NKT buňkách. [27]. T- regulační lymfocyty (Tregs) Regulační T-lymfocyty (CD4 + CD25 + Foxp3 + ) představují jeden z důležitých mechanizmů pro zachování imunologické tolerance a tlumení imunitní odpovědi. Zabraňují destrukci tkáně v průběhu infekce, vzniku autoimunitního onemocnění [28], zasahují do reakce GVHD (reakce štěpu proti hostiteli) i odhojení transplantátu [29]. Hrají i úlohu při vzniku a průběhu alergického zánětu [30]. Zvýšený počet Tregs zřejmě přispívá k ochraně nádorových buněk před eliminací imunitním systémem [31] Tregs byly poprvé popsány Sakaguchim. V pokuse bylo prokázáno, že pokud BALB/c athymickým myším byly podány CD4 + T-lymfocyty, které byly ochuzeny o CD25 + buňky, u všech myších příjemců se spontánně rozvinula autoimunitní onemocnění (thyreoiditis, gastritis, insulitis, sialoadenitis, adrenalitis, oophoritis, glomerulonefritis či polyartritis) [32-34]. 13

14 V periferní krvi u člověka i u myší jsou regulační T-lymfocyty zastoupeny v 5-12%. Jejich produkce brzlíkem je předpokládaná od třetího dne po narození. Zmíněnou buněčnou subpopulaci je možné detekovat již ve 13. týdnu gestace. Ve fetálním období hraje pravděpodobně úlohu v inhibici aktivace a proliferace mateřských lymfocytů. Tregs chrání fetální tkáně před matčinou imunitní odpovědí [35]. Jejich počet s věkem stoupá [36]. T-regulační lymfocyty je možné rozdělit na přirozené natural (n)-tregs a inducibilní či adaptivní (i)-tregs. Obě skupiny exprimují faktor Foxp3- transkripční faktor (forkhead box p3). Jeho mutace vede k IPEX syndromu (imunitní dysregulace, polyendokrinopatie, enteropatie, vázané na chromozom X) [37]. Dále na svém povrchu exprimují např. GITR - protein příbuzný s TNFR indukovaný glukokortikoidem (glucocorticoid-induced tumor necrosis factor) či CTLA4 (cytotoxic T lymphocyte antigen 4, CD 152). Přirozené (n)tregs se vyvíjejí v thymu a jsou silně závislé na IL-2. Tyto buňky přežívají v nezměněné funkční kapacitě po dlouhý čas a na svém povrchu nesou autoreaktivní TCR. ntregs jsou schopny indukovat v makrofázích supresivní fenotyp [38]. Nejčastěji se jedná o subpopulaci CD4 + CD25 high CD127 low, s menší četností CD8 + CD25 high CD127 low [39]. Regulační T-lymfocyty jsou nástrojem v indukci a udržení periferní tolerance. Regulační T-lymfocyty suprimují imunitní odpověď buď nepřímo prostřednictím IL-10 a TGF-β či kontaktními mechanizmy (např. CTLA-4 indukuje apoptózu), eventuelně přímým zabíjením prostřednictvím granzymů a perforinů [40]. Inducibilní Treg buňky vznikají po stimulaci tolerogenním mikroprostředím z T- lymfocytů. Tohoto procesu se účastní Th1 lymfocyty produkující IL-10, a to po stimulaci nezralými dendritickými buňkami. Klíčovou úlohu zde hraje i TGF-β [12]. Indukovat tvorbu, expanzi i biologickou aktivitu regulačních T lymfocytů jsou schopny i membránové mikrovezikuly či exosomy uvolňované přímo nádorovými buňkami [41]. Regulační lymfocyty různých typů mají schopnost přeměňovat jiné T-lymfocyty na sobě podobné buňky (tzv. infekční tolerance). Pokud se tedy setká aktivní Treg s jinými T- lymfocyty na povrchu stejné dendritické buňky, vytváří cytokinové prostředí příznivé pro diferenciaci obdobného typu buněk [9]. Většina T- regulačních lymfocytů je specifická pro nějaký z autoantigenů. Velký podíl s nádorem asociovaných antigenů (TAA) má zároveň povahu autoantigenů, a proto je činnost regulačních T-lymfocytů v nádorovém prostředí je podporována [42], Důsledkem je pak zvýšená ochrana nádorové buňky proti eliminujícím účinkům imunitního systému. Přítomnost Tregs je popisována jak v místě vlastního nádoru, tak v lymfatických uzlinách postižených metastázami, dále pak v periferní krvi i v nádorových pleurálních výpotcích či ascítu [43-45]. 14

15 Vyšší zastoupení Tregs v oblasti nádorového mikroprostředí či spádových uzlin představuje u karcinomu prsu negativní prognostický faktor [46-51]. Th-17 lymfocyty Th17 lymfocyty produkují skupinu cytokinů (IL-17, IL-21, IL-22) hrajících klíčovou úlohu při chemoatarakci neutrofilů. Přítomnost Th17 lymfocytů je podporována působením IL-23 (hlavním zdrojem jsou antigen prezentující buňky), IL-6 a TGF-β (produkován zejména naivními CD4 + lymfocyty). Tyto cytokiny pak působí prostřednictvím transkripčních faktorů RORγT a následně STAT3. Ve vztahu k T-regulačním (Foxp3 + ) lymfocytům jsou pravděpodobně Th17 lymfocyty udržovány v rovnováze [52]. Th17 lymfocyty fyziologicky hrají důležitou úlohu při obraně proti infekcím vyvolaných plísněmi či extracelulárními patogeny [53]. V oblasti primárních imunodeficitů byla nalezena např. příčinná souvislost mezi deficiencí Th17 lymfocytů a hyper IgE syndromem (geneticky dominantně negativní mutace transkripčního faktoru STAT3)[54]. Kromě řady neinfekčních projevů, jsou nositelé této mutace ohroženi závažnými infekcemi bakteriálními (Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae) a plísňovými (Aspegillus spp, Candida spp) ve formě recidivujících pneumonií, kožních i orgánových abscesů, či torpidního sooru [55]. Naopak nadměrná aktivita Th17 lymfocytů hraje důležitou úlohu v patogenezi některých autoimunitních onemocněníchjako jsou roztroušená skleróza mozkomíšní, revmatoidní artritída, Crohnova choroba, psoriáza či diabetes I. typu [56]. Úloha Th17 lymfocytů při nádorových onemocnění není dostatečně objasněna. Tato buněčná subpopulace pravděpodobně vytváří chronické prozánětlivé podmínky, které mohou naopak napomáhat v nádorovému růstu svojí podporou angiogeneze [57;58]. Na myších modelech bylo potvrzeno, že produkce IL-17 je dána více na vrub tumor infiltrujících lymfocytům, než nádorových buňek a vede k podpoře nádorového růstu a angiogeneze [59]. V nádorové tkáni prsu na rozdíl od zdravé tkáně prsu byla nalezena zvýšená expese Th17 buněk. Yang et al na 30 nemocných s nově diagnostikovaným karcinogen prsu, kteří primárně podstoupili chirurgický výkon, pozorovali, že množství Th17 lymfocytů negativně korelovalo s TMN klasifikací nádoru, jeho angioinvazí i zvýšeným počtem metastaticky postižených lymfatických uzlin [60]. Zvýšený podíl Th17 + buněk v místě nádoru byl nalezen v časných stádiích onemocnění. V dalších stádiích nádorového procesu jsou pak Th17 + lymfocyty nahrazeny zvýšeným podílem Treg [61;62]. U pokročilého stádia karcinomu žaludku byl popsán zvýšený podíl Th17 buněk v periferní krvi včetně spádových lymfatických uzlin [63]. 15

16 NK buňky, přirození zabíječi NK buňky rozpoznávají a zabíjejí buňky, které nenesou na svém povrchu molekuly HLA I. třídy (neaktivující tedy cytotoxické T-lymfocyty). K další aktivaci NK buněk dochází prostřednictvím IFN-α a IL-2 a kostimulačních molekul, které aktivují receptory jako např. NKp30, NKp44 či NKp46. Infiltrace nádoru NK buňkami je ve srovnání s T-lymfocyty méně významná a jejich homing není přesně znám, navíc se zdá, že jsou funkčně defektní. NK buňky ve vysoké míře exprimují na svém povrchu nízkoafinitní Fc receptor pro IgG (CD16), který zprostředkovává na protilátce závislou cytotoxicitu (ADCC). Jeho význam tedy stoupá přiléčbě monoklonálními protilátkami [8;12]. NKT buňky Jedná se o buněčnou subpopulaci stojící na pomezí NK buněk a T-lymfocytů. Tato populace buněk na svém povrchu exprimuje funkční receptor T-lymfocytů (TCR- αβ řetězce) a současně receptory NK buněk např. NK 1.1. Je schopna rozpoznávat glykolipidové antigeny v kontextu s molekulou CD1d. Dle vzoru T-lymfocytů byly nalezeny dvě subpopulace: typ I (podporující protinádorovou odpověď zprostředkovanou CD8 + T-lymfocyty) a typ II (se supresivními účinky). Oba subtypy se vzájemně ovlivňují. Zatím není zcela jasný vztah mezi buňkami NKT II. typu a T- regulačními lymfocyty [64]. Dendritické buňky (DC) Dendritické buňky patří asi mezi nejvýznamnější antigen prezentující buňky. DC jako jediné mohou aktivovat naivní T lymfocyty, a tím zahájit primární specifickou imunitní odpověď. Diferencují se z kmenových hematopoetických buněk v kostní dřeni, odkud jsou již jako nedělící se buňky vyplavovány do krevního oběhu. Z krevního oběhu vstupují DC do tkání, kde se vyskytují především v tzv. nezralé formě. Nezralé dendritické buňky exprimují na svém povrchu velké množství molekul umožňujících pohlcování nejrůznějších antigenních částic. Část obdobných struktur je obsažena i uvnitř buněk a umožňuje tak rozpoznávat i nitrobuněčné parazity. V obou případech hovoříme o toll like receptorech (TLR). V tomto nezralém stavu mají DC na svém povrchu malé množství MHC i kostimulačních molekul, které nedostačuje k zahájení imunitní odpovědí. Současně jsou antigen specifické lymfocyty 16

17 lokalizovány v sekundárních lymfatických orgánech. Pro jejich aktivaci je tedy nutné, aby se dendritické buňky prezentující antigen následně přesunuly z periferie např. do lymfatických uzlin. Proces, během kterého se z nezralé dendritické buňky stává profesionální antigen prezentující buňka (APC) je nazýván maturací. Dochází k němu v případě, že dendritická buňka rozpozná hrozící nebezpečí. Následně DC ztrácí schopnost fagocytovat antigeny a naopak na svém povrchu zvyšuje expresi molekul MHC I. a II. třídy, CD 83, CD80 a CD86, objevuje se i molekula CCR7 (receptor pro chemokiny). Dále narůstá produkce cytokinů potřebných pro optimální stimulaci diferenciace antigenně specifických efektorových T- lymfocytů (např. IL-1, IL-6, TNF a IL-12). Zrající aktivovaná dendritická buňka migruje (při ovlivnění chemokiny CCL19 a 21) do lymfatických uzlin, kde účinně předkládá antigeny prezentované na svém povrchu T lymfocytům Tím se aktivuje a následně i rozvíjí primární specifická odpověď [3; 58; 59]. Mezi dendritickými buňkami lze rozlišit řadu subpopulací. Plazmocytoidní dendritické buňky (PDC) byly pojmenovány podle morfologie připomínající plazmatické buňky. Lze je identifikovat dle exprese CD123 (receptoru pro IL-3) a jejich hlavní funkcí je rozpoznání virových infekcí a obrana proti nim (prostřednictvím exprese TLR-7 a TLR-9) [65-67] Myeloidní dendritické buňky (MDC), mezi které patří i Langerhansovy buňky v epidermis, jsou charakterizovány povrchovou expresí molekuly CD11c a současně absencí molekuly CD14,jež je charakteristická pro monocyty a makrofágy. Hlavními růstovými faktory MDC jsou IL-4 a GM-CSF[68] Dendritické buňky rozpoznávají přítomnost nebezpečí i nepřímým způsobem, detekcí prozánětlivých cytokinů (např. TNF, IL-1β, IFNα a IFNβ) produkovaných různými buňkami, které jsou aktivované přítomností daného patogenu. Tato cesta však nevede k plnohodnotné maturaci se schopností aktivovat T-lymfocyty. DC hrají i důležitou roli v indukci periferní tolerance, kdy v nepřítomnosti aktivačních signálů migruje určité množství nezralých DC do lymfatických uzlin a prezentuje antigeny pocházející z vlastních tkání. Tím se účastní i na indukci regulačních T-lymfocytů, které specificky potlačují imunitní odpověď proti vlastním tkáním. Tento proces je zodpovědný za mechanizmus periferní tolerance [8;9]. Přirozené nádorové mikroprosředí má na dendritické buňky imunosupresivní vliv [69]. Faktory negativně ovlivňující počet a funkci dendritický buněk shruje tabulka č. 1. Početní i funkční defekt dendritických buněk není patrný pouze v místě nádoru, ale i v periferní krvi a metastaticky postižených lymfatických uzlinách [50;70-74]. 17

18 Léčebné ovlivnění nádorového mikroprostředí může tedy sekundárně vést ke zlepšení funkce dendritických buněk. Verra a kol. zjistili, že u pacientů s renálním karcinomem, kterým byl předoperačně podán IL-2 s IFN gama v nízkých dávkách, se v národové tkáni v porovnání s kontrolní skupinou zvýšilo zastoupení CD3 + T-lymfocytů i dendritických buněk, zmnožila exprese molekul CD83, CD80 na buněčných površích a současně i navýšila produkce interleukinu 12 a některých dalších chemokinů produkovaných dendritickými buňkami [75]. Léčebná inhibice VEGF protilátkami vedla taktéž ke zlepšení funkcí dendritických buněk [76]. 18

19 Tab č. 1 Faktory negativně ovlivňující počet a funkci dendritický buněk. (Upraveno dle Bennaceur K, Cancer Letters, 2008) Cytokin TGF-β M-CSF IL-6 VEGF Prostaglandiny GM-CSF IL-10 ROS Vliv na dendritické buňky Inhibice zdrání DC a negativní ovlivnění jejich migrace lymfatickými zlinami Inhibice zdrání DC z CD34+ progenitorových buněk kostní dřeně Porucha diferenciace a maturace in vitro i in vivo Porucha diferenciace DC, kumulace buněk s inhibičními vlastnosti Zhoršené zrání a aktivita in vitro Tvorba nezralých APC s inhibiční úlohou in vitro i in vivo Zhoršení diferenciace, maturace a funkcí in vitro i in vivo Akumulace ROS vede k těžké poruše DC v důsledku oxidativního stresu S nádorem asociované makrofágy (TAM) S nádorem asociované makrofágy vykazují řadu vlastností, kterými podporují růst vlastního nádoru. Jedná se především o schopnost exprese řady růstových faktorů, matrixových proteáz,zejm. MMP2 a MMP9. TAM jsou takto schopny podporovat proces angiogeneze a suprimovat mechanizmy adaptivní imunity[77]. Tyto buňky jsou odvozeny od monocytoidních prekurzorů cirkulujících v periferní krvi. Působenim chemoatraktantů (především CCL2) dochází ke kumulaci makrofágů v místě nádoru. Dalšími molekulami, které vykonávají v nádorovém mikroprostředí funkci chemoatraktantů, jsou i molekuly VEGF, PDGFR, TGFβ nebo M-CSF, podporují tak přežívání i diferenciaci zmiňovaných makrofágů. Makrofágy společně s nádorovými buńkami produkují matrixové proteázy, které jsou schopny degradovat extracelulární matrix (fragmenty fibronektinu a fibrinogenu). MMP podporují produkci růstových faktorů, zvyšují invazivní a metastatický potenciál nádorových buněk. Zvýšené hladiny MMP2 a MMP9 korelují se špatnou prognózou u karcinomu prsu [78;79]. Po vzoru koncepce Th1/Th2 lymfocytů lze obdobně dělit i makrofágy na typ M1 a M2. M1 makrofágy jsou indukovány IFNγ, mikrobiálními stimuly (lipopolysacharidy) či cytokiny TNFα a GM-CSF. Funkčně mají vysokou schopnost prezentovat antigeny a současně ve vysoké míře produkují interleukiny 12 a 23. M1 makrofágy vykazují schopnost toxicity vůči 19

20 nádorovým buňkám či buňkám, které pohltily intracelulární mikroorganizmus pomocí uvolnění vysokého množství toxických metabolitů, jako jsou NO, reaktivní kyslíkové radikálů a TNFα. Na druhé straně subpopulace makrofágů M2 vzniká po expozici interleukinů IL-4, IL-10, IL-13, imunokomplexů či glukokortikoidů. Tato buněčná subpopulace má jen nízkou schopnost prezentovat antigeny, představuje fenotyp s nízkou produkcí IL-12 a naopak vysokou produkcí IL-10, čímž suprimuje zánětlivou odpověď Th1 lymfocytů, podporuje tak například hojení ran, angiogenezi a tkáňovou remodelaci. Schopnost polarizace ve směru M2 vykazují v nádorovém mikroprostředí zejm. působky M-CSF, PGE2, TGFβ, IL-6, IL-10 [12;80;81]. Řada produktů makrofágů, která je uvolňována do nádorového stromatu přímo stimuluje růst nádorových buněk a/nebo podporuje migraci nádorových buněk a tvorbu metastáz (EGF, IL-6, TNFα, chemokiny jako je CXCL12). TAM jsou dále zdrojem imunosupresivních molekul jako IL-10 a PGE2 [82;83] Interleukin 6 produkovaný TAM chrání nádorové buňky před Th1 odpovědí. Jeho vysoké hladiny korelují s nízkou léčebnou odpovědí v souladu s kratší dobou přežívání [84]. V případě invazivně rostoucího nádoru prsu představují makrofágy více než polovinu celkové nádorové masy [85;86]. Nadbytek M2 makrofágů v místě nádoru prsu koreluje tedy se špatnou prognózou [87] Vztah imunitního systému a protinádorové léčby Primárním efektem chemoterapie či radioterapie je přímá redukce nádorové masy. Její účinek však nelze zúžit pouze na cytoredukční, který bývá např. v důsledku myelotoxického působení doprovázen sekundární imunosupresí. Chemoterapeutika, zejména pak biologická léčba, zasahují přímými i nepřímými účinky do nádorového mikroprostředí a ovlivňují tak odpověď organizmu na nádorové bujení [74,98, 105, 108,119]. Rezistence k apoptóze je úzce spjata s procesem tumorigeneze. Předpokládá se, že nádorové buńky rezistentní k apoptóze, jsou současně rezistentní i k protinádorové léčbě. Klíčovým je tedy způsob smrti nádorové buňky. K zesílení žádoucímu zesílení vrozené i adaptivní protinádorové odpovědi dochází v případě, kdy při procesu umírání nádorové buňky dochází k dostatečně účinné prezentaci nádorových antigenů [88]. Z tohoto pohledu je apoptóza, jako jeden z hlavních typů programované buněčné smrti, poměrně málo účinná. Na rozdíl od smrti nekrotické nevede k lýze buńky ani k poškození okolní tkáně uvolněnými enzymy s následným zesílením zánětlivé odpovědí organizmu. Fyziologicky má apoptóza význam zejména při eliminaci autorektivních lymfocytů při vývoji v kostní dřeni a thymu a při odstrańování již nepotřebných efektorových 20

21 buněk. Apoptózu lze navodit mnoha způsoby, zejména vystavením buněk různým typům stresu, nedostatkem záchranných signálů nebo signalizací přes některé povrchové receptory, zejména Fas (CD95) a receptory z rodiny receptorů pro TNF [9]. Výkonovými enzymy pro apoptózu jsou kaspázy (cysteinové proteázy). Signalizační apoptotické dráhy jsou dále ovlivňovány různými proteiny - jako je Bcl-2, FLIP, chaperony a kinázami.[89] Nekróza v tomto smyslu stojí na opačné straně spektra a vede k významné zánětlivé odpovědi se všemi důsledky. Hranice mezi nekrózou a apoptózou však není ostrá. Tyto jevy se četně kombinují, čímž dochází k nejednoznačně pojmenovatelným typům buněčné smrti. Mezi významné neapoptotické způsoby smrti nádorové buňky patří dále autofagie, mitotická katastrofa a běžné stárnutí [90;91], V důsledku podání chemoterapeutik dochází např. ke změnám exprese HMGB1 (highmobility group box I protien), kalretikulinu, proteinů teplotního šoku tzv. heat shock proteiny (Hsp), tvorbě urey či reaktivních kyslíkových radikálů (ROS) [89;92-94]. Ne všechny tyto změny jsou však pozitivní, zejména produkce volných kyslíkových radikálů a zvýšení exprese některých Hsp či HMGB může být i kontraproduktivní [95;96],a proto jsou vyvíjena i léčiva, která je naopak blokují. Molekula p53 hraje rovněž klíčovou úlohu v regulaci buněčného cyklu ve vztahu k různým typům stresům, kterým je buňka vystavena. Kontroluje růst buněk, apoptózu,opravu DNA, stárnutí buněčných populací a angiogenezi. Mutace v oblasti p53 byly nalezeny v rámci hereditárního syndromu Li-Fraumeni. Byl popsán i vztah k mutací BRCA1, kdy dochází k interakcím s p53. Nádory vykazující vysokou expresi p53 bývají obvykle hormonálně negativní. Jsou spojeny s vyšším stupněm proliferace, aneuploidií a horší prognózou. Vyšší hladiny byly zaznamenány i u HER2 pozitivních karcinomů prsu. Mutace, zejména zasahující DNA vázající oblast, jsou všeobecně spojeny s vyšší rezistencí nádorových buněk k chemoterapii [97]. Vliv cytostatik ve vztahu k přímému či nepřímému ovlivnění imunitní odpovědi namířené proti nádorovým buňkám je v současné době intenzivně studován. Například efekt podávání cyklofosfamidu (CFM) v nízkých dávkách je již dlouhodobě znám a přešel i do klinické praxe. Toto tzv. metronomické podávání snižuje počet T-regulačních lymfocytů a obnovuje tak proliferační aktivity T-lymfocytů a NK buněk [98;98]. V léčbě karcinomu prsu je cyklofosfamid úspěšně zkoušen i v kombinaci s dalšími chemoterapeutiky, hormonální léčbou či při použití protinádorových vakcín [99-103] Při vyšším dávkování CFM však již tentoefekt ztrácí a naopak převažuje jeho imunosupresivní účinek prostřednictvím indukce 21

22 lymfocytů obecně, což je klinicky využíváno při léčbě zejména autoimunitních onemocnění [104]. Byly podány důkazy o pozitivním vlivu i dalších cytostatik v oblasti zesílení protinádorové imunity. Řada publikací potvrzuje tuto skutečnost i v případě antracyklinů, taxanů, gemcitabinu i 5-fluorouracilu [ ]. Tato chemoterapeutika působí tak, že restaurují funkční změny T lymfocytů s následnou vyšší produkcí interferonu gama, aktivací NK a NKT buněk [ ]. Dále vedou ke změnám exprese řady povrchových znaků se zvýšením exprese molekul s proapoptotickými účinky, především na buňkách s tlumivými účinky s následným zvýšením aktivity cytotoxických T lymfocytů. Tyto látky rovněž ovlivňují produkci řady cytokinů [ ]. Biologická léčba v tomto smyslu není výjimkou. Sama je založena na aktivaci imunitní odpovědi prostřednicvím na komplementu závislé cytotoxicitě, či na protilátce závislé cytotoxicitě (ADCC). Monoklonální protilátky jsou schopny tvořit antiidiotypové protilátky či indukovat apoptózu [119]. Po podání biologické léčby bylo taktéž zaznamenáno zvýšení počtu NK buněk, zvýšená produkce granzymů, [120], snížení počtu T-regulačních lymfocytů a naopak navýšení produkce interleukinu 17 [ ]. Inhibitory angiogeneze podporují diferenciaci a maturaci dendritických buněk do podoby antigen prezentujících buněk [76] a interferují s uvolňováním progenitorových buněk kostní dřeně s jejich následnou diferenciací do T-lymfocytů [124] Neopterin Obecnou imunitní odpověď organizmu reflektují relativně specificky některé metabolické dráhy. Aktivace imunitního systému v průběhu infekcí, autoimunitních onemocnění, či malignit je patrná např. prostřednictvím sledování produkce pteridinů, oxidu dusnatého či např. kynurenimu. Neopterin (D-erytroneopterin, D-erytro-6-trihydroxypropyl-pterin) je nízkomolekulární látka, která patří mezi nekonjugované pteridiny. Do této skupiny patří také biopterin, izoxantopterin, sepiapterin, xantopterin, kyselina listová, riboflavin a metanopterin. Pteriny jsou pteridiny se strukturou 2-amino-4-oxo-[125]. Neopterin se syntetizuje z guanozintrifosfátu za katalýzy enzymu GTPcyklohydroxylázy. Stanovení koncentrace neopterinu v tělních tekutinách je možné použít ke sledování stimulace GTP-cyklohydrolázy I cytokiny, a to především interferony. Interferon 22

23 gama je syntetizován především během průběhu imunitní odpovědi T lymfocyty a NK buňkami.. IFNγ stimuluje enzym GTP-cyklohydroxylázu I v lidských mikrofázích a má tedy za následek vzrůstající produkci neopterinu a jeho uvolnění.[125] Nebyla zjištěna signifikantní produkce neopterinu T-lymfocyty. Ohledně produkce neopterinu prostřednictvím B-lymfocytů existují kontroverzní data [126]. Zdá se však, že u pacientů s nádory nejsou B-lymfocyty signifikantním zdrojem neopterinu i s ohledem na to, že jsou četně pozorovány snížené hodnoty B-lymfocytů v periferní krvi [127] a dokonce ještě méně četně v nádorovém mikroprostředí. [128]. Lze tedy uzavřít, že neopterin sekundárně indukovaný INFγ odráží nejen aktivitu mikrofágů, ale potažmo i buněčné imunity jako celku. Dosud není známo, zda vyšší koncentrace neopterinu v lidských buňkách a tělních tekutinách plní nějakou funkci nebo pouze indikují částečnou degeneraci biosyntetické cesty. Nicméně, neopterin a jeho redukovaná forma se podílejí u člověka na modulaci cytotoxicity reaktivních forem kyslíku a chlóru a nezávisle na kyslíkových radikálech vyvolávají apoptózu buněk. Zvýšená syntéza neopterinu byla nejprve zaznamenána u pacientů s maligními nádory a virovými insekty. Další studie dokládají jeho zvýšení při aktivaci buněčné imunity spojené s rejekcí transplantátů [129], autoimunitních onemocnění [130], traumat [131], akutního infarktu myokardu [132], pleurálních výpotků u pacientů s TBC [133], dokonce však i v průběhu nekomplikovaného těhotenství[134] [135]. Jak již bylo výše řečeno, jeho zvýšené hladiny jsou nalézány u řady nádorových onemocnění (kolorektální karcinom, karcinom ovária, děložního čípku, endometria, rakoviny prsu [136] či leukémií a maligních lymfomů. V řadě studií jsou vyšší koncentrace spojovány s pokročilým stádiem horší prognózou. Naopak nebyly zaznamenány signifikantně vyšší hladiny u benigních tumorů a prekanceróz. [137] Koncentrace neopterinu se snižují po úspěšné léčbě, a naopak se zvyšují v průběhu progrese [138;138]. Jako materiál k jeho detekci je nejčastěji využívána moč, standardně se hodnotí jeho poměr k sérovému kreatinitu, aby se kompenzovaly další faktory ovlivňující jeho koncentraci v jednorázovém vzorku moči, např. změny diurézy. Jako další zdroj však může posloužit periferní krev, ascítés či pleurální výpotky. 23

24 1.5 Vztah CD14 + CD16 + monocytů periferní krve, močového neopterinu a rizikových faktorů aterosklerózy u nemocných léčených pro karcinom prsu Pokroky v léčbě nemocných s různými typy nádorů se promítají do zlepšení prognózy a prodloužení doby přežívání. Doposud nebyly dostatečně zmapovány dlouhodobé komplikace vč. aterosklerózy a dalších komplikací s nimi spojených [ ]. Konečnou příčinou úmrtí se u těchto nemocných často stávají spíše komorbidity než nádor sám o sobě [142]. Ateroskleróza se svými komplikacemi představuje nejčastější mimonádorovou příčinou morbidity i mortality [143]. Několik retrospektivních studií demonstruje zvýšené riziko kardiovaskulárních příhod, především infarktu myokardu u dlouhodobě přežívajících nemocných s nádorovým onemocněním varlat či nádorů dětského věku léčených chemoterapií [ ]. Protinádorová chemoterapie může vést k urychlení procesu aterosklerózy [144]. Data týkajících se běžnějších nádorových onemocnění v dospělé populaci nejsou četná. Karcinom prsu představuje nejčastější typ nádoru u žen [145]. Díky pokroku v léčbě se dosahuje lepších léčebných výsledků, se kterými je spojeno dlouhodobé přežívání nemalého podílu těchto nemocných. Existují silné důkazy o tom, že tuto prognózu zlepšuje kromě včasné diagnostiky také systémová léčba (hormonální léčba či chemoterapie) [146]. Tyto léčebné modality mohou mít nemalý vliv na akceleraci procesu aterosklerosklerózy [147].Ve studiích však byly zaznamenány oba závěry, tedy zvýšení, stejně jako snížení výskytu komplikací aterosklerózy [148;149]. Monocyty/makrofágy hrají důležitou úlohu v rozvoji poškození cévní steny aterosklerózou. Monocyty periferní krve nejsou čistě homogenní populací. Na základě exprese povrchových znaků CD14, CD16 a CD56 je je možné rozdělit do minimálně pěti subpopulací. Změny fenotypu monocytů periferní krve byly pozorovány i u nemocných se zvýšeným rizikem aterosklerózy. U nemocných s hypercholesterolémií bylo popsáno zvýšení počtu cirkulujících CD14 dim CD16 + monocytů [150]. Paradoxně zvýšené zastoupení CD14 dim CD16 + monocytů, stejně jako CD14 bright CD16 + monocytů v průběhu léčby statiny, bylo provázeno snížením hladiny sérového cholesterolu [151]. Při skríningu časných forem aterosklerózy je doporučováno sledovat i tyto parametry: cholesterol, homocystein, C- reaktivní protein [152]. Měření ztluštění lamina media stěny karotid je využíváno jako nepřímé metodiky ke sledování aterosklerózy věnčitých tepen [153]. Volně cirkulující CD 14 + CD16 + monocyty byly zaznamenány ve zvýšené míře i u nemocných s nádory [154], vč. karcinomu prsu [155]. Neopterin je heterocyklická sloučenina, která je produkována aktivovanými makrofágy. Společně s IFN γ je zvýšen u nemocných 24

25 s různými onemocněními (infekce, maligní tumory, ateroskleróza) [156]. Zvýšené koncentrace prozánětlivých markerů v periferní krvi jsou spojené s aktivací imunitního systému a současně také spojeny s vyšším rizikem aterosklerózy a jejích komplikací [152]. Množství neopterinu pozitivně koreluje se zvýšeným rizikem postižení koronárních tepen [157;158]. U nemocných s nádory zvýšená koncentrace neopterinu dále predikuje špatnou prognózu [137;159]. Mezi nemocnými s karcinomem prsu byla zaznamenána zvýšená koncentrace neopterinu v moči pouze u 20% pacientů [136;137], nicméně současně ve spojení se špatnou prognózou [137]. 25

26 2. Cíle disertační práce Imunitní systém ovlivňuje okolnosti vzniku a dalšího rozvoje nádorového procesu. V tomto smyslu představují T lymfocyty významnou efektorovou složkou s protinádorovým účinkem. Úkolem imunitního systému je tedy nádorové buňky rozpoznat a eliminovat. Na druhé straně stojí nádorové buňky, které se snaží těmto snahám uniknout a navíc využít hostitelský imunitní systém ve svůj prospěch [8]. Velkou výzvu pak představuje rozvinutí takových léčebný postupů, které by minimalizovaly poškození imunitních funkcí v průběhu léčby, a naopak maximálně podporovaly imunitní pochody s protinádorovým účinkem. Vhodným nástrojem se jeví použití biologické léčby a protinádorových vakcín v adjuvantních či neoadjuvantních léčebných režimech [120;121;160;161]. Navíc se opakovaně ukazuje, že imunomodulační účinky vykazuje i řada standardně používaných chemoterapeutik [162] [163] [164] [98]. Pro nemocné by byla nejvýhodnější vysoce individualizovaná léčba, která by zohledňovala kromě dalších faktorů i imunologický status kontrétního nemocného. V první části práce jsme se zaměřili na zmapování rozložení některých lymfocytárních subpopulací u žen trpících karcinomem prsu, ať již lokálně pokročilým, nově diagnostikovaným či metastatickým stádiem onemocnění. Snažili jsme se dále zjistit, jak konvenčně podávaná léčba ovlivňuje rozložení těchto buněčných subpopulací. Zaměřili jsme se za periferní krev, jako nejpřístupnější materiál v klinické praxi. Zlepšení prognózy a prodloužení doby přežívání s sebou přináší nové otázky i z hlediska dlouhodobých komplikací vč. aterosklerózy. Druhá část práce vyhodnocuje vztah mezi cirkulujícími CD14 + CD16 + monocyty, sérovým CRP, koncentrací močového neopterinu a vybranými laboratorními parametry aterosklerózy (sérová hladina cholesterolu, homocystein, α-tokoferol a retinol) a tloušťkou lamina intima a media karotid u nemocných s karcinomem prsu. 26

27 Byly stanoveny následující pracovní otázky: 1. Jaké je rozložení vybraných buněčných subpopulací v periferní krvi u nemocných s nově diagnostikovaným nádorem prsu? 2. Jaké je rozložení těchto vybraných buněčných subpopulací v periferní krvi u nemocných s metastatickou formou onemocněníí? 3. Jak se jednotlivé skupiny od sebe liší navzájem a jaký je rozdíl oproti zdravým kontrolám? 4. K jakým změnám dochází v průběhu podávání kombinované chemoterapie? 5. Bude se u žen, u kterých bylo dosaženo dlouhodobé remise onemocnění, i po třech letech lišit rozložení sledovaných subpopulací vůči zdravým kontrolám? 6. Jaký je vzájemný vztah mezi CD14 + CD16 + monocyty periferní krve, močového neopterinu a rizikových faktorů aterosklerózy, jako případné pozdní komplikace.u nemocných s karcinomem prsu? 27

28 7. Soubor, metodika práce a statistické zhodnocení 3.1. Sledování změn vybraných buněčných subpopulací a neopterinu v moči u nemocných s karcinomem prsu v průběhu a po ukončení protinádorové chemoterapie - soubor nemocných V prospektivní studii byly hodnoceny vzorky periferní krve vybraných pacientek s karcinomem prsu. Studie byla schválena etickou komisí Fakultní nemocnice v Hradci Králové. Před vstupem do studie všechny účastnice podepsaly informovaný souhlas (viz příloha). Pacientky byly léčeny na Klinice onkologie a radioterapie Fakultní nemocnice v Hradci Králové v období mezi Kontrolní skupina 20 zdravých žen (34-65 let, 51,8 ± 8,1, aritmetický průměr ± směrodatná odchylka) byla do studie vybrána z řad pravidelných dárkyň krve (s negativní osobní anamnézou maligního nádorového onemocnění). Soubor nemocných byl tvořen 30 ženami s histologicky ověřenou diagnosou karcinomu prsu (30-69 let, 50,3 ± 11,0). První skupina žen A byla tvořena ženami s nově diagnostikovaným karcinomem prsu, u kterých byla před chirurgickým zákrokem indikována neoadjuvantní chemoterapie. Druhá skupina žen M trpěla metastatickým postižení. Tyto ženy dosud nebyly léčeny pro metastatické onemocnění (adjuvantní a neoadjuvantní léčbu však mít mohly), měly adekvátní hematologické a biochemické hodnoty (léčeny v rámci klinické studie Athena).. Nemocné byly léčeny ve dvou skupinách: 1. skupina žen léčená neoadjuvantní chemoterapií (kohorta A), 20 žen, 49,2± 8,9, (30-64) let, které podstoupily 4 cykly neoadjuvantní chemoterapie ve složení: doxorubicin 60mg/m 2 + cyklofosfamid 600mg/m 2 v intervalu 2 týdnů za podpory filgrastimu. Po ukončení 4. cyklu pak byly dané ženy rozděleny na základě pozitivity Her2/Neu (podskupina HER-2+ dále označena jako A+ a podskupina HER-2- dále označena jako A-). 8 Her2 pozitivních žen (A+) pokračovalo 12cykly paclitaxelu v dávce 90mg/m 2 v kombinaci s trastuzumabem v dávce 4mg/kg při prvním podání a následně 2mg/kg v intervalu 1 týdne. Z této skupiny celkem v 5 případech byla do léčebné kombinace přidána carboplatina v dávce AUC2, 8 Her2 negativních žen (A-) pokračovalo 12 cykly monoterapií paclitaxelu v dávce 90 mg/m 2.. Celkem 3 ženy ve 28

29 studii již dále nepokračovaly. Po následujícícj třech letech, byly sledované parametry jednorázově změřeny u žen bez progrese základního onemocnění (celkem 10 žen) s cílem porovnat rozložení sledovaných subpopulací vůči výchozím hodnotám, tak i kontrolní skupině a pokusit se tak posoudit event. stupeň rekonstituce imunitního systému, 2. skupina s metastatickým onemocněním (kohorta M), 10 žen, 37-69, 53,0± 14,5, léčená paliativní kombinací: bevacizumab 10mg/m 2 + paclitaxel 90mg/m 2 + carboplatina AUC2 v dvoutýdenních intervalech do progrese onemocnění (v rámci klinické studie Athena). Bližší charakteristiky souboru ukazují tabulky číslo 2-4. Tabulka č. 2: Charakteristika souboru žen léčených primární terapií VĚK TMN S histologie Ki (%) p53(%) ER (IRS) PR (IRS) Her2 Léčebný režim 1 30 T1N1M0 IIA Duktální pozit AC/paclitaxel/trastuzumab 2 59 T3N2M0 T1N0M0 IIIA I Duktální pozit AC/paclitaxel/trastuzumab 3 54 T4N1M0 IIIB Duktální pozit AC/paclitaxel/trastuzumab 4 54 T3N1M0 IIIA lobulární pozit AC/paclitaxel/trastuzumab 5 54 T2N2M0 IIIA Duktální pozit AC/paclitaxel/trastuzumab 6 62 T3N1M0 IIIA Duktální pozit AC/paclitaxel/trastuzumab 7 48 T2N1M0 IIB Duktální pozit AC/paclitaxel/trastuzumab 8 51 T2N0M0 IIA Duktální neg AC/paclitaxel 9* 42 T2N0M0 IIA Duktální???? neg AC/paclitaxel T2N0M0 IIA Duktální neg AC/paclitaxel T2N1M0 IIB Duktální neg AC/paclitaxel T3N1M0 T3N0M0 IIIA IIB Duktální neg AC/paclitaxel T2N3M0 IIIA Duktální neg AC/paclitaxel T2N1M0 IIB Duktální?? 0 0 neg AC/paclitaxel T2N0M0 IIA Duktální neg AC/paclitaxel T1N2M0 IIIA nedif neg AC/paclitaxel T1N1M0 IIA Duktální neg AC/paclitaxel T3N1M0 IIIA Duktální pozit AC/paclitaxel/carboplatina/trastuzum T2N1M1 IV Duktální neg AC/paclitaxel/carboplatina T3N1M0 IIIA lobulární neg AC/paclitaxel/carboplatina * jednalo se o hormonálně dependentní nádor, další podrobnosti nejsou známy? neznámý údaj 29

30 Tab č. 3 Rozdělení žen léčených primární terapií (skupina A) dle stádia onemocnění Stádium počet % I 0 0 IIA 6 30 IIB 3 12 IIIA 7 35 IIIB 1 5 IV 1 5 bilaterální 2 10 Tab č. 4 Charakteristika souboru žen s metastatickým postižením (M) v období diagnózy. VĚK TMN Staging histologie Ki (%) p53(%) ER(IRS) PR (IRS) HER2/Neu 1 51 bilaterální* IIIB+IIIB duktální neg 2 41 T2N1M0 IIB duktální?? 0 0 neg 3 74 T3N2M0 IIIA duktální neg 4 44 T1N0M0 I duktální neg 5 32 T1N0M0 I duktální neg T N1M0 IIA duktální neg 7 49 T1N1M0 IIA duktální neg 8 65 T4N1M1 IV duktální neg 9 69 T1N0M0 I duktální neg T1N2M0 IIIA duktální neg 30

31 3.2. Sledování změn vybraných buněčných subpopulací a neopterinu u nemocných s karcinomem prsu v průběhu a po ukončení protinádorové chemoterapie - metodika řešení Po zařazení do studie byl u všech žen před zahájením chemoterapie proveden odběr vzorků periferní krve a ranní moče, které byly neprodleně zpracovány v příslušné laboratoři. V průběhu následující léčby byly další vzorky odebírány vždy v intervalu jednoho týdne, a to buď do ukončení neoaduvantní léčby (ženy s nově diagnostikovaným karcinomemprsu), či do progrese u žen zařazených do klinické studie Athéna (progresivní, metastatické postižení). Podskupina žen, u které bylo léčbou dosaženo remise onemocnění, byla po třech letech vyzvána k odběru závěrečného vzorku periferní krve Metodika analýzy průtokovou cytometrií Stanovení lymfocytárních subpopulací Vzorky periferní krve byly analyzovány pomocí čtyřbarevné průtokové cytometrie. Gatovány tyto buněčné subpopulace: CD3 +, CD , CD3 + CD4 +, CD3 + CD69 +, CD8 + CD69 +, CD69 +, CD3 + CD69 +, CD8 + CD28 +, CD8 + CD28 -, IRI (poměr CD4 + /CD8 + ), CD3 - CD µl heparinizované krve smíšené s 10µl koktejlu monoklonálních protilátek bylo inkubováno 15min při pokojové teplotě. Daný koktejl obsahoval: anti-cd28 (klon CD28.2 konjugovaný s FITC), anti-cd69 (klon TP konjugovaný s PE), anticd8 (klon B9.11 konjugovaný s PC5) and anticd3 (klon UCHT1 konjugovaný s PC7). Všechny monoklonální protilátky byly vyrobeny firmou Beckman Coulter, Miami, FL, USA. Po inkubaci byl přidán lyzační roztok (OptiLyse C, Beckman Coulter). Daná směs byla inkubována po dobu 10-ti minut. Analýza průtokovou cytometrií byla provedena na přístroji Cytomics FC 500 cytometer (Beckman Coulter). Následně byla získaná data analyzována pomocí CXP Analysis Software (Beckman Coulter, Miami, FL, USA). Pro každý vzorek bylo hodnoceno minimálně buněk. 31

32 T-regulačních lymfocyty Heparinizovaná krev pacientů byla inkubovaná s koktejlem monoklonálních protilátek anti-cd3-fitc (klon UCHT1), anti-cd4-pc7 (klon 13B8.2), anti-cd25-pc5 (klon B1.49.9), anti-cd127-pe (klon R34.34) (Beckman Coulter, Miami, FL, USA). Po 20min inkubaci byly erytrocyty zlyzovány činidlem Optilyse (Beckman Coulter) a vzorky byly ihned měřeny na průtokovém cytometru FC500 Cytomics (Beckman Coulter, Miami, FL, USA) vybaveným dvěma lasery. U každého vzorku bylo nasbíráno buněk a výsledky byly analyzovány softwarem CXP Analysis. Strategie gatování: Byly zagatovány CD4 + lymfocyty v douparametrovém histogramu CD3 + CD4 + a podle izotypové kontroly byly v dalším gatu zagatovány lymfocyty CD127 - CD25 + a CD127 dim CD25 +. Stanovení dendritických buněk Pro stanovení myeloidních dendritických buněk (MDCs) byl použit komerční kit Dendritic Cells Myeloid Subset (Beckman Coulter). Postupnou pozitivní selekcí pomocí čtyř monoklonálních protilátek (CD14, CD16, ILT3, CD33) v tříbarevné analýze byly odlišeny myeloidní dendritické buňky od ostatních krevních buněk periferní krve. Myeloidní dendritické buňky výrazně exprimují znaky CD33 a ILT3, zároveň jsou CD16 negativní a jen částečně CD14 pozitivní. Pro stanovení plazmocytoidních dendritických buněk (PDCs) byl použit komerční kit Dendritic Cells Plasmacytoid Subset (Beckman Coulter). Postupnou pozitivní selekcí pomocí čtyř monoklonálních protilátek (CD14, CD16, ILT3, CD123) v tříbarevné analýze byly odlišeny PDCs od ostatních krevních buněk periferní krve. Plazmocytoidní dendritické buňky výrazně exprimují znaky CD123 a ILT3, jsou však CD14 i CD16 negativní. Gatovací strategie ukazují obrázky č

33 Obr. č. 1 Gatovací strategie T-regulačních lymfocytů A B C Postup: Byly zagatovány CD4 + lymfocyty v douparametrovém histogramu CD3 + CD4 + (A), barevně zagatovány CD4+CD25high lymfocyty (B) a podle izotypové kontroly byly v dalším gatu zagatovány lymfocyty CD127 - CD25 high a CD127 dim CD25 high (C). 33

34 Obr. č. 2 Gatovací strategie plasmocytoidních dendritických buněk (PDC) A Postup: Byly zagatovány všechny CD123 + buňky (A), z nich byly v dalším douparametrovém histogramu zagatovány buňky ILT3+ a CD14 + CD16 neg odlišení od monocytů (zelená barva-b) a v douparametrovém histogramu C ohraničuje gate PDCs CD123 + ILT3 + B C 34

35 Obr.č. 3 Gatovací strategie myeloidních dendritických buněk (MDC) A Postup: Byly zagatovány všechny CD33 + buňky (A), z nich byly v dalším douparametrovém histogramu zagatovány buňky ILT3 + a CD14 + CD16 neg odlišení od monocytů (B) a v douparametrovém histogramu C ohraničuje gate MDCs CD33 + ILT3 + B C 35

36 Obr. č. 4 Gatovací strategie lymfocytární populace CD8 + CD28 + A B C D Postup: Z gatu všech lymfocytů (A) se přímo naměří populace CD8 + CD28 + (C) nebo se z gatu lymfocytů zagatují CD8 + lymfocyty (B) a z nich se naměří sledované populace (D). CD8 pozitivní buňky v tomto případě tvoří 100% populaci. 36

37 3.4. Stanovení neopterinu v moči Vzorky ranní moči byly sbírány a do analýzy skladovány při teplotě -20 C. Močový neopterin byl stanoven modifikovanou metodikou dle Melichara a kol., 2006 [165]. Po centrifugaci (5min,1300 x g) a naředění 100 μl vzorku moči s 1,0 ml mobilizační fáze obsahující disodium-edta (2g/l). Vzorky byly následně filtrovány pomocí Microtiter, AcroPrep 96 Filter Plate 0,2 m/ 350 μl, Pall Life Science (Ann Arbor, USA) a Vacuum Manifold Pall Life Science a poté injektovány do kolony. Neopterin byl stanoven pomocí kapalné chromatografie systémem Prominence LC20 (Shimadzu, Kyoto, Japonsko) složeného z Rack changer/c speciálního autosampletu pro mikrotitrační destičky, Degasser DGU- 20A5, 2 chromatografických pump LC-20 AB, autosampleru SIL-20 AC, Column Over CTO 20 AC termostatu, detektoru fluorescence RF- 10 AXL, diodového detektoru SPD M20A a komunikujícího modulu CBM-20A. V mobilizační fázi byl použit fosfátový pufr 15 mmol/l, ph 6,4 o rychlosti 0,8 ml/min. separace proběhla za pomoci analytické kolony Gemini Twin 5μ, C18, 150 x 3 mm /Phenomenex, Torrance, USA) při 25 C, objem injekce byl 1μl. Neopterin byl určen za jeho přirozené fluorescence (vlnová délka 353 nm excitace, 438 nm emise). Kreatinin byl detekován současně ze stejného vzorku pomocí detektoru s diodovým polem při 235nm. Doba analýzy močového neopterinu a kreatininu byla 6 min a analyty byly kvantifikovány pomocí externí standardizační křivky. Koncentrace neopterinu byla vyjádřena jako poměr neopterin/kreatinin (μmol/mol kreatininu). Aktivita N-acetyl-β-Dglukosaminidázy (NAG) v moči byla stanovena podle metodiky Ellise a kol [166] s minimální modifikací. NAG aktivita byla vyjádřena jako poměr NAG/kreatininu (μkat/mol kreatininu) Korelace CD14 + CD16 + monocytů periferní krve, močového neopterinu a rizikových faktorů aterosklerózy u nemocných léčených pro karcinom prsu soubor a metodika Do studie bylo zařazeno celkem 33 pacientek s histologicky potvrzenou diagnózou karcinomu prsu. Všechny nemocné podstoupily primární léčbu (chirurgickou a/nebo chemoterapii či adjuvantní radioterapii). Nemocné s nádorovou expresí estrogenních a/nebo progesteronových receptorů dostávaly hormonální léčbu (tamoxifen či inhibitory aromatáz). Výzkum byl schválen lokální etickou komisí. Nemocné podepsaly informovaný souhlas. Vzorky žilní krve byly odebírány po celonočním lačnění. Vzorky byly bezprostředně dopraveny do laboratoře, kde byly zpracovány pomocí centrifugace (1600 x g,10 min, 16 C). 37

38 Separované sérum bylo pro většinu parametrů zpracováno přímo, či v případě α-tokoferolu a retinol nejprve zmraženo na -20 C. Periferní krevní obraz byl vyhodnocen dle publikace Melichar a kol., 2009 [147]. Hemoglobin byl měřen fotometrickou metodou za použití lauryl-sulfátu sodného. Leukocyty a destičky byly určeny pomocí impedance krevní analyzátorem Sysmex XE-2100 (Sysmex, Kobe, Japan). Monocyty CD14+CD16+ byly stanoveny pomocí dvoubarevné průtokové cytometrie za použití monoklonální protilátky anti CD14 značené izokyanátem (Imunotech, Marseille, Francie) a protilátky anti CD16 značené fykoerytrinem (Imunotech) na průtokovém cytometru Cytomycs FC500 (Beckman Clouter Hialeah, Florida, USA). CRP byl stanoven pomocí imunoturbidimetrie, lipoprotein (a) a sérový cholesterol, low-density lipoprotein (LDL), high-density lipoprotein (HDL) cholesterol, triacylglyceridy pak za pomoci imunoturbidimetrie, na enzymu založené analýze pomocí komerčního kitu na analyzátoru MODULAR (Hoffmann-La Roche, Basilej, Švýcarsko). Koncentrace homocysteinu byla změřena imunochemicky (Immulite 2000, Siemens Healthcare Diagnostics, Deerfield, Illinois, USA). Sérový tokoferol-α byl stanoven kapalnou chromatografií dle metodiky popsané v práci Urbánek a kol.2006 [167]. V extrakční proceduře bylo deproteinizováno 500 μl séra za pomocí denaturovaného etanolu s 5% metanolem (500 μl, 5 min, 4 C). Následně pak bylo k této směsi přidáno 2500 μl n-hexanu a louhováno po dobu 5min ve vortexové aparatuře. Po centrifugaci (1600 x g, 10 min,0 C) byla část (2000μl) z čirého extraktu separována a evaporována (45 C) ve vákuovém koncentrátoru AD 5301 (Eppendorf, Hamburg, Německo). Zbytek byl rozpuštěn ve 400μl metanolu a analyzován kapalnou chromatografií za použití externí standardní kalibrace. Analýza byla provedena vysokovýkonným kapalným chromatografem Perkin Elmer (Norwalk,USA) zahrnujícím LC 200 pumpu, LC 200 autosampler, LC kolonovou troubu 101, termostat LC 235C, diodový detektor vzájemně propojené do Parkin Elmer Turbochrom chromatografické stanice verze 4.1. Separace α- tokoferolu a retinolu proběhly na Chromolith Performance RP-18e, 100 x 4,6 mm monolitické koloně (Merck, Darmstadt, Německo). V mobilizační fázi byl použit 100% metanol o průtoku 2,5 ml/min při tlaku 3,3 MPa v koloně. Termostat LC Oven 101 (Perkin Elmer) byl použit k udržování teploty 25 C. Objem injekce byl 50μl. Detekce alfa-tokoferolu a retinolu byla provedena při vlnové délce 295nm, resp 325nm. Přesná metodika stanovení neopterinu v moči byla popsána v předchozí části. Arteriae carotides byly hodnoceny dvourozměrnou zobrazovací metodou ultrazvukovým přístrojem (Aplio, Toshiba, Japonsko) s 14-MHz převodníkem energie. 38

39 Intimo-mediální ztluštění (IMT) bylo definováno jako vzdálenost mezi echogenní linií představující intimo-krevní rozhraní a echogenní linií představující medio-adventiciální rozhraní. Měření proběhlo na zadní stěně a.carotis v podélné ploše. IMT bylo změřeno oboustranně ve dvou úrovních (supraklavikulární segment společné a. karotis communis a 2cm pod bifurkací a.carotis communis). Celkem byla na dané úrovni provedena tři měření a následně vypočítán aritmetický průměr. Sledována byla přítomnost karotických plaků. Všechna vyšetření byla prováděna stejnou osobou Statistické zpracování Soubor byl zpracován pomocí statistického programu IBM SPSS Statistics, verze 20 a Microsoft Excel Porovnání jednotlivých skupin v čase nula Testování normality populace v jednotlivých skupinách bylo provedeno pomocí Shapiro-Wilcoxon testu pro malé výběry. Hypotéza o normálním rozložení byla zamítnuta pro jednotlivé skupiny nemocných i zdravé kontroly v různých proměnných téměř ve všech případech. Z důvodů nenormality byl pro všechny skupiny a všechny proměnné proveden neparametrický Mann-Whitney test porovnání středních hodnot s nulovou hypotézou mediány se rovnají. Jako statisticky významné bylo považováno dosažení hladiny významnosti p Uvedeny jsou statisticky průkazné výsledky. Sledování změn parametrů v čase, v průběhu podávané léčby Cílem byla analýza změn oproti počátečnímu stavu. Z tohoto důvodu byla vytvořena proměnná diffdate udávající počet dnů od prvního odběru a proměnná diffx udávající u sledovaných parametrů rozdíl od počáteční hodnoty. Byla provedena deskriptivní analýza dat. Následně byl proveden výpočet lineární regresní analýzy, ve kterém byla sledována závislost hodnoty měřeného markeru na čase pro jednotlivé proměnné. Regresní analýza byla odděleně provedena pro skupinu M a skupinu A. Skupina A byla dále separátně hodnocena pro časové období léčby 1. fáze (AC) a 2. fáze (paclitaxel/trastuzumab/carboplatina) a současně byla rozdělena do podskupin A+ a A-, všechny definované podskupiny byly statisticky zpracovány odděleně. Pro lineární regresní analýzu byly považovány za statisticky významné výsledky na 39

40 hladině významnosti (signifikance) 0,05. Definovaná proměnná B vyjadřovala změny hodnoty daného parametru za jeden den. Hodnota R kvadrát pak poměrnou část daného souboru, která byla vysvětlitelná modelem lineární regrese na dané hladině významnosti a současně s vyjádřenými změnami parametru B. K bližšímu popsání vzájemných vztahů sledovaných parametrů, byla v závěru provedena korelační a faktorová analýza. Korelace CD14 + CD16 + monocytů periferní krve, močového neopterinu a rizikových faktorů aterosklerózy u nemocných léčených pro karcinom prsu Korelace byly analyzovány pomocí Spearmanova korelačního koeficientu, hladina významnosti p=0,05. Analýza byla provedena za pomoci softwaru NCSS (Number Cruncher Statistical Systém, Kaysville,Utah, USA). 40

41 4.Výsledky 4.1. Deskriptivní statistika a vzájemné porovnání sledovaných skupin pro relativní i absolutní hodnoty jednotlivých parametrů před zahájením léčby Deskriptivní statistika a vzájemné porovnání sledovaných skupin pro relativní i absolutní hodnoty jednotlivých parametrů před zahájením léčby je znázorněna v tabulkách č 5 a 6 Jak vyplývá z tabulky č. 5 ve skupině žen s metastatickým postižením (M) bylo v porovnáni se skupinou žen léčených neoadjuvanntí léčbou (A) zjištěno statisticky významné relativní snížení CD3 + CD4 + lymfocytů, imunoregulačního indexu a relativního počtu PDC, a naopak zvýšení relativního počtu CD3 + CD8 + lymfocytů, zvýšení relativního i absolutního počtu CD8 + CD28 -, zvýšení relativního i absolutního počtu CD3 + CD69 + a absolutního počtu CD8 + CD69 + lymfocytů. Při vzájemném porovnání skupin žen s metastatickým postižením a kontrolní skupiny zdravých žen bylo zaznamenáno ve skupině M statistisky významné snížení absolutního počtu celkových lymfocytů, absolutního počtu CD3 + lymfocytů, IRI, dále pak snížení absolutního i relativního počtu CD3 + CD4 +, zvýšení relativního počtu CD3 + CD8 +, relativního počtu CD8 + CD28 -, CD3 + CD69 + a relativního počtu CD8 + CD69 + lymfocytů. Při vzájemném porovnání skupin žen léčených neoadjuvantní léčbou a kontrolní skupinou bylo zaznamenáno snížení relativního i absolutního celkového počtu lymfocytů, snížení absolutního počtu CD3 +, absolutního počtu CD3 + CD4 + lymfocytů, snížení relativního počtu CD69 +, zvýšení relativního počtu CD8 + CD28 + lymfocytů, zvýšení relativního počtu TREG a snížení absolutního i relativního počtu CD8 + CD28 - lymfocytů. Při porovnání sledovaných parametrů uvnitř skupiny A, kdy byly porovnávány podskupiny A+ a A- (rozdělení na základě exprese HER-2) nebylo zjištěno žádných statisticky významných rozdílů v porovnání relativních i absolutních hodnot sledovaných parametrů (tab č 6). Grafické znázornění porovnání mediánů vybraných parametrů shrnují grafy číslo

42 Graf č 1. Box-plot porovnání skupin před zahájením léčby, CD3 + lymfocyty (r Graf č. 3 Box-plot porovnání skupin před léčbou, CD3 + CD8 + lymfocyty (rel) Graf č. 2 Box-plot porovnání skupin před léčbou, CD3 + CD4 + lymfocyty (rel) Graf č. 4 Box-plot porovnání skupin před léčbou, neopterin 42

43 Graf č. 5 Box-plot porovnání skupin před léčbou,cd8 + CD28 + lymfocyty (rel) Graf č. 7 Box-plot porovnání skupin před léčbou, CD8 + CD28 - lymfocyty (rel) Graf č. 6 Box-plot, porovnání skupin před léčbou, CD3 + CD69 + lymfocyty (rel) Graf č. 8 Box-plot, porovnání skupin před zahájením léčby, TREG (rel) 43

44 4.2. Deskriptivní statistika a vzájemné porovnání sledovaných skupin pro relativní i absolutní hodnoty jednotlivých parametrů ve skupině žen bez známek aktivity základního onemocnění po 3 letech od zahájení neoadjuvantní léčby Deskriptivní statistika a vzájemné porovnání sledovaných skupin pro relativní i absolutní hodnoty jednotlivých parametrů ve skupině žen bez známek aktivity základního onemocnění po 3 letech od zahájení neoadjuvantní léčby je znázorněna v tabulce č 7. Při porovnání definované podskupiny žen po 3 letech s kontrolní skupinou zdravých žen bylo zjištěno statisticky významné snížení relativního i absolutního počtu CD3 + lymfocytů, snížení absolutního i relativního počtu CD3 + CD4 + lymfocytů, snížení imunoregulačního indexu, zvýšení relativního počtu T regulačních lymfocytů, zvýšení relativního počtu plasmocytoidních i myeloidních dendritických buněk. Při vzájemném porovnání hodnot sledovaných parametrů před zahájením léčby a za 3 roky bylo zjištěno, že po 3 letech došlo ke statisticky významnému vzestupu relativního celkového počtu lymfocytů při současném snížení relativního zastoupení CD3 +, snížení relativního zastoupení CD3 + CD4 + lymfocytů, snížení imunoregulačního indexu, snížení relativního počtu CD8 + CD28 + a naopak ke zvýšení relativního i absolutního počtu CD8 + CD28 - a zvýšení absolutního počtu CD69 + lymfocytů Při izolovaném porovnání HER-2 pozitivních a negativních se skupinou zdravých žen i hodnotami výchozími byly zjišteny výsledky obdobné. Shrnutí naleznete v tabulkách č 8 a 9. Vzájemné porovnání HER-2 pozitivních a HER-2 negativních žen po 3 letech nebylo možné pro nízké počty vyšetřovaných žen. Grafické znázornění porovnání mediánů vybraných parametrů shrnují grafy číslo

45 Graf č. 9 Box-plot, porovnání skupiny primární terapie (A) před léčbou (T0), po 3 letech (T3R)a kontrolní skupiny (K), CD3 + lymfocytů (rel) Graf č. 11 Box-plot, porovnání skupiny primární terapie (A) před léčbou (T0), po 3 letech (T3R)a kontrolní skupiny (K), CD3 + CD8 + lymfocytů (rel) Graf č. 10 Box plot, porovnání skupiny primární terapie (A) před léčbou (T0), po 3 letech (T3R)a kontrolní skupiny (K), CD3 + CD4 + lymfocytů (rel) Graf č. 12 Box plot, porovnání skupiny primární terapie (A) před léčbou (T0), po 3 letech (T3R)a kontrolní skupiny (K), CD8 + CD28 + lymfocytů (rel) 45

46 Graf č. 13 Box-plot, porovnání skupiny primární terapie (A) před léčbou (T0), po 3 letech (T3R)a kontrolní skupiny (K), CD lymfocytů (rel) Graf č. 15 Box-plot, porovnání skupiny primární terapie (A) před léčbou (T0), po 3 letech (T3R)a kontrolní skupiny (K), TREG (rel) Graf č. 14 Box-plot, porovnání skupiny primární terapie (A) před léčbou (T0), po 3 letech (T3R)a kontrolní skupiny (K), CD lymfocytů (rel) 46

47 4.3 Lineární regresní model při sledování změn sledovaných paramerů v průběhu chemoterapie u žen léčených neoadjuvantní léčbou. V průběhu fáze 1 (AC) byly zaznamenány změny pouze na hranici významnosti. Lineárním modelem bylo vysvětlitelné jen malé množství změn sledovaných parametrů. Jednalo se o postupné zvyšování relativních počtů CD3 +, CD3 + CD8 +, CD8 + CD28 +, CD3 + CD69 + a CD8 + CD69 + lymfocytů. Pro absolutní hodnoty nebyl lineární model aplikovaný pro vysoký rozptyl dat. Skupina A byla následně rozdělena na skupinu A+ a A- na základě exprese HER-2. Ve skupivě A+ v průběhu fáze 1 docházelo ke statisticky významným vzestupům relativního počtu CD3 +, CD3 + CD8 + a CD8 + CD28 + lymfocytů. Ve skupině A- kromě vzestupu relativního zastoupení CD3 +, CD3 + CD8 +, CD8 + CD28 + lymfocytů docházelo navíc i ke vzestupu relativného zastoupení CD3 + CD69 + a relativního zastoupení CD8 + CD69 + lymfocytů. Dosažené výsledky shnují tab č V průběhu fáze 2 ve skupině všech žen léčených neoadjuvantní chemoterapií bylo zaznamenáno statisticky významné snižování relativního počtu CD3 + CD4 + lymfocytů, snižování imunoregulačního indexu, snižování relativního zastoupení T regulačních lymfocytů, a snižování relativního i absolutního počtu myeloidních dendritických buněk. Ve stejném sledovaném období bylo naopak zjištěno statisticky významné zvyšování relativního i absolutního počtu CD8 + CD28 - lymfocytů. Při hranici významnosti se pro malý podíl souboru vysvětlitelný lineárním modelem pohyboval mírný vzestup CD3 + CD8 + lymfocytů. (tab č 13), Následně byla opět skupina A rozdělena na podskupiny A+ a A- a obě definované podskupiny byly zhodnoceny odděleně (tab č. 14, 15). Ve skupině HER-2 negativních žen v průběhu fáze 2 nebyly prakticky zaznamenány žádné statisticky významné změny jednotlivých parametrů vysvětlitelných lineárním modelem. Pokles absolutního počtu CD3 + lymfocytů a naopak vzestup absolutního počtu CD8 + CD28 + při vzestupu relativního počtu CD8 + CD28 - lymfocytů platilo jen pro malý podíl sledovaného souboru. Naopak v případě podskupiny A- ve 2. fázi léčby docházelo ke statisticky významným změnám v případě několika parametrů. Jednalo se o vzestup relativního podílu CD3 + CD8 + lymfocytů, a s ním souvsejícího poklesu imunoregulačního indexu. Dále pak byl zjištěn statisticky významný vzestup v čase relativního i absolutního počtu CD8 + CD28- lymfocytů, vzestup relativního počtu CD3 + CD69 + a CD8 + CD69 + lymfocytů a naopak pokles T regulačních lymfocytů. 47

48 Tabulka č. 10. Analýza lineární regrese ve skupině s primární terapií (A) pro první fázi léčby (AC). B značí o kolik se změní daný parametr za jeden den léčby, signifikance je hladina významnosti, hodnoty menší či rovné 0.05 jsou považovány za statisticky významné. R kvadrát vyjadřuje relativní podíl souboru, který je vysvětlitelný modelem lineární regrese na dané hladině významnosti (Pokud bychom vynásobili tuto hodnotu 100, pak se jedná o proceto hodnot vysvětlitelných daným lineárním modelem na příslušné hladině významnosti.) Parametr B Signifikance R kvadrát Neopterin Lymfocyty < (relativní počet) Lymfocyty (absolutní počet) CD3 + (%) CD3 + (abs) < <0.001 CD3 + CD4 + (%) CD3 + CD4 + (abs) CD3 + CD8 + (%) CD3 + CD8 + (abs) IRI CD8 + CD28 + (%) CD8 + CD28 + (abs) CD8 + CD28 - (%) <0.001 CD8 + CD28 - (abs) < CD3 + CD69 + (%) CD3 + CD69 + (abs) < CD8 + CD69 + (%) CD8 + CD69 + (abs) < CD69 + (%) CD69 + (abs) < <0.001 CD (%) CD (abs) < TREG (%) TREG (abs) < <0.001 PDC (%) PDC (abs) < MDC (%) MDC (abs) <

49 Tabulka č. 11 Analýza lineární regrese ve skupině s primární terapií HER-2 pozitivních žen (A+) pro první fázi léčby (AC). Parametr B Signifikance R kvadrát Neopterin Lymfocyty (relativní počet) Lymfocyty (absolutní počet) CD3 + (%) CD3 + (abs) CD3 + CD4 + (%) CD3 + CD4 + (abs) CD3 + CD8 + (%) < CD3 + CD8 + (abs) IRI CD8 + CD28 + (%) CD8 + CD (abs) CD8 + CD28 - (%) CD8 + CD28 - (abs) CD3 + CD69 + (%) CD3 + CD (abs) CD8 + CD69 + (%) CD8 + CD (abs) CD69 + (%) CD69 + (abs) CD (%) CD (abs) < TREG (%) TREG (abs) < PDC (%) PDC (abs) MDC (%) MDC (abs)

50 Tabulka č. 12 Analýza lineární regrese ve skupině s primární terapií HER-2 negativních žen (A-) pro první fázi léčby (AC). Parametr B Signifikance R kvadrát Neopterin Lymfocyty (relativní počet) Lymfocyty (absolutní počet) CD3 + (%) CD3 + (abs) CD3 + CD4 + (%) CD3 + CD4 + (abs) CD3 + CD8 + (%) CD3 + CD8 + (abs) IRI CD8 + CD28 + (%) CD8 + CD (abs) CD8 + CD28 - (%) CD8 + CD28 - (abs) < CD3 + CD69 + (%) CD3 + CD (abs) CD8 + CD69 + (%) CD8 + CD69 + < (abs) CD69 + (%) CD69 + (abs) CD (%) <0.001 CD (abs) < TREG (%) TREG (abs) < PDC (%) < PDC (abs) MDC (%) MDC (abs)

51 Tabulka č. 13 Analýza lineární regrese ve skupině s primární terapií (A) žen pro druhou fázi léčby. Parametr B Signifikance R kvadrát Neopterin Lymfocyty < (relativní počet) Lymfocyty (absolutní počet) CD3 + (%) CD3 + (abs) CD3 + CD4 + (%) < CD3 + CD4 + (abs) < <0.001 CD3 + CD8 + (%) CD3 + CD8 + (abs) < IRI CD8 + CD28 + (%) CD8 + CD28 + (abs) < CD8 + CD28 - (%) < CD8 + CD < (abs) CD3 + CD69 + (%) CD3 + CD69 + < (abs) CD8 + CD69 + (%) CD8 + CD69 + < (abs) CD69 + (%) < <0.001 CD69 + (abs) < CD (%) <0.001 CD (abs) < TREG (%) < TREG (abs) < PDC (%) < <0.001 PDC (abs) < MDC (%) < MDC (abs) <

52 Tabulka č. 14 Analýza lineární regrese ve skupině s primární terapií HER-2 negativních žen (A-) pro druhou fázi léčby. Parametr B Signifikance R kvadrát Neopterin Lymfocyty (relativní počet) Lymfocyty (absolutní počet) CD3 + (%) CD3 + (abs) CD3 + CD4 + (%) CD3 + CD4 + (abs) CD3 + CD8 + (%) CD3 + CD8 + (abs) IRI CD8 + CD28 + (%) CD8 + CD28 + (abs) CD8 + CD28 - (%) CD8 + CD (abs) CD3 + CD69 + (%) CD3 + CD (abs) CD8 + CD69 + (%) CD8 + CD <0.001 (abs) CD69 + (%) CD69 + (abs) CD (%) CD (abs) < <0.001 TREG (%) TREG (abs) < PDC (%) < PDC (abs) MDC (%) MDC (abs)

53 Tabulka č. 15 Analýza lineární regrese ve skupině s primární terapií HER-2 pozitivních žen (A+) pro druhou fázi léčby. Parametr B Signifikance R kvadrát Neopterin Lymfocyty (relativní počet) Lymfocyty (absolutní počet) CD3 + (%) CD3 + (abs) CD3 + CD4 + (%) CD3 + CD4 + (abs) CD3 + CD8 + (%) CD3 + CD8 + (abs) IRI CD8 + CD28 + (%) CD8 + CD28 + (abs) CD8 + CD28 - (%) CD8 + CD (abs) CD3 + CD (%) CD3 + CD (abs) CD8 + CD (%) CD8 + CD (abs) CD69 + (%) CD69 + (abs) CD (%) CD (abs) < <0.001 TREG (%) TREG (abs) < PDC (%) < PDC (abs) MDC (%) MDC (abs) Grafické znázornění změn významných parametrů pomocí dash-boardů v grafech číslo lze vidět 53

54 Graf č. 14 Dash-board, skupina A, změny parametru CD3 + lymfocytů (rel) v průběhu léčby. (Na ose x jsou znázorněny dny od zahájení léčby, na ose y hodnota sledovaného parametru. Jednotlivé boxploty znázorňují rozložení sledované buněčné subpopulace v jednotlivých časových intervalech od zahájení léčby. V průměru okolo 60. dne od zahájení léčby došlo ke změně složení terapie přechod z 1. fáze na 2. fázi léčby.) 1.fáze 2.fáze 54

55 Graf č. 14 Dash-board, skupina A, změny parametru CD3 + CD8 + lymfocytů (rel) v průběhu léčby Graf č. 15 Dash-board, skupina A, změny parametru CD3 + CD4 + lymfocytů (rel) v průběhu léčby 55

56 Graf č. 16 Dash-board, skupina A, změny parametru CD8+CD28+lymfocytů (rel) v průběhu léčby Graf č. 17 Dash-board, skupina A, změny parametru CD8 + CD28 - lymfocytů (rel) v průběhu léčby 56

57 Graf č. 18 Dash-board, skupina A, změny parametru CD3 + CD69 + lymfocytů (rel) v průběhu léčby Graf č. 19 Dash-board, skupina A, změny parametru CD8 + CD69 + lymfocytů (rel) v průběhu léčby 57

58 Graf č. 20 Dash-board, skupina A, změny parametru TREG (rel) v průběhu léčby Graf č. 21 Dash-board, skupina A, změny parametru MDC (rel) v průběhu léčby 58

59 Graf č. 22 Dash-board, skupina A+, změny parametru CD3 + lymfoctů (rel) v průběhu léčby 59

60 Graf č. 23 Dash-board, skupina A+, změny parametru CD3 + CD8 + lymfocytů (rel) v průběhu léčby Graf č. 24 Dash-board, skupina A+, změny parametru CD3 + CD4 + lymfocytů (rel) v průběhu léčby 60

61 Graf č. 25 Dash-board, skupina A+, změny parametru CD8 + CD28 + lymfocytů (rel) v průběhu léčby Graf č.26 Dash board, skupina A+, změny parametru CD8 + CD28 - lymfocytů (rel) v průběhu léčby 61

62 Graf č. 27 Dash board, skupina A+, změny parametru CD3 + CD69 + lymfocytů (rel) v průběhu léčby Graf č. 28 Dash board, skupina A+, změny parametru CD8 + CD69 + lymfocytů (rel) v průběhu léčby 62

63 Graf č. 29 Dash-board, skupina A+, změny parametru TREG (rel) v průběhu léčby Graf č. 30 Dash-board, skupina A+, změny parametru MDC (rel) v průběhu léčby 63

64 č. 31 Dash-board, skupina A-, změny parametru CD3 + lymfocytů (rel) v průběhu léčby 64

65 Graf č. 32 Dash-board, skupina A-, změny parametru CD3 + CD8 + lymfocytů (rel) v průběhu léčby Graf č. 33 Dash board, skupina A-, změny parametru CD3 + CD4 + lymfocytů (rel) v průběhu léčby 65

66 Graf č. 34 Dash-board, skupina A-, změny parametru CD8 + CD28 + lymfocytů (rel) v průběhu léčby Graf č. 35 Dash-board, skupina A-, změny parametru CD8 + CD28 - lymfocytů (rel) v průběhu léčby 66

67 Graf č. 36 Dash board, skupina A-, změny parametru CD3 + CD69 + lymfocytů (rel) v průběhu léčby Graf č. 37 Dash board, skupina A-, změny parametru CD8 + CD69 + lymfocytů (rel) v průběhu léčby 67

68 Graf č. 38 Dash board, skupina A-, změny parametru TREG (rel) v průběhu léčby Graf č. 39 Dash board, skupina A-, změny parametru MDC (rel) v průběhu léčby 68

69 4.4 Lineární regresní model při sledování změn sledovaných paramerů v průběhu chemoterapie u žen s metastatickým postižením. Při použití lineárního regresního modelu pro sledování změn v průběhu podávané chemoterapie u žen s metastitckým postižením (M) byly zaznamenány jen výsledky se slabší silou výpovědní hodnoty platné pro malý podíl sledovaného souboru (tab.č 16). Jednalo se o vzestup absolutního počtu CD3 + CD4 + lymfocytů a vzestup imunoregulačního indexu. Dále zjištěné změny relativního počtu T regulačních lymfocytů, absolutního i relativního počtu plasmocytoidních dendritických buněk, absolutního počtu CD8 + CD28 + a relativního počtu CD3 - CD69 + lymfocytů se pohybovaly jen u hranice významnosti. 69

70 Tabulka č. 16 Analýza lineární regrese pro skupinu s metastatickým postižením (M). Parametr B Signifikance R kvadrát Neopterin Lymfocyty < <0.001 (relativní počet) Lymfocyty (absolutní počet) CD3 + (%) CD3 + (abs) CD3 + CD4 + (%) CD3 + CD , (abs) CD3 + CD8 + (%) CD3 + CD8 + (abs) IRI < CD8 + CD28 + (%) CD8 + CD , (abs) CD8 + CD28 - (%) CD8 + CD28 - < (abs) CD3 + CD69 + (%) CD3 + CD69 + < (abs) CD8 + CD69 + (%) CD8 + CD69 + < (abs) CD69 + (%) CD69 + (abs) < CD (%) CD (abs) < TREG (%) TREG (abs) < <0.001 PDC (%) < PDC (abs) MDC (%) < MDC (abs) < <

71 4.5. Neopterin v moči - deskriptivní statistika a regresní model ve sledovaných skupinách Ve skupině A (20 žen) byl stanoven neopterin 226 ± 112 ( ) μmol/mol kreatininu, AM ± SD (min-max) a ve skupině žen s metastatickým postižením M (6 žen) 250 ± 115 ( ) μmol/mol kreatininu. Při vzájemném porovnání obou skupin před zahájením léčby nebyl shledán statisticky významný rozdíl mezi uvedenými skupinami (p=0.429). Obdobných výsledků bylo dosaženo i po rozdělení skupiny A dle HER-2 pozitivity: skupina A+ (9 žen), 226±153 ( ) μmol/mol kreatininu, A- (11 žen), 226±71 ( ) μmol/mol kreatininu. Opět nebyly zjištěny statisticky významné rozdíly při porovnání A+ vs M (p= 0,239),A- vs. M (0,763), A+ vs. A- (p= 0,201) Neopterin v moči nebyl z technických důvodů zhodnocen u žen v kontrolní skupině. V případě sledování změn množství neopterinu v moči, vyjádřeného jako podíl neopterin v moči/ kreatininu nebyl ve všech sledovaných skupinách aplikovatelný lineární regresní model pro vysoký rozptyl získaných hodnot. Při provedení korelační analýzy nebyly zaznamenány statisticky významné korelační vztahy mezi neopterinem a žádnou sledovanou buněčnou subpopulací, jak pro relativní, tak pro absolutní hodnoty Korelační a faktorová analýza pro sledované buněčné subpoplace. Nejprve byla provedena korelační analýza. S ohledem na to, že byly zjištěny významné korelační vztahy, byla provedena faktorová analýza. Ta v případě absolutních hodnot sledovaných parametrů sloučila do jednoho faktoru celkem 10 proměnných (celkové lymfocyty, CD3 + lymfocyty, CD3 + CD4 +, CD3 + CD8 +, CD8 + CD28 +, CD8 + CD28 -, CD8 + CD69 +, CD3 + CD69 +, CD3 - CD69 + lymfocyty a TREG). Druhou skupinu tvořily subpopulace CD ,CD8 + CD69 -, CD3 - CD69 -,TREG) s méně vyjádřenými korelačními vztahy. Ve třetí skupině byly vyděleny plazmocytoidní a myeloidní buňky. Jako samostatný, nezávisle se chovající faktor byla vydělena subpopulace CD69+ lymfocytů. Jednotlivé faktorové náboje jsou znázorněny v tab č. 17. Faktorová analýza pro relativní hodnoty je zobrazena v tabulce č. 18. V případě relativního hodnot byly seřazeny sledované parametry takto: komponenta 1 CD3 + CD8 +, CD8 + CD28 +, CD8 + CD28 - lymfocyty, IRI, komponenta 2 CD3 + CD69 +, CD8 + CD69 +, CD3- CD69 + lymfocyty, komponenta 3 CD3 + lymfocyty, komponenta 4 CD4 + lymfocyty, 71

72 komponenta 5 CD69 + lymfocyty, TREG, komponenta 6 plasmocytoidní a myeloidní dendritické buňky (tab č. 18). Výsledky jsou ve shodě s fyziologickým chováním sledovaných lymfocytárních subpopulací. Tabulka č. 17 Faktorová analýza absolutní hodnoty (zobrazení faktorových nábojů v rámci jednotlivých komponent) Komponenta Lymfo 0,928-0,243 0,054 0,174 CD3 + 0,977-0,114 0,007-0,008 CD3 + CD4 + 0,841-0,282 0,046 0,004 CD3 + CD8 + 0,978 0,079 0,034 0,000 CD ,925-0,120 0,084 0,028 CD ,856 0,156 0,003-0,080 CD ,714 0,644 0,033 0,037 CD ,731 0,634-0,007 0,129 CD3 - CD69 + 0,557 0,107-0,078 0,314 Treg 0,534-0,004 0,148 0,646 MDC 0,236-0,121 0,863 0,112 PDC 0,092 0,093 0,902-0,025 CD69 + 0,346 0,087 0,021 0,834 Komponenta 1: celkové lymfocyty, CD3 + lymfocyty, CD3 + CD4 +, CD3 + CD8 +, CD8 + CD28 +, CD8 + CD28 -, CD8 + CD69 +, CD3 + CD69 +, CD3 - CD69 + lymfocyty a TREG Komponenta 2: CD ,CD8 + CD69 -, CD3 - CD69 -,TREG Komponenta 3: plazmocytoidní a myeloidní buňky. Komponenta 4: CD69 + lymfocyty 72

73 Tabulka č. 18 Faktorová analýza relativní hodnoty (zobrazení faktorových nábojů v rámci jednotlivých komponent) Komponenta CD3 + CD8 + 0,867 0,324 0,152 0,091-0,020 0,100 CD8 + CD28 + 0,567 0,213 0,663-0,043 0,009 0,161 CD8 + CD28-0,747 0,115-0,552-0,058-0,044-0,016 IRI -0,819-0, ,009-0,165-0,014 CD3 + CD69 + 0,273 0,929 0,054-0,007-0, CD3 + CD69 + 0,350 0,874 0,021 0,141 0,120 0,059 CD3 - CD69 + 0,088 0,519 0,153-0,052 0,372-0,101 CD3 + 0,348 0, ,253-0,384-0,013 CD3 + CD4 + -0,143 0,052 0,091-0,941-0,149 0,001 CD ,242 0,229-0,191 0,092 0,796 0,003 TREG 0,192-0,026 0,186-0,083 0,770 0,141 PDC 0,190 0,131 0,017 0,114 0,097 0,790 MDC -0,004 0,029 0,041-0,156 0,011 0,891 Komponenta 1 CD3 + CD8 +, CD8 + CD28 +, CD8 + CD28 - lymfocyty, IRI Komponenta 2 CD3 + CD69 +, CD8 + CD69 +, CD3 - CD69 + lymfocyty Komponenta 3 CD3 + lymfocyty Komponenta 4 CD4 + lymfocyty Komponenta 5 CD69 + lymfocyty, TREG Komponenta 6 plasmocytoidní a myeloidní dendritické buňky 73

74 4.7. Výsledky korelace CD14 + CD16 + monocytů periferní krve, močového neopterinu a rizikových faktorů aterosklerózy u nemocných léčených pro karcinom prsu Všechny hodnoty sledovaných parametrů ukazuje tab č 19. Aritmetický průměr hodnot celkového cholesterolu a LDL cholesterolu se pohybovaly nad horní hranicí normy. Hodnoty většiny dalších sledovaných parametrů oscilovaly v rámci normálního rozmezí. Kromě očekávaných korelací mezi počtem monocytů, byla pozorována signifikantní negativní korelace mezi absolutním počtem CD14 + CD16 + monocytů a sérového HDL cholesterolu (graf č. 38). Absolutní počet CD14 + CD16 + monocytů taktéž pozitivně koreloval s koncentrací sérových triacylglyceridů a tělesnou hmotností. Byla zaznamenána signifikantně pozitivní korelace mezi relativním počtem CD14 + CD16 + monocyty, sérovými triacylglyceridy a koncentrací močového NAG. S výjimkou pozitivní korelace mezi hodnotou CRP a počtem leukocytů periferní krve, nebyla zaznamenána signifikantní korelace s močovým neopterinem či mezi sérovým CRP a dalšími sledovanými parametry (tab č. 20). 74

75 Tab č. 19 Hodnoty sledovaných parametrů, počet objektů n=33. Parametr (jednotka) Průměr ± standardní odchylka Rozmezí Hmotnost (kg) 73 ± BMI (kg/m 2 ) ± Věk (roky) 57 ± Hemoglobin (g/l) 135 ± Leukocyty (10 9 /l) 5.3 ± Monocyty (%) 6 ± Absolutní počet monocytů 315 ± (buňky/ l) CD14 + CD16 + monocyty (%) 19 ± CD14 + CD16 + monocyty (MFI) 8.2 ± Absolutní počet CD14 + CD ± monocytů (buňky/ ) Celkový cholesterol (mmol/l) 6.16 ± HDL cholesterol (mmol/l) 1.65 ± LDL cholesterol (mmol/l) 3.87 ± Triglyceridy (mmol/l) 1.48 ± Lp(a) (g/l) 0.42 ± CRP (mg/l) 3 ± Homocystein (µmol/l) 12.4 ± Retinol (µmol/l) 1.47 ± Alfa-tokoferol (µmol/l) ± Neopterin vmoči (µmol/mol 203 ± creatinin) NAG vmoči ( kat/mol 11.7 ± creatinin) Průměrná hodnota IMT (mm) 0.66 ± Maximální IMT (mm) 0.73 ± MFI = mean fluorescence intensity (střední intenzita fluorescence) 75

76 Tab 20 Korelace mezi CD14 + CD16 + monocyty and laboratorními parametry rizika aterosklerózy. Spearmanovy korelační koeficienty (r s ), hladiny významnosti v závorkách. Signifikantní korelace jsou proloženy tučně. Parametr (jednotka) r s CD14 + CD16 + (%) CD14 + CD16 + (buňky/ l) Neopterin v moči (µmol/mol creatininu) CRP (mg/l) Hmotnost (kg) 0.13 (0.47) 0.38 (0.03) (0.22) 0.18 (0.31) BMI (kg/m 2 ) 0.00 (0.99) 0.28 (0.11) (0.39) 0.19 (0.31) Věk (roky) (0.38) (0.18) (0.86) 0.32 (0.07) Hemoglobin (g/l) 0.20 (0.26) 0.05 (0.80) (0.14) 0.27 (0.14) Leukocyty (10 9 /l) 0.33 (0.06) 0.16 (0.38) (0.19) 0.43 (0.01) Monocyty (%) (0.68) 0.47 (0.005) (0.71) (0.61) Absolutní počet monocytů 0.13 (0.48) (0.13) 0.21 (0.24) (buňky/ l) (<0.0001) Celkový cholesterol (mmol/l) 0.00 (0.99) (0.29) 0.23 (0.20) 0.11 (0.55) HDL cholesterol (mmol/l) (0.08) (0.001) 0.24 (0.18) 0.02 (0.92) LDL cholesterol (mmol/l) 0.09 (0.63) 0.03 (0.89) 0.13 (0.49) 0.02 (0.93) Triglyceridy (mmol/l) 0.44 (0.01) 0.43 (0.01) (0.40) 0.15 (0.40) Lp(a) (g/l) (0.59) (0.15) 0.34 (0.07) (0.70) Homocystein (µmol/l) (0.58) (0.82) (0.94) 0.12 (0.53) Retinol (µmol/l) (0.30) (0.33) 0.12 (0.52) (0.09) Alfa-tokoferol (µmol/l) (0.91) 0.09 (0.61) (0.85) (0.20) NAG vmoči ( kat/mol 0.42 (0.02) 0.20 (0.26) 0.00 (1.00) 0.02 (0.93) creatininu) Průměrná IMT (mm) (0.80) (0.08) (0.62) 0.19 (0.29) Maximální IMT (mm) (0.68) (0.09) (0.54) 0.20 (0.28) Neopterin v moči (µmol/mol (0.50) (0.08) (0.31) creatininu) CRP (mg/l) 0.34 (0.06) 0.32 (0.07) (0.31) - 76

77 HDL cholesterol (mmol/l) Graf č. 38 Korelace mezi HDL cholesterolem a absolutním počtem CD14 + CD16 + monocytů (r s = -0.54, p = 0.001). 2,5 2 1,5 1 0, CD14+CD16+ monocytes (cells/ L) 77

78 5. Diskuze 5.1. Vzájemné porovnání sledovaných skupin žen v čase nule Karcinom prsu je nejčastějším typem nádoru v ženské populaci (s výjimkou nemelanomových karcinomů kůže). Díky léčebným pokrokům (především hormonální a cílené léčbě) a včasnější diagnostice se v posledních 40letech významně zvýšilo procento vyléčených žen. Všeobecné relativní pětileté přežití se zlepšilo z 75,1% mezi lety k 90% mezi lety Nicméně v celosvětovém měřítku je karcinom prsu stále významnou příčinou morbidity i mortality [168;169]. Při léčbě nádorových onemocnění je v současné době kladen důraz na nezastupitelnou úlohu imunitního systému nemocného. Velkou výzvu tedy představuje rozvinutí takových léčebných postupů, které by minimalizovaly poškození imunitních funkcí v průběhu léčby, a naopak maximálně podporovaly imunitní pochody s protinádorovým účinkem. Vhodným nástrojem se jeví použití biologické léčby a protinádorových vakcín zejména v adjuvantních či neoadjuvantních léčebných režimech [120;121;160;161]. Bylo popsáno, že imunomodulační účinky vykazuje i řada standardně používaných chemoterapeutik, v případě karcinomu prsu i konvenčně používané léky jako je doxorubicin či paclitaxel [163]. Pro nemocné by byla nejvýhodnější vysoce individualizovaná léčba, která zohledňuje kromě dalších faktorů i imunologický status kontrétního nemocného. Opakovaně byla publikována data týkajících se systémových imunologických parametrů u nemocných s nádory. Jedná se však četně o heterogenní série případů. Naše studie se snažila maximálně homogenizovat vybrané skupiny nemocných např. na základě molekulárně biologických vlastností (exprese HER-2) a s tím související léčby. Cíleně byla vydělena skupina žen s metastatickým, která se svými charakteristikami výrazně lišila od ostaních zařazených skupin. Předchozí data získaná u žen s karcinomem prsu ukazují na řadu změn imunitního systému, které reflektují rozdílné zastoupení různých buněčných subpopulací v oblasti vlastního nádoru či nádorového lůžka [ ], dále pak v lymfatických uzlinách [51;175;176], či v periferní krvi nemocných [ ]. Změny v periferní krvi bývají méně výrazné než v oblasti vlastního nádoru, nicméně se jedná o nejlépe dostupný, a tedy i vhodný materiál pro případné rutinní vyšetřování [184]. 78

79 U žen s nově diagnostikovaným onemocněním bylo popsáno signifikantní snížení celkového počtu lymfocytů [185], zvýšení cirkulujících B lymfocytů a NK buněk v porovnání se zdravými kontrolami [186]. V periferní krvi byl nalezen taktéž zvýšený podíl paměťových CD8 + lymfocytů, CD28 - lymfocytů a snížený podíl naivních CD8 +. A naopak byl popsán zvýšený podíl CD69 +, CD14 + CD16 +, CD3 + HLADR + lymfocytů jako důkaz imunitní odpovědi organizmu vůči nádoru [ ]. Intenzita exprese molekuly CD28 může negativně korelovat se histopatologickým nálezem u karcinomu prsu[190] Pro imunosupresivní vliv nádoru směrem k hostitelskému organizmu svědčí i snížená exprese zeta-řetězců u CD8 + lymfocytů, nižší exprese CD80 a naopak výraznější exprese FAS [188]. Opakovaně byl zaznamenán i zvýšený podíl T regulačních lymfocytů v periferní krvi, jejichž podíl dále roste se stádiem onemocnění [177;191;192]. Již v počátečních fázích onemocnění bylo zaznamenáno snížení podílu myeloidních i plasmocytiodních dendritických buněk v periferní krvi. Většinou převažovaly nezralé formy DC, a ve všech případech byl zaznamenán jejich funkční deficit [70;72;73;193]. Ve sledovaném souboru žen s nově diagnostikovaným karcinomem prsu léčených neoadjuvantní léčbou a kontrolní skupinou jsme tedy v souladu s dostupnými údaji taktéž zaznamenali snížení relativního i absolutního celkového počtu lymfocytů a snížení absolutního počtu CD3 + lymfocytů. Naše skupina žen naopak vykazovala již v počátečních stádiích onemocnění známky imunosuprese ve formě snížení absolutního počtu CD3 + CD4 + lymfocytů, snížení relativního počtu CD69 + lymfocytů a současně zvýšení relativního počtu T regulačních lymfocytů. Zvýšení relativního zastoupení CD8 + CD28 + lymfocytů při současném snížení absolutního i relativního počtu CD8 + CD28 - lymfocytů by mohlo být částečně vysvětlitelné včasnou diagnostikou nádorového onemocnění, kdy antigenní stimulace nádorovými antigeny neprobíhala ještě dostatečně dlouhou dobu tak, aby docházelo ke statisticky významnému snížení exprese molekuly CD28 [15;16]. V případě karcinomu prsu byly nalezeny i rozdíly na základě dalších molekulárněbiologických charakteristik nádoru, především přítomné exprese Her-2. Muraro et al. popsal, zvýšenou přítomnost NK buněk a T regulačních lymfocytů a snížení poměru CD4 +/ CD8 + lymfocytů v periferní krvi u pacientů s Her-2 negativním typem nádoru. Naopak HER-2 pozitivní nádory vykazovaly zvýšenou CD8 + mediovanou T buněčnou odpověď in vitro vůči různým TAA-odvozeným epitopům na rozdíl od HER-2 negativních nádorů a zdravých kontrol[194]. Nám se však nepodařilo zjistit žádných statisticky významných rozdílů ve sledovaných paramerech mezi Her-2 pozitivními a negativními nemocnými v období diagnózy nádorového onemocnění, a to ani v rámci relativního zastoupení jednotlivých 79

80 subpopulací ani absolutních počtů. Počet sledovaných nemocných všal byl v našem souboru relativně nízký. Při porovnání laboratorních nálezů u pacientů s metastatickým postižením a pacientů nově diagnostikovanými, pouze lokálně pokročilými nádory, případně se skupinou zdravých osob, jsou k imunosupresi vedoucí změny vyjádřeny výrazněji. Bylo popsáno významné snížení CD4 + T lymfocytů [178;195;196]. Nejen jako výraz dlouhodobé a intenzivní antigenní stimulace pak dochází ke zvýšení podílu CD28 - T lymfocytů, které představují subpopulaci antigen specifickou, vysoce oligoklonálně expandovanou. Tyto buňky vykazují sníženou schopnost proliferovat a jsou současně zvýšeně citlivé k proaptotickým signálům [20;22]. Expanze CD8 + CD28 - bývá u metastatického karcinomu prsu spojena se zkrácením intervalu do progresivního stadia [197]. U pacientů s metastatickým rozsahem nádoru dochází dále k významnému nárůstu T regulačních lymfocytů [178;198]. Signifikantně je ovlivněna populace dendritických buněk. Myeloidní i plasmocytoidní DC jsou snížené, převažují nezralé formy, které jsou četně funkčně defektní [70;72;199]. Dané změny jsou opět intenzivněji vyjádřeny u metastatického nádoru, než v počátečních fázích nádorového procesu [200]. V souladu s dalšími autory bylo tedy i v našem souboru zaznamenáno relativní snížení CD4 + T lymfocytů a PDC. Evidentní bylo absolutní i relativní zvýšené zastoupení CD8 + CD28 - lymfocytů a zvýšený podíl exprese aktivační molekuly CD69. Všechny popisované změny byly taktéž více vyjádřeny nejen vůči kontrolní skupině, ale i vůči skupině nově diagnostikovaných žen. Molekula CD69 je řazena mezi časné aktivační molekuly. Je exprimována na leukocytech. Nicméně díky tomu, že indukuje produkci transformujícího růstvého faktoru beta (TGF β), může být její zvýšená exprese v pozdějších fázích rovněž kontraproduktivní [ ]. CD69 negativní myší modely vykazují významné autoimunitní i protinádorové působení [205;206]. Zvýšená produkce TGF β podporuje metastazování primárního nádoru [207]. Totéž bylo ověřeno i na buněčných liniích [208]. Zvýšená exprese CD69 může být tedy chápána i jako negativní prognostický markerem u nemocných s metastatickým karcinomem [209]. Zvýšená povrchová exprese molekuly CD8 v relativních hodnotách v našem souboru tak může představovat jedinou aktivní snahu organismu s protinádorovým účinkem. Z uvedených faktů vyplývá, že pozitivní imunomodulační působení protinádorové terapie je u nemocných s progresivními stádii onemocnění značně omezeno. Distribuci různých buněčných subpopulací imunitního systému je však obtížné zobecňovat pro vysokou heterogenitu. Nemocní v této fázi již podstoupili řadu léčebných postupů, které samy o sobě 80

81 mají vliv na imunitní systém, ať se již jedná o samotný chirurgický zákrok, radioterapii, chemoterapii, biologickou či hormonální léčbu [ ] Vliv neoadjuvantní a paliativní léčby na rozložení sledovaných buněčných subpopulací Systémová chemoterapie je považována za významný imunosuprimující faktor působící sekundární imunodeficienci. I přesto však již byla podána řada důkazů o tom, že vykazuje i pozitivní imunogenní vlivy s tumoricidními důsledky [214]. Ovlivňuje způsob smrti nádorové buňky, kdy v důsledku některých léčiv dochází ke zvýšené expresi povrchových molekul, které činí nádorovou buňku více viditelnou pro imunitní systém a dochází pak v nádorovém mikroprostředí k akcentované zánětlivé odpovědi [89;92-94]. V důsledku podání léků s protinádorovým účinkem dochází dále ke zvýšené expresi signalizačních molekul na efektorových buňkách imunitního systému, mimo jiné s cytotoxickým potenciálem [ ]. Lze však zaznamenat i bezprostřední vliv na produkci cytokinů [118]. Jako negativní faktor působí na druhé straně zvýraznění oxidativního stresu [109;118]. Taxany v tomto smyslu účinně modulují dendritické buňky, které po pohlcení nádorové buňky indukují významnější kostimulační interakce. Dochází ke zvýšení produkce IL-12 s následným účinnějším cytotoxickým efektem T-lymfocytů [215;216] Paclitaxel dále snižuje počet a funkceschopnost T regulačních lymfocytů [47; ]. Antracykliny indukují translokaci nitrobuněčného kalretikulinu na buněčný povrch a dále pak i uvolnění HMGB1 [220;221]. Doxorubicin podporuje změnu balance mezi Th1 a Th2 ve prospěch cytokinové produkce Th1 typu [108;222] Z dlouhodobějšího hlediska má i účinky celkové, vedoucí k urychlení senescence thymu [223]. Doxorubicin v kombinaci s paclitaxelem zvyšuje účinnost protinádorových vakcín [224]. Změny buněčných subpopulací jsou ve většině prací sledovány po podání jednoho cyklu léčby či vzájemným porovnáním dat po kontrétním počtu léčebných cyklů s hodnotami v čase 0. Naše práce je jedinečná v tom, že bylo sesbíráno velké množství komplexních dat v týdenních intervalech po celou dobu prováděné léčby a hodnoceno s přihlédnutím na časový faktor. Tím jsme se snažili eliminovat individuální i exogenní vlivy v průběhu léčby, např. komplikující infekce, či podání růstových faktorů. 81

82 Bylo publikováno, že k pozitivním změnám imunitního systému, charakteru zvýšení absolutního počtu CD3 +, CD3 + CD4 +, CD3 + CD8 + a CD8 + CD28 + lymfocytů, dochází již po podání jediného cyklu kombinované chemoterapie doxorubicin/paclitaxel [155]. Potvrdili jsme, že tyto nastolené trendy setrvávají po celou dobu fáze AC, kdy jsme zaznamenali signifikantní vzestup relativního počtu subpopoulací CD3 +, CD3 + CD8 +, CD8 + CD28 +,CD3 + CD69 + a CD8 + CD69 + lymfocytů. Dané změny byly rovněž pozorovány v obou sledovaných podskupinách tj. Her-2 pozitivních i HER-2 negativních. Dosažené výsledky tedy potvrzují zvýšený efektorový potenciál imunitního systému vůči nádoru v první fázi neoadjuvantního podání kombinace taxanů a doxorubicinu. Při použití FEC (fluorouracil, epirubicin, cyklofosfamid) v neoadjuvantním režimu bylo autory shledáno signifikantní zvýšení procenta CD3 +, CD4 +, CD8 +, CD25 + a CD3 + CD56 +, při současném snížení B lymfocytů [186;225]. Ačkoliv jsme nepozorovali v našem souboru žen s karcinomem prsu statisticky významné změny v oblasti dendritických buněk, bylo popsáno u kolorektáního karcinomu, že vlivem chirurgického zákroku a následné adjuvantní chemoterapie dochází k postupnému vyrovnávání defektu v oblasti dendritických buněk, a to i jejich počtu i jejich funkce. Nicméně se jedná o proces pozvolný, trvající několik měsíců [200]. Účinnost některých monoklonálních protilátek je založena na aktivaci imunitní odpovědi prostřednicvím na komplementu závislé cytotoxicitě, či na protilátce závislé cytotoxicitě. Dále jsou monoklonální protilátky schopny indukovat tvorbu antiidiotypových protilátek či indukovat apoptózu [119]. Klíčovým biologickým lékem u nemocných s karcinomem prsu je trastuzumab. Kromě výše uvedených účinků, však rovněž byly pozorovány i další imunologické důsledky. V průběhu léčby trastuzumabem bylo zaznamenáno zvýšení počtu s nádorem asociovaných NK buněk a změřena zvýšená produkce granzymů ve srovnání s kontrolní skupinou [120]. Dále bylo zjištěno snížení počtu T-regulačních lymfocytů a naopak navýšení produkce IL-17 [ ]. Ve sledovaném souboru v průběhu druhé fáze neoadjuvantní léčby byl u HER-2 pozitivních žen v léčebném režimu kromě paclitaxelu s event. kombinací karbolatiny navíc podáván trastuzumab. Lze předpokládat, že v důsledku dlouhodobé antigenní stimulace docházelo v průběhu této fáze ke zvyšování podílu C8 + CD28 - lymfocytů Dále docházelo k postupnému snižování relativního počtu CD3 + CD4 + lymfocytů a plasmocytiodních dendritických buněk. Snižování relativního počtu T regulačních lymfocytů v této fázi může mít za následek snížení imunosupresivních tlaků v organizmu. Dynamika množství T regulačních lymfocytů se odvíjí od léčebné odpovědi na neoadjuvantní léčbu. U nemocných s dosaženou 82

83 remisí po neoadjuvantní léčbě dochází ke statisticky významnému snížení podílu Tregs v periferní krvi, zatímco u non-responderů se jejich hladina nemění.[226]. Rozdílně se chovaly HER-2 negativní i pozitivní ženy. Zatímco u HER-2 negativních žen nebyly zjištěny statisticky významné změny rozložení jednotlivých buněčných supopulací v čase, zcela rozdílná situace byla u HER-2 pozitivních žen. Zde kromě významného zvyšování relativního i absolutního podílu CD8 + CD28 - lymfocytů byl dále pozorován vzestup aktivačního markeru CD69 a současně i pokles relativního zastoupení T regulačních lymfocytů. Tato skutečnost může taktéž potvrzovat odlišné biologické chování HER-2 pozitivních i HER-2 negativních nádorových buněk, stejně jako poukazovat na možné další působení trastuzumabu na imunitní systém organizmu. Existuje i úzký vztah mezi inhibitory angiogeneze a zintenzivněním protinádorové odpovědi organizmu. Vaskulárně-endoteliální faktor (VEGF) inhibuje diferenciaci a maturaci dendritických buněk do podoby antigen prezentujících buněk [76] a interferuje s uvolňováním progenitorových buněk s jejich následnou diferenciací do T-lymfocytů [124]. Z těchto faktů vyplývá, že inhibice VEGF pozitivně moduluje imunitní odpověď organizmu vůči nádorovým buňkám. Konkrétně u režimů, jejichž součástí je bevacizumab, bylo pozorováno zvýšení B i T buněčného kompartmentu, pravděpodobně v důsledku zlepšení funkcí dendritických buněk a opět snížení procenta T-regulačních lymfocytů [160;161;227]. V souladu s dalšími autory jsme zjistili u žen s metastatickým karcinomem prsu léčených paliativní terapií pouze mírnou tendenci k relativnímu i absolutnímu zvýšení podílu CD4 + a s tím souvisejícího imunoregulačního indexu [228;229]. Léčba zahrnující bevacizumab u nemocných s kolorektálním karcinomem může vést kromě vzestupu CD4 + taktéž k vzestupu podílu CD3 + lymfocytů [160]. Snížení T regulačních lymfocytů je u inhibitorů angiogeneze spojeno s delším přežitím u metastatického karcinomu ledviny [230]. V našem souboru jsme však tento fakt nepotvrdili. Nepodařilo se nám ani prokázat předpoklad, že v první části paliativní léčby došlo k poklesu a poté s narůstající rezistencí vůči léčbě k opětovnému vzestupu relativních hodnot TREG, jak vyjadřuje obr č. 5 Pouze u 4 žen z 10 došlo v úvodu léčby ke snížení hodnoty TREG, nicméně z grafu vyplývá, že ani u těchto žen nebylo dosaženo dlouhodobější odpovědi na léčbu v porovnání s ostatními. 83

84 Obr č. 5. Zaznamenávající relativní hodnoty TREG u jednotlivých žen s progresivním onemocněním, léčených paliativní terapií. Hodnoty pod horizontální osou zobrazují snížení vůči hodnotě v čase T0 a nad osou pak zvýšení vůči času T0. Pouze u 4 žen z 10 došlo v úvodu léčby ke snížení hodnoty TREG, nicméně z grafu vyplývá, že ani u těchto žen nebylo dosaženo dlouhodobější odpovědi na léčbu než u ostatních. 84

85 5.3. Stupeň rekonstituce imunitního systému po 3 letech U nemocných, u kterých došlo vlivem léčby k regresi nádoru a léčba byla již ukončena, lze předpokládat imunorestaurační pochody imunitního systému. Rychlost změn závisí na zvolených léčebných režimech i typu základního onemocnění [231;232]. Tyto změny jsou do určité míry limitovány í sníženou funkcí thymu v dospělém věku a jsou pravděpodobně různě intenzivní v různých kompartmentech imunitního systému [233;234]. Jedná se o dlouhodobý proces, o kterém bylo zatím publikováno jen málo dat. My jsme si položili otázku, do jaké míry změny imunitního systému vznikající v důsledku léčby přetrvávají s časovým odstupem po dosažení klinické remise základního onemocnění. V periferní krvi nemocných s anamnézou nádorového onemocnění dlouhodobě přetrvávají nádor-specifické T lymfocyty, které si i řadu let po dosažení remise zachovávají dobrý funkční potenciál [235]. Po ukončené léčbě pro karcinom prsu byla popsána řada změn především zvýšení počtu T regulačních lymfocytů a lymfopenie se snížením počtu CD4 + T lymfocytů [178]. V podskupině žen s karcinomem prsu, u kterých bylo dosaženo remise onemocnění, došlo po 3 letech od doby diagnózy ke zvýšení relativního zastoupení lymfocytů. Nadále však setrvávalo relativního snížení celkového počtu CD3 + T lymfocytů a současně i relativního počtu CD4 + T lymfocytů. Literární údaje povrzují, že po intenzivní chemoterapii dochází k dřívějšímu vzestupu CD8 + než CD4 + T lymfocytů [236]. Tyto změny pak mohou přetrvávat i déle než 1 rok [237]. Rovněž bylo zaznamenáno zvýšení absolutního počtu CD69 + T lymfocytů. Stále přetrvával trend relativního i absolutního zvýšení CD lymfocytů a naopak k snížení relativního počtu CD8 + CD28 +. Tento jev lze vysvětlit urychleným stárnutím imunitního systému, v důsledku dlouhodobé a intenzivní antigenní stimulace při vyčerpání dostatečné kapacity poolu naivních T lymfocytů. Zvyšování podílu CD8 + CD28 - T lymfocytů je přirozeným jevem v průběhu imunosenescence[238]. V důsledku různých komplikujících onemocnění, např. chronických virových (např. CMV či HIV) infekcí [239;240], autoimunitních onemocněních [241] pak dochází k urychlení tohoto procesu. Při porovnání žen bez progrese po 3 letech se zdravými kontrolami se však již tento rozdíl setřel a relativní i absolutní počty CD8 + CD28 + a CD8 + CD28- T lymfocytů již od sebe statisticky významně nelišily. Stále však přetrvávalo absolutní i relativní snížení CD3 +, CD4 + T lymfocytů. I když po ukončení léčby několik měsíců přetrvává snížení počtu a funkce 85

86 dendritických buněk [70], za 3 roky již došlo k relativnímu zvýšení jejich počtu. Nález zvýšeného podílu T regulačních lymfocytů je možno chápat jako potenciálně rizikový faktor pro rozvoj event. progrese základního onemocnění [237;242]. Z těchto důvodu by bylo zajímavé sledovat tuto skupinu i dále v čase. Nejedná se však o ojedinělý nález, kdy Baráth et al prokázali, že zvýšená hladina TREG dlouhodobě přetrvává u nemocných s dosaženou remisí karcinomu prsu i Hodgkinova lymfomu [243]. Lze tedy shrnout, že imunorestaurační pochody nebyly ani 3 roky po ukončené léčbě (s výjimkou probíhající hormonální léčby u části žen) úplné. Přetrvávala deplece celkového počtu T lymfocytů, zejména pak CD4 + T lymfocytů a zvýšení relativního podílu T regulačních lymfocytů a dendritických buněk Korelace CD14 + CD16 + monocytů periferní krve, močového neopterinu a rizikových faktorů aterosklerózy u nemocných léčených V této části práce byla zkoumána korelace mezi počtem CD14 + CD16 + monocytů periferní krve a panelem vybraných laboratorních ukazatelů predikujících riziko aterosklerózy, včetně parametrů lipidového metabolizmu, zánětlivé odpovědi, antioxidantů, ledvinné dysfunkce či IMT. V souladu s již publikovanými pracemi naše data potvrdila asociaci mezi počtem CD14 + CD16 + periferní krve a koncentrací lipidů [150;151;244]. Všeobecně je přijímáno, že ateroskleróza představuje zánětlivý proces [245]. Zvýšená hladina sérového CRP, jako součást systémové prozánětlivé odpovědi organizmu v průběhu chronické infekce, hraje důležitou úlohu v progresi aterosklerózy. CRP je zvýšeno nejen u nemocných s pokročilými stádii nádorových onemocnění, ale i u nemocných s aterosklerózou. V řadě studií je prokázáno, že hodnota CRP predikuje riziko kardiovaskulárních příhod [152; ]. Obdobná asociace byla pozorována i v případě neopterinu [157;158]. Zvýšená koncentrace neopterinu byla zaznamenána u nemocných s infarktem myokardu [249] a navíc predikovala zvýšenou mortalitu nejen z kardiovaskulárních příčin [157;250]. Vysoká koncentrace neopterinu v séru byla taktéž popsána u starších osob [250]. Zánětlivá odpověď organizmu u nemocných s nádory korespondovala se zvýšeným počtem CD14 + CD16 + monocytů. Získaná data podporují hypotézu, že se na akcentované ateroskleróze může u nemocných s nádory spoluuplatňovat i systémová zánětlivá odpověď spojená s nádorem jako takovým. Z předchozích studií byla publikována korelace mezi parametry lipidového metabolizmu a CD14 + CD16 + monocyty ve vztahu k aterogenezi [150]. Zajímavý je fakt, že léčba statiny zvyšují zastoupení CD14 dim CD16 + monocytů v periferní krvi [151]. V jiné 86

87 studii počet CD14 + CD16 + monocytů se nelišil mezi nemocnými s diabetem, ať již s či bez kardiovaskulárních komplikací, a zdravými kontrolami. Intenzita exprese povrchového znaku CD14 však byla významně zvýšená u nemocných v porovnání se zdravými kontrolami [251]. Cirkulující CD14 antigen byl nalezen ve zvýšené míře u nemocných s onemocnění koronárních tepen ve srovnání se zdravými kontrolami a navíc pozitivně koreloval s LDL cholesterolem a negativně s HDL cholesterolem [252]. Neopterin představuje indikátor aktivace makrofágů. U nemocných s nádory různého primárního původu je jeho sérová i močová koncentrace spojena s horší prognózou [137;159]. Byla pozorována korelace mezi nízkým počtem či zhoršenou funkcí lymfocytů a dendritických buněk a koncentrací neopterinu [187; ]. V naší studii nebyla pozorována korelace mezi neopterinem v moči a počtem CD14 + CD16 + monocytů periferní krve či rizikovými faktory aterosklerózy. Jedním z možných ovlivňujících faktorů byl i nízký počet účastníků ve studii. 87

88 6. Závěry: Popsali jsme, že se iiž v období diagnózy karcinomu prsu statisticky významně od sebe liší rozložení sledovaných lymfocytárních subpopulací v periferní krvi oproti zdravým probandům. Jednalo se především o celkovou lymfopenii a CD4 + lymfopenii. Přítomny byly i další změny potenciálně přispívající ke snížení protinádorové odpovědi organizmu ve formě zvýšeného zastoupení relativního počtu T regulačních lymfocytů a snížení exprese povrchové molekuly CD69 +. V našem souboru jsme nenalezli statisticky významné rozdíly mezi ženami s, či bez exprese nádorového antigenu HER-2. Potvrdili jsme, že u žen s metastatickým postižením, byly tyto změny vyjádřeny intenzivněji, zejména dalším prohloubením CD4 + lymfopenie, snížení relativního počtu plasmocytoidních dendritických buněk a snížení exprese molekuly CD28 na periferních lymfocytech. V průběhu podávání léčby docházelo v čase k dalšímu vývoji rozložení sledovaných buněčných subpopulací. U žen s podávanou neoadjuvantní léčbou docházelo v první části léčby k potenciálně pozitivním změnám ve formě zvyšování zastoupení CD3 + T lymfocytů se zvýšenou povrchovou expresí molekul CD8, CD28 a CD69 v periferní krvi a snížení počtu T- regulačních lymfocytů. Nepozorovali jsme však zmírnění CD4 lymfopenie, charakteristického znaku nemocných s nádory. Stejně tak zvýšení exprese molekuly CD28 bylo pouze přechodné a provázelo jen první část neoadjuvantní léčby. V druhé části léčby naopak docházelo ke snižování její exprese. U žen s metastatickým postižením nebyly až na mírnou tendenci ke zvyšování relativního i absolutního počtu CD4 + lymfocytů zaznamenány statisticky významné změny v čase. Výsledky však vykazují nižší sílu, protože se jednalo o poměrně malou skupinu pacientů s vysokým rozptylem zíkaných hodnot. Ve skupině žen s nově diagnostikovaným karcinomem prsu, u kterých bylo dosaženo remise onemocnění, nedošlo ani po třech letech k plnému vyrovnání nálezů vůči zdravým kontrolám. I nadále přetrvávalo snížení počtu CD4 + T lymfocytů v periferní krvi, snížení exprese molekuly CD28 a zvýšené zastoupení T regulačních lymfocytů. Z toho lze usuzovat, že změny navozené přítomností nádoru a podávané léčby jsou dlouhodobého charakteru. V poslední části práce byla popsána asociace mezi počtem CD14 + CD16 + monocytů periferní krve a lipidovým metabolizmem u nemocných s karcinomem prsu. Zánětlivá odpověď organizmu vede ke zvýšení CD14 + CD16 + monocytů. Data otevírají možnost, že 88

89 systémová zánětlivá odpověď spojená s nádorem může být zahrnuta v procesu aterogeneze u těchto nemocných. Nebyla však pozorována žádná korelace mezi počtem CD14 + CD16 + monocytů periferní krve a koncentrací neopterinu v moči. 89

90 7. Seznam literatury [1] Burnet FM: The concept of immunological surveillance. Prog Exp Tumor Res 1970;13:1-27. [2] Dunn GP, Old LJ, Schreiber RD: The three Es of cancer immunoediting. Annu Rev Immunol 2004;22: [3] Vicente-Duenas C, Romero-Camarero I, Cobaleda C, Sanchez-Garcia I: Function of oncogenes in cancer development: a changing paradigm. EMBO J 2013;32: [4] Spíšek R, Kocián P, Rožková D: Imunitní systém a kontrola nádorového bujení. Postgraduální Medicína 2009;11: [5] Ramos RN, de Moraes CJ, Zelante B, Barbuto JA: What are the molecules involved in regulatory T-cells induction by dendritic cells in cancer? Clin Dev Immunol 2013;2013: [6] Riha P, Rudd CE: CD28 co-signaling in the adaptive immune response. Self Nonself 2010;1: [7] Marzio R, Mauel J, Betz-Corradin S: CD69 and regulation of the immune function. Immunopharmacol Immunotoxicol 1999;21: [8] Krejsek J, Kopecky O: Klinická imunologie, ed 1. Hradec Králové, NUCLEUS, [9] Hořejší, V. and Bartůňková, J.:Základy imunologie. ed. 2, Praha, TRITON, 2009 [10] Ham M, Moon A: Inflammatory and microenvironmental factors involved in breast cancer progression. Arch Pharm Res 2013;36: [11] Mauge L, Terme M, Tartour E, Helley D: Control of the adaptive immune response by tumor vasculature. Front Oncol 2014;4:61. 90

91 [12] Gross S, Walden P: Immunosuppressive mechanisms in human tumors: why we still cannot cure cancer. Immunol Lett 2008;116:7-14. [13] Mahmoud SM, Paish EC, Powe DG, Macmillan RD, Grainge MJ, Lee AH, Ellis IO, Green AR: Tumor-infiltrating CD8+ lymphocytes predict clinical outcome in breast cancer. J Clin Oncol 2011;29: [14] Coleman S, Clayton A, Mason MD, Jasani B, Adams M, Tabi Z: Recovery of CD8+ T-cell function during systemic chemotherapy in advanced ovarian cancer. Cancer Res 2005;65: [15] Dock JN, Effros RB: Role of CD8 T Cell replicative senescence in human aging and in HIV-mediated immunosenescence. Aging Dis 2011;2: [16] Vivar N, Ruffin N, Sammicheli S, Hejdeman B, Rethi B, Chiodi F: Survival and proliferation o CD28- T cells during HIV-1 infection relate to the amplitude of viral replication.. J Infect Dis 2011;203: [17] Zhang H, Meadows GG: Chronic alcohol consumption in mice increases the proportion of peripheral memory T cells by homeostatic proliferation. J Leukoc Biol 2005;78: [18] Macedo MF, Porto G, Costa M, Vieira CP, Rocha B, Cruz E: Low numbers of CD8+ T lymphocytes in hereditary haemochromatosis are explained by a decrease of the most mature CD8+ effector memory T cells. Clin Exp Immunol 2010;159: [19] Chen L: Co-inhibitory molecules of the B7-CD28 family in the control of T-cell immunity. Nat Rev Immunol 2004;4: [20] Strioga M, Pasukoniene V, Characiejus D: CD8+CD28- and CD8+CD57+ T cells and their role in health and disease. Immunology 2011;134: [21] Schiott A, Lindstedt M, Johansson-Lindbom B, Roggen E, Borrebaeck CA:CS27- CD4+ T cells define a differentiated memory population at both te functional and trascriptional levels. Immunology 2004;113:

92 [22] Le PY, Puthier D, Lecureuil C, Combadiere C, Debre P, Nguyen C, Combadiere B: High cytotoxic and specific migratory potencies of senescent CD8+ CD57+ cells in HIV-infected and uninfected individuals. J Immunol 2006;177: [23] Sada-Ovalle I, Torre-Bouscoulet L, Valdez-Vazquez R, Martinez-Cairo S, Zenteno E, Lascurain R: Characterization of a cytotoxic CD57+ T cell subset from patients with pulmonary tuberculosis. Clin Immunol 2006;121: [24] Eylar EH, Lefranc CE, Yamamura Y, Baez I, Colon-Martinez SL, Rodriguez N, Breithaupt TB: HIV infection and aging: enhanced Interferon- and Tumor Necrosis Factor-alpha production by the CD8+. BMC Immunol 2001;2:10. [25] Wu RC, Liu S, Chacon JA, Wu S, Li Y, Sukhumalchandra P, Murray JL, Molldrem JJ, Hwu P, Pircher H, Lizee G, Radvanyi LG: Detection and characterization of a novel subset of CD8(+)CD57(+) T cells in metastatic melanoma with an incompletely differentiated phenotype. Clin Cancer Res 2012;18: [26] Suciu-Foca N, Manavalan JS, Scotto L, Kim-Schulze S, Galluzzo S, Naiyer AJ, Fan J, Vlad G, Cortesini R: Molecular characterization of allospecific T suppressor and tolerogenic dendritic cells: review. Int Immunopharmacol 2005;5:7-11. [27] Arosa FA: CD8+CD28+ T-cells: Certainties and uncertainties of a prevalent human T-cell subset.. Immunol Cell Biol 2002;80:1-13. [28] Kelsen J, Agnholt J, Hoffmann HJ, Romer JL, Hvas CL, Dahlerup JF: FoxP3(+)CD4(+)CD25(+) T cells with regulatory properties can be cultured from colonic mucosa of patients with Crohn's disease. Clin Exp Immunol 2005;141: [29] Jiang S, Lechler RI, He XS, Huang JF: Regulatory T cells and transplantation tolerance. Hum Immunol 2006;67: [30] Ling EM, Smith T, Nguyen XD, Pridgeon C, Dallman M, Arbery J, Carr VA, Robinson DS: Relation of CD4+CD25+ regulatory T-cell suppression of allergendriven T-cell activation to atopic status and expression of allergic disease. Lancet 2004;363:

93 [31] Teng MW, Swann JB, von SB, Sharkey J, Zerafa N, McLaughlin N, Yamaguchi T, Sakaguchi S, Darcy PK, Smyth MJ: Multiple antitumor mechanisms downstream of prophylactic regulatory T-cell depletion. Cancer Res 2010;70: [32] Sakaguchi S: The origin of FOXP3-expressing CD4+ regulatory T cells: thymus or periphery. J Clin Invest 2003;112: [33] Sakaguchi S, Hori S, Fukui Y, Sasazuki T, Sakaguchi N, Takahashi T: Thymic generation and selection of CD25+CD4+ regulatory T cells: implications of their broad repertoire and high self-reactivity for the maintenance of immunological selftolerance. Novartis Found Symp 2003;252:6-16. [34] Sakaguchi S: Recent advances in animal models of autoimmune disease. Nihon Rinsho 1997;55: [35] Darrasse-Jeze G, Marodon G, Salomon BL, Catala M, Klatzmann D: Ontogeny of CD4+CD25+ regulatory/suppressor T cells in human fetuses. Blood 2005;105: [36] Gregg R, Smith CM, Clark FJ, Dunnion D, Khan N, Chakraverty R, Nayak L, Moss PA: The number of human peripheral blood CD4+ CD25high regulatory T cells increases with age. Clin Exp Immunol 2005;140: [37] Barzaghi F, Passerini L, Bacchetta R: Immune dysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy, x-linked syndrome: a paradigm of immunodeficiency with autoimmunity. Front Immunol 2012;3:211. [38] Perrone G, Ruffini PA, Catalano V, Spino C, Santini D, Muretto P, Spoto C, Zingaretti C, Sisti V, Alessandroni P, Giordani P, Cicetti A, D'Emidio S, Morini S, Ruzzo A, Magnani M, Tonini G, Rabitti C, Graziano F: Intratumoural FOXP3- positive regulatory T cells are associated with adverse prognosis in radically resected gastric cancer. Eur J Cancer 2008;44: [39] Wang RF: CD8+ regulatory T cells, their suppressive mechanisms, and regulation in cancer. Hum Immunol 2008;69:

94 [40] Piersma SJ, Welters MJ, van der Burg SH: Tumor-specific regulatory T cells in cancer patients. Hum Immunol 2008;69: [41] Szajnik M, Czystowska M, Szczepanski MJ, Mandapathil M, Whiteside TL: Tumorderived microvesicles induce, expand and up-regulate biological activities of human regulatory T cells (Treg). PLoS One 2010;5:e [42] Guiducci C, Vicari AP, Sangaletti S, Trinchieri G, Colombo MP: Redirecting in vivo elicited tumor infiltrating macrophages and dendritic cells towards tumor rejection. Cancer Res 2005;65: [43] Chen YQ, Shi HZ, Qin XJ, Mo WN, Liang XD, Huang ZX, Yang HB, Wu C: CD4+CD25+ regulatory T lymphocytes in malignant pleural effusion. Am J Respir Crit Care Med 2005;172: [44] Miller AM, Lundberg K, Ozenci V, Banham AH, Hellstrom M, Egevad L, Pisa P: CD4+CD25high T cells are enriched in the tumor and peripheral blood of prostate cancer patients. J Immunol 2006;177: [45] Yang XH, Yamagiwa S, Ichida T, Matsuda Y, Sugahara S, Watanabe H, Sato Y, Abo T, Horwitz DA, Aoyagi Y: Increase of CD4+ CD25+ regulatory T-cells in the liver of patients with hepatocellular carcinoma. J Hepatol 2006;45: [46] Liu F, Lang R, Zhao J, Zhang X, Pringle GA, Fan Y, Yin D, Gu F, Yao Z, Fu L: CD8(+) cytotoxic T cell and FOXP3(+) regulatory T cell infiltration in relation to breast cancer survival and molecular subtypes. Breast Cancer Res Treat 2011;130: [47] Liu F, Li Y, Ren M, Zhang X, Guo X, Lang R, Gu F, Fu L: Peritumoral FOXP3(+) regulatory T cell is sensitive to chemotherapy while intratumoral FOXP3(+) regulatory T cell is prognostic predictor of breast cancer patients. Breast Cancer Res Treat 2012;135: [48] Ladoire S, Arnould L, Apetoh L, Coudert B, Martin F, Chauffert B, Fumoleau P, Ghiringhelli F: Pathologic complete response to neoadjuvant chemotherapy of breast carcinoma is associated with the disappearance of tumor-infiltrating foxp3+ regulatory T cells. Clin Cancer Res 2008;14:

95 [49] Kim ST, Jeong H, Woo OH, Seo JH, Kim A, Lee ES, Shin SW, Kim YH, Kim JS, Park KH: Tumor-infiltrating Lymphocytes, Tumor Characteristics, and Recurrence in Patients With Early Breast Cancer. Am J Clin Oncol [50] Mansfield AS, Heikkila P, von SK, Vakkila J, Leidenius M: Metastasis to sentinel lymph nodes in breast cancer is associated with maturation arrest of dendritic cells and poor co-localization of dendritic cells and CD8+ T cells. Virchows Arch 2011;459: [51] Nakamura R, Sakakibara M, Nagashima T, Sangai T, Arai M, Fujimori T, Takano S, Shida T, Nakatani Y, Miyazaki M: Accumulation of regulatory T cells in sentinel lymph nodes is a prognostic predictor in patients with node-negative breast cancer. Eur J Cancer 2009;45: [52] Ziegler SF, Buckner JH: FOXP3 and the regulation of Treg/Th17 differentiation. Microbes Infect 2009;11: [53] Sallusto F, Lanzavecchia A: Human Th17 cells in infection and autoimmunity. Microbes Infect 2009;11: [54] Holland SM, DeLeo FR, Elloumi HZ, Hsu AP, Uzel G, Brodsky N, Freeman AF, Demidowich A, Davis J, Turner ML, Anderson VL, Darnell DN, Welch PA, Kuhns DB, Frucht DM, Malech HL, Gallin JI, Kobayashi SD, Whitney AR, Voyich JM, Musser JM, Woellner C, Schaffer AA, Puck JM, Grimbacher B: STAT3 mutations in the hyper-ige syndrome. N Engl J Med 2007;357: [55] Ochs HD, Oukka M, Torgerson TR: TH17 cells and regulatory T cells in primary immunodeficiency diseases. J Allergy Clin Immunol 2009;123: [56] Iwakura Y, Ishigame H, Saijo S, Nakae S: Functional specialization of interleukin- 17 family members. Immunity 2011;34: [57] Du JW, Xu KY, Fang LY, Qi XL: Interleukin-17, produced by lymphocytes, promotes tumor growth and angiogenesis in a mouse model of breast cancer. Mol Med Report 2012;6:

96 [58] Hou F, Li Z, Ma D, Zhang W, Zhang Y, Zhang T, Kong B, Cui B: Distribution of Th17 cells and Foxp3-expressing T cells in tumor-infiltrating lymphocytes in patients with uterine cervical cancer. Clin Chim Acta 2012;413: [59] Du JW, Xu KY, Fang LY, Qi XL: Interleukin-17, produced by lymphocytes, promotes tumor growth and angiogenesis in a mouse model of breast cancer. Mol Med Rep 2012;6: [60] Yang L, Qi Y, Hu J, Tang L, Zhao S, Shan B: Expression of Th17 cells in breast cancer tissue and its association with clinical parameters. Cell Biochem Biophys 2012;62: [61] Wang J, Cai D, Ma B, Wu G, Wu J: Skewing the balance of regulatory T-cells and T-helper 17 cells in breast cancer patients. J Int Med Res 2011;39: [62] Maruyama T, Kono K, Mizukami Y, Kawaguchi Y, Mimura K, Watanabe M, Izawa S, Fujii H: Distribution of Th17 cells and FoxP3(+) regulatory T cells in tumorinfiltrating lymphocytes, tumor-draining lymph nodes and peripheral blood lymphocytes in patients with gastric cancer. Cancer Sci 2010;101: [63] Zhang B, Rong G, Wei H, Zhang M, Bi J, Ma L, Xue X, Wei G, Liu X, Fang G: The prevalence of Th17 cells in patients with gastric cancer. Biochem Biophys Res Commun 2008;374: [64] Terabe M, Berzofsky JA: NKT cells in immunoregulation of tumor immunity: a new immunoregulatory axis. Trends Immunol 2007;28: [65] Kaisho T: Pathogen sensors and chemokine receptors in dendritic cell subsets. Vaccine [66] Jegalian AG, Facchetti F, Jaffe ES: Plasmacytoid dendritic cells: physiologic roles and pathologic states. Adv Anat Pathol 2009;16: [67] Szabo G, Dolganiuc A: The role of plasmacytoid dendritic cell-derived IFN alpha in antiviral immunity. Crit Rev Immunol 2008;28: [68] Hellman P, Eriksson H: Early activation markers of human peripheral dendritic cells. Hum Immunol 2007;68:

97 [69] Bennaceur K, Chapman J, Brikci-Nigassa L, Sanhadji K, Touraine JL, Portoukalian J: Dendritic cells dysfunction in tumour environment. Cancer Lett 2008;272: [70] Pinzon-Charry A, Ho CS, Maxwell T, McGuckin MA, Schmidt C, Furnival C, Pyke CM, Lopez JA: Numerical and functional defects of blood dendritic cells in earlyand late-stage breast cancer. Br J Cancer 2007;97: [71] Pinzon-Charry A, Ho CS, Laherty R, Maxwell T, Walker D, Gardiner RA, O'Connor L, Pyke C, Schmidt C, Furnival C, Lopez JA: A population of HLA-DR+ immature cells accumulates in the blood dendritic cell compartment of patients with different types of cancer. Neoplasia 2005;7: [72] Wojas K, Tabarkiewicz J, Jankiewicz M, Rolinski J: Dendritic cells in peripheral blood of patients with breast and lung cancer--a pilot study. Folia Histochem Cytobiol 2004;42: [73] Almand B, Resser JR, Lindman B, Nadaf S, Clark JI, Kwon ED, Carbone DP, Gabrilovich DI: Clinical significance of defective dendritic cell differentiation in cancer. Clin Cancer Res 2000;6: [74] Gabrilovich DI, Corak J, Ciernik IF, Kavanaugh D, Carbone DP: Decreased antigen presentation by dendritic cells in patients with breast cancer. Clin Cancer Res 1997;3: [75] Verra N, de JD, Bex A, Batchelor D, Dellemijn T, Sein J, Nooijen W, Meinhardt W, Horenblas S, de GG, Vyth-Dreese F: Infiltration of activated dendritic cells and T cells in renal cell carcinoma following combined cytokine immunotherapy. Eur Urol 2005;48: [76] Gabrilovich DI, Ishida T, Nadaf S, Ohm JE, Carbone DP: Antibodies to vascular endothelial growth factor enhance the efficacy of cancer immunotherapy by improving endogenous dendritic cell function. Clin Cancer Res 1999;5: [77] Riabov V, Gudima A, Wang N, Mickley A, Orekhov A, Kzhyshkowska J: Role of tumor associated macrophages in tumor angiogenesis and lymphangiogenesis. Front Physiol 2014;5:75. 97

98 [78] Talvensaari-Mattila A, Paakko P, Blanco-Sequeiros G, Turpeenniemi-Hujanen T: Matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) is associated with the risk for a relapse in postmenopausal patients with node-positive breast carcinoma treated with antiestrogen adjuvant therapy. Breast Cancer Res Treat 2001;65: [79] Wu ZS, Wu Q, Yang JH, Wang HQ, Ding XD, Yang F, Xu XC: Prognostic significance of MMP-9 and TIMP-1 serum and tissue expression in breast cancer. Int J Cancer 2008;122: [80] Ruffell B, Affara NI, Coussens LM: Differential macrophage programming in the tumor microenvironment. Trends Immunol 2012;33: [81] Laoui D, Movahedi K, Van OE, Van den Bossche J, Schouppe E, Mommer C, Nikolaou A, Morias Y, De BP, Van Ginderachter JA: Tumor-associated macrophages in breast cancer: distinct subsets, distinct functions. Int J Dev Biol 2011;55: [82] Allavena P, Sica A, Solinas G, Porta C, Mantovani A: The inflammatory microenvironment in tumor progression: the role of tumor-associated macrophages. Crit Rev Oncol Hematol 2008;66:1-9. [83] Fukuda K, Kobayashi A, Watabe K: The role of tumor-associated macrophage in tumor progression. Front Biosci (Schol Ed) 2012;4: [84] Zhang GJ, Adachi I: Serum interleukin-6 levels correlate to tumor progression and prognosis in metastatic breast carcinoma. Anticancer Res 1999;19: [85] Lewis CE, Pollard JW: Distinct role of macrophages in different tumor microenvironments. Cancer Res 2006;66: [86] Pollard JW: Macrophages define the invasive microenvironment in breast cancer. J Leukoc Biol 2008;84: [87] Leek RD, Lewis CE, Whitehouse R, Greenall M, Clarke J, Harris AL: Association of macrophage infiltration with angiogenesis and prognosis in invasive breast carcinoma. Cancer Res 1996;56:

99 [88] de Bruin EC, Medema JP: Apoptosis and non-apoptotic deaths in cancer development and treatment response. Cancer Treat Rev 2008;34: [89] Schmitz I, Kirchhoff S, Krammer PH: Regulation of death receptor-mediated apoptosis pathways. Int J Biochem Cell Biol 2000;32: [90] Okada H, Mak TW: Pathways of apoptotic and non-apoptotic death in tumour cells. Nat Rev Cancer 2004;4: [91] Chen N, Karantza-Wadsworth V: Role and regulation of autophagy in cancer. Biochim Biophys Acta 2009;1793: [92] Haynes NM, van der Most RG, Lake RA, Smyth MJ: Immunogenic anti-cancer chemotherapy as an emerging concept. Curr Opin Immunol 2008;20: [93] Gelebart P, Opas M, Michalak M: Calreticulin, a Ca2+-binding chaperone of the endoplasmic reticulum. Int J Biochem Cell Biol 2005;37: [94] Liu N, Zheng Y, Zhu Y, Xiong S, Chu Y: Selective impairment of CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cells by paclitaxel is explained by Bcl-2/Bax mediated apoptosis. Int Immunopharmacol 2011;11: [95] Ciocca DR, Calderwood SK: Heat shock proteins in cancer: diagnostic, prognostic, predictive, and treatment implications. Cell Stress Chaperones 2005;10: [96] Campana L, Bosurgi L, Rovere-Querini P: HMGB1: a two-headed signal regulating tumor progression and immunity. Curr Opin Immunol 2008;20: [97] Lacroix M, Toillon RA, Leclercq G: p53 and breast cancer, an update. Endocr Relat Cancer 2006;13: [98] Ge Y, Domschke C, Stoiber N, Schott S, Heil J, Rom J, Blumenstein M, Thum J, Sohn C, Schneeweiss A, Beckhove P, Schuetz F: Metronomic cyclophosphamide treatment in metastasized breast cancer patients: immunological effects and clinical outcome. Cancer Immunol Immunother 2012;61: [99] Masci G, Losurdo A, Gandini C, Garassino I, di TL, Torrisi R, Zuradelli M, Santoro A: Low-dose "metronomic chemotherapy" with oral cyclophosphamide and 99

100 methotrexate in metastatic breast cancer: a case report of extraordinarily prolonged clinical benefit. Ecancermedicalscience 2012;6:275. [100] Montagna E, Cancello G, Bagnardi V, Pastrello D, Dellapasqua S, Perri G, Viale G, Veronesi P, Luini A, Intra M, Calleri A, Rampinelli C, Goldhirsch A, Bertolini F, Colleoni M: Metronomic chemotherapy combined with bevacizumab and erlotinib in patients with metastatic HER2-negative breast cancer: clinical and biological activity. Clin Breast Cancer 2012;12: [101] Soriano JL, Batista N, Santiesteban E, Lima M, Gonzalez J, Garcia R, Zarza Y, Lopez MV, Rodriguez M, Loys JL, Montejo N, Aguirre F, Macias A, Vazquez AM: Metronomic Cyclophosphamide and Methotrexate Chemotherapy Combined with 1E10 Anti-Idiotype Vaccine in Metastatic Breast Cancer. Int J Breast Cancer 2011;2011: [102] Licchetta A, Correale P, Migali C, Remondo C, Francini E, Pascucci A, Magliocca A, Guarnieri A, Savelli V, Piccolomini A, Carli AF, Francini G: Oral metronomic chemo-hormonal-therapy of metastatic breast cancer with cyclophosphamide and megestrol acetate. J Chemother 2010;22: [103] Garcia-Saenz JA, Martin M, Calles A, Bueno C, Rodriguez L, Bobokova J, Custodio A, Casado A, Diaz-Rubio E: Bevacizumab in combination with metronomic chemotherapy in patients with anthracycline- and taxane-refractory breast cancer. J Chemother 2008;20: [104] Audia S, Nicolas A, Cathelin D, Larmonier N, Ferrand C, Foucher P, Fanton A, Bergoin E, Maynadie M, Arnould L, Bateman A, Lorcerie B, Solary E, Chauffert B, Bonnotte B: Increase of CD4+ CD25+ regulatory T cells in the peripheral blood of patients with metastatic carcinoma: a Phase I clinical trial using cyclophosphamide and immunotherapy to eliminate CD4+ CD25+ T lymphocytes. Clin Exp Immunol 2007;150: [105] Backus HH, Dukers DF, van Groeningen CJ, Vos W, Bloemena E, Wouters D, van Riel JM, Smid K, Giaccone G, Pinedo HM, Peters GJ: 5-Fluorouracil induced Fas upregulation associated with apoptosis in liver metastases of colorectal cancer patients. Ann Oncol 2001;12:

101 [106] Suzuki E, Kapoor V, Jassar AS, Kaiser LR, Albelda SM: Gemcitabine selectively eliminates splenic Gr-1+/CD11b+ myeloid suppressor cells in tumor-bearing animals and enhances antitumor immune activity. Clin Cancer Res 2005;11: [107] Nowak AK, Robinson BW, Lake RA: Gemcitabine exerts a selective effect on the humoral immune response: implications for combination chemo-immunotherapy. Cancer Res 2002;62: [108] Santos RV, Caperuto EC, de Mello MT, Rosa LF: Effect of doxorubicin on cytokine production by lymphocytes and the Th1/Th2 balance. Biomed Pharmacother 2010;64: [109] Panis C, Herrera AC, Victorino VJ, Campos FC, Freitas LF, De RT, Colado Simao AN, Cecchini AL, Cecchini R: Oxidative stress and hematological profiles of advanced breast cancer patients subjected to paclitaxel or doxorubicin chemotherapy. Breast Cancer Res Treat 2012;133: [110] Khallouf H, Marten A, Serba S, Teichgraber V, Buchler MW, Jager D, Schmidt J: 5- Fluorouracil and interferon-alpha immunochemotherapy enhances immunogenicity of murine pancreatic cancer through upregulation of NKG2D ligands and MHC class I. J Immunother 2012;35: [111] Aresvik DM, Pettersen RD, Abrahamsen TG, Wright MS: 5-fluorouracil-induced death of Jurkat T-cells--a role for caspases and MCL-1. Anticancer Res 2010;30: [112] Plate JM, Plate AE, Shott S, Bograd S, Harris JE: Effect of gemcitabine on immune cells in subjects with adenocarcinoma of the pancreas. Cancer Immunol Immunother 2005;54: [113] Manthey CL, Perera PY, Salkowski CA, Vogel SN: Taxol provides a second signal for murine macrophage tumoricidal activity. J Immunol 1994;152: [114] Brignone C, Gutierrez M, Mefti F, Brain E, Jarcau R, Cvitkovic F, Bousetta N, Medioni J, Gligorov J, Grygar C, Marcu M, Triebel F: First-line chemoimmunotherapy in metastatic breast carcinoma: combination of paclitaxel and 101

102 IMP321 (LAG-3Ig) enhances immune responses and antitumor activity. J Transl Med 2010;8:71. [115] Denkert C, Darb-Esfahani S, Loibl S, Anagnostopoulos I, Johrens K: Anti-cancer immune response mechanisms in neoadjuvant and targeted therapy. Semin Immunopathol 2011;33: [116] Galetto A, Buttiglieri S, Forno S, Moro F, Mussa A, Matera L: Drug- and cellmediated antitumor cytotoxicities modulate cross-presentation of tumor antigens by myeloid dendritic cells. Anticancer Drugs 2003;14: [117] Bergmann-Leitner ES, Abrams SI: Treatment of human colon carcinoma cell lines with anti-neoplastic agents enhances their lytic sensitivity to antigen-specific CD8+ cytotoxic T lymphocytes. Cancer Immunol Immunother 2001;50: [118] Panis C, Lemos LG, Victorino VJ, Herrera AC, Campos FC, Colado Simao AN, Pinge-Filho P, Cecchini AL, Cecchini R: Immunological effects of taxol and adryamicin in breast cancer patients. Cancer Immunol Immunother 2012;61: [119] Congy-Jolivet N, Probst A, Watier H, Thibault G: Recombinant therapeutic monoclonal antibodies: mechanisms of action in relation to structural and functional duality. Crit Rev Oncol Hematol 2007;64: [120] Arnould L, Gelly M, Penault-Llorca F, Benoit L, Bonnetain F, Migeon C, Cabaret V, Fermeaux V, Bertheau P, Garnier J, Jeannin JF, Coudert B: Trastuzumab-based treatment of HER2-positive breast cancer: an antibody-dependent cellular cytotoxicity mechanism? Br J Cancer 2006;94: [121] Horlock C, Stott B, Dyson PJ, Morishita M, Coombes RC, Savage P, Stebbing J: The effects of trastuzumab on the CD4+CD25+FoxP3+ and CD4+IL17A+ T-cell axis in patients with breast cancer. Br J Cancer 2009;100: [122] Perez SA, Karamouzis MV, Skarlos DV, Ardavanis A, Sotiriadou NN, Iliopoulou EG, Salagianni ML, Orphanos G, Baxevanis CN, Rigatos G, Papamichail M: CD4+CD25+ regulatory T-cell frequency in HER-2/neu (HER)-positive and HER- 102

103 negative advanced-stage breast cancer patients. Clin Cancer Res 2007;13: [123] Slavina EG, Chertkova AI, Zabotina TN, Gan'shina IP, Lichinitser MR: Variations in the number of regulatory T cells (CD4+CD25+) in patients with breast cancer during herceptin therapy. Bull Exp Biol Med 2006;141: [124] Ohm JE, Gabrilovich DI, Sempowski GD, Kisseleva E, Parman KS, Nadaf S, Carbone DP: VEGF inhibits T-cell development and may contribute to tumorinduced immune suppression. Blood 2003;101: [125] Tomandl J. Pteriny. Chem.Listy 1998; 92]: [126] Hofmann B, Bass H, Nishanian P, Faisal M, Figlin RA, Sarna GP, Fahey JL: Different lymphoid cell populations produce varied levels of neopterin, beta 2- microglobulin and soluble IL-2 receptor when stimulated with IL-2, interferongamma or tumour necrosis factor-alpha. Clin Exp Immunol 1992;88: [127] Melichar B, Touskova M, Solichova D, Kralickova P, Kopecky G: CD4+ T- lymphocytopenia and systemic immune activation in patients with primary and secondary liver tumours. Scand J Clin Lab Invest 2001;61: [128] Melichar B, Touskova M, Tosner J, Kopecky O: The phenotype of ascitic fluid lymphocytes in patients with ovarian carcinoma and other primaries. Onkologie 2001;24: [129] Reibnegger G, Aichberger C, Fuchs D, Hausen A, Spielberger M, Werner ER, Margreiter R, Wachtehr H: Posttransplant neopterin excretion in renal allograft recipients--a reliable diagnostic aid for acute rejection and a predictive marker of long-term graft survival. Transplantation 1991;52: [130] Nagy G, Brozik M, Tornoci L, Gergely P: Diagnostic value of combined evaluation of neopterin and anti-dna antibody levels for assessment of disease activity in systemic lupus erythematosus. Clin Exp Rheumatol 2000;18:

104 [131] Mommsen P, Frink M, Pape HC, van GM, Probst C, Gaulke R, Krettek C, Hildebrand F: Elevated systemic IL-18 and neopterin levels are associated with posttraumatic complications among patients with multiple injuries: a prospective cohort study. Injury 2009;40: [132] Melichar B, Gregor J, Solichova D, Lukes J, Tichy M, Pidrman V: Increased urinary neopterin in acute myocardial infarction. Clin Chem 1994;40: [133] Tozkoparan E, Deniz O, Cakir E, Yaman H, Ciftci F, Gumus S, Ozcan O, Akgul OE, Bilgic H, Erbil K, Ekiz K: The diagnostic values of serum, pleural fluid and urine neopterin measurements in tuberculous pleurisy. Int J Tuberc Lung Dis 2005;9: [134] Fuith LC, Fuchs D, Hausen A, Hetzel H, Reibnegger G, Werner ER, Wachter H: Neopterin, a marker of cell-mediated immune activation in human pregnancy. Int J Fertil 1991;36: [135] Blaschko O, Schwarz W, Schranz W, Fuith A: Order-disorder phase transition in potassium thiocyanate. Phys Rev B Condens Matter 1991;44: [136] Murr C, Bergant A, Widschwendter M, Heim K, Schrocksnadel H, Fuchs D: Neopterin is an independent prognostic variable in females with breast cancer. Clin Chem 1999;45: [137] Melichar B, Solichova D, Freedman RS: Neopterin as an indicator of immune activation and prognosis in patients with gynecological malignancies. Int J Gynecol Cancer 2006;16: [138] Reibnegger G, Hetzel H, Fuchs D, Fuith LC, Hausen A, Werner ER, Wachter H: Clinical significance of neopterin for prognosis and follow-up in ovarian cancer. Cancer Res 1987;47: [139] Huddart RA, Norman A, Shahidi M, Horwich A, Coward D, Nicholls J, Dearnaley DP: Cardiovascular disease as a long-term complication of treatment for testicular cancer. J Clin Oncol 2003;21:

105 [140] Meinardi MT, Gietema JA, van der Graaf WT, van Veldhuisen DJ, Runne MA, Sluiter WJ, de Vries EG, Willemse PB, Mulder NH, van den Berg MP, Koops HS, Sleijfer DT: Cardiovascular morbidity in long-term survivors of metastatic testicular cancer. J Clin Oncol 2000;18: [141] Zagars GK, Ballo MT, Lee AK, Strom SS: Mortality after cure of testicular seminoma. J Clin Oncol 2004;22: [142] Satariano WA, Ragland DR: The effect of comorbidity on 3-year survival of women with primary breast cancer. Ann Intern Med 1994;120: [143] Ogawa A, Kanda T, Sugihara S, Masumo H, Kobayashi I: Risk factors for myocardial infarction in cancer patients. J Med 1995;26: [144] Nuver J, Smit AJ, Sleijfer DT, van Gessel AI, van Roon AM, van der Meer J, van den Berg MP, Burgerhof JG, Hoekstra HJ, Sluiter WJ, Gietema JA: Microalbuminuria, decreased fibrinolysis, and inflammation as early signs of atherosclerosis in long-term survivors of disseminated testicular cancer. Eur J Cancer 2004;40: [145] Veronesi U, Boyle P, Goldhirsch A, Orecchia R, Viale G: Breast cancer. Lancet 2005;365: [146] Effects of chemotherapy and hormonal therapy for early breast cancer on recurrence and 15-year survival: an overview of the randomised trials. Lancet 2005;365: [147] Melichar B, Kalabova H, Krcmova L, Urbanek L, Hyspler R, Solichova D, Melicharova K, Pecka M, Zadak Z: Effect of aromatase inhibitors on lipid metabolism, inflammatory response and antioxidant balance in patients with breast carcinoma. Anticancer Res 2009;29: [148] Jagsi R, Griffith KA, Koelling T, Roberts R, Pierce LJ: Rates of myocardial infarction and coronary artery disease and risk factors in patients treated with radiation therapy for early-stage breast cancer. Cancer 2007;109:

106 [149] Jagsi R, Griffith KA, Koelling T, Roberts R, Pierce LJ: Stroke rates and risk factors in patients treated with radiation therapy for early-stage breast cancer. J Clin Oncol 2006;24: [150] Rothe G, Gabriel H, Kovacs E, Klucken J, Stohr J, Kindermann W, Schmitz G: Peripheral blood mononuclear phagocyte subpopulations as cellular markers in hypercholesterolemia. Arterioscler Thromb Vasc Biol 1996;16: [151] Rothe G, Herr AS, Stohr J, Abletshauser C, Weidinger G, Schmitz G: A more mature phenotype of blood mononuclear phagocytes is induced by fluvastatin treatment in hypercholesterolemic patients with coronary heart disease. Atherosclerosis 1999;144: [152] Ridker PM: Novel risk factors and markers for coronary disease. Adv Intern Med 2000;45: [153] Nguyen-Thanh HT, Benzaquen BS: Screening for subclinical coronary artery disease measuring carotid intima media thickness. Am J Cardiol 2009;104: [154] Saleh MN, Goldman SJ, LoBuglio AF, Beall AC, Sabio H, McCord MC, Minasian L, Alpaugh RK, Weiner LM, Munn DH: CD16+ monocytes in patients with cancer: spontaneous elevation and pharmacologic induction by recombinant human macrophage colony-stimulating factor. Blood 1995;85: [155] Melichar B, Touskova M, Dvorak J, Jandik P, Kopecky O: The peripheral blood leukocyte phenotype in patients with breast cancer: effect of doxorubicin/paclitaxel combination chemotherapy. Immunopharmacol Immunotoxicol 2001;23: [156] Wachter H, Fuchs D, Hausen A, Reibnegger G, Werner ER: Neopterin as marker for activation of cellular immunity: immunologic basis and clinical application. Adv Clin Chem 1989;27: [157] Grammer TB, Fuchs D, Boehm BO, Winkelmann BR, Maerz W: Neopterin as a predictor of total and cardiovascular mortality in individuals undergoing angiography in the Ludwigshafen Risk and Cardiovascular Health study. Clin Chem 2009;55:

107 [158] Fuchs D, Avanzas P, Arroyo-Espliguero R, Jenny M, Consuegra-Sanchez L, Kaski JC: The role of neopterin in atherogenesis and cardiovascular risk assessment. Curr Med Chem 2009;16: [159] Reibnegger G, Fuchs D, Fuith LC, Hausen A, Werner ER, Werner-Felmayer G, Wachter H: Neopterin as a marker for activated cell-mediated immunity: application in malignant disease. Cancer Detect Prev 1991;15: [160] Manzoni M, Rovati B, Ronzoni M, Loupakis F, Mariucci S, Ricci V, Gattoni E, Salvatore L, Tinelli C, Villa E, Danova M: Immunological effects of bevacizumabbased treatment in metastatic colorectal cancer. Oncology 2010;79: [161] Wada J, Suzuki H, Fuchino R, Yamasaki A, Nagai S, Yanai K, Koga K, Nakamura M, Tanaka M, Morisaki T, Katano M: The contribution of vascular endothelial growth factor to the induction of regulatory T-cells in malignant effusions. Anticancer Res 2009;29: [162] Suzuki K, Aiura K, Matsuda S, Itano O, Takeuchi O, Umezawa K, Kitagawa Y: Combined effect of dehydroxymethylepoxyquinomicin and gemcitabine in a mouse model of liver metastasis of pancreatic cancer. Clin Exp Metastasis 2013;30: [163] Tsavaris N, Kosmas C, Vadiaka M, Kanelopoulos P, Boulamatsis D: Immune changes in patients with advanced breast cancer undergoing chemotherapy with taxanes. Br J Cancer 2002;87: [164] Buttiglieri S, Galetto A, Forno S, De AM, Matera L: Influence of drug-induced apoptotic death on processing and presentation of tumor antigens by dendritic cells. Int J Cancer 2003;106: [165] Melichar B, Solichova D, Melicharova K, Malirova E, Cermanova M, Zadak Z: Urinary neopterin in patients with advanced colorectal carcinoma. Int J Biol Markers 2006;21: [166] Ellis BG, Tucker SM, Thompson AE, Price RG: Presence of serum and tissue forms of N-acetyl-beta-glucosaminidase in urine from patients with renal disease. Clin Chim Acta 1975;64:

108 [167] Urbanek L, Solichova D, Melichar B, Dvorak J, Svobodova I, Solich P: Optimization and validation of a high performance liquid chromatography method for the simultaneous determination of vitamins A and E in human serum using monolithic column and diode-array detection. Anal Chim Acta 2006; : [168] Barrett SV: Breast cancer. J R Coll Physicians Edinb 2010;40: [169] Siegel R, Naishadham D, Jemal A: Cancer statistics, CA Cancer J Clin 2012;62: [170] West NR, Kost SE, Martin SD, Milne K, Deleeuw RJ, Nelson BH, Watson PH: Tumour-infiltrating FOXP3(+) lymphocytes are associated with cytotoxic immune responses and good clinical outcome in oestrogen receptor-negative breast cancer. Br J Cancer [171] Tsuge T, Yamakawa M, Tsukamoto M: Infiltrating dendritic/langerhans cells in primary breast cancer. Breast Cancer Res Treat 2000;59: [172] Yoshino I, Goedegebuure PS, Peoples GE, Lee KY, Eberlein TJ: Human tumorinfiltrating CD4+ T cells react to B cell lines expressing heat shock protein 70. J Immunol 1994;153: [173] Chin Y, Janseens J, Vandepitte J, Vandenbrande J, Opdebeek L, Raus J: Phenotypic analysis of tumor-infiltrating lymphocytes from human breast cancer. Anticancer Res 1992;12: [174] Whitford P, George WD, Campbell AM: Flow cytometric analysis of tumour infiltrating lymphocyte activation and tumour cell MHC class I and II expression in breast cancer patients. Cancer Lett 1992;61: [175] Krausz LT, Fischer-Fodor E, Major ZZ, Fetica B: GITR-expressing regulatory T- cell subsets are increased in tumor-positive lymph nodes from advanced breast cancer patients as compared to tumor-negative lymph nodes. Int J Immunopathol Pharmacol 2012;25:

109 [176] Matsuura K, Yamaguchi Y, Osaki A, Ohara M, Okita R, Emi A, Murakami S, Arihiro K: FOXP3 expression of micrometastasis-positive sentinel nodes in breast cancer patients. Oncol Rep 2009;22: [177] Li CH, Kuo WH, Chang WC, Huang SC, Chang KJ, Sheu BC: Activation of regulatory T cells instigates functional down-regulation of cytotoxic T lymphocytes in human breast cancer. Immunol Res 2011;51: [178] Rech AJ, Mick R, Kaplan DE, Chang KM, Domchek SM, Vonderheide RH: Homeostasis of peripheral FoxP3(+) CD4 (+) regulatory T cells in patients with early and late stage breast cancer. Cancer Immunol Immunother 2010;59: [179] Decker T, Fischer G, Bucke W, Bucke P, Stotz F, Gruneberger A, Gropp-Meier M, Wiedemann G, Pfeiffer C, Peschel C, Gotze K: Increased number of regulatory T cells (T-regs) in the peripheral blood of patients with Her-2/neu-positive early breast cancer. J Cancer Res Clin Oncol 2012;138: [180] Abo-Elenein A, Elgohary SE, Hashish A, El-Halaby E: Significance of immunoregulatory T cells in different stages of breast cancer patients. Egypt J Immunol 2008;15: [181] Ferrari S, Malugani F, Rovati B, Porta C, Riccardi A, Danova M: Flow cytometric analysis of circulating dendritic cell subsets and intracellular cytokine production in advanced breast cancer patients. Oncol Rep 2005;14: [182] Satthaporn S, Robins A, Vassanasiri W, El-Sheemy M, Jibril JA, Clark D, Valerio D, Eremin O: Dendritic cells are dysfunctional in patients with operable breast cancer. Cancer Immunol Immunother 2004;53: [183] Kurt RA, Urba WJ, Smith JW, Schoof DD: Peripheral T lymphocytes from women with breast cancer exhibit abnormal protein expression of several signaling molecules. Int J Cancer 1998;78: [184] Rubbert A, Manger B, Lang N, Kalden JR, Platzer E: Functional characterization of tumor-infiltrating lymphocytes, lymph-node lymphocytes and peripheral-blood lymphocytes from patients with breast cancer. Int J Cancer 1991;49:

110 [185] Caras I, Grigorescu A, Stavaru C, Radu DL, Mogos I, Szegli G, Salageanu A: Evidence for immune defects in breast and lung cancer patients. Cancer Immunol Immunother 2004;53: [186] Murta EF, de Andrade JM, Falcao RP, Bighetti S: Lymphocyte subpopulations in patients with advanced breast cancer submitted to neoadjuvant chemotherapy. Tumori 2000;86: [187] Melichar B, Touskova M, Solichova D, Kralickova P, Kopecky G: CD4+ T- lymphocytopenia and systemic immune activation in patients with primary and secondary liver tumours. Scand J Clin Lab Invest 2001;61: [188] Gruber IV, El YS, Durr-Storzer S, Wallwiener D, Solomayer EF, Fehm T: Downregulation of CD28, TCR-zeta (zeta) and up-regulation of FAS in peripheral cytotoxic T-cells of primary breast cancer patients. Anticancer Res 2008;28: [189] Poschke I, De BJ, Mao Y, Kiessling R: Tumor-induced changes in the phenotype of blood-derived and tumor-associated T cells of early stage breast cancer patients. Int J Cancer 2012;131: [190] Gong J, Pan W, Yang C, Guo F, Sun Y: Expression of co-stimulators CD28/B7-1 in peripheral blood of patients with breast cancer. Breast Cancer Res Treat 2012;136: [191] Jaberipour M, Habibagahi M, Hosseini A, Habibabad SR, Talei A, Ghaderi A: Increased CTLA-4 and FOXP3 transcripts in peripheral blood mononuclear cells of patients with breast cancer. Pathol Oncol Res 2010;16: [192] Wang ZK, Yang B, Liu H, Hu Y, Yang JL, Wu LL, Zhou ZH, Jiao SC: Regulatory T cells increase in breast cancer and in stage IV breast cancer. Cancer Immunol Immunother 2012;61: [193] Della BS, Gennaro M, Vaccari M, Ferraris C, Nicola S, Riva A, Clerici M, Greco M, Villa ML: Altered maturation of peripheral blood dendritic cells in patients with breast cancer. Br J Cancer 2003;89:

111 [194] Muraro E, Martorelli D, Turchet E, Miolo G, Scalone S, Comaro E, Talamini R, Mastorci K, Lombardi D, Perin T, Carbone A, Veronesi A, Crivellari D, Dolcetti R: A different immunologic profile characterizes patients with HER-2-overexpressing and HER-2-negative locally advanced breast cancer: implications for immune-based therapies. Breast Cancer Res 2011;13:R117. [195] Melichar B, Touskova M, Dvorak J, Jandik P, Kopecky O: The peripheral blood leukocyte phenotype in patients with breast cancer: effect of doxorubicin/paclitaxel combination chemotherapy. Immunopharmacol Immunotoxicol 2001;23: [196] Bose A, Chakraborty T, Chakraborty K, Pal S, Baral R: Dysregulation in immune functions is reflected in tumor cell cytotoxicity by peripheral blood mononuclear cells from head and neck squamous cell carcinoma patients. Cancer Immun 2008;8:10. [197] Song G, Wang X, Jia J, Yuan Y, Wan F, Zhou X, Yang H, Ren J, Gu J, Lyerly HK: Elevated level of peripheral CD8(+)CD28(-) T lymphocytes are an independent predictor of progression-free survival in patients with metastatic breast cancer during the course of chemotherapy. Cancer Immunol Immunother 2013;62: [198] Karagoz B, Bilgi O, Gumus M, Erikci AA, Sayan O, Turken O, Kandemir EG, Ozturk A, Yaylaci M: CD8+CD28- cells and CD4+CD25+ regulatory T cells in the peripheral blood of advanced stage lung cancer patients. Med Oncol 2010;27: [199] Fricke I, Mirza N, Dupont J, Lockhart C, Jackson A, Lee JH, Sosman JA, Gabrilovich DI: Vascular endothelial growth factor-trap overcomes defects in dendritic cell differentiation but does not improve antigen-specific immune responses. Clin Cancer Res 2007;13: [200] Della PM, Danova M, Rigolin GM, Brugnatelli S, Rovati B, Tronconi C, Fraulini C, Russo RA, Riccardi A, Castoldi G: Dendritic cells and vascular endothelial growth factor in colorectal cancer: correlations with clinicobiological findings. Oncology 2005;68: [201] Kobie JJ, Wu RS, Kurt RA, Lou S, Adelman MK, Whitesell LJ, Ramanathapuram LV, Arteaga CL, Akporiaye ET: Transforming growth factor beta inhibits the 111

112 antigen-presenting functions and antitumor activity of dendritic cell vaccines. Cancer Res 2003;63: [202] Ziegler SF, Ramsdell F, Alderson MR: The activation antigen CD69. Stem Cells 1994;12: [203] Testi R, D'Ambrosio D, De MR, Santoni A: The CD69 receptor: a multipurpose cell-surface trigger for hematopoietic cells. Immunol Today 1994;15: [204] Esplugues E, Vega-Ramos J, Cartoixa D, Vazquez BN, Salaet I, Engel P, Lauzurica P: Induction of tumor NK-cell immunity by anti-cd69 antibody therapy. Blood 2005;105: [205] Sancho D, Gomez M, Viedma F, Esplugues E, Gordon-Alonso M, Garcia-Lopez MA, de la Fuente H, Martinez A, Lauzurica P, Sanchez-Madrid F: CD69 downregulates autoimmune reactivity through active transforming growth factorbeta production in collagen-induced arthritis. J Clin Invest 2003;112: [206] Lauzurica P, Sancho D, Torres M, Albella B, Marazuela M, Merino T, Bueren JA, Martinez A, Sanchez-Madrid F: Phenotypic and functional characteristics of hematopoietic cell lineages in CD69-deficient mice. Blood 2000;95: [207] Siegel PM, Massague J: Cytostatic and apoptotic actions of TGF-beta in homeostasis and cancer. Nat Rev Cancer 2003;3: [208] Ammanamanchi S, Tillekeratne MP, Ko TC, Brattain MG: Endogenous control of cell cycle progression by autocrine transforming growth factor beta in breast cancer cells. Cancer Res 2004;64: [209] Vesely P, Touskova M, Melichar B: Phenotype of peripheral blood leukocytes and survival of patients with metastatic colorectal cancer. Int J Biol Markers 2005;20: [210] Hase S, Weinitschke K, Fischer K, Fornara P, Hoda R, Unverzagt S, Seliger B, Riemann D: Monitoring peri-operative immune suppression in renal cancer patients. Oncol Rep 2011;25:

113 [211] Koukourakis GV, Zabatis H, Zacharias GA, Koukourakis MJ: Post-surgical irradiation causes cellular immune suppression in patients with breast cancer. Eur J Cancer Care (Engl ) 2009;18: [212] Boomsma MF, Garssen B, Slot E, Berbee M, Berkhof J, Meezenbroek EJ, Slieker W, Visser A, Meijer S, Beelen RH: Breast cancer surgery-induced immunomodulation. J Surg Oncol 2010;102: [213] Generali D, Bates G, Berruti A, Brizzi MP, Campo L, Bonardi S, Bersiga A, Allevi G, Milani M, Aguggini S, Dogliotti L, Banham AH, Harris AL, Bottini A, Fox SB: Immunomodulation of FOXP3+ regulatory T cells by the aromatase inhibitor letrozole in breast cancer patients. Clin Cancer Res 2009;15: [214] Fargeot P, Guerrin J: Role of chemotherapy in adjuvant treatment of breast cancer: modulation of the immune status. Bull Cancer 1984;71: [215] Kaneno R, Shurin GV, Kaneno FM, Naiditch H, Luo J, Shurin MR: Chemotherapeutic agents in low noncytotoxic concentrations increase immunogenicity of human colon cancer cells. Cell Oncol (Dordr ) 2011;34: [216] Pfannenstiel LW, Lam SS, Emens LA, Jaffee EM, Armstrong TD: Paclitaxel enhances early dendritic cell maturation and function through TLR4 signaling in mice. Cell Immunol 2010;263: [217] Zhang L, Dermawan K, Jin M, Liu R, Zheng H, Xu L, Zhang Y, Cai Y, Chu Y, Xiong S: Differential impairment of regulatory T cells rather than effector T cells by paclitaxel-based chemotherapy. Clin Immunol 2008;129: [218] Zhu Y, Liu N, Xiong SD, Zheng YJ, Chu YW: CD4+Foxp3+ regulatory T-cell impairment by paclitaxel is independent of toll-like receptor 4. Scand J Immunol 2011;73: [219] Vicari AP, Luu R, Zhang N, Patel S, Makinen SR, Hanson DC, Weeratna RD, Krieg AM: Paclitaxel reduces regulatory T cell numbers and inhibitory function and enhances the anti-tumor effects of the TLR9 agonist PF in the mouse. Cancer Immunol Immunother 2009;58:

114 [220] Cao C, Han Y, Ren Y, Wang Y: Mitoxantrone-mediated apoptotic B16-F1 cells induce specific anti-tumor immune response. Cell Mol Immunol 2009;6: [221] Obeid M, Tesniere A, Ghiringhelli F, Fimia GM, Apetoh L, Perfettini JL, Castedo M, Mignot G, Panaretakis T, Casares N, Metivier D, Larochette N, van EP, Ciccosanti F, Piacentini M, Zitvogel L, Kroemer G: Calreticulin exposure dictates the immunogenicity of cancer cell death. Nat Med 2007;13: [222] Park JY, Jang MJ, Chung YH, Kim KY, Kim SS, Lee WB, You S, Choi YS, Hur DY, Kim D: Doxorubicin enhances CD4(+) T-cell immune responses by inducing expression of CD40 ligand and 4-1BB. Int Immunopharmacol 2009;9: [223] Sultana R, Di DF, Tseng M, Cai J, Noel T, Chelvarajan RL, Pierce WD, Cini C, Bondada S, St Clair DK, Butterfield DA: Doxorubicin-induced thymus senescence. J Proteome Res 2010;9: [224] Eralp Y, Wang X, Wang JP, Maughan MF, Polo JM, Lachman LB: Doxorubicin and paclitaxel enhance the antitumor efficacy of vaccines directed against HER 2/neu in a murine mammary carcinoma model. Breast Cancer Res 2004;6:R275-R283. [225] Wijayahadi N, Haron MR, Stanslas J, Yusuf Z: Changes in cellular immunity during chemotherapy for primary breast cancer with anthracycline regimens. J Chemother 2007;19: [226] Verma C, Eremin JM, Robins A, Bennett AJ, Cowley GP, El-Sheemy MA, Jibril JA, Eremin O: Abnormal T regulatory cells (Tregs: FOXP3+, CTLA-4+), myeloidderived suppressor cells (MDSCs: monocytic, granulocytic) and polarised T helper cell profiles (Th1, Th2, Th17) in women with large and locally advanced breast cancers undergoing neoadjuvant chemotherapy (NAC) and surgery: failure of abolition of abnormal treg profile with treatment and correlation of treg levels with pathological response to NAC. J Transl Med 2013;11:16. [227] Osada T, Chong G, Tansik R, Hong T, Spector N, Kumar R, Hurwitz HI, Dev I, Nixon AB, Lyerly HK, Clay T, Morse MA: The effect of anti-vegf therapy on immature myeloid cell and dendritic cells in cancer patients. Cancer Immunol Immunother 2008;57:

115 [228] Recchia F, Sica G, Candeloro G, Necozione S, Bisegna R, Bratta M, Rea S: Maintenance immunotherapy in metastatic breast cancer. Oncol Rep 2008;20: [229] Li Y, Li XF, Ma Y, Fang N, Russell J, Ma D, Sun X, Han X, Yang H, Kinuya S: Changes in the levels of CD4+ and CD8+ T-lymphocytes after strontium-89 chloride therapy for painful bone metastases in patients correlate with treatment efficacy. Cancer Biother Radiopharm 2007;22: [230] Adotevi O, Pere H, Ravel P, Haicheur N, Badoual C, Merillon N, Medioni J, Peyrard S, Roncelin S, Verkarre V, Mejean A, Fridman WH, Oudard S, Tartour E: A decrease of regulatory T cells correlates with overall survival after sunitinib-based antiangiogenic therapy in metastatic renal cancer patients. J Immunother 2010;33: [231] Kang DH, Weaver MT, Park NJ, Smith B, McArdle T, Carpenter J: Significant impairment in immune recovery after cancer treatment. Nurs Res 2009;58: [232] Goodyear MD, MacKay IR, Russell IS: Delayed recovery of peripheral blood cell numbers after adjuvant cytotoxic chemotherapy for stage II breast cancer. Cancer Chemother Pharmacol 1981;7: [233] Hakim FT, Cepeda R, Kaimei S, Mackall CL, McAtee N, Zujewski J, Cowan K, Gress RE: Constraints on CD4 recovery postchemotherapy in adults: thymic insufficiency and apoptotic decline of expanded peripheral CD4 cells. Blood 1997;90: [234] Talmadge JE, Jackson JD, Kelsey L, Borgeson CD, Faltynek C, Perry GA: T-cell reconstitution by molecular, phenotypic, and functional analysis in the thymus, bone marrow, spleen, and blood following split-dose polychemotherapy and therapeutic activity for metastatic breast cancer in mice. J Immunother Emphasis Tumor Immunol 1993;14: [235] Hadrup SR, Gehl J, Sorensen RB, Geertsen PF, Straten PT, Andersen MH: Persistence of survivin specific T cells for seven years in a melanoma patient during complete remission. Cancer Biol Ther 2006;5:

116 [236] Steele TA: Chemotherapy-induced immunosuppression and reconstitution of immune function. Leuk Res 2002;26: [237] Mozaffari F, Lindemalm C, Choudhury A, Granstam-Bjorneklett H, Lekander M, Nilsson B, Ojutkangas ML, Osterborg A, Bergkvist L, Mellstedt H: Systemic immune effects of adjuvant chemotherapy with 5-fluorouracil, epirubicin and cyclophosphamide and/or radiotherapy in breast cancer: a longitudinal study. Cancer Immunol Immunother 2009;58: [238] Chou JP, Effros RB: T cell replicative senescence in human aging. Curr Pharm Des 2013;19: [239] Libri V, Azevedo RI, Jackson SE, Di MD, Lachmann R, Fuhrmann S, Vukmanovic- Stejic M, Yong K, Battistini L, Kern F, Soares MV, Akbar AN: Cytomegalovirus infection induces the accumulation of short-lived, multifunctional CD4+CD45RA+CD27+ T cells: the potential involvement of interleukin-7 in this process. Immunology 2011;132: [240] Aberg JA: Aging, inflammation, and HIV infection. Top Antivir Med 2012;20: [241] Smolenska Z, Pawlowska J, Daca A, Soroczynska-Cybula M, Witkowski J, Bryl EM: Disease activity in patients with long-lasting rheumatoid arthritis is associated with changes in peripheral blood lymphocyte subpopulations. Pol Arch Med Wewn 2012;122: [242] Aruga T, Suzuki E, Saji S, Horiguchi S, Horiguchi K, Sekine S, Kitagawa D, Funata N, Toi M, Sugihara K, Kuroi K: A low number of tumor-infiltrating FOXP3-positive cells during primary systemic chemotherapy correlates with favorable anti-tumor response in patients with breast cancer. Oncol Rep 2009;22: [243] Barath S, Aleksza M, Keresztes K, Toth J, Sipka S, Szegedi G, Illes A: Immunoregulatory T cells in the peripheral blood of patients with Hodgkin's lymphoma. Acta Haematol 2006;116:

117 [244] Huang ZS, Chiang BL: Correlation between serum lipid profiles and the ratio and count of the CD16+ monocyte subset in peripheral blood of apparently healthy adults. J Formos Med Assoc 2002;101: [245] Hansson GK: Inflammation, atherosclerosis, and coronary artery disease. N Engl J Med 2005;352: [246] Pai JK, Pischon T, Ma J, Manson JE, Hankinson SE, Joshipura K, Curhan GC, Rifai N, Cannuscio CC, Stampfer MJ, Rimm EB: Inflammatory markers and the risk of coronary heart disease in men and women. N Engl J Med 2004;351: [247] Ridker PM, Hennekens CH, Buring JE, Rifai N: C-reactive protein and other markers of inflammation in the prediction of cardiovascular disease in women. N Engl J Med 2000;342: [248] Ridker PM, Rifai N, Rose L, Buring JE, Cook NR: Comparison of C-reactive protein and low-density lipoprotein cholesterol levels in the prediction of first cardiovascular events. N Engl J Med 2002;347: [249] Melichar B, Gregor J, Solichova D, Lukes J, Tichy M, Pidrman V: Increased urinary neopterin in acute myocardial infarction. Clin Chem 1994;40: [250] Solichova D, Melichar B, Blaha V, Klejna M, Vavrova J, Palicka V, Zadak Z: Biochemical profile and survival in nonagenarians. Clin Biochem 2001;34: [251] Patino R, Ibarra J, Rodriguez A, Yague MR, Pintor E, Fernandez-Cruz A, Figueredo A: Circulating monocytes in patients with diabetes mellitus, arterial disease, and increased CD14 expression. Am J Cardiol 2000;85: [252] Masuda M, Miyoshi H, Kobatake S, Nishimura N, Dong XH, Komiyama Y, Takahashi H: Increased soluble FcgammaRIIIa(Mphi) in plasma from patients with coronary artery diseases. Atherosclerosis 2006;188: [253] Melichar B, Jandik P, Krejsek J, Solichova D, Drahosova M, Skopec F, Mergancova J, Voboril Z: Mitogen-induced lymphocyte proliferation and systemic immune activation in cancer patients. Tumori 1996;82:

118 [254] Melichar B, Savary C, Kudelka AP, Verschraegen C, Kavanagh JJ, Edwards CL, Platsoucas CD, Freedman RS: Lineage-negative human leukocyte antigen-dr+ cells with the phenotype of undifferentiated dendritic cells in patients with carcinoma of the abdomen and pelvis. Clin Cancer Res 1998;4: [255] Melichar B, Nash MA, Lenzi R, Platsoucas CD, Freedman RS: Expression of costimulatory molecules CD80 and CD86 and their receptors CD28, CTLA-4 on malignant ascites CD3+ tumour-infiltrating lymphocytes (TIL) from patients with ovarian and other types of peritoneal carcinomatosis. Clin Exp Immunol 2000;119:

119 Přílohy Tabulka č. 5 Deskriptivní statistika a vzájemné porovnání podskupin A (primární chemoterapie),m (metastatické postižení) a kontrolní skupina zdravých žen AM (aritmetický průměr), SD (standardní odchylka), min (minimální hodnota pametru),max (maximální hodnota parametru), p (hladina významnosti) Parametr AM±SD (min-max) Skupina A (primární chemoterapie) Lymfocyty 0.23±0.06 (rel. počet) ( ) Lymfocyty 1.42±0.13 (abs. počet) ( ) CD3 + (%) 70.18±12.39 ( ) CD3 + (abs) 0.99±0.46 ( ) CD3 + CD ±13.25 (%) ( ) CD3 + CD ±0,32 (abs) ( ) Skupina M (metastatické onemocnění) 0.25±0.05 ( ) 1.31±0.65 ( ) 68.84±2.90 ( ) 0.91±0.53 ( ) 31.05±3.38 ( ) 0.45±0.35 ( ) 119 p skupina A vs. skupina M Kontroly p skupina A vs. kontroly p skupina M vs. kontroly ± ( ) ± ( ) ± ( ) ± ( ) ±1.6 4 ( ) ± ( )

120 CD3 + CD ± ± ± (%) ( ) ( ) 5 ( ) CD3 + CD ± ± ± (abs) ( ) ( ) ( ) IRI 1.67± ± ± ( ) ( ) ( ) CD8 + CD ± ± ± (%) ( ) ( ) ( ) CD8 + CD ± ± ± (abs) ( ) ( ) ( ) CD8 + CD ± ± ± (%) ( ) ( ) 0 ( ) CD8 + CD ± ± ± (abs) ( ) ( ) ( ) CD3 + CD ± ± ± (%) ( ) ( ) ( ) CD3 + CD ± ± ± (abs) ( ) ( ) ( ) CD8 + CD ± ± ± (%) ( ) ( ) ( ) CD8 + CD ± ± ± (abs) ( ) ( ) ( ) CD69 + (%) 4.90± ± ±

121 ( ) ( ) ( ) CD69 + (abs) 0.07±0.07 ( ) 0.08±0.05 ( ) ±0.06 ( ) CD3 - CD ± ± ±2.53 (%) ( ) ( ) ( ) CD3 - CD ± ± ±0.05 (abs) ( ) ( ) ( ) TREG (%) 3.09± ± ±0.18 ( ) ( ) ( ) TREG (abs) 0.04± ± ±0.03 ( ) ( ) ( ) PDC (%) 0.15± ± ±0.01 ( ) ( ) ( ) PDC (abs) 0.01± ± ±0.00 ( ) ( ) ( ) MDC (%) 0.16± ± ±0.01 ( ) ( ) ( ) MDC (abs) 0.01± ± ±0.00 ( ) ( ) ( )

122 Tabulka č. 6 Deskriptivní statistika a vzájemné porovnání skupiny žen léčených primární chemoterapií HER-2 negativní, HER-2 pozitivní, M (metastatické postižení) a kontrolní skupina zdraých žen Parametr AM±SD HER-2- pozitivní (min-max) Lymfocyty 0.26±0.01 (rel. počet) ( ) Lymfocyty 1.70±0.63 (abs. počet) ( ) CD3 + (%) 75.06±2.60 ( ) CD3 + (abs) 1.17±0.55 ( ) CD3 + CD ±6.36 (%) (1, ) CD3 + CD ±0.45 (abs) ( ) CD3 + CD ±1.94 (%) ( ) CD3 + CD ±0.20 (abs) ( ) IRI 1.55±0.19 ( ) CD8 + CD ±2.15 (%) ( ) CD8 + CD ±0.14 (abs) ( ) CD8 + CD ±3.32 (%) ( ) HER-2 negativní 0.21±0.02 ( ) 1.22±0.46 ( ) 66.93±4.10 ( ) 0.86±0.35 ( ) 46.88±2.22 ( ) 0.56±0.21 ( ) 21.14±1.80 ( ) 0.27±0.15 ( ) 1.74±0.14 ( ) 16.10±1.39 ( ) 0.19±0.09 ( ) 11.85±1.51 ( ) p HER-2+ vs. HER-2- P HER-2+ vs. kontrola P HER-2- v.s. kontrola p HER-2 + vs. sk. M p HER-2- vs. sk. M

123 CD8 + CD28 - (abs) 0.23±0.14 ( ) CD3 + CD ±0.34 (%) ( ) CD3 + CD ±0.02 (abs) ( ) CD8 + CD ±0.28 (%) ( ) CD8 + CD ±0.02 (abs) ( ) CD69 + (%) 3.93±0.59 ( ) CD69 + (abs) 0.09±0.10 ( ) CD3 - CD ±2.43 (%) ( ) CD3 - CD ±0.09 (abs) ( ) TREG (%) 3.00±0.39 ( ) TREG (abs) 0.05±0.02 ( ) PDC (%) 0.11±0.03 ( ) PDC (abs) 0.01±0.00 ( ) MDC (%) 0.15±0.03 ( ) MDC (abs) 0.01±0.01 ( ) 0.15±0.11 ( ) 2.08±0.24 ( ) 0.03±0.02 ( ) 1.61±0.26 ( ) 0.02±0.01 ( ) 5.55±1.28 ( ) 0.05±0.03 ( ) 4.58±2.61 ( ) 0.06±0.04 ( ) 3.15±0.53 ( ) 0.04±0.03 ( ) 0.18±0.03 ( ) 0.01±0.01 (0, ) 0.17±0.04 ( ) 0.01±0.01 ( )

124 Tabulka č.7 Porovnání parametrů periferní krve před léčbou a za 3 roky po ukončení léčby u žen bez progrese základního onemocnění (celá skupina A) Parametr AM±SD Před léčbou (PL) (min-max) Lymfocyty 0.23±0.06 (rel. počet) ( ) Lymfocyty 1.42±0.13 (abs. počet) ( ) CD3 + (%) 70.18±12.39 ( ) CD3 + (abs) 0.99±0.46 ( ) CD3 + CD ±13.25 (%) ( ) CD3 + CD ±0,32 (abs) ( ) CD3 + CD ±1.40 (%) ( ) CD3 + CD ±0.58 (abs) ( ) IRI 1.67±0.49 ( ) CD8 + CD ±5.21 (%) ( ) CD8 + CD ±0.12 (abs) ( ) CD8 + CD ±6.60 (%) ( ) CD8 + CD ±0.12 (abs) ( ) 3 roky po Kontrola p P léčbě (3R) (PL vs. 3Y) (3Y vs. kontrola) 0.33±0.01 ( ) 1.66±0.35 ( ) 60.28±2.97 ( ) 0.95±0.33 ( ) 33.54±2.48 ( ) 0.56±0.18 ( ) 24.61±2.06 ( ) 0.42±0.14 ( ) 1.16±0.14 ( ) 9.39±1.37 ( ) 0.16±0.07 ( ) 22.29±2.40 ( ) 0.38±0.15 ( ) 0.30±0.03 ( ) ± ( ) 72.85± ( ) 1.50± ,024 ( ) 48.13± ( ) 0.98± ( ) 22.55± ,472 ( ) 0.46±0.33 ( ) , ± ( ) 9.45± ( ) 0.18± ( ) 17.90± ( ) 0.37± ( ) CD3 + CD ± ± ±

125 (%) ( ) ( ) ( ) CD3 + CD69 + (abs) 0.03±0.02 ( ) 0.07±0.12 ( ) 0.04±0.04 ( ) CD8 + CD ± ± ±0.17 (%) ( ) ( ) ( ) CD8 + CD ± ±0, ±0.02 (abs) ( ) ( ) ( ) CD69 + (%) 4.90± ± ±0.57 ( ) ( ) ( ) CD69 + (abs) 0.07± ± ±0.06 ( ) ( ) ( ) CD3 - CD ± ± ±2.53 (%) ( ) ( ) ( ) CD3 - CD ± ± ±0.05 (abs) ( ) ( ) ( ) TREG (%) 3.09± ± ±0.18 ( ) ( ) ( ) TREG (abs) 0.04± ± ±0.03 ( ) ( ) ( ) PDC (%) 0.15± ± ±0.01 ( ) ( ) ( ) PDC (abs) 0.01± ± ±0.00 ( ) ( ) ( ) MDC (%) 0.16± ± ±0.01 ( ) ( ) ( ) MDC (abs) 0.01± ± ±0.00 ( ) ( ) ( )

126 Tabulka č.8 Porovnání sledovaných parametrů perifení krve a 3 roky po léčbě (HER-2- pozitivní nemocní) Parametr Před léčbou 3 roky po Kontroly p P (LP) HER- léčbě (PL vs. 3R) (3Y vs. AM±SD 2-pozitivní (3R) kontroly) (min-max) Lymfocyty 0.26± ± ± (rel. počett) ( ) ( ) ( ) Lymfocyty 1.70± ± ± (abs.počet) ( ) ( ) ( ) CD3 + (%) 75.06± ± ± ( ( ) ( ) 84.20) CD3 + (abs) 1.17± ± ± ( ) ( ) ( ) CD3 + CD ± ± ± (%) (1, ) ( ) ( ) CD3 + CD ± ± ± (abs) ( ) ( ) ( ) CD3 + CD ± ± ± (%) ( ( ) ( ) 33.80) CD3 + CD ± ± ± (abs) ( ) ( ) ( ) IRI 1.55± ± ± ( ) ( ) ( ) CD8 + CD ± ± ± (%) ( ) ( ) ( ) CD8 + CD ± ± ± (abs) ( ) ( ) ( ) CD8 + CD ± ± ± (%) ( ) ( ) ( ) CD8 + CD ± ± ± (abs) ( ) ( ) ( ) 126

127 CD3 + CD ± ± ± (%) ( ) ( ) ( ) CD3 + CD ± ± ± (abs) ( ) ( ) ( ) CD8 + CD ± ± ± (%) ( ) ( ) ( ) CD8 + CD ± ± ± (abs) ( ) (0, ) ( ) CD69 + (%) 3.93± ± ± ( ) ( ) ( ) CD69 + (abs) 0.09± ± ± ( ) ( ) ( ) CD3 - CD ± ± ± (%) ( ) ( ) ( ) CD3 - CD ± ± ± (abs) ( ) ( ) ( ) TREG (%) 3.00± ± ± ( ) ( ) ( ) TREG (abs) 0.05± ± ± ( ) ( ) ( ) PDC (%) 0.11± ± ± ( ) ( ) ( ) PDC (abs) 0.01± ± ± ( ) ( ) ( ) MDC (%) 0.15± ± ± ( ) ( ) ( ) MDC (abs) 0.01± ± ± ( ) ( ) ( ) 127

128 Tabulka č. 9 Porovnání sledovaných parametrů perifení krve a 3 roky po léčbě (HER-2- negativní nemocní) Parametr Před léčbou 3 roky po léčbě Kontroly p p AM±SD (PL) (3R) (PL v.s. 3R) (3R v.s.. (min-max) kontroly) Lymfocyty 0.21± ± ± (rel. počet) ( ) ( ) ( ) Lymfocyty 1.22± ± ± (abs. počet) ( ) ( ) ( ) CD3 + (%) 66.93± ± ± ( ) ( ) ( ) CD3 +( abs) 0.86± ± ± ( ) ( ) ( ) CD3 + CD ± ± ± (%) ( ) ( ) ( ) CD3 + CD ± ± ± (abs) ( ) ( ) ( ) CD3 + CD ± ± ± (%) ( ) ( ) ( ) CD3 + CD ± ± ± (abs) ( ) ( ) ( ) IRI 1.74± ± ± ( ) ( ) ( ) CD8 + CD ± ± ± (%) ( ) ( ) ( ) CD8 + CD ± ± ± (abs) ( ) ( ) ( ) CD8 + CD ± ± ± (%) ( ) ( ) ( ) CD8 + CD ± ± ± (abs) ( ) ( ) ( ) 128

129 CD3 + CD ± ± ± (%) ( ) ( ) ( ) CD3 + CD ± ± ± (abs) ( ) ( ) ( ) CD8 + CD ± ± ± (%) ( ) ( ) ( ) CD8 + CD ± ± ± (abs) ( ) ( ) ( ) CD69 + (%) 5.55± ± ± ,836 ( ) ( ) ( ) CD69 + (abs) 0.05± ± ± ( ) ( ) ( ) CD3 - CD ± ± ± (%) ( ) ( ) ( ) CD3 - CD ± ± ± (abs) ( ) ( ) ( ) TREG (%) 3.15± ± ± ( ) ( ) ( ) TREG (abs) 0.04± ± ± ( ) ( ) ( ) PDC (%) 0.18± ± ± ( ) ( ) ( ) PDC (abs) 0.01± ± ± (0, ) ( ) ( ) MDC (%) 0.17± ± ± ( ) ( ) ( ) MDC (abs) 0.01± ± ± ( ) ( ) ( ) 129

130 Fakultní nemocnice Hradec Králové Sokolská 58, Hradec Králové Ústav klinické imunologie a alergologie Klinika onkologie a radioterapie Informovaný souhlas se zařazením do grantového projektu GAUK Pacient/ka:.... Titul jméno Příjmení RČ Vážená paní, vážený pane, Nabízíme Vám účast na grantovém projektu: Bevacizumab v léčbě metastatického kolorektálního karcinomu a karcinomu prsu: změny v rámci imunologické odpovědi v průběhu chemoimunotherapie. Bevacizumab je humanizovaná rekombinantní monoklonální protilátka, která se váže na VEGF (vaskulárně-endoteliální růstový faktor potentní mediátor nádorové angiogenese). Bevacizumab je s úspěchem používán v kombinované léčbě metastatického kolorektálního karcinomu i karcinomu prsu. Bylo prokázáno, že se nejedná pouze o potentní inhibitor angiogenese, avšak zasahuje i do procesu protinádorové odpovědi organismu (zrání dendritických buněk a T-lymfocytů). Chceme sledovat změny fenotypu periferních lymfocytů v průběhu chemoimunotherapie (se zaměřením na T-regulační lymfocyty, dendritické buňky a monocyty). Krevní vzorky budou odebrány v úvodu a dále pak v přesně daných intervalech v průběhu léčby. Vzorky budou vyhodnocovány průtokovou cytometrií. Cílem práce bude přispět k objasňování vlivu bevacizumabu na přirozenou protinádorovou odpověď organismu. V rámci pravidelných odběrů před podáním každého cyklu chemoimunoterapie, Vám bude navíc odebrána jedna zkumavka nesrážlivé krve, která bude odeslána a vyšetřena v imunologické laboratoři. Nebudete vystaven/a žádnému zvýšenému riziku, jde o běžné krevní odběry. Prohlašuji, že se uvedeného výzkumného projektu účastním dobrovolně, jsem si vědom/a práva kdykoliv souhlas s účastí na studii odmítnout, aniž by toto odmítnutí negativně ovlivnilo vztah mezi mnou a lékařem. Můj lékař se zavazuje, že budu včas informován o nově zjištěných okolnostech, které by mohly mít vliv na mé rozhodnutí v pokračování ve studii. Potvrzuji, že jsem četla informovaný souhlas, rozumím jeho obsahu, byla jsem svým odborným lékařem:. Seznámen/a se všemi procedurami plynoucími ze zařazení do výzkumného projektu a byl/a upozorněna na možná rizika. Se zařazením souhlasím. V Hradci Králové dne.. V Hradci Králové dne.. v hod.. Podpis pacienta: v hod. Jmenovka a podpis lékaře: 130

131 131

132 132

133 133