Adoptivní T-buněčná terapie v léčbě nádorových onemocnění

Transkript

1 Adoptivní T-buněčná terapie v léčbě nádorových onemocnění Adoptive T cell therapy in cancer treatment KATEŘINA VÁVROVÁ, JIŘINA BARTŮŇKOVÁ, RUDOLF HORVÁTH Ústav imunologie, Univerzita Karlova, 2. lékařská fakulta, Fakultní nemocnice Motol, Praha SOUHRN Snahou jednotlivých imunoterapeutických postupů je namíření imunitních reakcí organismu proti nádorové tkáni tak, aby vedly k eliminaci nebo ke kontrole růstu maligně transformovaných buněk. Jednou z možností imunoterapie je využití adoptivního T-buněčného transferu, jehož podstatou je aplikace ex vivo upravených a expandovaných tumor specifických lymfocytů, které rozeznávají a ničí neoplastické buňky. Úspěšnost adoptivní T-buněčné terapie se významně zlepšila pochopením základních molekulárních mechanismů interakce imunitního systému s nádory. Slibných výsledků bylo dosaženo zejména u klinických studií s maligním melanomem, karcinomem ledviny a lymfatické leukemie. Adoptivní T-buněčná terapie se v současnosti postupně etabluje mezi nadějné imunoterapeutické postupy a rozšiřuje tak portfolio léčebných možností. Cílem tohoto článku je podat stručné informace o teoretických předpokladech protinádorové imunoterapie a zároveň shrnout poznatky z oblasti výzkumu a aplikace imunoterapie se zaměřením na adoptivní T-buněčný transfer. Klíčová slova: protinádorová imunita, adoptivní T-buněčný transfer, tumor specifické lymfocyty SUMMARY The aim of current immunotherapeutic approaches is to elicit an individual s immune response towards a tumor tissue to eliminate or, at least, to control proliferation of the neoplastic tumor cells. Among the contemporary cancer treatment strategies, the adoptive T cell transfer shows to be the most progressively developing method that uses an ex vivo modified and expanded tumor-specific T cells as a tool to target and destroy the neoplastic tumor cells. The efficacy of the adoptive T cell therapy has significantly improved in recent years due to a better understanding of the molecular mechanisms that control the interactions of immune system and tumor cells. Promising results have already been achieved within the clinical trials of malignant melanoma, renal cancer and lymphoid leukemia. The adoptive T cell therapy is therefore gradually finding its stable place among the other contemporary immunotherapeutic strategies and expands the spectrum of available treatment options in cancer therapy. The purpose of this review is to introduce a theoretical background of the cancer treatment strategies and also to summarize the contemporary status of the adoptive T cell transfer therapy and its prospects for future. Key words: anti-cancer immunotherapy, adoptive T cell transfer, tumor-specific lymphocytes Historické aspekty a teoretické předpoklady využití protinádorové imunoterapie Hlavní funkcí imunitního systému je obrana proti infekcím. Infekční nemoci byly v historii lidstva až do objevu účinných antimikrobiálních léků nejčastější příčinou smrti. Ještě na počátku 20. století se průměrná délka života pohybovala mezi třiceti pěti a čtyřiceti lety. Z evolučního hlediska bylo proto důležité, aby nás imunitní systém chránil minimálně do okamžiku dosažení reprodukční zralosti. Postupně také přibývalo množství důkazů o tom, že imunitní systém nás chrání i před vznikem nádorových onemocnění, které dominují postreprodukčnímu věku, a že antiinfekční a protinádorová obrana je založená na podobném principu fungování. Zcela jistě však působení selekčního tlaku antiinfekčních mechanismů převyšuje ty protinádorové. Inferiorita protinádorových odpovědí je také částečně dána následkem strukturní podobnosti nádorových buněk buňkám normálním, které se pak imunitnímu systému jeví jako organismu vlastní nebo antigenně velmi podobné. Navíc nádorové buňky disponují celou řadou schopností, jak uniknout kontrolním mechanismům imunitního systému (1). Ke značnému pokroku v oblasti imunoterapie došlo především díky porozumění molekulárním interakcím nádorových buněk s imunitním systémem. Uplatnění imunoterapie jakožto léčebné strategie vychází z předpokladu, že imunitní systém má schopnost rozeznat a eliminovat nádorové buňky zejména v raném stadiu karcinogeneze, ještě před klinickou manifestací 204 Alergie 3/2013

2 Eliminace Rovnováha Únik Obr. 1: Teorie editace nádoru imunitním systémem popisuje (1) fázi eliminace transformované buňky zprostředkovanou především CD8+ T-lymfocyty, (2) fázi rovnováhy, ustanovené mezi transformovanou buňkou a imunitním systémem a (3) vznik únikových variant transformovaných buněk vlivem selekčního tlaku imunitního systému, což vede k manifestaci nádorového onemocnění (upraveno dle (11,12)). onemocnění. Řada experimentálních dat však ukázala, že u pokročilých stadií nemoci jsou imunitní mechanismy často neúčinné nebo utlumené a v některých případech dokonce růst nádoru podporují. Tato ambivalence imunitního systému se zdá být zcela zásadní ve správném načasování imunoterapie a v současnosti je snahou aplikovat imunoterapii v co nejčasnějších stadiích onemocnění. Cesta k pochopení protinádorových imunitních mechanismů byla složitá. Z historického hlediska na příčinnou souvislost mezi protizánětlivou imunitou a nádory poprvé poukázal německý lékař R. Virchow. Na základě nálezu leukoretikulárního infiltrátu v neoplastické tkáni předpokládal, že původ rakoviny je v místech chronického zánětu (2). Představa, že imunitní systém může reagovat na nádorovou tkáň, byla poprvé vyslovena v roce 1898 americkým chirurgem W. Coleyem, který zaznamenal vzácné regrese solidních nádorů u pacientů v průběhu bakteriálních infekcí erysipelem (3). Jasnější představu o účasti imunitního systému na obraně proti nádorům však přinesla až série transplantačních experimentů na inbredních myších. Na studiích ze čtyřicátých a padesátých let minulého století se poprvé podařilo demonstrovat, že inbrední myši mohou být imunizovány proti nádorům indukovaným karcinogeny a že transplantovaný nádor u nich navozuje specifickou imunitní odpověď (4). Na základě těchto objevů byla v roce 1957 sirem M. Burnetem a L. Thomasem formulována hypotéza o protinádorovém imunitním dohledu. Ta předpokládala existenci strážných buněk pocházejících z thymu, které aktivně monitorují přítomnost transformovaných nádorových buněk (5). Teorie imunitního dohledu by se měla projevit u imunodeficientních jedinců, kde se očekávala zvýšená frekvence nádorů, nicméně zásadní evidence stále chyběla. Rozhodující důkaz o roli imunitního systému v obraně proti nádorům poskytly až studie na myších, které nemají T- a B-lymfocyty v důsledku mutací genů pro RAG1 a RAG2 rekombinázy, enzymů nutných pro tvorbu antigenně specifických receptorů. V porovnání s imunokompetentními kontrolami byly RAG-/- myši náchylnější ke vzniku chemicky indukovaných, ale i spontánně rostoucích nádorů (6). Série analogických studií na myších knock-out modelech pomohla objasnit roli dalších buněčných složek imunitního systému v prevenci nádorového onemocnění. Za zmínku stojí knock-outy NKT buněk nebo interferonu γ (IFN-γ) (7, 8). Původní hypotéza Thomase a Burneta byla později komplexněji rozvinuta G. P. Dunnem a kol. (9) v rámci teorie Cancer immune editing (tj. editace nádoru imunitním systémem), formulované na základě analýzy poznatků získaných při pokusech na RAG deficientních myších. Z těch vyplývá, že imunitní systém působí neustálým selekčním tlakem, který vede nejen k eliminaci nádorových buněk, ale i k utváření imunogenního fenotypu nádoru. Výsledkem je selekce takových forem transformovaných buněk, které dokážou uniknout efektorovým mechanismům imunitního systému. Teorie popisuje tři úrovně vztahu mezi nádorovou buňkou a imunitním systémem: eliminace nádorové buňky Alergie 3/

3 Obr. 2: Imunoterapeutické přístupy v léčbě nádorových onemocnění. CTLA-4, cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4; PD-1, programmed cell death 1; IL, interleukin; CTL, cytotoxický T-lymfocyt; TIL, tumor infiltrující lymfocyt; CAR, chimerický antigenní receptor (elimination), ustanovení rovnováhy mezi nádorovou buňkou a organismem (equilibrium) a únik nádorové buňky před kontrolou imunitního systému (escape) (obr. 1). Většina nádorových buněk je rozpoznána a eliminována v raných stadiích transformace. V některých případech tímto proces nádorového bujení nekončí a může tak přejít do dalších fází. Ve fázi equilibria je imunitní systém a nádorová buňka v dynamické rovnováze, kdy systém kontroluje růst nádoru, ale zároveň selekčním tlakem umožní vznik nových genotypů nádorových buněk. U nich může dojít k fázi úniku před imunitními mechanismy, která je charakteristická nekontrolovatelnou expanzí nádorových buněk, a tedy klinickou manifestací onemocnění. Nejdelším procesem je fáze ustanovení rovnováhy, která se klinicky shoduje s preneoplastickým onemocněním. Výsledkem tohoto stadia můžou být tři různé situace: 1. úplná eliminace nádorových buněk, 2. dlouhodobé, možná stálé udržení dynamické rovnováhy mezi aktivní imunitní odpovědí a vymezenou populací nádorových buněk, 3. únik před kontrolou imunitní reakce a rozvoj klinického onemocnění (9,10). Již výše zmíněná ambivalence imunitního systému poukazuje na fakt, že ideální načasování imunoterapie je nejlepší v časnějších stadiích karcinogeneze. Možnosti protinádorové imunoterapie Na základě poznatků získaných na experimentálních modelech se protinádorová imunoterapie v současnosti koncipuje do tří základních linií výzkumu a terapeutického využití: strategie využívající nespecifickou stimulaci imunitního systému; protinádorové vakcíny a adoptivní buněčná terapie (obr. 2). Snahou těchto imunoterapeutických přístupů je navodit efektorové mechanismy namířené proti nádorové tkáni, které by vedly k eliminaci nádorových buněk nebo ke kontrole jejich růstu. Následující statě se zabývají principy a možnostmi aplikace jednotlivých strategií. Obecný mechanismus nespecifické stimulace spočívá v podpoře základních funkcí imunitního systému, nezávisle na specifitě nádorového antigenu. Mezi nespecifické imunostimulační metody patří systémová aplikace imunomodulačních cytokinů jako např. interleukinu-2 (IL-2) nebo interferonu α (IFN-α) (13,14), které mohou navodit zvýšenou cytotoxickou aktivitu efektorových T-lymfocytů a NK buněk. Dosud se používá Bacille Calmette-Guérin (BCG) v léčbě karcinomu močového měchýře (15). Perspektivní variantou je využití humorálních složek imunity, které inhibují 206 Alergie 3/2013

4 efektorové funkce molekul imunologické kaskády. Jedná se o monoklonální protilátky proti CTLA-4 ipilimumab (cytotoxic T lymphocyte antigen 4) a dalším molekulám z rodiny B7, jako je programmed cell death protein 1 (PD-1), programmed cell death protein ligand 1 (PDL-1) nebo kostimulační molekula CD276. Ipilimumab byl v r schválen úřadem FDA pro léčbu metastatického melanomu a zkouší se u dalších nádorů jak v monoterapii, tak i v kombinaci s dalšími imunopreparáty např. s poxvirovou vakcínou PROSTVA- C-VF s GM-CSF (NCT ). Ve fázi I klinické studie metastatického melanomu je i testování dvojité blokády CTLA-4 (ipilimumab) a PD-1(MDX-1106) (NCT ). Dalším přístupem je manipulace T-regulačních lymfocytů s cílem zvýšení účinnosti protinádorových imunitních mechanismů pacienta (16). Velmi slibnou oblastí specifické aktivní imunoterapie se zdá být využití tzv. protinádorových vakcín, jejichž předností je nízká toxicita. Cílem vakcinace je indukce tumor specifických T-lymfocytů zvýšenou nabídkou nádorových antigenů imunitnímu systému. Existuje několik přístupů, jak dosáhnout tohoto účinku, od podání jednoduché peptidové vakcíny až po komplexní buněčné systémy s využitím dendritických buněk (DC) pulzovaných nádorovou RNA (17), lyzáty autologních tumorů (18), nebo nádorovými liniemi (19). Prvním schváleným preparátem z této oblasti je Sipuleucel-T (Provenge ) (20). Cílovou skupinou registrační studie byli pacienti ve stadiu kastrát rezistentního karcinomu prostaty, kterým byla aplikována tato autologní vakcína připravená in vitro kultivací antigen-prezentujících buněk s fúzním proteinem prostatické kyselé fosfatázy a faktoru stimulujícího růst granulocytů a makrofágů (GM-CSF). Výsledkem randomizované, placebem kontrolované studie fáze III je prodloužení mediánu celkového přežití o 4,1 měsíce (25,8 vs. 21,7 měsíce). Vakcinace je obecně velmi dobře tolerovaná, s mírnými nežádoucími účinky (zimnice, horečka, únava). Na základě těchto výsledků se Provenge stal první imunoterapeutickou vakcínou, která byla schválená FDA (Food and Drug Administration) a uvedena na severoamerický trh v indikaci léčby karcinomu prostaty. Nedávno publikovaná randomizovaná studie testovala účinky terapeutické vakcíny, která je selektivně cílená na patologické B-buňky folikulárního lymfomu (21). Vakcína u pacientů zlepšuje odpověď na konvenční chemoterapii a signifikantně prodlužuje dobu přežívání bez relapsu (disease-free survival). Slibné výsledky v použití protinádorových vakcín přinesla nedávná studie D. Schwartzentrubera a kol., kde kombinace standardní léčby a terapeutické vakcíny (z peptidu gp100) zdvojnásobila léčebnou odpověď a prodloužila dobu bez progrese onemocnění (progression-free survival) o 2,2 měsíce u pacientů s metastatickým melanomem (22). Dalším příkladem protinádorových vakcín, které vstoupily do fáze III klinických studií, je poxvirová vakcína cílená na prostatický specifický antigen (PSA) u pacientů s karcinomem prostaty (20), dále peptidová vakcína cílená na MAGE-A3 (melanome-associated antigen 3) nebo na glykoprotein MUC-1 (mucin-1) u pacientů s nemalobuněčným karcinomem plic (NCT ). V rámci aktivní buněčné imunoterapie je současný výzkum orientován na možnost terapeutického využití tzv. adoptivního buněčného transferu antigen specifických T-lymfocytů (Adoptive Cell Transfer, ACT), který představuje doplnění imunitního systému pacienta ex vivo modifikovanými a aktivovanými imunitními efektory. Zdrojem transferovaných lymfocytů může být přímo nádorová tkáň (tzv. Tumor Infiltrating Lymphocytes TILs), nebo periferní krev či lymfatické uzliny, zejména po indukční terapii protinádorovými vakcínami (obr. 3). In vitro expanze a polyklonální aktivace tumor specifických lymfocytů se nejčastěji provádí pomocí monoklonální protilátky anti-cd3, která simuluje antigenní signál přes T-buněčný receptor (TCR). Stejného účinku lze dosáhnout i pomocí kombinace protilátek anti-cd3 a anti-cd28 (23). Výhodou manipulace s buňkami ex vivo je fakt, že umožňuje obejít endogenní regulační mechanismy a vyhnout se možnému supresivnímu vlivu nádorového mikroprostředí. V ACT protokolech jsou nejčastěji generovány vysoké počty (až ) antigen specifických cytotoxických T-lymfocytů (CTL) nebo TILs buněk. K expanzi buněk se využívají vysoké dávky IL-2, který je autokrinním růstovým faktorem T-lymfocytů a jehož přítomnost prodlužuje délku trvání buněčné odpovědi a zvyšuje tak účinnost ACT terapie. První důkazy o účinnosti adoptivní buněčné terapie byly publikovány v několika klinických studiích již v devadesátých letech minulého století. Jednalo se o podání dárcovských lymfocytů pacientům s relapsem chronické myeloidní leukemie po alogenní transplantaci kostní dřeně, které vedlo u většiny pacientů ke kompletní remisi onemocnění (24,25). Podobný efekt této metody byl také zaznamenán v léčbě pacientů s EB- V-asociovanými malignitami, s relapsem leukemie po transplantaci kmenových buněk a v některých případech v léčbě metastatického melanomu (shrnuto v (26)). Paradoxem zůstává fakt, že i přes prokazatelnou terapeutickou účinnost se adoptivní buněčný transfer zatím nestal standardním léčebným postupem schváleným FDA. Adoptivní T-buněčná terapie CTL terapie Pilotní studie adoptivního buněčného transferu se snažily charakterizovat fenotypové a funkční vlastnosti T-lymfocytů, které ovlivňují úspěšnost léčby. Bylo prokázáno, že cytotoxické CD8+ T-lymfocyty (CTL) v kooperaci s CD4+ T-lymfocyty jsou schopny specificky rozpoznat nádorový antigen a mohou tak cíleně působit na nádorové buňky. Významný pokrok byl učiněn také díky identifikaci řady nádorových antigenů exprimovaných na lidských tumorech. Experimentální práce poukázaly na významnou asociaci mezi aviditou T-lymfocytů k nádorovému antigenu in vitro a efektivitou ACT terapie in vivo (28,29). Při adoptivní terapii cytotoxickými T-buňkami jsou lymfocyty senzitizovány daným nádorovým antigenem in vitro nebo in vivo. Proces dále pokračuje selekcí tumor-reaktivních CTL a jejich expanzí na terapeuticky významné množství. Nejlepších výsledků adoptivního transferu CTL bylo dosaženo Alergie 3/

5 Obr. 3: Schéma možností adoptivního transferu in vitro expandovaných T-lymfocytů (upraveno dle (27)). Pacientovi je podána protinádorová vakcína, po níž následuje izolace vakcínou indukovaných lymfocytů. Autologní T-lymfocyty izolované z periferní krve (A) nebo ze spádových lymfatických uzlin (B) jsou in vitro aktivovány, namnoženy a podány zpět pacientovi. Pro zvýšení účinnosti léčby pacienti podstupují lymfodepleční chemoterapii. Protinádorová antigenně specifická odpověď se měří po podání posilující booster vakcíny. T-lymfocyty mohou být získány přímo z nádorové tkáně (C). Účinnost TIL transferu může být zvýšena následnou infuzí interleukinu 2, čímž lze prodloužit in vivo proliferaci a prodloužit přežití transferovaných buněk. PBMC, mononukleární buňky periferní krve; HSC, hematopoetická kmenová buňka v léčbě a prevenci virem-asociovaných malignit. Infekce virem Epstein-Baarove (EBV), při níž je replikace viru kontrolována specifickými CTL, představuje riziko vzniku imunoblastického lymfomu u pacientů po alogenní transplantaci kostní dřeně. Aplikace EBV-specifických lymfocytů vedla k rejekci lymfomu a obnovení imunitních reakcí namířených proti EBV (30,31). CTL byly také úspěšně použity v prevenci komplikací způsobených infekcí cytomegalovirem (CMV). Tato oportunní infekce se vyskytuje u pacientů po alogenní transplantaci a koreluje s absencí CMV-specifických T-lymfocytů. Adoptivní transfer CMV-specifických CTL klonů izolovaných z dárce transplantátu umožní restaurovat imunitu vůči cytomegaloviru (32) a zabraňuje tak posttransplantačním komplikacím. Vývoj metodických postupů zaměřených na antigeny, které nejsou virového původu, je komplikovanější. Mnohé z těchto antigenů mají nízkou aviditu k TCR, patří mezi autoantigeny přispívající k toleranci imunitního systému, jsou anergizované nebo existuje jen malé množství CTL specifických vůči těmto antigenům. Jsou to především studie na metastatickém melanomu, které demonstrovaly vzájemný vztah mezi navozením antigenně specifické odpovědi a klinickou účinností léčby (33). Pozitivní efekt ve smyslu infiltrace transferovaných T-buněk do kožní i nádorové tkáně byl pozorován po podání autologních CD8+ lymfocytů cílených na nádorový antigen MART-1 spolu s nízkou dávkou IL-2 (34). Yee a kol. tak přinesli první důkazy o tom, že transferované CTL se in vivo přednostně lokalizují do míst s cílovým antigenem v nádorové i normální tkáni. Tento výsledek potvrdila fáze I klinické studie metastatického melanomu, která detekovala MART-1 reaktivní T-lymfocyty v místech nádoru pomocí specifických tetramerů. Indukovaná klinická odpověď byla zaznamenána u tří z jedenácti pacientů, u kterých klony CTL perzistovaly v periferní krvi několik týdnů po adoptivním transferu (35). TIL terapie Zdrojem buněk pro adoptivní transfer jsou v tomto případě tumor infiltrující lymfocyty (TILs) izolované přímo z nádorové tkáně, nejčastěji z lymfatických uzlin infiltrovaných nádorovými buňkami. Před reinfuzí pacientovi můžou být TILs in vitro dále manipulovány a pomnoženy. Potenciál adoptivního transferu TILs byl v minulosti prokázán na zvířecích modelech (36), nicméně humánní klinické studie, až na výjimku (37) moc úspěšné nebyly (38,39). Otázkou byla diskrepance nálezů a nejvíce 208 Alergie 3/2013

6 diskutovaným důvodem byla krátká doba přežívání transferovaných buněk in vivo. Posun nastal až po zavedení lymfodeplečních režimů před samotnou aplikací ACT. Významných úspěchů s tímto postupem dosáhla vědecká skupina kolem M. E. Dudleye a S. A. Rosenberga při léčbě pacientů s metastazujícím maligním melanomem. Objektivní klinická odpověď byla zaznamenána u více než 50 % pacientů, kteří před adoptivním transferem podstoupili non-myeloablativní chemoterapii (cyklofosfamidem a fludarabinem) a byla jim podána vysoká dávka IL-2 (40). Tento režim u pacientů navodil přechodnou myelosupresi a krátkodobě eliminoval lymfocyty cirkulující v oběhu. Pacientům se následně obnovila aktivita a funkce kostní dřeně a jejich lymfocytární profil se po 2 3 týdnech po chemoterapii uvedl do původního stavu (41). Stejná vědecká skupina dosáhla téměř identických výsledků i ve své následující studii (42). Nicméně nutnost současného podání vysokých dávek IL-2 souvisela s řadou nežádoucích účinků. Ty byly odstraněny, jestliže se dávka IL-2 potřebná pro dlouhodobé přežití TILs in vivo snížila na koncentraci IU a byla podána subkutánně. Podání autologních TILs bylo úspěšně testováno i u pacientů s renálním karcinomem, kde léčebná odpověď dosahovala až 43 % (43). Příznivý léčebný efekt detekovaný u pacientů s maligním melanomem nebo renálním karcinomem zřejmě souvisí s vyšší imunogenicitou těchto typů nádorů (38, 44). Využití TILs pro adoptivní transfer přináší několik výhod: buňky nepodléhají žádným genetickým změnám během své expanze a zároveň si zachovávají vysoký stupeň specifické protinádorové reaktivity (33,45,46). Tato metoda má však i svá technická omezení: od každého typu nádoru nelze získat vzorek tkáně, navíc pouze % bioptických vzorků poskytuje T-lymfocyty vhodné ke kultivaci (47). Limitujícím faktorem je také dlouhá kultivační doba potřebná pro produkci dostatečného množství TILs. Terapie se tak stává časově a finančně náročná, což lze považovat za hlavní omezení aplikace v širší klinické praxi. Na druhé straně je zajímavé uvést i druhý pohled na TILs, a to s ohledem nejen na jejich terapeutické využití. Publikované studie na ovariálním a kolorektálním karcinomu prokázaly, že přítomnost tumor infiltrujících lymfocytů v nádorové tkáni pozitivně koreluje s dobou přežívání pacientů a že na základě charakterizace infiltrátu imunokompetentních buněk je možné predikovat relaps onemocnění. Galon ve svých studiích s kolorektálním karcinomem demonstroval, že odhad nebo stratifikace rizika progrese nemoci tímto způsobem je dokonce přesnější než klasická histologie a TNM klasifikace (48,49). Geneticky modifikované T-lymfocyty V případech, kdy nádor nemůže sloužit jako primární zdroj buněk, se zkouší technika genetické modifikace T-lymfocytů (50). Transferované T-lymfocyty jsou upraveny in vitro transdukcí pomocí virového vektoru, který vnese do genomu T-lymfocytů sekvenci DNA kódující modifikovaný povrchový receptor. Takto modifikovaný T-lymfocyt exprimuje αβ TCR heterodimer, s žádanou specifitou a aviditou k nádorovému antigenu. První studie, provedené v Národním onkologickém institutu, se zaměřily na adoptivní transfer T-buněk s receptorem pro MART1 (melanoma antigen recognized by T cells 1) a gp100 antigen % pacientů s metastatickým melanomem vykazovalo objektivní klinickou odpověď, bohužel řadu nežádoucích reakcí (vitiligo, akutní uveitida)(51). Povzbudivých výsledků přineslo několik prací s použitím TCR proti germinálním antigenům s nádory asociovaných, jako jsou NY-ESO1 (52,53), MAGE-A1 (53) a MAGE-A3 (54). V posledních letech se objevují klinické studie využívající adoptivní transfer pomocí T-lymfocytů exprimujících chimérický antigenní receptor (CAR), který ke své aktivaci nevyžaduje vazbu nádorového antigenu na molekuly MHC (55). Extracelulární část CAR je tvořena variabilní doménou monoklonální protilátky (scfv), která zajišťuje specifickou vazbu antigenu. Struktura intracelulární části receptoru prošla několika stupni vývoje. První generace CARs (zvaná T bodies ) měla intracelulární signalizační doménu z CD3ξ řetězce nebo FcεRIγ. Využití těchto CARs neprokázalo významnější klinický přínos. Druhé generaci byly pro zlepšení aktivačního signálu přidány cytosolické domény z různých kostimulačních receptorů (např. CD28, CD137) (shrnuto v (56)). Na preklinických modelech bylo demonstrováno, že takto modifikované T-lymfocyty vykazují lepší protinádorovou aktivitu, zvýšenou proliferaci a produkci cytokinů. Chimérické konstrukty této generace jsou experimentálně využívány např. v léčbě chronické lymfoidní leukemie, akutní lymfoidní leukemie nebo folikulárního lymfomu. K zacílení maligních B-buněk je využíváno CARs modifikovaných T-buněk proti B-buněčnému antigenu CD19 (57). Tento přístup má zatím slibné výsledky s přijatelným cytotoxickým účinkem. V současnosti probíhá také fáze I klinické studie pacientů s karcinomem prostaty (NCT ), zaměřená na adoptivní transfer autologních chimérických T-lymfocytů cílených proti prostatickému specifickému membránovému antigenu (PSMA). Nyní probíhají klinické testy s použitím nejnovější třetí generace CARs, která má endodoménu tvořenou kombinací dvou kostimulačních domén, nejčastěji CD28 a CD137 nebo CD28 a CD134. Použití geneticky modifikovaných T-receptorů s sebou bohužel přináší i riziko nežádoucích vedlejších účinků. Tvorba TCR z endogenních a transgenních řetězců může vést ke vzniku nových forem autoreaktivních receptorů, vyvolávajících autoimunitní onemocnění. Dalším úskalím je toxické působení CAR modifikovaných T-buněk, které napadají zdravé tkáně exprimující stejné cílové antigeny, jaké jsou obsaženy v nádorových buňkách. Ke zmírnění těchto účinků by mohla přispět tzv. sebevražedná genová terapie, která využívá modifikované T-lymfocyty exprimující sebevražedné molekuly. Jako první byla úspěšně provedena metoda vnesení genu pro tymidin kinázu z herpes simplex viru (HSV-TK) při transplantaci hematopoetických kmenových buněk (58). Ta byla navržena tak, aby podáním léku (acyklovir nebo gancyklovir) došlo k aktivaci takto modifikovaných buněk a jejich následné apoptóze. V současné době probíhá klinické testování dalších kandidátních sebevražedných genů. Alergie 3/

7 Tab. 1: Možnosti vylepšení adoptivní T-buněčné terapie (převzato z (27)). CTLA-4, cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4; PD-1, programmed cell death 1; PD- L1, pregrammed cell death ligand 1; IL, interleukin; TGF-β, transforming growth factor β Strategie Ref. Adjuvans pro navození a udržení Th1 buněčné odpovědi (např. podáním endotoxinu) [68] Podání protilátek vedoucích k zablokování CTLA-4 [69] Podání protilátek vedoucích k zablokování PD-L1 PD-1 interakcí [70] Podání protilátek pro podporu 4-1BB signálu [71] Aplikace cytokinů (např. IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, IL-21) [13] Podání antagonistických cytokinů (např. zablokování nebo inhibice TGF-β) [72] Infuze CD4+ T-lymfocytů pro podporu T-buněčných cytotoxických funkcí [73] Lymfodeplece pacienta [65, 67] Deplece T-regulačních buněk pacienta [16] Transplantace nonmyeloablativních kmenových buněk pro usnadnění transferu alogenních T-buněk [74] Kryoablace [75] Inhibice fosfodiesterázy-5 [76] Vakcinační terapie [62, 63] Kombinace ACT a nádorových vakcín Další možností, jak zvýšit protinádorovou imunitní odpověď, je kombinovaná terapie adoptivního transferu tumor specifických T-buněk a vakcín. Tato metoda využívá schopnosti vakcíny indukovat efektorové antigen specifické T-lymfocyty, které mohou být izolovány, ex vivo expandovány a následně zpět podány pacientovi. Na myších modelech bylo demonstrováno, že adoptivní T-buněčná terapie zvyšuje účinek terapeutických vakcín (59,60). První humánní testy byly provedeny u hematologických malignit. Výsledkem byla rapidní rekonstituce lymfocytů u pacientů s non-hodgkinovým lymfomem, kteří podstoupili transplantaci CD34+ hematopoetických kmenových buněk následovanou infuzí autologních ex vivo expandovaných T-lymfocytů (61). Fáze I/II randomizované studie provedená Rapoportem a kol. (62) byla navržena tak, aby analogicky otestovala možný přínos této strategie u mnohočetného myelomu. Pacientům byla podána pneumokoková vakcína Prevenar a poté jim ve dvou intervalech (14 nebo 100 dní) byly odebrány a ex vivo expandovány indukované T-lymfocyty. Po následné transplantaci kmenových buněk jim byly takto generované autologní T-lymfocyty injikovány zpět do těla. Pouze u pacientů, kteří obdrželi ex vivo-expandované T-lymfocyty, v kratším intervalu po transplantaci došlo k rekonstituci lymfocytů. Výstupní data této pilotní studie ukázala, že terapie sestávající se z vakcíny podané před transplantací a časného adoptivního transferu zlepšuje imunodeficitní stav pacienta během jednoho měsíce po transplantaci. Dalším terčem testování se stal maligní melanom a renální karcinom. Na základě poznatků z preklinických studií byla provedena fáze I klinické studie, ve které byla pacientům aplikována vakcína z ozářených autologních nádorových buněk s bakteriálním adjuvans (63). Za několik dní byly vakcínou indukované T-lymfocyty použity pro adoptivní transfer. Tato metoda vedla k částečné regresi tumoru u 1 z celkem 11 pacientů s metastatickým melanomem. U pacientů s renálním karcinomem byly zaznamenány dvě kompletní a dvě částečné regrese nádoru z celkových dvanácti (63). Uvedené výsledky ukazují na klinický benefit této strategie. Možnosti vylepšení ACT Na úspěšnost adoptivní buněčné terapie má vliv řada faktorů. Byl popsán přímý vztah mezi počtem transferovaných buněk a úspěšností léčby. Důležitý je i fenotyp transferovaných buněk. Bylo prokázáno, že efektorové paměťové T-lymfocyty (TEM) mají sice zesílenou efektorovou funkci, ale jsou náchylné k aktivací indukované buněčné smrti (AICD) a po transferu přežívají jen krátkodobě (34). Experimentální studie prováděné na animálních modelech naopak naznačují, že podání centrálních paměťových T-buněk (TCM) vede k rejekci nádoru a zajistí dlouhodobou imunitní odpověď. Detailnější fenotypová analýza expandovaných lymfocytů se zaměřuje především na znaky spojené s efektorovými funkcemi a schopností přežívání lymfocytů v podmínkách in vivo. Z publikovaných dat vyplývá, že žádaná je indukce tzv. early/intermediate lymfocytů, které se vyznačují ko-expresí molekul CD27, CD28 a CD62L a naopak absencí molekuly CD57. Ukazuje se, že při vysokých hladinách exprese znaků CD27 a CD28 perzistují transferované T-lymfocyty v krvi déle (64). Naopak nízká exprese znaku CD57 demonstruje, že daná populace není terminálně 210 Alergie 3/2013

8 diferenciovaná v efektorové buňky, a nemá tedy omezenou proliferační kapacitu. Dříve pacienti podstupovali ACT bez předchozí chemoterapie, docházelo však k nežádoucím efektům způsobovaným regulačními T-lymfocyty. Zablokování negativních regulačních mechanismů zodpovědných za udržování imunologické tolerance lze dosáhnout prostřednictvím α-cd25 neutralizačních protilátek nebo farmakologicky. Zavedení lymfodeplečních režimů předcházejících transferu vedlo k eliminaci těchto supresorových faktorů a k významnému prodloužení přežívání transferovaných lymfocytů (40,65). Poskytlo také prostor pro rekonstituci protinádorových efektorových buněk. Tento postup byl úspěšný například při léčbě pacientů s maligním melanomem (40) a lymfomem, ale představuje i možnost léčby dalších typů nádorů. Je zvažována i další manipulace s organismem pacienta ve smyslu eliminace dalších buněk (B, T a NK), které by mohly soupeřit s těmi transferovanými o důležité homeostatické cytokiny, jako jsou IL-7 a IL-15 (66,67). Možnosti podpůrných metod adoptivního transferu jsou shrnuty v tabulce 1. Alergie 3/2013 Závěr Imunoterapeutické metody si postupně hledají své pevné místo v léčbě nádorových nemocí. Trendem se stává individualizovaná a více cílená imunoterapie, která především díky rozvoji v molekulárních, genetických a biotechnologických oblastech udělala v posledních letech obrovský pokrok. Dosavadní ojedinělé úspěchy ACT terapie se staly podnětem pro rozvoj tohoto typu léčby, která se rychlým tempem zdokonaluje. Do budoucna se dá předpokládat, že zjednodušením a optimalizací výrobních procesů bude možné širší uplatnění imunoterapeutických strategií v praxi. Perspektivní možností se zdá být kombinace standardních léčebných metod a moderní buněčné imunoterapie. LITERATURA 1. Rosenberg SA, Dudley ME. Cancer regression in patients with metastatic melanoma after the transfer of autologous antitumor lymphocytes. Proc Natl Acad Sci U S A, Suppl 2: p Balkwill F, Mantovani A. Inflammation and cancer: back to Virchow? Lancet, (9255): p Coley WB. The treatment of inoperable sarcoma with the mixed toxins of erysipelas and bacillus prodigiosus: immediate and final results in one hundred and forty cases. JAMA, : p Paul WE. ed. Fundamental Immunology. Fourth Edition ed. Tumor immunology, ed. Schreiber H 1999, Philadelphia: Lippincott-Raven Burnet, F.M., The concept of immunological surveillance. Prog Exp Tumor Res, : p Shankaran V et al. IFNgamma and lymphocytes prevent primary tumour development and shape tumour immunogenicity. Nature, (6832): p Street SE, Cretney E, Smyth MJ. Perforin and interferon-gamma activities independently control tumor initiation, growth, and metastasis. Blood, (1): p Smyth MJ et al. Differential tumor surveillance by natural killer (NK) and NKT cells. J Exp Med, (4): p Dunn GP, Old LJ, Schreiber RD. The three Es of cancer immunoediting. Annu Rev Immunol, : p Spisek R et al. Imunitní reakce na nádorové buňky a možnosti vakcinace proti nádorům. Vakcinologie, (4): p Zhang X-x et al., T cell activity in glioma chemoresponsiveness and genetics. Gene Ther Mol Biol, : p Dunn GP et al. Cancer immunoediting: from immunosurveillance to tumor escape. Nat Immunol, (11): p Rosenberg SA et al. A progress report on the treatment of 157 patients with advanced cancer using lymphokine-activated killer cells and interleukin-2 or high-dose interleukin-2 alone. N Engl J Med, (15): p Interferon-alpha and survival in metastatic renal carcinoma: early results of a randomised controlled trial. Medical Research Council Renal Cancer Collaborators. Lancet, (9146): p Morales A, Eidinger D, Bruce AW. Intracavitary Bacillus Calmette-Guerin in the treatment of superficial bladder tumors. J Urol, (2): p Curtin JF. Treg depletion inhibits efficacy of cancer immunotherapy: implications for clinical trials. PLoS One, (4): p. e Su Z et al. Immunological and clinical responses in metastatic renal cancer patients vaccinated with tumor RNA-transfected dendritic cells. Cancer Res, (9): p Thumann P et al. Antigen loading of dendritic cells with whole tumor cell preparations. J Immunol Methods, (1-2): p Rozkova D. et al. FOCUS on FOCIS: combined chemo-immunotherapy for the treatment of hormone-refractory metastatic prostate cancer. Clin Immunol, (1): p Kantoff PW et al. Overall survival analysis of a phase II randomized controlled trial of a Poxviral-based PSA-targeted immunotherapy in metastatic castration-resistant prostate cancer. J Clin Oncol. 28(7): p Schuster SJ et al. Vaccination with patient-specific tumor-derived antigen in first remission improves disease-free survival in follicular lymphoma. J Clin Oncol. 29(20): p Schwartzentruber DJ et al. gp100 peptide vaccine and interleukin-2 in patients with advanced melanoma. N Engl J Med. 364(22): p Kalamasz D et al. Optimization of human T-cell expansion ex vivo using magnetic beads conjugated with anti-cd3 and Anti-CD28 antibodies. J Immunother, (5): p Drobyski WR et al. Salvage immunotherapy using donor leukocyte infusions as treatment for relapsed chronic myelogenous leukemia after allogeneic bone marrow transplantation: efficacy and toxicity of a defined T-cell dose. Blood, (8): p Kolb HJ et al. Donor leukocyte transfusions for treatment of recurrent chronic myelogenous leukemia in marrow transplant patients. Blood, (12): p Tey SK, Bollard CM, Heslop HE. Adoptive T-cell transfer in cancer immunotherapy. Immunol Cell Biol, (3): p

9 27. June CH. Adoptive T cell therapy for cancer in the clinic. J Clin Invest, (6): p Alexander-Miller MA, Leggatt GR, Berzofsky JA. Selective expansion of high- or low-avidity cytotoxic T lymphocytes and efficacy for adoptive immunotherapy. Proc Natl Acad Sci U S A, (9): p Shilyansky J et al. Identification of a T-cell receptor from a therapeutic murine T-cell clone. J Immunother, (4): p Riddell SR et al. Restoration of viral immunity in immunodeficient humans by the adoptive transfer of T cell clones. Science, (5067): p Heslop HE et al. Long-term restoration of immunity against Epstein-Barr virus infection by adoptive transfer of gene-modified virus-specific T lymphocytes. Nat Med, (5): p Walter EA et al. Reconstitution of cellular immunity against cytomegalovirus in recipients of allogeneic bone marrow by transfer of T-cell clones from the donor. N Engl J Med, (16): p Yee C et al. Adoptive T cell therapy using antigen-specific CD8+ T cell clones for the treatment of patients with metastatic melanoma: in vivo persistence, migration, and antitumor effect of transferred T cells. Proc Natl Acad Sci U S A, (25): p Yee C et al. Melanocyte destruction after antigen-specific immunotherapy of melanoma: direct evidence of t cell-mediated vitiligo. J Exp Med, (11): p Mackensen A et al. Phase I study of adoptive T-cell therapy using antigen-specific CD8+ T cells for the treatment of patients with metastatic melanoma. J Clin Oncol, (31): p Greenberg PD. Adoptive T cell therapy of tumors: mechanisms operative in the recognition and elimination of tumor cells. Adv Immunol, : p Kono K et al. Prognostic significance of adoptive immunotherapy with tumor-associated lymphocytes in patients with advanced gastric cancer: a randomized trial. Clin Cancer Res, (6): p Rosenberg SA et al. Treatment of patients with metastatic melanoma with autologous tumor-infiltrating lymphocytes and interleukin 2. J Natl Cancer Inst, (15): p Dreno B et al. Randomized trial of adoptive transfer of melanoma tumor-infiltrating lymphocytes as adjuvant therapy for stage III melanoma. Cancer Immunol Immunother, (10): p Dudley ME et al. Cancer regression and autoimmunity in patients after clonal repopulation with antitumor lymphocytes. Science, (5594): p Dudley ME et al. A phase I study of nonmyeloablative chemotherapy and adoptive transfer of autologous tumor antigenspecific T lymphocytes in patients with metastatic melanoma. J Immunother, (3): p Dudley ME et al. Adoptive cell transfer therapy following nonmyeloablative but lymphodepleting chemotherapy for the treatment of patients with refractory metastatic melanoma. J Clin Oncol, (10): p Figlin RA et al. Treatment of metastatic renal cell carcinoma with nephrectomy, interleukin-2 and cytokine-primed or CD8(+) selected tumor infiltrating lymphocytes from primary tumor. J Urol, (3 Pt 1): p Weiss GR et al. A randomized phase II trial of continuous infusion interleukin-2 or bolus injection interleukin-2 plus lymphokine-activated killer cells for advanced renal cell carcinoma. J Clin Oncol, (2): p Dighiero G. Adverse and beneficial immunological effects of purine nucleoside analogues. Hematol Cell Ther, Suppl 2: p. S Takada K et al. Lymphocyte depletion with fludarabine in patients with psoriatic arthritis: clinical and immunological effects. Ann Rheum Dis, (11): p Dudley ME et al. Generation of tumor-infiltrating lymphocyte cultures for use in adoptive transfer therapy for melanoma patients. J Immunother, (4): p Zhang L et al. Intratumoral T cells, recurrence, and survival in epithelial ovarian cancer. N Engl J Med, (3): p Galon J et al. Type, density, and location of immune cells within human colorectal tumors predict clinical outcome. Science, (5795): p Rosenberg SA. Cell transfer immunotherapy for metastatic solid cancer--what clinicians need to know. Nat Rev Clin Oncol. 8(10): p Johnson LA et al. Gene therapy with human and mouse T-cell receptors mediates cancer regression and targets normal tissues expressing cognate antigen. Blood, (3): p Robbins PF et al. Tumor regression in patients with metastatic synovial cell sarcoma and melanoma using genetically engineered lymphocytes reactive with NY-ESO-1. J Clin Oncol. 29(7): p Willemsen R et al. Redirecting human CD4+ T lymphocytes to the MHC class I-restricted melanoma antigen MAGE-A1 by TCR alphabeta gene transfer requires CD8alpha. Gene Ther, (2): p Chinnasamy N et al. A TCR targeting the HLA-A*0201-restricted epitope of MAGE-A3 recognizes multiple epitopes of the MAGE-A antigen superfamily in several types of cancer. J Immunol. 186(2): p Eshhar Z et al. Specific activation and targeting of cytotoxic lymphocytes through chimeric single chains consisting of antibody-binding domains and the gamma or zeta subunits of the immunoglobulin and T-cell receptors. Proc Natl Acad Sci U S A, (2): p Cartellieri M et al. Chimeric antigen receptor-engineered T cells for immunotherapy of cancer. J Biomed Biotechnol. 2010: p Porter DL et al. Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia. N Engl J Med. 365(8): p Bonini C et al. HSV-TK gene transfer into donor lymphocytes for control of allogeneic graft-versus-leukemia. Science, (5319): p Teshima T et al. Donor leukocyte infusion from immunized donors increases tumor vaccine efficacy after allogeneic bone marrow transplantation. Cancer Res, (3): p Parviz M et al. Successful adoptive immunotherapy with vaccine-sensitized T cells, despite no effect with vaccination alone in a weakly immunogenic tumor model. Cancer Immunol Immunother, (12): p Laport GG et al. Adoptive transfer of costimulated T cells induces lymphocytosis in patients with relapsed/refractory non- Hodgkin lymphoma following CD34+-selected hematopoietic cell transplantation. Blood, (6): p Rapoport AP et al. Restoration of immunity in lymphopenic individuals with cancer by vaccination and adoptive T-cell transfer. Nat Med, (11): p Alergie 3/2013

10 63. Chang AE et al. Adoptive immunotherapy with vaccine-primed lymph node cells secondarily activated with anti-cd3 and interleukin-2. J Clin Oncol, (2): p Huang J et al. Survival, persistence, and progressive differentiation of adoptively transferred tumor-reactive T cells associated with tumor regression. J Immunother, (3): p Rosenberg SA, Dudley ME. Adoptive cell therapy for the treatment of patients with metastatic melanoma. Curr Opin Immunol, (2): p Gattinoni L et al. Removal of homeostatic cytokine sinks by lymphodepletion enhances the efficacy of adoptively transferred tumor-specific CD8+ T cells. J Exp Med, (7): p Klebanoff CA et al. Sinks, suppressors and antigen presenters: how lymphodepletion enhances T cell-mediated tumor immunotherapy. Trends Immunol, (2): p De AK et al. Selective activation of peripheral blood T cell subsets by endotoxin infusion in healthy human subjects corresponds to differential chemokine activation. J Immunol, (9): p Sutmuller RP et al. Synergism of cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4 blockade and depletion of CD25(+) regulatory T cells in antitumor therapy reveals alternative pathways for suppression of autoreactive cytotoxic T lymphocyte responses. J Exp Med, (6): p Barber DL et al. Restoring function in exhausted CD8 T cells during chronic viral infection. Nature, (7077): p Kim JA et al. Divergent effects of 4-1BB antibodies on antitumor immunity and on tumor-reactive T-cell generation. Cancer Res, (5): p Suzuki E et al. Soluble type II transforming growth factor-beta receptor inhibits established murine malignant mesothelioma tumor growth by augmenting host antitumor immunity. Clin Cancer Res, (17): p Hu HM et al. Divergent roles for CD4+ T cells in the priming and effector/memory phases of adoptive immunotherapy. J Immunol, (8): p Childs RW et al. Successful treatment of metastatic renal cell carcinoma with a nonmyeloablative allogeneic peripheral-blood progenitor-cell transplant: evidence for a graft-versus-tumor effect. J Clin Oncol, (7): p Sabel MS et al. Adoptive immunotherapy of breast cancer with lymph node cells primed by cryoablation of the primary tumor. Cryobiology, (3): p Serafini P et al. Phosphodiesterase-5 inhibition augments endogenous antitumor immunity by reducing myeloid-derived suppressor cell function. J Exp Med, (12): p Mgr. Kateřina Vávrová Ústav imunologie Univerzita Karlova, 2. lékařská fakulta V Úvalu Praha 5 katerina.vavrova@lfmotol.cuni.cz Alergie 3/

11 Výsledky testů s klinickým významem Více než 600 alergenů 90 alergenových komponent Panel pro měření 20 autoimunitních onemocnění 60 testů za hodinu Phadia 250 Vyvinuto pro testování alergií a autoimunitních onemocnění Alergie ImmunoCAP specifické IgE ImmunoCAP celkové IgE ImmunoCAP specifické IgG ImmunoCAP specifické IgG4 ImmunoCAP ECP ImmunoCAP tryptáza Autoimunitní onemocnění Revmatoidní Artritida Celiakie Vasculitida Onemocnění pojivové tkáně Antifosfolipidový Syndrom Autoimunitní Tyreoiditida Pro podrobnosti kontaktujte: Phadia s.r.o., Drahobejlova 1019/27, Praha 9 tel./fax: , klara.hruba@thermofisher.com