Lékařská fakulta Univerzity Palackého v Olomouci

Transkript

1 Lékařská fakulta Univerzity Palackého v Olomouci OPTIMALIZACE POLYMERÁZOVÉ ŘETĚZOVÉ REAKCE PRO ZÍSKÁNÍ GENOTYPIZAČNÍCH DAT ZA VYHRANĚNÝCH PODMÍNEK Habilitační práce Mgr. Jiří Drábek, PhD. Olomouc 2007

2 John Donne v 17. století tvrdil, že žádný člověk není ostrov. Pro vědeckou práci ve 21. století to platí také. Děkuji proto svým mladším i starším spolupracovníkům za souhlas s použitím publikovaných článků - našich společných výsledků - pro tuto habilitační práci. Děkuji své ženě za zázemí pro sepsání této práce.

3 Obsah 1. SEZNAM ZKRATEK A POJMŮ ÚVOD ROZSAH POUŽITÍ PCR V LIDSKÉ GENETICE DNA PROFILOVÁNÍ, KONTROLA PŮVODU, URČENÍ RODIČOVSTVÍ A PŘÍBUZNOSTI DETEKCE DĚDIČNÝCH CHOROB A SPECIFICKÝCH POLYMORFISMŮ DETEKCE VIROVÉ, BAKTERIÁLNÍ A HOUBOVÉ INFEKCE GENETICKÉ INŽENÝRSTVÍ: KLONOVÁNÍ GENŮ A CÍLENÁ MUTAGENEZE KVANTIFIKACE NUKLEOVÝCH KYSELIN OMEZENÍ PCR CHYBOVOST POLYMERÁZY DÉLKA CÍLOVÉ SEKVENCE POČÁTEČNÍ MNOŽSTVÍ A KVALITA TEMPLÁTU KONTAMINACE NESPECIFICKÁ VAZBA PRIMERŮ FAKTORY ÚSPĚŠNOSTI PCR REAKCE PRVOČINITELÉ PRIMERY HARDWARE POLYMERÁZA PUFR PCR PROGRAM TEMPLÁT INHIBITORY ENHANCERY KONCEPT UNIVERZALITY PŘÍPADOVÁ STUDIE 1: UZAMČENÁ MEZIDRUHOVÁ QPCR SONDA Úvod Metody Výsledky a diskuse PŘÍPADOVÁ STUDIE 2: MULTIPLEX PCR S NASTAVOVANÝMI PRIMERY PRO IDENTIFIKACI OSOB A URČOVÁNÍ PŘÍBUZNOSTI Úvod Metody Výsledky a diskuse ANOTOVANÉ ČASOPISECKÉ PRÁCE DIVERSITY AMONG WILD TYPE AND VACCINATION STRAINS OF TRICHOPHYTON VERRUCOSUM INVESTIGATED USING RANDOM AMPLIFIED POLYMORPHIC DNA ANALYSIS A COMMENTED DICTIONARY OF TECHNIQUES FOR GENOTYPING BP DELETION IN CCR-5 GENE AND HUMAN IMMUNODEFICIENCY VIRUS EPIDEMIC IN THE CZECH REPUBLIC CHARACTERIZATION OF A NOVEL HLA-A*24 ALLELE CONTAINING AN HLA-A*03 SEQUENCE MOTIF FREQUENCY OF 657DEL(5) MUTATION OF THE NBS1 GENE IN THE CZECH POPULATION BY POLYMERASE CHAIN REACTION WITH SEQUENCE SPECIFIC PRIMERS A STUDY ON THE EFFECTS OF DEGRADATION AND TEMPLATE CONCENTRATION ON THE AMPLIFICATION EFFICIENCY OF THE STR MINIPLEX PRIMER SETS CONCORDANCE STUDY BETWEEN MINIPLEX ASSAYS AND A COMMERCIAL STR TYPING KIT CLASS I TYPING BY PCR-SSP IN OLOMOUC A SUGAR, LAUNDRY DETERGENT, AND SALT METHOD FOR EXTRACTION OF DEOXYRIBONUCLEIC ACID FROM BLOOD SHRNUTÍ PŘEHLED LITERATURY POUŽITÉ... 43

4 1. Seznam zkratek a pojmů AFLP AABB Amplikon Anticipace Antigen ARMS bp BSA Delece Denaturace Deoxyribóza DNA dntps EDNAP EDTA EFI ELISA Enzym Eukaryota FAM FRET Genom Genotyp GMO HLA Chelát Chromozom Imunita Indel Inzerce ISSR-PCR LCN LIF LNA Lokus MGB MSP µtas Nukleotid PCR Protilátka ligací podmíněná amplifikace délkového polymorfismu (Amplified fragment length polymorphism) Americká asociace krevních bank (American Association of Blood Banks) namnožený úsek DNA, většinou pomocí PCR výjimka z mendelovské genetiky, kdy se neurologická nemoc způsobená zvýšeným počtem tripletů zhoršuje (nebo nastupuje dříve) v dalších generacích látka pro daný organismus cizorodá, vzbuzující imunitní odpověď PCR amplifikace podmíněná přítomností konkrétní alely/polymorfismu (Amplification refractory mutation system) páry bazí (basepairs) hovězí sérový albumin (Bovine serum albumine) odstranění nukleotidu z DNA řetězce narušení nejčastější biologické formy molekuly: zde rozpletení dvoušroubovice DNA na jednořetězce (vratná denaturace nukleových kyselin) pětiuhlíkový cukr, přítomný v DNA deoxyribonukleová kyselina, dvoušroubovicové vlákno - molekulární základ dědičnosti deoxynukleotid trifosfáty Evropský odborný panel pro DNA profilování (The European DNA Profiling Group) ethylendiamintetraacetát, chelatační činidlo vychytává dvoumocné kationty Evropská imunogenetioká federace (European Federation for Immunogenetics) test na přítomnost antigenu, provedený pomocí specifických protilátek a enzymatické vizualizace výsledku (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) biologický katalyzátor nadříše organismů složených z buněk, obsahujících jádro a mitochondrie; jádro prochází mitózou, popřípadě meiózou 5-karboxyfluorescein fluorescenční rezonanční přenos energie (Fluorescence resonance energy transfer) kompletní soubor genů jedince, lokalizovaných v jádře soubor konkrétních forem genů jednotlivce, genetická konstituce organismu geneticky modifikované organismy; organismy kromě člověka, jejichž dědičný materiál byl změněn genetickou modifikací lidské tkáňové antigeny (Human leukocyte antigens) organická látka, vytvářející cyklický komplex s kovy vláknitá struktura v eukaryotickém jádře, sestávající z chromatinu a nesoucí lineárně seřazenou genetickou informaci obranyschopnost organismu na buněčné a subbuněčné úrovni založená na rozlišení tělu vlastního od cizího inzerce a/nebo delece vložení, vsazení, vsunutí nukleotidu do DNA řetězce PCR amplifikace úseků mezi repeticemi (Intersequence specific PCR) metody pracujícím s limitně malým množstvím templátu (Low copy number) Laserem indukovaná fluorescence uzamčená nukleová kyselina (Locked nucleic acid) umístění genu na chromozomu interkalátor menšího žlábku dvoušroubovice DNA (Minor Groove Binder) na methylaci templátu citlivá PCR (Methylation Specific PCR) analytická laboratoř na čipu (micro Total Analysis System) monomerní jednotka DNA a RNA, skládá se z purinové nebo pyrimidinové báze, pětiuhlíkového cukru a zbytku kyseliny fosforečné Polymerázová řetězová reakce (Polymerase Chain Reaction), molekulární kopírovací stroj pro kratší úseky DNA imunoglobulinový působek cílené imunity

5 Purin Pyrimidin RACE RAPD Rep Replikace RFLP Ribóza RFLP RNA SBT Sérum SSCP SNP STR Substituce TAIL PCR TWGDAM UNG VNTR heterocyklická dusíkatá sloučenina, zásaditá část nukleotidu; adenin, guanin (výskyt v DNA i v RNA) heterocyklická dusíkatá sloučenina, zásaditá část nukleotidu; cytozin (výskyt v DNA i v RNA), uracil (v RNA), tymin (v DNA) rychlá amplifikace začátku a konce cdna (Rapid amplification of cdna ends) amplifikace polymorfní DNA s neznámými místy vazby primerů (Random amplification of polymorphic DNA, Random amplified polymorphic DNA) repetice (Repetitive sequences) vytváření DNA kopií in vivo, před nebo v průběhu dělení buňky polymorfismus v délce restrikčních fragmentů (Restriction fragment length polymorphism) pětiuhlíkový cukr, přítomný v RNA (riflip) polymorfismus délky restrikčních fragmentů (Restriction Fragment Length Polymorphism) ribonukleová kyselina, většinou jednořetězcové vlákno; polynukleotid s cukrem ribózou a nukleotidem uracilem na rozdíl od deoxyribózy a tyminu v DNA; meziprodukt vyjádření dědičné informace genotypizace sekvencováním (Sequencing based typing) nesrážlivá část krevní plazmy konformační polymorfismus jednořetězců (Single strand conformational polymorphism) bodový polymorfismus/mutace (Single nucleotide polymorphism) krátké tandemové repetice (Short Tandem Repeats), mikrosatelity náhrada jednoho nukleotidu jiným teplotně asymetrická prokládaná PCR (Thermal asymmetric interlaced PCR) Technical Working Group on DNA Analysis Methods uracyl-n glykosyláza Variabilní počet tandemových repeticí (Variable Number of Tandem Repeats)

6 2. Úvod Polymerázová řetězová reakce (Polymerase chain reaction, PCR) je způsob, jak in vitro, enzymaticky, bez účasti živého organismu (kromě lidského činitele) namnožit deoxyribonukleovou kyselinu. PCR je molekulární kopírka pro DNA, která je nedílnou součástí rutiny molekulárního biologa. Dá se říct, že přístroj pro PCR - termocyklér - sám o sobě již definuje základní molekulárně biologickou laboratoř, ať už je součástí mikrobiologického, onkologického, imunologického, kriminalistického nebo akademického pracoviště. Jaká je tedy definice PCR? Můžeme parafrázovat definici editora časopisu Science Dr. D. Koshlanda Jr. z roku 1989, kdy byla termostabilní polymeráza jmenována molekulou roku: Nechť substrátem - cílovou sekvencí, templátem - pro PCR je gen nebo úsek DNA, část celkové DNA vložené do reakce. Za několik (desítek) minut může být tato cílová sekvence milionkrát namnožená následujícím postupem: Napřed jsou komplementární řetězce dvoušroubovicové DNA rozpleteny teplem (denaturovány). Dva krátké kousky syntetické DNA, každý z nich komplementární ke specifické sekvenci na jednom konci cílové sekvence, slouží jako primery, startéry PCR. Každý z primerů se váže k cílové sekvenci dle Watson-Crickova pravidla o párování bází (vždy adenin proti thyminu, cytozin proti guaninu). Polymeráza začne z každého ukotveného primeru syntetizovat nový, dceřinný řetězec podle vzoru cílové sekvence. Za minutu je vytvořena přesná replika cílové sekvence a tím je první cyklus PCR u konce. V dalších cyklech je opětovně rozplétána dvoušroubovice cílové sekvence i jejích replik, primery se znovu komplementárně váží a polymeráza vytváří další repliky cílové sekvence. Po dokončení 30 dalších cyklů je ve směsi DNA fragmentů ve zkumavce obrovský nadbytek cílové sekvence a tato amplifikovaná genetická informace je připravena pro další analýzu. Z této definice vyplývá geometrický průběh amplifikace cílové sekvence (počet kopií = 2 počet cyklů ) za předpokladu 100% účinnosti PCR. Takovéto účinnosti se můžeme za ideálních podmínek přiblížit jen v prvních dvaceti, pětadvaceti cyklech PCR. Pak nastává fáze kvazi-lineární a nakonec fáze plató, kdy už množství amplikonu nepřibývá. Z uvedeného však na první pohled není zřejmé, že z obou stran vymezená cílová sekvence je poprvé syntetizovaná až ve třetím cyklu PCR (Obr. 1). V prvním a druhém cyklu nejméně jeden řetězec končí na nedefinovaném místě, kde se polymeráza odpojí od templátu. To bývá před dosažením konce templátu a odpovídá to jednomu z parametrů polymerázy její procesivitě. Obrázek 1: Schéma prvních tří cyklů množení cílové sekvence pomocí PCR První cyklus Dvoušroubovicový DNA templát Denaturace, 94 C Hybridizace primerů, 65 C Extenze primerů, 72 C (konec prvního cyklu) 6

7 Konec druhého cyklu Dvoušroubovice z templátového řetězce a řetězce definovaného z jedné strany Dvoušroubovice z řetězce definovaného z jedné strany a řetězce definovaného z obou stran Konec třetího cyklu Dvoušroubovice z templátového řetězce a řetězce definovaného z jedné strany Dvoušroubovice z řetězce definovaného z jedné strany a řetězce definovaného z obou stran Dvoušroubovice definovaná z obou stran Výše uvedené schéma zjednodušuje; pro představu složitosti systému a počtů složek v jediné stomikrolitrové PCR zkumavce uvádím příklad amplifikace 500 bp fragmentu fága lambda (Tab. 1). Tabulka 1: Popisná statistika počátku a konce PCR Před PCR Po PCR Váha Σ molekul Váha Σ molekul Templát (50 kbp) 1 ng 1,9* ng 1,8*10 7 Cílová sekvence (500 bp) 10 pg 1,8* µg 1,8*10 12 Primery (21-mery) 1,4 µg 1,2* ,3 µg 1,2*10 14 dntps 39 µg 4,8* µg 4,6*10 16 Mg 2+ 3,6 µg 9,0* ,6 µg 9,0*10 16 Taq polymeráza 12,5 ng 8,0* ,5 ng 8,0*10 10 Upraveno podle Applied Biosystems, USA. Pokud se podíváme na změnu množství reagencií v průběhu PCR, je zřejmé, že příčinou plató fáze nemohou být spotřebované reagencie, přestože se to někdy nepřesně uvádí. Příčinou plató je renaturace amplikonů a templátu (1) spolu s nespecifickou vazbou polymerázy k dvoušroubovicové DNA (2). Pokud chceme PCR ukončit a vyhodnotit před plató fází, je řešením vysoce citlivá, laserem indukovaná fluorescence (LIF) v zobrazovacím kroku. Citlivost a specifičnost ustanovila PCR jako preferovaný způsob namnožení nukleové kyseliny, jejíž sekvenci dopodrobna známe (3), jejíž sekvenci známe jen útržkovitě (4) anebo o jejíž sekvenci se můžeme jen dohadovat (5;6) (Obr.2). 7

8 Obrázek 2: Varianty PCR Rozepsání akronymů: AFLP Amplified fragment length polymorphism, ARMS Amplification refractory mutation system, ISSR Intersequence specific PCR, MSP - Methylation Specific PCR, RACE Rapid amplification of cdna ends, Rep Repetitive sequences, RAPD Random amplification of polymorphic DNA, RFLP Restriction fragment length polymorphism, SSCP Single strand conformational polymorphism, STR Short tandem repeats, TAIL Thermal asymmetric interlaced PCR. Alternativní amplifikační technologie jako je Cycling probe technology, Helicase dependent amplification, Transcription based amplification system, Ramification amplification, Nucleic acid sequence based amplification (Self-sustained sequence replication), Q beta replication, Ligase chain reaction, Strand displacement amplification a Boomerang DNA amplification (7) se ve srovnání s PCR prosadily jen v úzkých vědeckých komunitách. Celkový přehled PCR modifikací a fines by vydal na knihu. Ostatně, mnoho takových knih již bylo vydáno (viz proto se v další části této práce zaměřím jen na ty části teorie PCR, které se přímo dotýkají mé osobní zkušenosti s PCR. Předkládaná habilitační práce je mým holdem PCR - švýcarskému noži každého laboratorního pracovníka, který se zaobírá nukleovou kyselinou. Práce sestává ze souboru devíti původních časopiseckých prací s důležitým metodickým aspektem (kde jsem prvním nebo druhým autorem) a z nových, zatím nepublikovaných vědeckých poznatků ve formě dvou případových studií. Všechny práce se zabývají využitím polymerázové řetězové reakce ke genotypizaci lidské DNA, a proto jsou zarámovány výběrovým přehledem o PCR. 8

9 3. Rozsah použití PCR v lidské genetice Polymerázová řetězová reakce může být umístěna na rozdílných místech časové osy analýzy nukleové kyseliny. Může se použít jako první, amplifikační krok před důkladnější analýzou nukleotidové sekvence. Pak je to jen potlačení informačního šumu z nadbytku sekvencí, které nás nezajímají; prvotní zaostření na cílovou sekvenci, kterou dále analyzujeme sekvencováním (SBT, Sequencing based typing), hybridizací se sondami (SSO, Sequence specific oligonucleotides) nebo reakcí se sekvenčněspecifickými enzymy (PCR-RFLP, Restriction fragment legth polymorphism) (7). PCR může být použita i jako druhý krok analýzy nukleové kyseliny například tehdy, pokud je objektem našeho zájmu exprese genové informace. RNA si reverzní transkripcí nejprve přepíšeme do komplementární DNA, a tu pak teprve amplifikujeme. Jinou možností je předřazení štěpícího, popřípadě ligačního krok (AFLP, Amplified fragment length polymorphism; Ligation-mediated PCR) (8). PCR může být také použita jako jediný specifický krok analýzy DNA, jako extrakce informace, zakódované v řetězci DNA. Články 1, 2 Pokud se na PCR podíváme z pohledu specializace uživatele, můžeme aplikace PCR rozdělit na profilovací, detekční, geno-inženýrské a kvantifikační DNA profilování, kontrola původu, určení rodičovství a příbuznosti DNA profilování je forenzní technika identifikace osob (zvířat, rostlin, hub) porovnáním referenční DNA s DNA testovaného vzorku (z místa činu). Dříve byla tato metoda zvaná genetické otisky prstů, protože konečný krok analýzy elektroforéza - generoval charakteristické (individuálně specifické) proužkové vzory, vzdáleně podobné papilárním liniím na prstech. Pro DNA profilování se využívají délkové polymorfismy (Short tandem repeats), dané rozdílným počtem opakování krátkého sekvenčního motivu mezi jedinci. Metoda je vhodná nejen pro kriminalistiku a určování otcovství (a to s účinností i přes uběhlá staletí (9)) ale i pro zjišťování evoluční příbuznosti (sestrojování fylogenetických stromů) a pro kontrolu původu potravinářských surovin (identifikace pytláckého úlovku, který skončil na jídelním lístku restaurace). Pro detekci geneticky modifikovaných organismů se namísto mikrosatelitů využívají sekvence vnášeného genu anebo pomocné sekvence (např. promotory) (10) Detekce dědičných chorob a specifických polymorfismů Pokud 3 konec primeru navrhneme tak, aby hybridizoval s templátovou DNA přesně v místě bodové mutace (Single nucleotide polymorphism, SNP), můžeme ve dvou PCR reakcích, pomocí dvou rozdílných primerů v páru s jedním společným primerem, rozlišit dvě varianty genu. Metoda je známá pod názvy PCR-SSP (PCR Sequence-specific primers), ASP (Allele specific primers), ARMS (Amplification refractory mutation system) a je použitelná k přímé diagnostice dědičných chorob nebo k nepřímé diagnostice pomocí markerů, asociovaných s genem původcem onemocnění. Při sledování genů (alel) asociovaných s infekčními a autoimunními nemocemi celému lidskému genomu vévodí HLA systém (11), na kterém byly pro jeho důležitost při transplantacích prvotně testovány mnohé genotypizační (a bioinformatické) strategie. Články 3, 4, 5, 6 V současné době se těžiště vývoje genotypizačních metod posunulo směrem k analýze binármích bodových polymorfismů (SNP) a jejich asociací (12) pro komerčně nejperspektivnější skupiny genů (jako jsou transportéry a metabolizující enzymy v rámci farmakogenetiky (13;14) anebo nutriční receptory pro aktivizaci proliferace specifických genů v rámci nutrigenomiky (15)) Detekce virové, bakteriální a houbové infekce Metody detekce mikrobů, založené na specifické vazbě protilátky, generované imunitním systémem člověka, k umělému antigenu, spojenému s vizualizační kaskádou (např. ELISA), mohou být vysoce citlivé a vysoce specifické. Mají však jednu nevýhodu časovou prodlevu, než se protilátky vytvoří a objeví v krevním oběhu. PCR, popřípadě Reverse Transcription PCR u RNA-virů, toto období nejistoty může zkrátit a tak vést k rychlejšímu nasazení účinné léčby a epidemiologických opatření (16). Určitým diagnostickým omezením je pozitivní PCR detekce usmrcených mikroorganismů, které lze překonat použitím reverzní transkripce a detekováním exprese. PCR spolu s biosenzory je také nezastupitelná v rychlé detekci bioteroristických agens (17). 9

10 3.4. Genetické inženýrství: klonování genů a cílená mutageneze Při klonování genů (na rozdíl od klonování celých organismů) dochází k namnožení jednotlivého genu pomocí klonovacího vektoru (nejčastěji plazmidu). Vektorové klonování může být transgenozní (rekombinantní) technikou, pokud je gen před vložením do vektoru izolován z jednoho organismu a vložen do druhého organismu (který se tímto stává geneticky modifikovaným). Vytvářet identické kopie (klonovat) geny lze samozřejmě i pomocí PCR. Klonování pomocí plazmidu má však výhody při produkci většího množství klonů je levnější než PCR a zároveň se dá jednoduše vyselektovat věrný, pravý klon. U PCR se pravost klonu (amplikonu) verifikuje zase jen genotypizační technikou. Přesto se ani vektorové klonování bez PCR úplně neobejde: například TA klonování (18) je na PCR přímo postavené a i v jiných případech vložení do vektoru následuje po PCR. Cílená mutageneze je provádění změn v nukleotidové sekvenci DNA, například za účelem sledování vztahů struktura-funkce u genem kódovaných proteinů. Mutageneze pomocí PCR se provádí: inkorporací nekomplementárního nukleotidu na 5 konci primeru vyštěpením modifikovaných nukleotidů (19) randomizovaně - použitím defektní polymerázy cíleněji - pomocí Assembly PCR (20) Kvantifikace nukleových kyselin PCR je vhodnou metodou i tehdy, pokud nám nestačí zjistit pouhou přítomnost/nepřítomnost určité nukleotidové sekvence, ale chceme znát i její množství. Může se jednat o zjišťování počtu přítomných genů (u genové amplifikace při některých nádorech), zjišťování počtu chromozomů (detekce aneuploidie) nebo zjišťování počtu genomů (kvantifikace vstupního templátu před DNA profilováním). Pokud před kvantitativní PCR zařadíme reverzní transkripci (a použijeme dostatečné kontroly), můžeme kvantifikovat i genovou expresi. Přestože semi-kvantifikovat lze i pomocí kompetitivní PCR a agarózové elektroforézy, v současné době vévodí kvantitativní PCR (qpcr) uzavřené, homogenní systémy. Zkumavka se po prvotním namíchání všech reagencií již neotevírá a v reálném čase, za použití laserem indukované fluorescence, se měří množství templátu. Srovnáním průběhu množení amplikonu testovaného vzorku a průběhu množení vnitřní nebo vnější kontroly můžeme extrapolovat k původnímu množství templátu před amplifikací. U všech qpcr platí zásada: systém můžeme považovat za optimalizovaný, pokud je kalibrační křivka diluční řady standardu lineární (r 2 0,98; směrnice -3,323), amplifikace dosahuje vysoké účinnosti (85 až 110 %) a rozptyl výsledků opakovaných vyšetření je nízký. qpcr metody se liší způsobem detekce signálu množení amplikonu, a tím i designem primerů (popřípadě sond). Nejjednodušším případem vizualizace qpcr v reálném čase jsou fluorescenční interkalační činidla, jako je SYBR Green I, který v průběhu PCR vydává signál přímo úměrný narůstajícímu množství dvoušroubovicové DNA. Artefakty PCR - primerové dimery a multimery jsou také dvoušroubovicemi, vydávajícími signál, takže po PCR je nutno amplikon verifikovat analýzou křivky tání (Obr.3) nebo na elektroforéze. 10

11 Obrázek 3: Disociační křivky po qpcr se SYBR Green I Navíc není vazba SYBR Green I k DNA úplně náhodná (21), 1 a proto jsou elegantnější takové kvantifikační metody, kde je generování signálu přímo svázáno se specifickou vazbou k cílové sekvenci templátu. Existuje několik komerčně dodávaných systémů s flouroforem umístěným na sondě (TaqMan, Eclipse, Molekulární majáček) nebo na jednom z primerů (Amplifluor, Scorpions, LUX, BD Qzyme, Tab. 2) (22). V principu se k vyslání signálu využívá oddálení fluorescenčního reportéru od zhášeče anebo naopak přiblížení akceptorové sondy k sondě dárcovské při fluorescenčním rezonančním přenosu energie (FRET). 1 Na rozdíl od interkalátorů nové generace (LCGreen, Syto 9), které se váží pravidelně, nezávisle na sekvenci a nepřeskakují na přilehlá místa nukleové kyseliny v průběhu denaturace. Tatonová generace interkalátorů je vhodná i pro genotypizaci analýzou disociační křivky. 11

12 Tabulka 2: Srovnání qpcr systémů Název Umístění fluoroforu Princip tvorby signálu SYBR Green I amplikon Volný SYBR Green I nezáří, zatímco po vmezeření do dvoušroubovicové DNA vydává fluorescenční signál. TaqMan sonda 5 3 exonukleázová funkce Taq polymerázy odštěpí z hydrolyzační sondy nukleotid se zhášečem a tím se uvolní signál reportérové molekuly, umístěné na druhé straně sondy. Molekulární majáček sonda Vlásenková sonda se vazbou na komplementární sekvenci uvnitř amplikonu natáhne, a tím se dostane reportér z vlivu zhášeče fluorescence. Hybridizační dvojice Eclipse Amplifluor Scorpions LUX BD Qzyme Plexor sondy sonda primer primer primer primer primer Dárcovská fluorescenční sonda se uvnitř amplikonu naváže poblíž akceptorové sondy, a tím dojde k fluorescenční rezonanci. Vlásenková sonda se vazbou na komplementární sekvenci uvnitř amplikonu natáhne, a tím se dostane reportér z vlivu zhášeče fluorescence; vazba k cílové sekvenci je posílena přítomností ligandu menšího žlábku dvoušroubovice (Minor Groove Binder), což umožňuje zkrácení sondy při zachování specifičnosti. 5 konec jednoho ze specifických primerů je prodloužen o univerzální přívěsek (tag, tail, nastavení), který má shodnou sekvenci jako vlásenkový oligonukleotid Uniprimer s fluoroforem a zhášečem; v průběhu amplifikace se Uniprimer natáhne, a tím se dostane reportér z vlivu zhášeče. Jeden z primerů má na 5 konci vlásenkové nastavení s reportérem a zhášečem; v průběhu amplifikace se vlásenka rozplete a její 5 konec se naváže uvnitř cílové sekvence, a tím se dostane reportér z vlivu zhášeče. Na konci specifického primeru (před nastavením) je PCR blok (uvolňovač polymerázy z templátu). Jeden z primerů je ve formě vlásenky, s reportérem umístěným uprostřed. Jako zhášeč funguje sekundární struktura vlásenky, kdy je guanin přiblížen reportéru; v průběhu amplifikace se vlásenka rozplete, a tím se dostane reportér z vlivu zhášeče. Jeden z primerů má na 5 konci zymogenový ocásek (enzymový prekurzor katalytické DNázové DNA), jehož konce jsou komplementární k sondě s reportérem a zhášečem. V průběhu amplifikace zymogen štěpí sondu, a tím se dostane reportér z vlivu zhášeče. Inkorporace Dabcyl-iso-dGTP do amplikonu zhasí fluorescenci reportéru na primeru s iso-dc nukleotidem. 12

13 4. Omezení PCR Polymerázová řetězová reakce je biologický systém, což s sebou nese určitá omezení a možnosti chyb. Vždy musíme počítat s chybovostí inkorporace nukleotidu, s omezením délky amplifikace, omezením kvalitou a množstvím amplikonu, s možností kontaminace a s nespecifickou hybridizací primeru Chybovost polymerázy Nejčastěji používaná termostabilní polymeráza (Taq, z baktérie Thermus aquaticus) nemá korekturskou funkci (3' 5' exonukleázovou aktivitu). To nemusí být na škodu (je to principem metody PCR- SSP/ARMS), ale zároveň to vede k vysoké chybovosti (až 2 báze z 10000), protože nativní (nerekombinantní) Taq polymeráza po sobě nemůže opravit špatně (nekomplementárně) vložený nukleotid. Jiné termostabilní polymerázy (např.: Thermococcus kodakaraensis: polymeráza KOD1; Thermococcus litoralis: Vent, Pyrococcus furiosus: Pfu, Pyrococcus woesii: Pwo) korekturskou funkci mají a dají se použít v aplikacích, kde je vitální věrnost předloze při amplifikaci (například sekvencování). Chyby se dají i enzymaticky opravit (reparačními enzymy MutH, MutL a MutS (23)) Délka cílové sekvence Klasická PCR (se standardní Taq polymerázou) může amplifikovat cílové sekvence do délky 2 kb. Pak se amplifikace stává neúčinnou, protože se polymeráza odpojuje od templátu před dosažením konce cílové sekvence. Ostatně, i v průběhu in vivo replikace se chromozomy duplikují z mnoha míst současně. Amplifikace 50 kb sekvence pomocí PCR je možná: vyžaduje však kombinaci dvou polymeráz (polymeráza Taq a polymeráza s korekturskou funkcí, v poměru 200:1) a graduální prodlužování doby extenze. Efektivní procesivitu polymerázy také zvyšují proteiny, které udržují DNA v jednořetězcové formě (SSB (24), reca (25); mohou být i součástí rekombinantních polymeráz) a reparační enzymy (Reparase, Sigma-Aldrich) Počáteční množství a kvalita templátu Přestože je teoreticky možné spuštění PCR z jediné molekuly cílové sekvence (což je mnohem menší množství než DNA z jediné buňky (26;27)), dostáváme se zde ke stochastickým limitům PCR, kdy úspěšnost amplifikace následuje Poisonnovu distribuci 2 (28) a ke spolehlivému výsledku je potřeba vyšetření zopakovat (29;30). Metody pracující s extrémně malým množstvím templátu (LCN, Low copy number) využívají vyšší počet cyklů PCR a detekci pomocí laserem indukované fluorescence. Jejich citlivost detekce se dá ještě navýšit předřazením amplifikace celého genomu před samotnou PCR (31-35). Z těchto Whole genome amplification metod dává nejrobustnější výsledky technika balancované PCR (36), komerčně dodávaná firmou Sigma-Aldrich pod názvem GenomePlex. Kvalita templátové DNA je rozsah, v jakém je DNA chemicky čistá, nepoškozená DNázami a fyzikálně chemickými vlivy. Zatímco existují postupy na odstranění ko-extrahovaných PCR inhibitorů v templátové DNA, s chemickými modifikacemi a fragmentací DNA se lze vypořádat jen omezeně. Článek Kontaminace Kontaminace obecně znamená znečištění prostředí škodlivými látkami, zamoření. V PCR má význam užší pod kontaminací rozumíme vstup neautorizované cílové sekvence do PCR reakce. Zde se projeví citlivost PCR jako dvousečná zbraň - amplikon předchozí PCR je největším nebezpečím. 2 Pravděpodobnost, že se cílová DNA molekula nachází ve zkumavce, je popsána vztahem: m n e m P( n) =, kde P(n) je pravděpodobnost, že v alikvotu je n molekul cílové sekvence, m je n! průměrný počet molekul cílové sekvence ve vzorku, e je konstanta 2,718. Pokud je průměrně jedna molekula cílové sekvence na alikvot, tak je pravděpodobnost 37 %, že v našem testu se cílová molekula nenachází. 13

14 Veškeré odborné validace laboratoře (které jsou součástí ISO akreditací) pro použití PCR (např. imunogenetická European Federation for Immunogenetics nebo forenzní Technical Working Group on DNA Analysis Methods) (37) vyžadují dodržování striktního antikontaminačního režimu pro: místnosti pre-pcr přetlaková místnost s vyhrazenou sadou pomůcek, PCR/post-PCR podtlaková místnost s vyhrazenou sadou pomůcek; dekontaminační místnost; pravidelná eliminace kontaminace (UV+(iso)psoralen, UNG (38), chloristan, vyhrazený autokláv); kontrola tvorby antistatického náboje, individuální klimatizace. plastový materiál bez DNáz, bez DNA, jednorázový chemikálie v kvalitě pro molekulární biologii, manipulace bez kontaminace v laminárním boxu roztoky alikvotování, manipulace bez kontaminace v laminárním boxu, použití špiček s filtrem nebo pístem, otevírání zkumavek až po krátkém stočení na centrifuze přístroje se zábranou proti tvorbě aerosolu personál častá výměna jednorázových rukavic; jednosměrný pohyb mezi místnostmi (pre- PCR post-pcr dekontaminace); při práci s limitním množstvím lidské DNA je nutné zahalení laboratorního pracovníka od hlavy až k patě vzorky fyzikální bariéry proti křížové kontaminaci, několik druhů negativních kontrol (39). Pro paleogenetické zkoumání jsou požadavky ještě přísnější (40-42). Přesto se i v neprecizněji vedených laboratořích kontaminační události stávají zdroj kontaminace je však rychle odhalen a eliminován (43). Článek 8 Pro eliminaci kontaminace je nejúčelnějším postupem čištění pracovních povrchů a náčiní 10% chloristanem (Savo) anebo 5% kyselinou fosforečnou v roztoku detergentu. Sofistikovaným přístupem k identifikaci kontaminace je označení každé (kontaminující) molekuly před započetím PCR (44) Nespecifická vazba primerů Spuštění polymerace po vazbě primerů má v sobě prvek náhody a 100% specificita je nedosažitelná. V laboratorních podmínkách je cílem, aby nespecifická vazba primerů nezhoršila analýzu amplikonu v následných krocích: aby se na elektroforetickém gelu neobjevily nespecifické proužky (popřípadě nespecifické píky na fragmentačním elektroforeogramu), popřípadě aby signál jednotlivých nukleotidů při sekvencování nebyl potláčen šumem. V PCR je obrovský nadbytek primerů. Pokud nejsou plně vysyceny vazbou na templát, může jejich částečná komplementarita na 3 konci vést k tvorbě primerových dimerů a oligomerů. Specifičnost reakce můžeme modulovat složením PCR směsi, návrhem primerů a teplotními podmínkami amplifikace (viz Faktory úspěšnosti PCR). Nezamýšlenou aktivitu polymerázy, schopnou prodlužovat nespecificky navázané primery při pokojové teplotě (ještě v průběhu míchání reakční směsi), můžeme eliminovat horkým startem. Při horkém startu je některá z nezbytných složek PCR (většinou polymeráza nebo hořčík) sekvestrována až do dosažení denaturační teploty prvního cyklu PCR. Sekvestrace je dosaženo: vazbou protilátky, aptameru nebo termolabilního inhibitoru (anhydridu kyseliny dikarboxylové) do aktivního místa polymerázy, uměle vytvořenými disulfidickými můstky v rekombinantní polymeráze (45), zkrácením polymerázy z N-konce (45), nespecifickou vazbou polymerázy na krátké dvoušroubovicové DNA (46), přidáním helikázy, která separuje řetězce v nově vznikající dvoušroubovici, dokud není sama tepelně inaktivována (47), zalitím některých složek PCR do parafínové kuličky (48), tepelně uvolňovaným hořčíkem, vázaným ve šťavelanu hořečnatém (49). Další modifikace pro navýšení specificity a citlivosti, Uhnízděná PCR (Nested PCR), se používá jako dvojí síto, kdy vnitřní část amplikonu prvotní PCR (s případnými nespecificky namnoženými sekvencemi) je specificky amplifikována pomocí druhé PCR s novou dvojicí primerů. Manipulace s otevřenou zkumavkou po prvotní PCR je však náchylná ke kontaminaci. 14

15 5. Faktory úspěšnosti PCR reakce prvočinitelé Úspěch PCR je jen podmíněný. Do správné PCR praxe patří: Alikvotování reagencií, aby se ohraničil dopad případné kontaminace a zamezilo opětovnému zamražování/rozmražování reagencií. Ustálené pořadí pipetování, kdy se hořečnaté kationty mají setkat s polymerázou dříve, než případné inhibitory z templátu. Tvorba PCR koktejlů (premixů) snižující počet pipetovacích kroků a tím snižující možnost chyby. Monitorování kvality všech PCR reagencií (včetně vody). Častá výměna rukavic (které jsou bez pudru), snižující riziko kontaminace. Na nejdůležitější parametry PCR specifičnost a citlivost mají vliv (kromě vlastností templátu, reakční směsi a laboratorního pracovníka) i nechemické faktory. Proto jsou zde uvedeny spolu s chemickými parametry Primery Primery jsou cíleně uvedeny na prvním místě prvočinitelů PCR. Důležitost designu oligonukleotidů je v molekulárně biologických aplikacích obecná špatný design vede k nízké spolehlivosti a nízké reprodukovatelnosti i u DNA mikromatic (50). U primerů sledujeme tyto základní parametry (51): Teplota tání celého primeru a z ní odvozená teplota hybridizace o Hrubý odhad lze provést podle vzorce T m = 2AT + 4GC. o Přesnější odhad T m je vypočitatelný dle termodynamických parametrů (52-56). o V průběhu PCR dochází i k nekomplementární vazbě primerů (síla vazby pro jednotlivé nukleotidy klesá ve směru: GC > AT > GG > GT = GA > TT = AA > TC > AC > CC (57;58)). Dokonce lze neshodu v rámci PCR-SSP/ARMS využít cíleně, pokud přidáním druhého neshodného nukleotidu více destabilizujeme nekomplementární primer (59-61) (Obr. 4). Obrázek 4: Cílená neshoda v PCR-SSP/ARMS Teplota tání 3 konce primeru, dolaďující specifičnost vazby Délka 15

16 o 21 nukleotidů (ve speciálních případech minimum 8 nukleotidů nebo maximum 40 nukleotidů) Podíl guaninů a cytozinů o %; mimo tento rozsah je nutné použít PCR enhancer Tendence k tvorbě dimerů a vlásenek o Obecně je lépe se dimerům a vlásenkám vyhnout. Ve výjimečných případech se dají využít ve prospěch PCR. Vlásenka na 5 konci primeru může být regulátorem fluorescence anebo neproduktivní dimer funguje jako záchytné depo (Obr. 5) (62), zvyšující specificitu PCR. Obrázek 5: Srovnání primerových dimerů Primerové depo Amplifikovatelný primerový dimer 5 gacaccttctgcttccacct 3 5 gacaccttctgcttccacct 3 3 CCTgCTgTggAAgACgAAgg 5 3 AAggTggACCTTgAAggTggA 5 Přestože lze navrhnout primerové páry pro základní PCR pouhým započtením 4GC+2AT pravidla pro T m a dosáhnout 93% úspěšnosti amplifikace (60), tak při PCR, která má vyhraněné podmínky na vstupu nebo výstupu, se neobejdeme bez specializovaného software (Tab. 3). Pro design multiplexní PCR reakce je náročnost výpočtů taková, že se musejí využívat postupy počítačové vědy (63-68), pokud se nepoužije nějaký nivelizující trik (viz Koncept univerzality). 16

17 Tabulka 3: Software pro design a kontrolu primerů Název Účel Webový odkaz Ref. PDA Primer Nejjednodušší PCR design. (69) Design Assistant Primer3 Zlatý standard pro základní (70) PCR. FastPCR Pokročilý PCR design. ms/fastpcr.htm VectorNTI Pokročilý PCR design (71) v rámci bioinformatického t.cfm?pageid=10373 balíku, dostupného po registraci k nekomerčním účelům. GenoFrag LongPCR design. (72) PROBEmer PCR SSP/ARMS design. (73) SSP Manager PCR-SSP/ARMS design pro mbunce@hgmp.mrc.ac.uk (74) lidské tkáňové antigeny. T m utility Kontrola teploty tání amplikonu. ds_up/tmutility_form.htm CODEHOP Design degenerovaných (75) primerů. /blocks/codehop.html AutoDimer Kontrola dimerizace a (76) vlásenkování v PCR base/autodimerhomepage/autod multiplexu. imerprogramhomepage.htm MixPCR Výběr maximálního multiplexu z primerových ex.html párů, prefabrikovaných programy FastPCR nebo AutoDimer. Gene2Oligo Pro syntézu dlouhých DNA (77;78) pomocí Ligase chain oligo/#form reaction anebo Assembly PCR. SNPbox Pro PCR-ARMS/SSP. (79) e-pcr Pro kontrolu specificity (80;81) MethPrimer v rámci genomu. Pro návrh primerů k detekci methylace. 3 er/ (82) 5.2. Hardware Všechny zavedené molekulárně genetické firmy na trhu dodávají cykléry a plasty v kvalitě dostatečné pro základní PCR. Ale opět platí: pokud chceme mířit k limitům PCR, je lépe pamatovat na následující: Cyklér o Peltierovy pumpy třetí generace se stříbrnými jamkami mají dosahovat přesnosti ± 0,1 C přes 96 jamek cykléru. Nižší přesnost může vést k nehomogenním výsledkům u citlivých aplikací. o Zahřívání a chlazení na karuselu rotujících zkumavek vzduchem může zrychlit cykly PCR, ale zbavíme se možnosti použít 12-tikanálovou pipetu při míchání PCR směsí. 3 Nutnost specálního software pro design primerů k PCR detekci methylace lze obejít i použitím MS Wordu, pokud se sekvencí templátové DNA provedeme následující manipulaci: změň CG na CF, pak změň G na A, pak změň F na G. 17

18 o Gradientový cyklér může usnadnit hledání teploty hybridizace, ale mnohdy vystačí použít Touchdown (viz Koncept univerzality). Mikrozkumavky o Je výhodnější zakoupit mikrozkumavky s certifikátem (bez DNA a DNáz), než autoklávovat nesterilní zkumavky. o Kvalitní mikrozkumavky z polypropylenu anebo polykarbonátu (s kontrolovanou tloušťkou mikrozkumavky i u dna) se rozsahem použitelnosti neliší (pokud máme odpovídající víčka nebo zavírací plátky). Větší rozdíl je mezi kvalitním (inertním) a nekvalitním plastem (s nabitými, antistatickými a hydrofobními místy nebo se zbytky kovů u barevných zkumavek). o Pro nižší přilnavost polymerázy ke stěnám mohou být mikrozkumavky potažené teflonem. o Skleněné kapiláry ve vzduchem chlazeném/ohřívaném cykléru vyžadují úpravu složení reakční směsi (přídavek BSA a MgCl 2 ). Pipety o o o 5.3. Polymeráza Kalibrovaná pipeta je přesná jen tehdy, pokud použijeme odpovídající špičky. Je výhodnější zakoupit špičky s certifikátem (bez DNA a DNáz), než autoklávovat nebo ozařovat nesterilní špičky. Autokláv může být zdrojem kontaminace fragmentovanou DNA, zkumavky zkřehnou a ztratí své vlastnosti po iradiaci. Low copy number aplikace vyžadují použití špiček s protikontaminační zábranou (filtr ze zesíťovaného polyethylenu s 16 µm póry nebo posuvný jednorázový píst). Jednotka polymerázy je definována jako množství enzymu, potřebné k převedení 10 nmol nukleozidů do produktu nerozpustného v kyselém prostředí za 30 minut při použití M13mp18 DNA jako templátu a při daných reakčních podmínkách. Je zřejmé, že taková definice jednotky je vzdálená použití polymerázy v reálných podmínkách a může sloužit pro titrování množství polymerázy jen orientačně; každá nová šarže polymerázy musí být otestována. U polymerázy můžeme sledovat: fidelitu 4 - věrnost originálu (1/10 4 1/10 6 ) přítomnost korekturské funkce (je vhodná u sekvencování nebo u Long PCR, kde má polymeráza s korekturskou funkcí minoritní podíl ve směsi polymeráz) adenylaci, přidání beztemplátového adeninu na konec nascentního řetězce u polymeráz bez korekturské funkce procesivitu délku nakopírovaného úseku templátu na jedno navázání polymerázy; procesivita může být navýšena metodami genetického inženýrství (připojení domén proteinů jako je Sso7d (83), substitucí Asn Ser543 (84)) rychlost pohybu po templátu (60 nukleotidů za sekundu) poločas rozpadu při 95 C (40 min až 2 hodiny) aktivitu při pokojové teplotě (zabudovaný horký start) odolnost vůči inhibitorům (Tth je robustnější než Taq) Pufr Molekulárně biologické firmy dodávají polymerázu i s optimalizovaným pufrem, ale se zachovanou možností titrovat hořečnaté kationty. Standardní pufr se skládá z těchto reagencií: KCl o 50 mm MgCl 2 o 1,5 nebo 2,0 mm dntps o 200 nmol každý 4 Chybovost 1/10000 generuje pro Y cyklů a x párů bazí pravděpodobnost n nepřesných fragmentů = (Y!/((Y-n)!*n!))*( X ) Y-n * (1-(0.9999) X ) n ; po 25 cyklech amplifikace 100 bp fragmentu je 22 % amplikonů s chybou. 18

19 o Citlivé aplikace (Multiplexní PCR) vyžadují nukleotidy nejvyšší kvality o Hliníkové soli nukleotidů jsou nejodolnější vůči zamražování/rozmražování Želatina 0,01% (w/v) TrisCl 10 mm, ph 8,3 až 8,8 (měřeno při pokojové teplotě) Taq o 30 mu/µl o V izolovaném Taq proteinu mohou být zbytky DNA T. aquaticus a E.coli, což může interferovat s citlivou PCR analýzou bakteriální DNA. Složením pufru můžeme modulovat citlivost a specifičnost. Citlivost a výtěžek zvýšíme změnou koncentrací ve směru šipky: MgCl 2, Taq, primery, dntps, (také počet cyklů, teplota hybridizace ). Naopak specificitu posílíme těmito změnami: MgCl 2, Taq, primery, dntps, (také počet cyklů, teplota hybridizace, optimalizace návrhu primerů, Nested PCR). Pokud standardní podmínky měníme, měli bychom sledovat vzájemně závislé složky (přidání nukleotidů vyžaduje současné přidání hořčíku, aby množství hořčíku dostupného pro vazbu do aktivního místa polymerázy zůstalo zachováno) PCR program Na PCR programu můžeme měnit tyto parametry: Počet cyklů o Pro agarózovou elektroforézu dostačuje 30 cyklů. o Pro laserem indukovanou fluorescenci dostačuje 28 cyklů i s redukovaným množstvím templátové DNA. o Pro reamplifikaci (Nested PCR) dostačuje 20 cyklů. o Pro zvýšení citlivosti můžeme použít až 50 cyklů, ale to už namnožíme i neodstranitelnou, všudypřítomnou kontaminující DNA. Čas cyklu o U cyklérů vyhřívaných a chlazených vzduchem můžeme časy jednotlivých PCR kroků zkrátit na sekundy. o I v průběhu změny teploty z jednoho kroku na druhý se dějí polymerační procesy. Pokud přecházíme na novější a rychlejší cyklér, můžeme podmínky prvního cykléru simulovat zpomalením zahřívání a chlazení (změnou ramp time). Denaturace o Před prvním cyklem PCR je vhodné templát denaturovat delší dobu (5 minut při 95 C), aby se rozpletly všechny dvoušroubovice a uvolnily případné histony z DNA. o Pokud máme polymerázu se zabudovaným horkým startem, je prvotní denaturaci nutno prodloužit na 11 minut. o V jednotlivých PCR cyklech při použití Peltierova článku dostačuje zahřátí na 96 C po dobu 10 sekund. o U některých programů se teplota denaturace v pozdějších cyklech snižuje na 90 C. Je to snahou snížit reaktivitu dlouhých fragmentů templátové DNA (jejichž renaturace je jednou z příčin nástupu plató). Hybridizace o Teplota hybridizace má být o 5 C vyšší než je teplota tání primeru, vypočtená na základě termodynamických parametrů. Termodynamické rovnice jsou jen modelem - existují primery, jejichž predikovaná T m se liší od skutečné o 4 C. Extenze o 72 C nemusí být optimální pro jiné polymerázy než Taq; snížení na 65 C neznatelně sníží výtěžek (což se využívá u dvoustupňové PCR) o U Long (range) PCR čas pro extenzi v pozdějších cyklech graduálně navyšujeme Templát Kvalitu DNA templátu ovlivníme izolačním postupem. Přestože lze provést PCR bez izolace DNA (například in situ na skleněném sklíčku (85), po lýze rostlinného vzorku ethylxanthogenátem draselným (86), po lýze krve DMSO, po krátkém povaření vzorku, přidáním bakteriální kolonie z párátkového stěru přímo do PCR směsi), pro robustní výsledky a v případech s potenciálně přítomnými PCR inhibitory musíme DNA zbavit peptidů, cukrů, tuků, RNA a minerálních látek. Čistota DNA je vitální 19

20 zvláště u profilujích metod (87). Izolačních metod je nepřeberné množství, přesahující rozsah této práce. Skládají se z některých z těchto procedur: Chaotropní a detergentová lýza buněk (guanidin isothiokyanát, Chelex, cetyltrimethylamonium bromid, sodium dodecyl sulfát) Enzymatické štěpení proteinů (proteináza K) Organická extrakce proteinů (fenol-chloroform-isoamylalkohol) Neorganická extrakce proteinů (vysolení) (88) Kolonky o Iontoměničové o Triplexové (89) Magnetické kuličky Srážení alkoholem Kvalita templátu nezávisí jen na izolačním postupu. Za zmínku stojí složitost templátu (je nutný větší počet PCR cyklů pro větší nadbytek necílových sekvencí), oba extrémy podílu GC v cílové sekvenci (vyžadují rozdílné hybridizační teploty a rozdílné enhancery), fragmentace templátu (nelze namnožit úsek, který není mezi primery celistvý). Články 7, Inhibitory Již Theophrastus Bombastus von Hohenheim, zvaný Paracelsus, tvrdil, že Všechny sloučeniny jsou jedy. Neexistuje sloučenina, která by jedem nebyla. Rozdíl mezi lékem a jedem tvoří dávka, takže není překvapením, že některé látky fungují jako PCR enhancery při nižších koncentracích a jako PCR inhibitory při vyšších koncentracích (90). Inhibitory mohou pocházet ze vzorku a jeho okolí (91-93), z izolačních, odběrových a pre-pcr reagencií (94-98); souhrnně viz Obr

21 Obrázek 6: Inhibitory PCR S inhibitory se lze vypořádat následujícími způsoby: naředěním templátové DNA navýšením množství Taq polymerázy změnou polymerázy Taq na odolnější Tth promytím templátu NaOH (99) re-extrakcí o flokulací s AlNH 4 (SO 4 ) 2 (100) o selektivní precipitací pomocí DextranBlue (101) nebo isopropanolu (102), o centrifugační iontově výměnnou kolonkou Sephadex G-200 (103), Sepharose 2B, Disposaflex (104); lektinová kolonka o Thiopropyl Sepharose 6B kuličkami (105) o (fenol)chloroformem promýváním templátu po zachycení v agaróze (106;107) vysokou teplotou před PCR (108) použitím enhancerů (v první řadě hovězího sérového albuminu) Enhancery Enhancery, posilovače PCR, jsou látky, které zvyšují účinnost amplifikace. Liší se mechanismem působení: 21

22 Potlačení sekundární struktury templátu vedlejší vazbou o gene 32 protein (109) o Single strand binding protein o reca (110;110) o T4 gene 32 (25;111). Potlačení sekundární struktury templátu denaturačním činidlem o 10% glycerol (60) o nízkomolekulární amidy a sulfony (112): 10% dimethyl sulfoxid (60;113), tetramethylen sulfoxid (114), 10% polyethylen glykol 6000, osmoprotektant betain (115) a 5% (dimethyl)formamid (116), trimethylamin N-oxide, 50 µm tetramethylamonium chlorid, tetramethyl amonium oxalát (117), spermidin (118) o 1% neiontový detergent Tween 20 o trehaloza (119). Potlačení sekundární struktury amplikonu vlastnostmi nukleotidů o náhrada části dgtp pomocí 7 deaza dgtp. Potlačení nespecifické vazby Taq na dsdna o spermidin (118). Zlepšení tepelného přenosu o koloidní zlato (120). Vyvázání PCR inhibitorů, reagujích s Taq na: o hovězí sérový albumin (BSA) (111) o polyvinyl pyrolidon (121) o dithiothreitol (122) o minerální olej. Dlužno podotknout, že snaha o nalezení opravdu univerzální směsi enhancerů (123) se míjí účinkem jak zjistí každý, kdo se pokusí zopakovat nadějné výsledky autorů článků o enhancerech na svém templátu a se svými vyzkoušenými chemikáliemi. Přesto současná industrializace genotypizace vede ke snahám o zjednodušení, které můžeme nazvat konceptem univerzality. 22

23 6. Koncept univerzality Obecným současným trendem při zjišťování genotypu je miniaturizace, automatizace a vysoká propustnost. Poslední cíl bývá kritizován jako necílené rybářské expedice oproti tradičnímu výzkumu vedeného hypotézami. Začíná však přinášet zajímavá data, která nejsou tradičními postupy získatelná (124). Zmíněný trend může být v PCR sledován změnou standardního pufru a protokolu, plynulou integrací jednotlivých kroků, zvýšením počtu paralelních testů a multiplexováním. Univerzální pufr a protokol o Milníkem ve snaze o robustní pufr a PCR protokol je Phototyping Mike Bunce a spolupracovníků (3). Jejich optimální protokol byl použit pro tisíce rozdílných duplexních PCR při genotypizaci lidských genů tkáňové slučitelnosti (HLA) a dosáhl zatím 562 citací v ISI. o Používají metodu PCR-SSP/ARMS spolu s principem Touchdown, nebo přesněji Stepdown (125;126), kdy teplota hybridizace primerů je v počátečních cyklech tak vysoká, že dochází jen k prodlužování primerů, dokonale navázaných na cílovou sekvenci po celé své délce (rozhodující je 3 konec). V dalších cyklech je teplota hybridizace graduálně snížena, čímž se dramaticky zvýší účinnost amplifikace, která probíhá již jen na vytvořených věrných cílových sekvencích. Ve zkráceném zápise zní jejich PCR protokol takto: 96 C 1, (96 C 20 /70 C 45 /72 C 25 )*5, (96 C 25 /65 C 50 /72 C 30 )*21, (96 C 30 /55 C 1 /72 C 1 30 )*4, 25 C 1. o Další změna je ve standardním pufru: draselné ionty, které stabilizují sekundární struktury templátu a snižují procesivitu polymerázy, jsou nahrazeny ionty amonnými (10*koncentrovaný pufr má složení: 0,67 M TrisCl ph 8.8; 0,166 M (NH 4 ) 2 SO 4 ; 1% Tween 20; 20 mm MgCl 2 ). Integrace jednotlivých kroků o S narůstajícím počtem lidských zásahů a kroků procedury roste složitost a křehkost systému, proto má jednokroková analýza své příznivce. Zatímco objem reakční směsi v PCR mikrozkumavce lze ztěží zmenšit pod 6 µl (kdy už se negativně projeví i permeabilita stěny zkumavky, Obr. 7), v mikročipových podmínkách lze pracovat v nanolitrových množstvích ( ). Cirkulace PCR reakční směsi oblastmi s rozdílnou teplotou v nanoškálových rozměrech vede k dalšímu zrychlení cyklů PCR (patent firmy Thermal Gradient). Pokud integrujeme další kroky analýzy (izolaci DNA, kapilární elektroforézu (130)), dostáváme se k přístupu miniaturizované integrované laboratoře (µtas - micro Total Analysis System, Lab-on-chip (131)). 23

24 Obrázek 7: Srovnání výsledku profilování mikrosatelitů v rozdílných reakčních objemech Multiparalelismus o Souběžné testování mnoha vzorků je nutné pro velké populační projekty anebo pro projekty sekvenací genomů. Ze sekvenačních přístupů nové generace zmíním jen formát PCR na magnetických kuličkách v emulzi (132). Multiplexing o Pokud nás nezajímá jediný polymorfismus u velkého množství vzorků, ale spíše více cílů u omezeného množství vzorků, můžeme využít multiplexing (multitasking v komplexním systému). Původní optimalizace PCR multiplexu vyžadovala zdlouhavé testování reakčních podmínek pro nalezení kompromisních podmínek pro všechny kombinace primerový pár cílová sekvence ( ). Inovativním přístupem bylo využití potlačované PCR (PCR suppression) ( ), počítačových modelů a nastavovaných, přívěskových primerů (tagged, tailed primers; viz Případová studie 2). Koncept univerzality je téma, jehož aplikací se v současné době zabývám. Proto v následujících dvou případových studiích uvedu čerstvá data, která ještě nedosáhla stadia připravenosti k zaslání do impaktového časopisu. 24