Nová klasifikace astmatu na základě jeho subfenotypů

Transkript

1 Nová klasifikace astmatu na základě jeho subfenotypů Ruth H. Green, Chris E. Brightling a Peter Bradding Význam přehledu Přestože se obecně na astma pohlíží jako na heterogenní onemocnění, nebylo zatím dosaženo shody o přesném systému jeho klasifikace. V novějších studiích byly vysloveny představy, že pro lepší poznání tohoto onemocnění by bylo obzvláště přínosné rozpoznávat subfenotypy astmatu podle charakteru zánětu přítomného v dýchacích cestách. V tomto přehledu jsou probrány důležité literární práce na dané téma a současné poznatky jsou zasazeny do příslušného historického kontextu. Aktuální výsledky Zavedení používání neinvazivních markerů zánětu v dýchacích cestách naznačilo, že lze rozlišit čtyři různé fenotypy astmatu eozinofilní, neutrofilní, smíšeně zánětlivý a paucigranulocytární. Podle novějších studií se tyto podskupiny mohou lišit ve své etiologii, imunopatologii a odpovědi na léčbu. Několik studií se zaměřilo na refrakterní astma jako na samostatný fenotyp onemocnění a prokázalo distálnější lokalizaci zánětu dýchacích cest a deregulace osy faktoru nekrotizujícího nádory (tumour necrosis factor) a. A konečně se objevují nové léčebné postupy zaměřené na určité typy zánětu v dýchacích cestách, což jen podtrhuje význam rozlišování subfenotypů astmatu. Souhrn V tomto přehledu se budeme zabývat nedostatky současných systémů klasifikace astmatu, upozorníme na hlavní současné studie zabývající se identifikací zánětlivých subfenotypů astmatu a navrhneme nové postupy, které by mohly dále zlepšit naše poznání dané problematiky. Klíčová slova astma, fenotypy, klasifikace, refrakterní, zánět The reclassification of astma based on subpehnotypes Curr Opin Allergy Clin Immunol 2007;7: Lippincott Williams & Wilkins, Inc. Department of Respiratory Medicine, Glenfield Hospital, Groby Road, Leicester, UK Adresa pro korespondenci: Ruth H. Green, MSc, MD, FRCP, Department of Respiratory Medicine, Glenfield Hospital, Groby Road, Leicester, LE3 9QP, UK E mail: ruth.green@uhl tr.nhs.uk Zkratky FEV 1 objem vydechnutý maximálním úsilím (forced expired volu me) za jednu sekundu MMP 9 matrixová metaloproteináza 9 (matrix metalloproteinase 9) PEF vrcholový výdechový průtok (peak expiratory flow) TNF faktor nekrotizující nádory (tumour necrosis factor) Úvod Astma je již dlouho považováno za heterogenní onemocnění. Rozlišení jeho jednotlivých subfenotypů nám může pomoci pochopit jeho patofyziologii, odpověď na léčbu, prognózu a genetický podklad. Přes úsilí mnoha generací odborníků v klinické praxi proto přesný a úplný systém klasifikace astmatu stále zůstává prioritou výzkumu tohoto onemocnění. Ohlédnutí do historie Již počátkem 20. století navrhl Rackemann [1] rozdělení astmatu na extrinsické (z vnějších příčin pozn. překl.) a intrinsické (z vnitřních příčin pozn. překl.) a toto dělení se nadále široce používá. Následně byly na základě vyvolávající příčiny rozlišeny další fenotypy astmatu, jako jsou astma vyvolané kyselinou acetylsalicylovou nebo astma z povolání. V 70. letech minulého století popsal Turner Warwick [2] podskupiny pacientů s astmatem charakterizovaným různými typy obstrukce dýchacích cest, jako bylo nestabilní astma (brittle asthma), ireverzibilní astma nebo astma s ranními záchvaty (the morning dipper). Ayres a spol. [3] pak na základě povahy exacerbací rozlišili dva různé typy nestabilního astmatu, zatímco představa ireverzibilního astmatu nadále přetrvává vzhledem ke zjištění, že u menšiny pacientů dochází ke zrychlenému poklesu plicních funkcí, které vede k fixované obstrukci dýchacích cest [4]. Směrnice pro léčbu astmatu mají sklon ke kategorizaci onemocnění podle jeho závažnosti, odhadované na základě množství medikace potřebné k dosažení zmírnění příznaků a zlepšení plicních funkcí [5 6]. Problém může spočívat v tom, že užívání léků je ovlivněno jak dostupností zdravotní péče, tak chováním pacienta a lékaře i závažností onemocnění. Byly navrženy i alternativní metody klasifikace astmatu, a to na základě klinických projevů onemocnění. Byla popsána podskupina pacientů se zdánlivě větším rizikem častějších a těžších exacerbací astmatu [7 ]. Existují však důkazy o tom, že tento typ exacerbací souvisí s povahou a rozsahem základního zánětu v dýchacích cestách [8,9 ], takže ke zjištění těchto fenotypů je nezbytná kvantifikace zánětlivé odpovědi. Bylo navrženo i dělení podle věku v době nástupu onemocnění, ovšem ve studiích omezených na dětskou populaci byly také zjištěny výrazné rozdíly z hlediska klinických projevů i zánětu [10], což hodnotu tohoto přístupu snižuje. Nověji byla navržena klasifikace astmatu vycházející z povahy zánětu v dýchacích cestách [11,12,13 ] (obr. 1). Důležitá je skutečnost, že se objevují nové důkazy o tom, že identifikace těchto zánětlivých fenotypů by mohla po Curr Opin Allergy Clin Immunol/CS 2007;4:1 7

2 Nová klasifikace astmatu na základě jeho subfenotypů Green, Brightling a Bradding Typ buňky Eozinofilní Neutrofilní Spouštěč Alergeny???? Nízkomolek. Kouření Bakteriální Virový?? Znečištění chem. slouč. infekce infekt ovzduší Obrázek 1 Schéma ilustrující heterogenitu onemocnění dýchacích cest, pokud jde o spouštěče, charakter zánětu v dýchacích cestách, přidružená onemocnění, fyziologii dýchacích cest a konkrétní patologicko-anatomické nálezy Syndrom Astma Astma z vnitř. Eozinofilní Profes. CHOPN Bronchiektazie Hvízdání Astma Bronchitida z vnějš. příčin příčin bronchitida astma při viróze/ z vnitř. příčin (eozin.) /kašel (non-eozin.) po viróze Zánět průdušek Astmatu podobný stav Bronchitida Těžké exacerbace FAO Bronchiektazie (BHR: proměnlivá (neproduktivní (rychlé nekontrolované (obstrukce dých. cest (purulentní kašel, obstrukce dých. cest) kašel) poklesy plicních funkcí) navzdory optimální léčbě) stanoveno pomocí CT) Infiltrace hladké Zánět epitelu Těžký eozinofilní Hypertrofie hladkého Dilatace dých. cest svaloviny dých. cest a submukózy zánět svalstva žírnými buňkami BHR bronchiální hyperreaktivita; FAO (Food and Agriculture Organization) Organizace pro potraviny a zemědělství; CHOPN chronická obstrukční plicní nemoc Přetištěno se svolením [14 ]. moci při vedení léčby astmatu u jednotlivých pacientů. Tento přehled má za cíl probrat důkazy z nejnovějších studií, které by mohly pomoci nově klasifikovat astma, přičemž se zaměřuje na zánětlivé fenotypy a na studie podporující používání léčby specifické pro určitý fenotyp astmatu. Nastiňujeme nedostatky současných systémů klasifikace a navrhujeme možnosti nových přístupů, které by mohly zlepšit naše poznání v dané oblasti. Eozinofilní astma Podle údajů pocházejících z prvních bronchoskopických studií byl charakteristickou imunopatologickou abnormalitou nalézanou u pacientů s mírným astmatem eozinofilní zánět v dýchacích cestách [14 16]. Předpokládalo se, že k jeho rozvoji dochází jak u atopického, tak u neatopického astmatu [17 20], u astmatu indukovaného kyselinou acetylsalicylovou [21] či astmatu z povolání [22]. Celkově tyto studie uváděly širokou korelaci mezi klinickou závažností astmatu a stupněm eozinofilie v dýchacích cestách, zvláště pokud eozinofily vykazovaly známky aktivace [14,23]. Zavedení techniky indukce sputa [24,25 ], která umožnila charakterizaci dalších různých populací pacientů, odhalilo složitý vztah mezi eozinofilním zánětem a ostatními markery astmatu. Studie porovnávající korelaci eozinofilie ve sputu s plicními funkcemi [26,27] nepřinesly jednoznačné výsledky, a tak se zdá, že hyperreaktivita dýchacích cest a eozinofilie představují dvě nezávislé složky astmatického fenotypu [28]. Naproti tomu eozinofilní zánět v dýchacích cestách je zřejmě spíše mnohem těsněji spojen s rizikem vzniku těžkých exacerbací astmatu [8,9,29]. Non eozinofilní astma Vyšetření indukovaného sputa [11,30,31 ] a malé bronchoskopické studie [12] jasně prokázaly, že u pacientů s těžkým astmatem není eozinofilní zánět vždy přítomen (obr. 2). Ve studii s 23 pacienty s astmatem, kteří byli léčeni podle potřeby pouze b 2 mimetiky, mělo devět nemocných počet eozinofilů ve sputu nižší než 3 %. Skupina s eozinofilním astmatem i skupina s non eozinofilním astmatem vykazovaly podobné hodnoty plicních funkcí, variabilní vrcholový výdechový průtok (peak expiratory flow, PEF) i závažnost příznaků, ale u non eozinofilních pacientů existovala nižší pravděpodobnost přítomnosti atopie, menší hyperreaktivita dýchacích cest a častěji se jednalo o kuřáky [11]. Toto vyšetření jsme opakovali u 259 pacientů se symptomatickým astmatem, kteří byli léčeni v krocích 1 3 podle směrnic Britské společnosti pro onemocnění hrudníku (British Thoracic Society), a nalezli jsme významné rozdíly v počtu buněk v indukovaném sputu, zvláště u pacientů s neatopickým astmatem. Přitom jsme rozpoznali podskupinu 60 pacientů s odlišným profilem sputa s neutrofilií sputa, avšak s fyziologickým počtem eozinofilů; 35 z těchto pacientů nebylo předtím léčeno kortikosteroidy. Jednalo se o starší osoby, především ženy a spíše pacientky s neatopickým astmatem, jinak se však z hlediska klinických projevů a z fyziologického hlediska tato skupina podstatněji nelišila od celého souboru [30]. Řešitelé dřívějších studií si povšimli přítomnosti neutrofilního zánětu u některých pacientů s těžkým astmatem [32,33] i u malého počtu pacientů vyšetřovaných v průběhu exacerbací astmatu [34]. Gibson Obrázek 2 Ukázky barvení submukózy na eozinofily ( 100) (A) a neutro fily ( 100) (B) vzorky od nemocných s eozinofilním a non-eozinofilním astmatem A B Curr Opin Allergy Clin Immunol/CS 2007;4:1 7

3 Nová klasifikace astmatu na základě jeho subfenotypů Green, Brightling a Bradding a spol. [35] ve své práci uvedli, že 59 % pacientů s perzistujícím astmatem, kteří užívali vysoké dávky inhalačních kortikosteroidů, vykazovalo nízké počty eozinofilů ve sputu, ale známky neutrofilního zánětu. Wenzelová a spol. [12] provedli bronchoskopickou studii u pacientů s těžkým astmatem léčených vysokými dávkami inhalačních či perorálních kortikosteroidů a popsali mezi nimi podskupinu s převažujícím neutrofilním zánětem v dýchacích cestách, s absencí eozinofilů a fyziologickou tloušťkou subretikulární bazální membrány. Silný neutrofilní zánět byl rovněž prokázán u pacientů ventilovaných pro těžké akutní astma [36] a u nemocných, kteří na astma náhle zemřeli [37]. Není však známo, zda bývá neutrofilní fenotyp astmatu obzvláště spojen s těžším onemocněním, neboť nález může být zkreslen léčbou kortikosteroidy. K dalšímu pochopení non eozinofilního fenotypu napomohly nejnovější výzkumy. Simpsonová a spol. [31 ] pečlivě vyšetřili zánětlivý profil u 93 pacientů s astmatem různého stupně závažnosti a rozlišili čtyři různé zánětlivé fenotypy. Největší skupina (41 % pacientů) vykazovala známky eozinofilního zánětu, ale měla fyziologický po čet neutrofilů. Dvacet procent pacientů mělo izolovanou neutrofilii sputa, zatímco dalších 8 % vykazovalo zvýšené počty eozinofilů i neutrofilů. A konečně 31 % případů bylo diagnostikováno jako paucigranulocytární astma s počty buněk ve sputu ve fyziologickém rozmezí. Jedinci s vyšším počtem neutrofilů ve sputu byli starší, ale jinak si z klinického hlediska uvedené čtyři skupiny byly podobné. Opakovaná měření provedená u části pacientů prokázala, že non eozinofilní fenotyp přetrvává jak krátce (4 týdny), tak po delší dobu (5 let). Autoři rovněž zkoumali u týchž pacientů aktivitu proteolytických enzymů v indukovaném sputu, přičemž nemocné se smíšeným a neutrofilním zánětem sloučili do stejné skupiny. Zjistili, že zatímco eozinofilní fenotyp bývá spojen s vysokou aktivitou matrixové metaloproteinázy 9 (matrix metalloproteinase 9, MMP 9), u pacientů s neutrofilním typem zánětu je významně vyšší aktivita neutrofilní elastázy, ale inaktivní MMP 9. U pacientů s paucigranulocytárním astmatem se aktivita proteolytických enzymů nelišila od hodnot zdravých kontrolních osob [38 ]. Není vyloučeno, že různá úroveň reparace a remodelace u jednotlivých fenotypů je právě důsledkem této různorodosti zánětlivé odpovědi. Tuto domněnku podporuje zjištěná negativní korelace mezi počtem neutrofilů ve sputu a poměrem FEV 1 /FVC [FEV 1 objem vydechnutý maximálním úsilím (forced expired volume) za jednu sekundu; FVC usilovná vitální kapacita (forced vital capacity)] [31 ] a také absence depozice kolagenu v subretikulární bazální membráně u pacientů s neutrofilním astmatem [12]. Nadále není jasné, zda různé zánětlivé fenotypy vznikají v důsledku odlišných etiologických pochodů, i když nejnovější studie mohou tuto koncepci do jisté míry podpořit. U neutrofilního astmatu se prokázala vyšší aktivace systému přirozené imunity s vyšší expresí receptorů TLR2, Curr Opin Allergy Clin Immunol/CS 2007;4:1 7 Obrázek 3 Cytospiny sputa od různých pacientů s astmatem ilustrují heterogenitu zánětu v dýchacích cestách Na levém horním obrázku převládají makrofágy při fyziologickém počtu neutrofilů a eozinofilů tento cytospin nelze odlišit od vzorku zdravé kontrolní osoby [paucigranulocytární astma ( 100)]; obrázek vpravo nahoře zobrazuje kombinaci neutrofilního a eozinofilního zánětu ( 400), obrázek vlevo dole neutrofilní zánět ( 400) a obrázek vpravo dole eozinofilní zánět ( 400) [25]. TLR4 a CD14 a prozánětlivých cytokinů IL 8 a IL 1b ve sputu společně s vyšší koncentrací endotoxinu [39 ]. Navíc se zjistilo, že jedinci s eozinofilním astmatem mají podstatně vyšší koncentraci IL 4 ve sputu než pacienti s non eozinofilním astmatem či zdravé kontrolní osoby, což ukazuje na převahu cytokinů Th2. Eozinofilní skupina kromě toho vykazovala nižší koncentraci faktoru nekrotizujícího nádory (tumour necrosis factor, TNF) a než skupina non eozinofilní, což naznačuje, že léčba prostředky inhibujícími dráhu TNF a nemusí být u této skupiny přínosná [40]. V této studii byli pacienti s neutrofilním zánětem rovnoměrně rozděleni do eozinofilní a non eozinofilní skupiny, což pouze podtrhuje neshodu mezi studiemi, pokud jde o charakterizaci fenotypu. Doporučujeme, aby se v budoucích studiích zvážilo rozdělení pacientů s astmatem na skupinu eozinofilní, neutrofilní, smíšeně zánětlivou a paucigranulocytární, jak navrhovali Gibson a spol. [31 ] (obr. 3) [25]. Refrakterní astma jako odlišný zánětlivý fenotyp Malá část pacientů má refrakterní astma, které se při použití běžných léčebných postupů obtížně léčí (tab. 1) [41]. V těchto případech by lepší poznání zánětlivého fenotypu bylo zvláště přínosné, neboť uvedená skupina trpí značnou morbiditou a významně se podílí na čerpání zdrojů zdravotní péče. Přestože, jak jsme již uvedli, byla u pacientů s těžkým astmatem popsána přítomnost eozinofilního i neutrofilního zánětu, je možné, že pro refrakterní fenotyp jsou některé patofyziologické rysy charakteristické. Změřili jsme alveolární koncentraci oxidu dusnatého (NO) u pacientů s astmatem různého stupně závažnosti [42 ]. Alveolární koncentrace NO byla u pacientů s refrakterním onemocněním podstatně vyšší a snižovala se při léčbě perorálními, nikoli však inhalačními kortikosteroidy, což

4 Nová klasifikace astmatu na základě jeho subfenotypů Green, Brightling a Bradding Tabulka 1 Definice refrakterního astmatu podle Americké společnosti pro onemocnění hrudníku (American Thoracic Society) a Hlavní charakteristiky Lék Dávka (µg/den) Dávka (vdechů/den) a) Beclometason dipropionát > 1260 > 40 vdechů (42 µg/inhalaci) > 20 vdechů (84 µg/inhalaci) b) Budesonid > 1200 > 06 vdechů c) Flunisolid > 2000 > 08 vdechů d) Fluticason propionát > 0880 > 08 vdechů (110 µg), > 04 vdechy (220 µg) e) Triamcinolon acetonid > 2000 > 20 vdechů Méně významné (vedlejší) charakteristiky: 1. Nutnost další preventivní léčby kromě inhalačních kortikosteroidů, např. dlouhodobě působící beta mimetika, teofylin nebo antagonisté leukotrienů 2. Příznaky astmatu vyžadující každodenní nebo téměř každodenní podávání krátkodobě působících beta mimetik 3. Perzistující obstrukce dýchacích cest (FEV 1 < 80 % prediktivní hodnoty; diurnální variabilita PEF > 20 %) 4. Potřeba neodkladného ošetření pro astma jednou nebo vícekrát za rok 5. Nutnost nárazového podání perorálních kortikosteroidů třikrát nebo vícekrát za rok 6. Okamžité zhoršení při snížení dávky perorálních nebo inhalačních kortikosteroidů o 25 % 7. Život ohrožující ataka astmatu v minulosti Pro dosažení kontroly nad astmatem, tzn. jeho převedení na úroveň mírného až středně těžkého perzistujícího astmatu: a) kontinuální nebo téměř kontinuální (50 % roku) léčba perorálními kortikosteroidy; b) nutnost léčby vysokými dávkami inhalačních kortikosteroidů. Přetištěno se svolením [41]. a Definice refrakterního astmatu zahrnuje přítomnost jednoho nebo obou hlavních kritérií a dvou vedlejších kritérií. naznačuje, že pro astma vzdorující standardní léčbě může být charakteristická přítomnost zánětu v distálních dýchacích cestách. Tuto domněnku podporuje zjištění přítomnosti silného alveolárního zánětu u 20 osob, které zemřely na fatální astma [43 ]. Rovněž jsme prokázali, že refrakterní astma bývá spojeno s aktivací osy TNF a, jak dokazuje zvýšená exprese na membránu navázaného TNF a, receptoru 1 pro TNF a a TNF a konvertujícího enzymu v periferních monocytech. U týchž pacientů se významně zlepšily hodnoty zmírnění astmatu po dvojitě slepé, překřížené, placebem kontrolované studii s léčbou rozpustným receptorem pro TNF a (etanerceptem) (obr. 4) [44 ]. To je v souladu s nálezem zvýšené exprese TNF a u těžkého astmatu v porovnání s mírným astmatem [45 ]. Poznání charakteristického refrakterního fenotypu nám tedy může pomoci identifikovat konkrétní cíle léčby. A PC 20 (mg metacholinu/ml) 30,0 10,0 3,0 1,0 0,3 0,1 0,03 Placebo Pacient 1 Pacient 3 Pacient 5 Pacient 7 Pacient 9 Pacient 2 Pacient 4 Pacient 6 Pacient 8 Pacient 10 p = 0,05 Etanercept p = 0,18 p = 0,03 B Skóre kvality života pacienta s astmatem Placebo p = 0,02 Etanercept p = 0,94 p = 0,005 Obrázek 4 Koncentrace vdechovaného metacholinu vyvolávající 20% pokles objemu vzduchu vydechnutého maximálním úsilím za 1 sekundu (FEV 1 ) [PC 20 ; PC (provocation concentration) provokační koncentrace] (A) a skóre kvality života pacienta s astmatem (B) před léčbou, během léčby a po 10 týdnech léčby etanerceptem nebo placebem a kumulativní průměrná (+ SE) změna FEV 1 po inhalaci 200 µg salbutamolu každý týden při 10týdenním pokusu (C) 0, Týdny Týdny Týdny Týdny C Kumulativní změna FEV 1 po bronchodilataci (litry) 0,40 0,20 0,00 p < 0,05 p < 0,01 p < 0,01 p < 0,01 Etanercept Placebo 0, Týdny Přetištěno se svolením [44 ]. Curr Opin Allergy Clin Immunol/CS 2007;4:1 7

5 Nová klasifikace astmatu na základě jeho subfenotypů Green, Brightling a Bradding Jakkoli lze refrakterní astma považovat za samostatný subfenotyp s odlišnými patofyziologickými abnormalitami, které nenalézáme u lehčího typu onemocnění, v případě těžkého astmatu je obzvláště pravděpodobné, že se jedná o velmi různorodé onemocnění z hlediska vyvolávajících příčin, příznaků, charakteru klinického zánětu v dýchacích cestách i odpovědi na léčbu [46,47 ]. Další studie navržené ve snaze o charakterizaci fenotypů astmatu se budou muset zaměřit na tuto populaci nemocných s těžkou formou onemocnění. Léčba astmatu podle konkrétního fenotypu Nová klasifikace astmatu bude mít smysl pouze za předpokladu, že nabídne nový pohled na etiologii onemocnění a pomůže předpovědět jeho prognózu nebo rozpoznat fenotypy, které by mohly lépe odpovídat na určitou léčebnou strategii. Vývoj nových agens určených k léčbě astmatu představuje významný podnět pro provádění fenotypizace, neboť vzhledem k nákladům a konkrétní povaze mnoha z těchto léků je pravděpodobné, že na léčbu s jejich použitím bude odpovídat pouze malá část pacientů. Naším úkolem je tedy vyhledávání pacientů, kteří budou na léčbu odpovídat. Randomizované kontrolované studie s monoklonální protilátkou proti IgE omalizumabem prokázaly zmírnění astmatu spolu se snížením výskytu exacerbací u pacientů se symptomatickým alergickým astmatem, kteří měli alespoň jeden pozitivní výsledek kožního testu vpichem ( prick test ) a zvýšenou koncentraci sérových IgE [48 50]. Kromě přítomnosti atopie však není známo, zda u nějakého konkrétního fenotypu astmatu existuje vyšší pravděpodobnost odpovědi na léčbu. Jedna nedávno provedená souhrnná analýza údajů ze sedmi studií s omalizumabem naznačila, že by tato léčba mohla být přínosná spíše u pacientů s těžkým astmatem charakterizovaným perzistující obstrukcí dýchacích cest, potřebou vysokých dávek inhalačních kortikosteroidů a četnými exacerbacemi astmatu [51 ]; avšak objasnění souvislosti mezi odpovědí na léčbu a klinickým fenotypem si vyžádá ještě mnoho úsilí. Existuje řada důkazů o tom, že na základě zánětlivého fenotypu lze předpovídat odpověď nemocného na léčbu kortikosteroidy. Nález eozinofilie v dýchacích cestách byl shodně spojován s příznivou odpovědí astmatu na léčbu kortikosteroidy [11,30,52 ] a se zvýšeným rizikem exacerbací po vysazení kortikosteroidů [53]. U pacientů, v jejichž sputu navzdory vysokým dávkám inhalačních nebo perorálních kortikosteroidů přetrvávala eozinofilie, přispívala intramuskulární aplikace triamcinolonu ke zmírnění zánětu i příznaků [54]. Je pravděpodobné, že perzistující zánět lze alespoň zčásti vysvětlit špatnou spoluprací pacienta při léčbě. Na druhé straně non eozinofilní astma bývá spojeno s významně horší odpovědí na léčbu inhalačními kortikosteroidy [11,30]. Výsledky nejnovějších studií rovněž podpořily význam klasifikace astmatu vycházející z imunopatologického fenotypu onemocnění pro zlepšení výsledných ukazatelů pomocí strategií zaměřených na zmírnění zánětu v dýchacích cestách. V randomizované kontrolované studii jsme u 74 pacientů se středně těžkým až těžkým astmatem porovnávali léčebné strategie zaměřené na snížení počtu eozinofilů v indukovaném sputu s tradiční léčbou vedenou podle příznaků a hodnoty PEF. Za dobu 12 měsíců bylo u pacientů léčených podle strategie zaměřené na udržení počtu eozinofilů ve sputu nižšího než 3 % zaznamenáno podstatně méně těžkých exacerbací astmatu a příjmů do nemocnice než u pacientů léčených podle standardních klinických doporučení (obr. 5) [8]. V multicentrické studii s podobným uspořádáním bylo randomizovaným způsobem léčeno 107 pacientů podle nálezu ve sputu nebo podle klinických projevů. Při léčbě podle nálezu ve sputu se oddálil výskyt první exacerbace a snížila se četnost exacerbací; zajímavé však bylo zjištění, že tento účinek byl z velké části zaznamenán u pacientů s těžším astmatem a u prevence exacerbací eozinofilie [9 ]. Díky znalosti fenotypu astmatu tedy můžeme u jednotlivých pacientů předpovídat úspěšnost léčby zvolené podle přítomného typu zánětu. Problémy spojené s indukcí a se zpracováním sputa vedly k zájmu o vyšetření koncentrace vydechovaného NO při vedení léčby astmatu. Smith a spol. [55 ] porovnávali ve své studii 97 pacientů léčených standardně nebo podle hodnoty vydechovaného NO, přičemž u pacientů randomizovaně zařazených do skupiny s léčbou podle vydechovaného NO nezjistili statisticky významné snížení výskytu exacerbací, přestože konečná průměrná denní dávka inhalačních kortikosteroidů byla u skupiny pacientů léčených podle NO nižší. Tato zjištění jsme potvrdili ve studii se 118 nemocnými v primární péči ve Velké Británii, v níž pacienti léčení podle hodnot vydechovaného NO vykazovali obdobný výskyt exacerbací astmatu jako pacienti léčení tradičním způsobem [56 ]. Tyto nálezy znamenají, že u pacientů s lehčím onemocněním nejsou léčebné strategie zaměřené na zánět v dýchacích cestách účinnější než ty strategie, které se řídí pouze vý Obrázek 5 Kumulativní počet exacerbací astmatu v průběhu 12měsíčního randomizovaného pokusu, při němž se účinek léčby astmatu vedené podle počtu eozinofilů ve sputu porovnával se standardní léčbou Těžké exacerbace (kumulativní počet) Přetištěno se svolením [9] Čas (měsíce) Kontrolní léčba 109 Léčba vedená podle sputa 35 Curr Opin Allergy Clin Immunol/CS 2007;4:1 7

6 Nová klasifikace astmatu na základě jeho subfenotypů Green, Brightling a Bradding sledky klinického vyšetření, popřípadě že vydechovaný NO necharakterizuje přesně zánětlivý fenotyp. Nedostatky současné klasifikace V současném systému klasifikace astmatu nadále přetrvává řada nedostatků. Současné metody klasifikace, ať už vycházejí z etiologie, charakteru obstrukce dýchacích cest nebo zánětlivého fenotypu, jsou totiž vždy z velké části popisné a nevyhnutelně zaměřené pouze na jednu stránku onemocnění. To však celou situaci hrubě zjednodušuje, neboť pro astma je charakteristická různorodost jak u jednotlivce, tak mezi jedinci. Definice astmatu skutečně zůstává popisnou a zahrnuje celou řadu projevů, jako jsou chronický zánět dýchacích cest, hyperreaktivita dýchacích cest, příznaky, jako jsou hvízdání, dušnost, tlak na hrudi nebo kašel a proměnlivá obstrukce dýchacích cest [6]. Každý tento aspekt je u konkrétních pacientů v různé míře významný a v průběhu času se mění. Uvedená složitost problematiky vedla nedávno k návrhu, aby byl pojem astma zrušen ve prospěch přesnější charakterizace odlišných patologických procesů, jež se projevují jako astma [57 ]. Jednou z cest, jak se s tímto problémem vypořádat, je rozlišit různé typy onemocnění metodou zahrnující různé aspekty tohoto onemocnění, například analýzou velké populace pacientů s astmatem pomocí multivariačních technik. Jedním z těchto multivariačních statistických nástrojů, s jejichž pomocí lze uspořádat informace o proměnných tak, aby bylo možno heterogenní skupiny jedinců roztřídit do poměrně homogenních skupin (neboli clusterů ), je clusterová (resp. též shluková pozn. překl.) analýza. Tyto skupiny jedinců jsou sestaveny tak, aby byl stupeň asociace mezi členy stejné skupiny silný, ale mezi členy různých skupin naopak slabý. Při vkládání velkého počtu proměnných můžeme pomocí tohoto přístupu odhalit mezi proměnnými asociace, které předtím nebyly zjevné, a nalézt nové, zřetelně odlišné fenotypy. Techniku clusterové analýzy jsme použili k identifikaci subfenotypů v populaci pacientů s těžkým astmatem, kteří navštěvují naši kliniku [58 ]. Shromáždili jsme údaje od více než 270 pacientů s těžkým astmatem a analyzovali jsme velký počet proměnných popisujících různé aspekty onemocnění. Pomocí clusterové analýzy jsme odhalili čtyři skupiny s různými fenotypy onemocnění: a) populaci pacientů s relativně dobře léčenými příznaky a s minimálním zánětem v dýchacích cestách; b) skupinu nemocných s časným nástupem alergického astmatu, kteří měli těžké příznaky, perzistující zánět a výrazně proměnlivou obstrukci dýchacích cest; c) třetí skupina (především ženy) vykazovala pozdní nástup astmatu, výrazné příznaky, ale minimální eozinofilní zánět, a mnozí pacienti trpěli obezitou; d) skupina, v níž převažovali muži, vykazovala pozdní nástup astmatu a onemocnění charakterizoval perzistující eozinofilní zánět při absenci příznaků [58 ]. Je možné, že pro jednotlivé podskupiny mohou být vhodné různé léčebné strategie. Pacienti s výrazným zánětem, ale s minimálními příznaky mohou obzvláště dobře odpovídat na léčebné strategie řídící se podle počtu eozinofilů ve sputu, zatímco u nemocných, jejichž příznaky těsně souvisí se zánětem v dýchacích cestách, se může ke zmírnění příznaků zvláště hodit léčebný režim s inhalačním budesonidem v kombinaci s formoterolem [59 ]. Závěry Nové metody klasifikace astmatu založené na charakterizaci typu zánětu v dýchacích cestách již vedly ke zlepšení výsledných ukazatelů léčby, přičemž byly použity specificky cílené druhy terapie a léčebné strategie. Vzhledem ke komplexní mnohorozměrné povaze astmatu však zůstává ještě řada otázek nevyřešených. Podle našeho názoru lze pomocí multivariační analýzy změnit chápání této problematiky v tom smyslu, že budeme rozeznávat různé subfenotypy onemocnění spojené s potenciálně horší prognózou, u kterých se však mohou obzvláště úspěšně uplatnit určité léčebné přístupy. Odkazy a doporučená literatura Zvláště významné práce zveřejněné během roku přípravy tohoto přehledového článku jsou označeny takto: = významné, = mimořádně významné. 1. Rackemann FM. A clinical classification of asthma. Am J Med Sci 1921; 12: Turner Warwick M. On observing patterns of airflow obstruction in chronic asthma. Br J Dis Chest 1977;71: Ayres JG, Miles JF, Barnes PJ. Brittle asthma. Thorax 1998;53: Covar RA, Spahn JD, Murphy JR, Szefler SJ. Progression of asthma measured by lung function in the childhood asthma management program. Am J Respir Crit Care Med 2004;170: British Thoracic Society, Scottish Intercollegiate Network. British guideline on the management of asthma. Thorax 2003;5 (Suppl 1):i Global Initiative for Asthma. Global strategy for asthma management and prevention. 2005; 7. Wenzel SE. Asthma: defining of the persistent adult phenotypes. Lancet 2006;368: Přehledový článek zabývající se aktuálně běžně používanými systémy klasifikace astmatu. 8. Green RH, Brightling CE, McKenna S, et al. Asthma exacerbations and sputum eosinophil counts: a randomised controlled trial. Lancet 2002;360: Jayaram L, Pizzichini MM, Cook RJ, et al. Determining asthma treatment by monitoring sputum cell counts: effect on exacerbations. Eur Respir J 2006;27: Druhá randomizovaná kontrolovaná studie, která vyznívá ve prospěch monitorování zánětu v dýchacích cestách pomocí stanovení počtu eozinofilů v indukovaném sputu při léčbě astmatu. V porovnání s tradičním přístupem došlo při léčbě vedené podle počtu eozinofilů ve sputu ke snížení výskytu exacerbací astmatu, zejména u pacientů s těžkým astmatem a s eozinofilním fenotypem. 10. Payne DN, Wilson NM, James A, et al. Evidence for different subgroups of difficult asthma in children. Thorax 2001;56: Pavord ID, Brightling CE, Woltmann G, Wardlaw AJ. Noneosinophilic corticosteroid unresponsive asthma [letter]. Lancet 1999;353: Wenzel SE, Schwartz LB, Langmack EL, et al. Evidence that severe asthma can be divided pathologically into two inflammatory subtypes with distinct physiologic and clinical characteristics. Am J Respir Crit Care Med 1999;160: Wardlaw AJ, Silverman M, Siva R, et al. Multidimensional phenotyping: towards a new taxonomy for airway disease. Clin Exp Allergy 2005;35: Přehled zabývající se nedostatky tradičních systémů klasifikace onemocnění dýchacích cest a navrhující nové přístupy. 14. Wardlaw AJ, Dunnette S, Gleich GJ, et al. Eosinophils and mast cells in bronchoalveolar lavage in subjects with mild asthma: Relationship to bronchial hyperreactivity. Am Rev Respir Dis 1988;137: Broide DH, Gleich GJ, Cuomo AJ, et al. Evidence of ongoing mast cell and eosinophil degranulation in symptomatic asthma airway. J Allergy Clin Immunol 1991;88: Djukanovic R, Wilson JW, Britten KM, et al. Quantitation of mast cells and eosinophils in the bronchial mucosa of symptomatic atopic asthmatics and Curr Opin Allergy Clin Immunol/CS 2007;4:1 7

7 Nová klasifikace astmatu na základě jeho subfenotypů Green, Brightling a Bradding healthy control subjects using immunohistochemistry. Am Rev Respir Dis 1990;142: Bentley AM, Menz G, Storz C, et al. Identification of T lymphocytes, macrophages, and activated eosinophils in the bronchial mucosa in intrinsic asthma: Relationship to symptoms and bronchial responsiveness. Am Rev Respir Dis 1992;146: Humbert M, Durham SR, Ying S, et al. IL 4 and IL 5 mrna and protein in bronchial biopsies from patients with atopic and nonatopic asthma: evidence against intrinsic asthma being a distinct immunopathologic entity. Am J Respir Crit Care Med 1996;154: Humbert M, Ying S, Corrigan C, et al. Bronchial mucosal expression of the genes encoding chemokines RANTES and MCP 3 in symptomatic atopic and nonatopic asthmatics: relationship to the eosinophil active cytokines interleukin (IL) 5, granulocyte macrophage colony stimulating factor, and IL 3. Am J Respir Cell Mol Biol 1997;16: Ying S, Humbert M, Barkans J, et al. Expression of IL 4 and IL 5 mrna and protein product by CD4+ and CD8+ T cells, eosinophils, and mast cells in bronchial biopsies obtained from atopic and nonatopic (intrinsic) asthmatics. J Immunol 1997;158: Nasser SM, Pfister R, Christie PE, et al. Inflammatory cell populations in bronchial biopsies from aspirin sensitive asthmatic subjects. Am J Respir Crit Care Med 1996;153: Frew AJ, Chan H, Lam S, Chan Yeung M. Bronchial inflammation in occupational asthma due to western red cedar. Am J Respir Crit Care Med 1995; 151: Bousquet J, Chanez P, Lacoste JY, et al. Eosinophilic inflammation in asthma. N Engl J Med 1990;323: Pavord ID, Pizzichini MM, Pizzichini E, Hargreave FE. The use of induced sputum to investigate airway inflammation. Thorax 1997;52: Brightling CE. Clinical applications of induced sputum. Chest 2006;129: Přehled klinického využití techniky indukovaného sputa u onemocnění dýchacích cest. 26. Pin I, Gibson PG, Kolendowicz R, et al. Use of induced sputum cell counts to investigate airway inflammation in asthma. Thorax 1992;47: Crimi E, Spanevello A, Neri M, et al. Dissociation between airway inflammation and airway hyperresponsiveness in allergic asthma [see comments]. Am J Respir Crit Care Med 1998;157: Brightling CE, Bradding P, Symon FA, et al. Mast cell infiltration of airway smooth muscle in asthma. N Engl J Med 2002;346: Pizzichini MM, Pizzichini E, Clelland L, et al. Prednisone dependent asthma: inflammatory indices in induced sputum. Eur Respir J 1999;13: Green RH, Brightling CE, Woltmann G, et al. Analysis of induced sputum in adults with asthma: identification of subgroup with isolated sputum neutrophilia and poor response to inhaled corticosteroids. Thorax 2002;57: Simpson JL, Scott R, Boyle MJ, Gibson PG. Inflammatory subtypes in asthma: assessment and identification using induced sputum. Respirology 2006;11: Studie popisující rozlišení čtyř různých zánětlivých fenotypů astmatu pomocí indukovaného sputa (eozinofilní, neutrofilní, smíšeně zánětlivý a paucigranulocytární). 32. Jatakanon A, Uasuf C, Maziak W, et al. Neutrophilic inflammation in severe persistent asthma. Am J Respir Crit Care Med 1999;160: Louis R, Lau LC, Bron AO, et al. The relationship between airways inflammation and asthma severity. Am J Respir Crit Care Med 2000;161: Fahy JV, Kim KW, Liu J, Boushey HA. Prominent neutrophilic inflammation in sputum from subjects with asthma exacerbation. J Allergy Clin Immunol 1995;95: Gibson PG, Simpson JL, Saltos N. Heterogeneity of airway inflammation in persistent asthma: evidence of neutrophilic inflammation and increased sputum interleukin 8. Chest 2001;119: Lamblin C, Gosset P, Tillie Leblond I, et al. Bronchial neutrophilia in patients with noninfectious status asthmaticus. Am J Respir Crit Care Med 1998;157: Sur S, Crotty TB, Kephart GM, et al. Sudden onset fatal asthma A distinct entity with few eosinophils and relatively more neutrophils in the airway submucosa? Am Rev Respir Dis 1993;148: Simpson JL, Scott RJ, Boyle MJ, Gibson PG. Differential proteolytic enzyme activity in eosinophilic and neutrophilic asthma. Am J Respir Crit Care Med 2005;172: Studie, v níž se porovnávala aktivita proteolytických enzymů u různých zánětlivých subfenotypů astmatu. Pacienti s eozinofilním astmatem vykazovali vyšší úroveň aktivity MMP 9, kdežto pacienti s neutrofilním fenotypem vykazovali vysokou aktivitu neutrofilní elastázy, ale inaktivní MMP Simpson JL, Grissell TV, Douwes J, et al. Innate immune activation in neutrophilic asthma and bronchiectasis. Thorax 2006 [Epub ahead of print]. V této studii se uvádí, že u neutrofilního astmatu je patrná zvýšená aktivace systému přirozené imunity, což naznačuje, že etiologie různých zánětlivých fenotypů může být odlišná. 40. Quaedvlieg V, Henket M, Sele J, Louis R. Cytokine production from sputum cells in eosinophilic versus noneosinophilic asthmatics. Clin Exp Immunol 2006;143: American Thoracic Society. Proceedings of the ATS workshop on refractory asthma: current understanding, recommendations, and unanswered questions. Am J Respir Crit Care Med 2000;162: Berry M, Hargadon B, Morgan A, et al. Alveolar nitric oxide in adults with asthma: evidence of distal lung inflammation in refractory asthma. Eur Respir J 2005;25: V této studii bylo zjištěno, že pacienti s refrakterním astmatem mají vyšší obsah oxidu dusnatého v alveolárním vzduchu než kontrolní osoby s mírným astmatem. Tento nález bylo možné potlačit systémovým, nikoli však inhalačním podáváním kortikosteroidů. To ukazuje na možný mechanismus rezistence vůči léčbě inhalačními kortikosteroidy u refrakterního astmatu. 43. De Magalhaes SS, dos Santos MA, da Silva OM, et al. Inflammatory cell mapping of the respiratory tract in fatal asthma. Clin Exp Allergy 2005;35: Studie hodnotící charakter zánětu dýchacích cest u fatálního astmatu uvádí se přítomnost silného zánětu v alveolech, což podporuje názor, že u refrakterního astmatu je základní abnormalitou distální zánět. 44. Berry MA, Hargadon B, Shelley M, et al. Evidence of a role of tumor necrosis factor alpha in refractory asthma. N Engl J Med 2006;354: V této studii se porovnávaly markery aktivity TNF a v mononukleárních buňkách periferní krve u zdravých osob, u pacientů s mírným až středně těžkým astmatem a u nemocných s refrakterním astmatem. Zjistilo se, že u pacientů s refrakterním astmatem je významně aktivovaná osa TNF a. Tito nemocní byli 10 týdnů léčeni solubilním receptorem TNF a (etanerceptem) v rámci placebem kontrolované studie se zkříženým uspořádáním. Po léčbě etanerceptem u nich bylo v porovnání s placebem pozorováno podstatné zlepšení reaktivity dýchacích cest, plicních funkcí a kvality života. 45. Howarth PH, Babu KS, Arshad HS, et al. Tumour necrosis factor (TNFalpha) as a novel therapeutic target in symptomatic corticosteroid dependent asthma. Thorax 2005;60: V této nezaslepené a nekontrolované studii se potvrdilo, že podávání etanerceptu nemocným s těžkým astmatem vede ke zmírnění příznaků a ke zlepšení plicních funkcí a hyperreaktivity. U těžkého, nikoli však u mírného astmatu byla rovněž potvrzena zvýšená exprese TNF a na sliznicích. 46. Peters SP, Ferguson G, Deniz Y, Reisner C. Uncontrolled asthma: a review of the prevalence, disease burden and options for treatment. Respir Med 2006;100: Přehled prevalence a možností léčby nekontrolovaného astmatu. 47. Holgate ST, Polosa R. The mechanisms, diagnosis, and management of severe asthma in adults. Lancet 2006;368: Obsáhlý přehled informací o těžkém astmatu u dospělých. 48. Busse WW, Corren J, Lanier BQ, et al. Omalizumab, anti IgE recombinant humanised monoclonal antibody, for the treatment of severe allergic asthma. J Allergy Clin Immunol 2001;108: Soler M, Matz J, Townley R, et al. The anti IgE antibody omalizumab reduces exacerbations and steroid requirement in allergic asthmatics. Eur Respir J 2001;18: Holgate ST, Chuchalin AG, Hebert J, et al. Efficacy and safety of a recombinant antiimmunoglobulin E antibody (omalizumab) in severe allergic asthma. Clin Exp Allergy 2004;34: Bousquet J, Cabrera P, Berkman N, et al. The effect of treatment with omalizumab, an anti IgE antibody, on asthma exacerbations and emergency medical visits in patients with severe persistent asthma. Allergy 2005;60: Souhrnná analýza údajů z dřívějších studií s použitím protilátky proti IgE omalizumabu ukazuje, že u pacientů s těžkým astmatem, charakterizovaným perzistující obstrukcí dýchacích cest, potřebou užití vysokých dávek inhalačních kortikosteroidů a častými exacerbacemi astmatu, je větší pravděpodobnost úspěšnosti této léčby. 52. Kelly MM, Leigh R, Jayaram L, et al. Eosinophilic bronchitis in asthma: a model for establishing dose response and relative potency of inhaled corticosteroids. J Allergy Clin Immunol 2006;117: Studie doplňující základní literaturu na toto téma, která ukazuje, že rozpoznání eozinofilního fenotypu astmatu může mít význam pro předpověď odpovědi na léčbu inhalačními kortikosteroidy. 53. Jatakanon A, Lim S, Barnes PJ. Changes in sputum eosinophils predict loss of asthma control. Am J Respir Crit Care Med 2000;161: Ten Brinke A, Zwinderman AH, Sterk PJ, et al. Refractory eosinophilic airway inflammation in severe asthma; effect of parenteral corticosteroids. Am J Respir Crit Care Med 2004;170: Smith AD, Cowan JO, Brassett KP, et al. Use of exhaled nitric oxide measurements to guide treatment in chronic asthma. N Engl J Med 2005;352: Randomizovaná studie porovnávající tradiční léčbu astmatu s léčebnou strategií vedenou podle NO ve vydechovaném vzduchu. Na rozdíl od studií, ve kterých se léčba řídila podle indukovaného sputa, nedošlo při léčbě vedené podle NO ke snížení počtu exacerbací astmatu, i když bylo možné snížit konečnou dávku inhalačních kortikosteroidů bez zřetelného negativního ovlivnění léčby astmatu. 56. Shaw DE, Berry MA, Thomas M, et al. Asthma exacerbations and exhaled nitric oxide: a randomised controlled trial [abstract]. Eur Respir J 2006;28: 572S. 57. A plea to abandon asthma as a disease concept [editorial]. Lancet 2006, 368:705. Anonymní editorial, v němž se uvádí, že současné pojetí astmatu jako onemocnění je zastaralé a musí být nahrazeno přesnějším, které lépe odráží přítomnost různých fenotypů onemocnění. 58. Haldar P, Green RH, Berry MA, et al. Heterogeneity in refractory asthma: the use of cluster analysis to identify distinct cohorts [abstract]. Thorax 2005;60:ii Rabe KF, Atienza T, Magyar P, et al. Effect of budesonide in combination with formoterol for reliever therapy in asthma exacerbations: a randomised controlled, double blind study. Lancet 2006;368: Dvojitě slepá studie s paralelními skupinami, podle které může léčba kombinací budesonidu s formoterolem podle potřeby v porovnání s léčbou terbutalinem podle potřeby omezit výskyt těžkých exacerbací astmatu u pacientů již léčených kombinací budesonidu s formoterolem. Curr Opin Allergy Clin Immunol/CS 2007;4:1 7

8 Kvantitativní stanovení počtu buněk ve sputu jako ukazatele stupně závažnosti zánětu dýchacích cest v klinické praxi Frederick E. Hargreave Význam přehledu Bronchitida, tedy zánět průdušek, je významnou složkou onemocnění dýchacích cest. Přesto odborníci na respirační onemocnění a alergologové, kteří zdůrazňují význam hodnocení funkce dýchacích cest, zavádějí do klinické praxe hodnocení zánětu dýchacích cest pouze pozvolna. Z dostupných způsobů hodnocení je z klinického hlediska nejcennější kvantitativní stanovení počtu buněk ve sputu. Tento článek přináší další informace na dané téma, které byly získány ze studií publikovaných v letech 2005 a Aktuální výsledky Onemocnění dýchacích cest se u pacientů projevují různě, a to ve smyslu jak samotného onemocnění, tak i typu zánětu dýchacích cest. Kvantitativní stanovení počtu buněk ve sputu (stanovení celkového i diferenciálního počtu) prokázalo u nemocných s astmatem a s chronickou obstrukční plicní nemocí časté, snad infekční exacerbace jiných než eozinofilních buněk, zejména neutrofilů, které nemusí odpovídat na léčbu kortikosteroidy. Naopak stanovení počtu eozinofilů ve sputu může posloužit jako vodítko při stanovování minimální dávky kortikosteroidu, která je nezbytná ke kompenzaci eozinofilní bronchitidy a ke snížení počtu eozinofilních exacerbací. Souhrn Je třeba, aby se kvantitativní stanovení počtu buněk ve sputu stalo dostupnou metodou zpočátku v centrech terciární péče pro diagnostiku bronchitické složky onemocnění dýchacích cest a k optimalizaci léčby. Budoucí výzkum musí zjistit, jak se kvantitativní stanovení počtů buněk ve sputu vzájemně doplňuje s nepřímými měřítky stupně závažnosti zánětu dýchacích cest, konkrétně s množstvím vydechovaného oxidu dusnatého a s hyperreaktivitou dýchacích cest na podněty působící nepřímo uvolňováním mediátorů. Klíčová slova astma, chronická obstrukční plicní nemoc, chronický kašel, počet buněk ve sputu, sputum Quantitative sputum cell counts as a marker of airway inflammation in clinical practice Curr Opin Allergy Clin Immunol 2007;7: Lippincott Williams & Wilkins, Inc. McMaster University, St Joseph s HealthCare, Hamilton, Ontario, Canada Adresa pro korespondenci: Frederick E. Hargreave, MD, McMaster University, St Joseph s HealthCare, Room T2129, 2nd Level Tower, 50 Charlton Avenue East, Hamilton, Ontario L8N 4A6, Canada Zkratky FEV 1 CHOPN IKS objem vydechnutý maximálním úsilím (forced expired volume) za jednu sekundu chronická obstrukční plicní nemoc inhalační kortikosteroidy Úvod Významnou složkou všech onemocnění dýchacích cest v plicích, jakými jsou astma, chronická obstrukční plicní nemoc (CHOPN), emfyzém, bronchitida a bronchiektázie (i cystická fibróza jako příčina bronchiektázie), je zánět dýchacích cest [1]. K rozvoji zánětu dochází z různých příčin; následkem je široká škála typů zánětu, odpovídajících na různé způsoby léčby. Nepřímé vyšetření zánětu dýchacích cest na základě příznaků a spirometrie je problematické a často nepřesné, přestože je provedeno odborníky. Stanovení stupně závažnosti zánětu je tedy přínosné, zejména v odborné praxi, kam často přicházejí pacienti se závažnějšími, komplikovanými a obtížněji léčitelnými formami onemocnění. Do klinické praxe již pronikly metody pro stanovení stupně závažnosti zánětu dýchacích cest, jako je zjišťování množství vydechovaného oxidu dusnatého [2 ] a kvantitativní stanovení počtu buněk ve sputu [3,4,5], i když zatím pouze v ojedinělých případech. Druhá z obou zmíněných metod poskytuje nejucelenější informace a je z klinického hlediska nesmírně cenná. Pro její využití v praxi hovoří publikace z poslední doby a bude uvedena i v rámci aktualizovaných verzí Globální iniciativy pro léčbu astmatu (Global Initiative for Asthma) a Kanadských směrnic pro léčbu astmatu (Canadian Asthma Treatment Guidelines). V tomto článku shrnuji své názory na danou problematiku a výsledky některých studií z let 2005 a 2006, které s ní souvisí. Definice onemocnění dýchacích cest Je třeba vycházet z toho, jak onemocnění dýchacích cest definujeme. Označení, která pro onemocnění dýchacích cest používáme, vypovídají o složkách těchto nemocí, jež jsou pro jejich definice určující [1] (obr. 1). Například astma a CHOPN jsou primárně definovány funkčními abnormitami astma jako onemocnění charakterizované značnou proměnlivostí průtokové rezistence v dýchacích cestách uvnitř plic během krátkých časových úseků [1] a CHOPN jako stav nemoci charakterizovaný obstrukcí dýchacích cest, jež není plně reverzibilní [6]. Emfyzém a bronchiektázie jsou definovány strukturálními abnormitami. Bronchitida je charakterizována jako zánět dýchacích cest klinicky rozpoznatelný kvantitativním stanovením počtu buněk ve sputu. Onemocnění postihující konkrétního jedince vždy závisí na hostiteli i na faktorech prostředí. U pacientů s astmatem nebo jinými onemocněními rozlišujeme různé fenotypy (definované jako soubory Curr Opin Allergy Clin Immunol/CS 2007;4:8 11

9 Kvantitativní stanovení počtu buněk ve sputu Hargreave Obrázek 1 Jednotlivé složky onemocnění dýchacích cest a jejich vzájemné vztahy Proměnlivé omezení funkce dýchacích cest (astma) Příznaky Zánět (bronchitida) Hyperreaktivita dýchacích cest Chronické omezení funkce dýchacích cest (CHOPN) Různá onemocnění dýchacích cest tak, jak jsou primárně definována, tvoří pouze jednotlivé složky obecného modelu onemocnění dýchacích cest. CHOPN chronická obstrukční plicní nemoc charakteristik, které lze pozorovat u daného jedince či skupiny) [7]. Pokud si tuto skutečnost neuvědomíme, má například označení nemoci, kterou nazýváme astmatem, pro různé jedince různý význam a mohlo by být dokonce mylně považováno za přežité [8,9 ]. Heterogenita zánětu dýchacích cest Nejspolehlivějším a nespecifičtějším způsobem hodnocení stupně závažnosti zánětu dýchacích cest je kvantitativní stanovení počtu buněk ve spontánně vytvořeném nebo indukovaném sputu. Na základě tohoto vyšetření lze rozlišovat mezi eozinofilním, neutrofilním, smíšeným eozinofilně neutrofilním a paucigranulocytárním typem bronchitidy [10 ]. Příčiny eozinofilních a non eozinofilních typů bronchitidy jsou dobře známy. Eozinofilní bronchitidu lze nejlépe diagnostikovat podle procentuálního zastoupení eozinofilů ve sputu (protože celkový počet buněk ve sputu většinou zůstává ve fyziologickém rozmezí). Naopak infekční, zpravidla neutrofilní bronchitida je spojena s nárůstem jak celkového počtu buněk, tak podílu neutrofilů. Závažnost neutrofilie bývá v těchto případech jiného rázu než obyčejná neutrofilie vznikající při kouření cigaret nebo při dýchání znečištěného vzduchu, u níž se setkáváme pouze s vyšším procentuálním zastoupením neutrofilů, aniž by celkový počet buněk překračoval fyziologické hranice. U osob, které zanechaly kouření, dochází po šesti týdnech k poklesu procentuálního zastoupení neutrofilů a ke zvětšení objemu vydechnutého maximálním úsilím za jednu sekundu (forced expired volume, FEV 1 ) [11]. Pro léčbu bronchitidy je nutno určit její typ a stupeň závažnosti. Léčba kortikosteroidy vedená podle zastoupení eozinofilů ve sputu Existují přesvědčivé důkazy o tom, že eozinofilie sputa (> 3 %) předpovídá klinické zlepšení při léčbě kortikosteroidy, a to nejen u astmatu, ale rovněž u CHOPN a chronického kašle [3,5]. Dále bylo prokázáno, že eozinofilie sputa po snížení dávky prednisonu nebo inhalačního kortikosteroidu (IKS) zpravidla předchází zhoršení příznaků, zhoršení funkce dýchacích cest a rozvoji eozinofilie v periferní krvi. O platnosti uvedených tvrzení svědčí údaje ze tří nově zveřejněných studií. Bacci a spol. [12] vyšetřovali dospělé pacienty, kteří předtím po dobu tří měsíců nedostávali žádné IKS; vyšetření bylo provedeno před léčbou beclometasonem v dávce 500 µg dvakrát denně a dále dva a čtyři týdny po této léčbě. Eozinofilie sputa byla spojena se zmírněním příznaků, vrcholové výdechové rychlosti a odpovídavostí dýchacích cest na podávání metacholinu. Nízké zastoupení eozinofilů ve sputu bylo nejlepším předpovědním ukazatelem nedostatečného účinku kortikosteroidů. Ve studii zabývající se snižováním dávek IKS dospěli Belda a spol. [13] k závěru, že pokud eozinofily tvoří méně než 2 % buněk ve sputu, je vhodné dávky IKS nesnižovat. U dětí se stabilizovaným astmatem Zacharasiewisz a spol. [14] snížili dávky IKS v intervalu osmi týdnů na polovinu a zjistili účinnost tohoto postupu ve všech případech, kdy indukované sputum před snížením dávky neobsahovalo žádné eozinofily. Uvedené studie potvrzují vhodnost léčby kortikosteroidy vedené podle kvantitativního stanovení počtu buněk ve sputu. Ve studii, během níž bylo 117 dospělých astmatiků sledováno déle než dva roky, byl přínos léčby IKS vedené podle kvantitativního stanovení počtu buněk ve sputu porovnáván s přínosem léčby vedené podle příznaků a spirometrie [15 ]. Sledování zastoupení eozinofilů ve sputu bylo přínosné u pacientů se středně těžkým až těžkým astmatem ve smyslu snížení počtu eozinofilních exacerbací (6 oproti 26) a omezení závažnosti všech exacerbací, aniž bylo třeba zvyšovat celkovou dávku IKS (obr. 2). Tento postup neměl žádný vliv na počet běžnějších non eozino Obrázek 2 Analýza eozinofilních a non- -eozinofilních exacerbací (upraveno podle autorů Jayaram a spol. [15 ]) 1,5 Eozinofilní RR = 0,28 p = 0,01 1,5 Non eozinofilní RR = 1,07 p = 0,82 KS klinická strategie, spočívající ve vedení léčby podle příznaků a spirometrie; RR relativní riziko; SS strategie spočívající ve vedení léčby inhalačními kortikosteroidy podle zastoupení eozinofilů ve sputu. Z výsledků vyplývá, že sledování eozinofilie sputa vedlo ke snížení počtu eozinofilních (nikoli však non eozinofilních) exacerbací. Průměrný počet exacerbací 1,0 0,5 KS n = 26 SS n = 6 0, Čas od zavedení strategie (dny) Průměrný počet exacerbací 1,0 0,5 KS n = 37 SS n = 33 0, Čas od zavedení strategie (dny) Curr Opin Allergy Clin Immunol/CS 2007;4:8 11 9

10 Kvantitativní stanovení počtu buněk ve sputu Hargreave filních exacerbací (33 ve skupině se sledováním sputa, 37 v klinické skupině), u nichž se předpokládal převážně virový původ. Dílčí analýza prokázala, že u nemocných, u nichž se předpokládala nutnost léčbu doplnit dlouhodobě působícími beta mimetiky, se počet těchto non eozinofilních exacerbací ve skupině se sledováním sputa (kde byla eozinofilie průběžně sledována) snížil je tedy možné, že tento léčebný postup omezí vliv virových infekcí. Na rozdíl od kvantitativního stanovení počtu buněk ve sputu se při vedení léčby IKS podle vydechovaného množství oxidu dusnatého nepodařilo snížit počet exacerbací a u jedné třetiny pacientů se dokonce ani nepodařilo udržet eozinofilní bronchitidu pod kontrolou [16]. Kvantitativní stanovení počtu buněk ve sputu u CHOPN Vědci zkoumající CHOPN považovali tuto nemoc za odlišnou od astmatu, což je podle primární definice skutečně pravda. Nicméně platí, že zatímco klasická bronchitida provázející CHOPN u kuřáků je non eozinofilní povahy, byla nedávno přibližně u 40 % kuřáků se středně těžkou až těžkou CHOPN pozorována eozinofilie sputa [17,18 ]. Dvě kontrolované studie prokázaly, že léčba těchto pacientů prednisonem vede k ústupu eozinofilie a zvyšuje kvalitu života i hodnotu FEV 1. Brightling a spol. [17] v placebem kontrolované studii se zkříženým uspořádáním zkoumali u nemocných se středně těžkou až těžkou CHOPN přínos šestitýdenní léčby inhalačním mometasonem v dávce 400 µg denně. Nezaznamenali žádné zlepšení v procentuálním zastoupení eozinofilů ve sputu, ačkoli od nejnižšího do nejvyššího tercilu výchozího počtu eozinofilů ve sputu docházelo k progresivnímu zvyšování hodnoty FEV 1 a skóre kvality života. Na základě těchto výsledků dospěli autoři studie k závěru, že CHOPN je onemocnění charakterizované rezistencí vůči IKS a odpovídavostí na perorální podávání kortikosteroidů [19]. Leigh a spol. [18 ] naopak v podobné kontrolované studii s použitím vyšší dávky IKS (800 µg Pulmicortu dvakrát denně), která je podle odhadu přibližně čtyřikrát účinnější než zmíněná dávka mometasonu, prokázali ústup eozinofilie sputa a klinické zlepšení, které během dvoutýdenní léčby prednisonem v dávce 30 mg denně již dále nepokračovalo (obr. 3). Středně těžká až těžká CHOPN s eozinofilií sputa tedy může na léčbu inhalačními steroidy odpovídat, je však možné, že bude nutno zvýšit dávky. Zmíněná studie rovněž upozornila na tři další závažné otázky v souvislosti s CHOPN týkající se působení IKS, eozinofilní bronchitidy a reverzibility FEV 1 měřeného po podání salbutamolu. Pokud nebyly sledované osoby rozděleny na eozinofilní a non eozinofilní skupinu, nebylo po léčbě inhalačními steroidy pozorováno žádné zlepšení. To může být jedním z důvodů, proč předchozí velké multicentrické studie zabývající se účinky IKS u CHOPN, v nichž nebyl zohledňován typ zánětu dýchacích cest, neprokázaly žádný přínos. Dále se zjistilo, že eozinofilní Obrázek 3 Změny skóre dušnosti u chronických respiračních onemocnění, objemu vydechnutého maximálním úsilím za jednu sekundu po podání bronchodilatancia (postbronchodilator forced expired volume in 1 s, post BD FEV 1 ) a procentuálního zastoupení eozinofilů ve sputu po podávání placeba, budesonidu a prednisonu nemocným se středně těžkou až těžkou chronickou obstrukční plicní nemocí A B C Skóre dušnosti Post BD FEV 1 (litry) Zastoupení eozinofilů ve sputu (%) 1,00 0,75 0,50 0,25 0,00 0,15 0,10 0,05 0,00 0, Placebo Budesonid Prednison Placebo Budesonid Prednison Výchozí Placebo Budesonid Prednison hodnota Bílé sloupce označují osoby s nejméně 3% výchozím zastoupením eozinofilů ve sputu a šedé sloupce pak osoby bez eozinofilie sputa. Chybové úsečky u dušnosti a FEV 1 představují střední chyby průměru (SEM), u zastoupení eozinofilů pak interkvartilové rozmezí. Přerušovaná čára vyznačuje minimální klinicky významný rozdíl ve stupni závažnosti dušnosti a horní fyziologické hranici pro zastoupení eozinofilů. Budesonid a prednison u osob s výchozí eozinofilií významně zmírňovaly dušnost (A) a FEV 1 (B) a snižovaly zastoupení eozinofilů ve sputu (C) do fyziologického rozmezí. Převzato se svolením [18 ]. bronchitida nemusí mít nutně souvislost s primární definicí astmatu (tj. s významnou reverzibilitou po podání bronchodilatancia). A konečně nebyl zaznamenán vztah mezi touto reverzibilitou a odpovídavostí na léčbu steroidy. Tato zjištění zpochybňují výchozí předpoklad některých odborníků, podle něhož bylo zlepšení stavu zmíněných pacientů podmíněno výhradně skutečností, že trpěli astmatem. Uvedená zjištění spíše hovoří ve prospěch představy, že jednotlivé složky onemocnění dýchacích cest mohou být pod vlivem různých příčin a mechanismů oddělené. Infekční exacerbace astmatu a CHOPN Je stále zřejmější, že u nemocných s astmatem nebo CHOPN jsou příčinou exacerbací časté virové a bakteriální infekční bronchitidy [20 ]. Zpravidla bývají non eozino 10 Curr Opin Allergy Clin Immunol/CS 2007;4:8 11

11 Kvantitativní stanovení počtu buněk ve sputu Hargreave filní, přičemž virové infekce obvykle provází lehká až středně významná neutrofilie, bakteriální infekce pak nápadněji vyjádřená neutrofilie. Pokud tedy nejsou exacerbace spojeny s výskytem eozinofilní bronchitidy, neměly by jako takové příznivě reagovat na léčbu kortikosteroidy. Ve studii zabývající se astmatem dospěli Jayaram a spol. [15 ] k závěru, že exacerbace jsou většinou non eozinofilní, jak vyplývá z absence nárůstu procentuálního zastoupení eozinofilů ve sputu. U některých pacientů zařazených do studie se vzhledem k průvodnímu vzestupu celkového počtu leukocytů zvyšoval absolutní počet eozinofilů. Papi a spol. [21 ] zjistili, že virové i smíšené virové a bakteriální exacerbace vedou u CHOPN k vzestupu absolutního počtu eozinofilů ve sputu; jejich procentuální zastoupení autoři neuvedli. Klinický význam těchto rozporných nálezů je třeba objasnit dalším výzkumem. Ten musí stanovit jak celkový počet eozinofilů, tak jejich procentuální zastoupení (ve vztahu k fyziologickému rozmezí) a také posoudit případný přínos léčby kortikosteroidy. Metodika a proveditelnost Popisu a hodnocení metod používaných k indukci a vyšetřování sputa již byly věnovány jiné práce (viz Brightling [3]). Fyziologické hodnoty buněčného složení sputa odděleného z expektorátu byly opakovaně ověřeny: celkový počet buněk do 9, /g, procentuální zastoupení eozinofilů do 2 % a neutrofilů do 64,4 %. Vyšetření má optimálně provádět zkušený laborant ve funkční plicní laboratoři. Indukci lze ukončit již po získání malého množství sputa (o velikosti odpovídající přibližně polovině hrášku); celá procedura může trvat až 45 minut, nicméně má li pacient zkušenosti s prováděním spirometrie a vytvoří li se sputum již krátce po zahájení indukčního procesu, bývá kratší. Pokud sputum určené pro kvantitativní stanovení počtu buněk zpracovává a vyšetřuje laborant se specializací na hematologickou nebo cytologickou problematiku, není procedura nijak složitá. Tento laborant musí pracovat na pneumologickém či alergologickém oddělení; pracoviště hematologie ani patologie by mu neposkytla vhodné zázemí. Výsledky lze získat za 1,5 hodiny, přičemž v této době je již zahrnuta 1 hodina laborantovy práce. Hlavním problémem je úhrada nákladů na vyšetření, jejichž hlavní část tvoří plat laboranta. Toto vyšetření je hrazeno podle sazebníku, popřípadě je nutná spoluúčast nemocnice nebo podpora jiné strany. Lze li tuto podmínku splnit, je vyšetření samo o sobě z klinického hlediska proveditelné a účelné, jak bylo prokázáno v Kanadě zajištěním jeho dostupnosti v Quebec City, Montrealu, Hamiltonu a Calgary. Závěr Kvantitativní stanovení počtu buněk ve sputu se za posledních 15 let zdokonalilo, bylo vyhodnoceno a zavedeno do klinické praxe. Toto vyšetření představuje nejúplnější a nejspecifičtější neinvazivní či relativně neinvazivní (v případě indukce sputa) způsob stanovení stupně závažnosti zánětu dýchacích cest. Jeho použití úspěšně snižuje počet exacerbací onemocnění a náklady na zdravotní péči. Je načase zvýšit dostupnost kvantitativního stanovení počtu buněk ve sputu v centrech terciární péče, aby bylo podle něj možné vést léčbu různých onemocnění dýchacích cest, zejména jejich středně těžkých až těžkých, komplikovaných a obtížně léčitelných forem. Poděkování Děkuji Dianě Lawson za pomoc při přípravě rukopisu. Odkazy a doporučená literatura Zvláště významné práce zveřejněné během roku přípravy tohoto přehledového článku jsou označeny takto: = významné, = mimořádně významné. 1. Hargreave FE, Parameswaran K. Asthma, COPD and bronchitis are just components of airway disease. Eur Respir J 2006;2: Taylor DR, Pijnenburg MW, Smith AD, Jongste JCD. Exhaled nitric oxide measurements: clinical application and interpretation. Thorax 2006;61: Znamenitý přehled. 3. Brightling CE. Clinical applications of induced sputum. Chest 2006;129: Nejnovější přehled, pronikající do podstaty problému. 4. O Byrne PM, Parameswaran K. Pharmacological management of mild or moderate persistent asthma. Lancet 2006;378: Brightling CE. Chronic cough due to nonasthmatic eosinophilic bronchitis: ACCP evidence base clinical practice guidelines. Chest 2006;129: 116S 121S. 6. Global Initiative for Chronic Obstructive Pulmonary Disease. Global Strategy for the Diagnosis and Management and Prevention of COPD. Bethesda: NHLBI/WHO, Workshop Report Wenzel SE. Asthma: Defining of the persistent adult phenotypes. Lancet 2006;368: A plea to abandon asthma as a disease concept. Lancet 2006;368: Hargreave FE, Leigh R, Parameswaran K. Asthma as a disease concept. Lancet 2006;368: Článek, který by měl objasnit význam měření pro definice onemocnění dýchacích cest. 10. Simpson JL, Scott R, Boyle MJ, Gibson PG. Inflammatory subtypes in asthma: assessment and identification using induced sputum. Respirology 2006;11: Tato práce se soustřeďuje na různorodou zánětlivou odpověď u stabilizovaného astmatu. 11. Choudhuri R, Livingston E, McMahon AD, et al. Effects of smoking cessation on lung function and airway inflammation in smokers with asthma. Am J Respir Crit Care Med 2006;174: Bacci E, Chinchetti S, Bartoli ML, et al. Low sputum eosinophils predict the lack of response to beclamethasone in symptomatic asthmatic patients. Chest 2006;129: Belda J, Parameswaran K, Lemiere C, et al. Predictors of loss of asthma control induced by corticosteroid withdrawal. Can Respir J 2006;13: Zacharasiewisz A, Wilson N, Lex C, et al. Clinical use of noninvasive measurements of airway inflammation in steroid reduction in children. Am J Respir Crit Care Med 2005;171: Jayaram L, Pizzichini MM, Cook RJ, Boulet L P, et al. Determining asthma treatment by monitoring sputum cell counts: effect on exacerbations. Eur Resp J 2006;27: Druhá kontrolovaná studie, prováděná po dobu dvou let, jež prokazuje přínos sledování zastoupení různých buněk ve sputu pro vedení léčby minimálními dávkami inhalačních kortikosteroidů. Dochází ke snížení počtu eozinofilních exacerbací, aniž by bylo nutno zvyšovat dávky inhalačních kortikosteroidů. 16. Smith AD, Cowan JO, Brassett KP, et al. Use of exhaled nitric oxide measurements to guide treatment in chronic asthma. N Engl J Med 2005;352: Brightling CE, Makenna S, Hargadon B, et al. Sputum eosinophilia and short term response to inhaled mometasone in chronic obstructive pulmonary disease. Thorax 2005;60: Leigh R, Pizzichini MMM, Morris MM, et al. Stable COPD: predicting benefit from high dose inhaled corticosteroid treatment. Eur Respir J 2006;27: První randomizovaná kontrolovaná studie, která potvrdila, že vysoké dávky inhalačního kortikosteroidu u středně těžké až těžké chronické obstrukční plicní nemoci potlačují eozinofilii sputa, zmírňují dušnost a zvyšují objem vydechnutý maximálním úsilím za jednu sekundu. 19. Saha S, Sivar, Brightling CE, Pavord ID. COPD: an inhaled corticosteroid resistant, oral corticosteroid responsive condition. Eur Respir J 2006;27: Johnston SL. Impact of virus on airway diseases. Eur Respir J 2005;14: Přehled upozorňující na nejčastější zánětlivou příčinu exacerbací onemocnění dýchacích cest. 21. Papi A, Bellettato CM, Braccioni F, et al. Infections and airway inflammation in chronic obstructive pulmonary disease severe exacerbations. Am J Respir Crit Care Med 2006;173: První studie zabývající se virovými a bakteriálními infekcemi a zánětem u těžkých exacerbací chronické obstrukční plicní nemoci. Curr Opin Allergy Clin Immunol/CS 2007;4:

12 Standardizace Kvantitativní stanovení alergenových počtů extraktů buněk ve pro sputu imunoterapii jako ukazatele Becker, stupně Vogel závažnosti a Vieths zánětu dýchacích cest v klinické praxi Hargreave Standardizace alergenových extraktů pro imunoterapii: jaký je aktuální stav? Wolf Meinhard Becker a, Lothar Vogel b a Stefan Vieths b Význam přehledu Přehled shrnuje aktuální stav týkající se standardizace alergenů i pokrok dosažený v této oblasti v poslední době a přináší diskusi o jejím předpokládaném budoucím vývoji. Aktuální výsledky Výzkum standardizace alergenů se v poslední době soustředil zejména na sendvičové enzymatické imunosorpční analýzy nebo kompetitivní testy pro kvantifikaci jednotlivých alergenů v extraktech. Pro kvantifikaci hlavních i vedlejších alergenů ze zdrojů, jakými jsou pyly stromů i plevele z oblasti Středomoří, travní pyly a potraviny, jako arašídy a jablka, byly vyvinuty nové analytické metody. V několika případech bylo dosaženo dobré korelace s alergenní aktivitou, hodnocenou inhibičními testy. Kromě toho byla v jedné studii zkoumána možnost použití analytických metod založených na uvolňování buněčných mediátorů při standardizaci alergenů. Souhrn S cílem získat více hlavních i vedlejších alergenů z různých zdrojů bylo vyvinuto několik nových testů, které by bylo možné použít v programech standardizace alergenů, jako je například projekt CREATE. Očekává se, že v blízké budoucnosti budou k dispozici analytické metody pro stanovení většiny klinicky významných hlavních vzdušných alergenů. Standardizované a ověřené analytické metody založené na uvolňování buněčných mediátorů mohou sloužit jako doplňkové nástroje pro hodnocení biologické účinnosti referenčních alergenů a pro zjišťování korelací mezi koncentracemi alergenů a biologickou účinností. Klíčová slova alergenové extrakty, kontrola šarží, směrnice pro alergenové přípravky, standardizace Standardization of allergen extracts for immunotherapy: where do we stand? Curr Opin Allergy Clin Immunol 2006;6: Lippincott Williams & Wilkins, Inc. a Research Center Borstel, Division of Molecular and Clinical Allergology, Borstel, Germany, a b Paul Ehrlich Institut, Department of Allergology, Langen, Germany Adresa pro korespondenci: Stefan Vieths, PhD, Department of Allergology, Paul Ehrlich Institut, Paul Ehrlich Strasse 51 59, D Langen, Germany E mail: viest@pei.de Zkratky CREATE ELISA IHR LTP mab RAST Vývoj certifikovaných referenčních materiálů pro alergenové přípravky a ověřování metod jejich kvantifikace (Development of Certified Reference Materials for Allergenic Products and Validation of Methods for their Quantification) enzymatická imunosorpční analýza (enzyme linked immunosorbent assay) interní reference (in house reference) protein přenášející lipidy (lipid transfer protein) monoklonální protilátka (monoclonal antibody) radioalergosorpční test (radioallergosorbent test) Úvod Extrakty zdrojových materiálů pro alergeny jsou základem diagnostiky a specifické imunoterapie alergií I. typu již od roku 1911, kdy jejich použití popsal Noon [1,2]. Tyto extrakty obsahují různé množství alergenních a nealergenních složek. Koncentrace alergenů je ovlivňována biologickou proměnlivostí, vedoucí například k rozdílné míře jejich zastoupení v různých zdrojových materiálech. Rozmanitost alergenových přípravků dále vyplývá z odlišných výrobních postupů používaných různými výrobci. Situaci také komplikuje genetická různorodost postižených jedinců, jejímž důsledkem jsou individuální rozdíly v reaktivitě imunitního systému na molekuly alergenů. Tato reaktivita definuje aktivní složky extraktu na úrovni jednotlivých pacientů. Je známo, že u alergií na některé pyly a potraviny existují zeměpisné rozdíly v senzibilizačních profilech; například u pacientů ze severní a střední Evropy může alergickou reakci vyvolat extrakt lískového oříšku bez detekovatelného obsahu Cor a 8 (proteinu přenášejícího lipidy lipid transfer protein, LTP), který by u nemocných z jižní Evropy, mnohem častěji trpících těžkými alergickými reakcemi způsobovanými právě složkou Cor a 8, žádnou reakci nevyvolal [3 5]. Proto bylo ihned zřejmé, že alergenové extrakty je třeba standardizovat, aby se zajistilo stálé složení a účinnost vyráběných šarží. Vzhledem k výše uvedeným faktorům však dosažení tohoto cíle může být nejtěžším úkolem v oblasti biologických léčiv. V 80. letech 20. století byla snaha vyvinout mezinárodní standardní extrakty a vypracovat definici mezinárodních jednotek účinnosti; tyto standardy však z různých důvodů nikdy nenašly uplatnění v širším měřítku [6,7]. Velmi lákavou možností, jak překonat problémy s materiály z přírodních zdrojů obsahujícími směsi antigenů, je použití panelů purifikovaných přírodních či rekombinantních alergenních proteinů, které by se aplikovaly v optimalizovaných koncentracích a představovaly by ideálně standardizovaný materiál. Vzhledem k možnosti 12 Curr Opin Allergy Clin Immunol/CS 2007;4:12 18

13 Standardizace alergenových extraktů pro imunoterapii Becker, Vogel a Vieths realizace těchto představ byl koncem 80. let 20. století zahájen intenzivní výzkum rekombinantních alergenů, který probíhá rychlým tempem až do současnosti [8 11]. Nedávno byly dokončeny první klinické studie věnované specifické imunoterapii rekombinantními alergeny, například hlavním alergenem březového pylu Bet v 1 a směsí alergenů travních pylů produkovanou rekombinantní bakterií Escherichia coli [12,13]. Žádný takový přípravek však zatím nebyl registrován, aby bylo možno jej uvést na trh, takže standardem v blízké budoucnosti zůstane specifická imunoterapie přírodními alergenovými extrakty. Vzhledem k nákladům spojeným s registračním řízením umožňujícím uvedení jakéhokoli biotechnologického přípravku na trh je navíc pravděpodobné, že se na trhu v podobě rekombinantních molekul objeví pouze nejvýznamnější hlavní alergeny. V tomto kontextu je cílem našeho přehledu shrnout současný stav standardizace alergenů i nejnovější úspěchy dosažené v této oblasti a nastínit další směr vývoje. Současná regulační opatření týkající se alergenů a jejich standardizace V Evropské unii jsou alergeny definovány směrnicí 2001/83/EC Kodexu pro humánní léčiva jako imunologická léčiva [14]. Tato směrnice se stala součástí národních zákonů, například německého Zákona o léčivech [15]. Všechny alergenové přípravky pro specifickou imunoterapii i pro diagnostiku in vivo jsou imunologickými léčivy a jako takové podléhají před uvedením na trh registračnímu řízení. Kromě těchto obecných předpisů existuje v Evropě pouze několik konkrétních předpisů pro alergenové přípravky. V roce 1996 byla vydána Poznámka pro orientaci v alergenových přípravcích (Note for guidance on allergen products) Evropské lékové agentury (European Medicines Evaluation Agency, EMEA) [16], která obsahuje především doporučení ohledně kvality farmak, metod zkoušení a některé obecné poznámky k preklinické bezpečnosti a ke klinické účinnosti. Monografie o alergenových přípravcích (Monograph on allergen products) Evropského lékopisu (European Pharmacopoeia) [17] navíc obsahuje konkrétní definice přípravků, orientační informace o rozsahu zkoušení alergenových přípravků na poměrně obecné úrovni a parametry, které musí splňovat. Například přijatelné rozmezí celkové alergenní aktivity a koncentrace jednotlivých alergenů činí % deklarované hodnoty. Evropský lékopis zatím konkrétně neuvádí laboratorní metody pro zkoušení přípravků. Nedávno byl vydán koncepční návrh o revizi zmíněné Poznámky pro orientaci v alergenových přípravcích [18]; revidované směrnice mohou mít vliv na standardizaci alergenů. Dále byly vydány směrnice Evropské lékové agentury týkající se klinického hodnocení přípravků pro léčbu alergické rhinokonjunktivitidy, které se specifickou imunoterapií alergenovými přípravky nezabývají [19]. Tento nedostatek byl zjištěn a bude napraven dodatkem v podobě směrnice pro klinické hodnocení alergenových přípravků [20]. V blízké budoucnosti lze tedy očekávat podrobná doporučení pro provádění studií specifické imunoterapie. Jak Poznámka pro orientaci v alergenových přípravcích, tak Monografie o alergenových přípravcích vycházejí při určování aktivity alergenových přípravků z celkové alergenní aktivity a biologické účinnosti. V USA se v současnosti vyrábějí dva druhy alergenových extraktů standardizované a nestandardizované. Účinnost standardizovaných alergenových extraktů se před jejich uvedením na trh porovnává s účinností amerických referenčních standardů. Udržování těchto referenčních standardů a jejich distribuce výrobcům je v kompetenci Centra pro hodnocení a výzkum biologických produktů (Center for Biologics Evaluation and Research). V současné době je dostupných 19 standardizovaných alergenových extraktů z těchto zdrojů: hmyzí jedy zástupců řádu blanokřídlých (šest), prachoví roztoči (dva), kočičí lupy (dva), pyl ambrózie (jeden) a travní pyly (osm) [21]. Zatímco americký Úřad pro kontrolu potravin a léků (Food and Drug Administration, FDA) vypracoval standardy a vyvinul humánní zkušební séra, s jejichž pomocí musí všichni výrobci prokazovat stálost složení mezi šaržemi a dodržování standardů, je evropský systém založen především na využívání interních referenčních (in house reference, IHR) přípravků [16]. Standardy FDA i přípravky IHR jsou podrobně charakterizovány pomocí nejmodernějších metodologických postupů, jež zpravidla zahrnují biologickou (tj. in vivo) standardizaci aktivity referenčního extraktu. Tak došlo k situaci, že zatímco v USA jsou všechny schválené extrakty daného alergenu upravovány porovnáním s aktivitou jediného referenčního vzorku, v Evropě se používá celá řada referenčních vzorků. Důsledkem toho jsou významné rozdíly v celkové alergenní aktivitě přípravků různých evropských výrobců. Situaci v Evropě dále komplikuje to, že různí výrobci používají k hodnocení alergenní aktivity svých přípravků různé systémy. Proto se používá řada různých jednotek a přípravky různých výrobců nelze vzájemně snadno zaměnit. Biologické metody standardizace alergenů (standardizace in vivo) V USA [22] a ve Skandinávii [23] byly vyvinuty dva různé systémy biologické standardizace. Přestože jsou oba založeny na kvantitativním hodnocení kožních testů, jsou mezi nimi značné rozdíly. Metoda používaná v USA spočívá v provádění intradermálních testů u 15 vysoce senzibilizovaných jedinců, a to s alergenovým extraktem postupně třikrát ředěným. Měří se nejdelší erytém a kolmé průměry procházející středem, jejich hodnoty se sečtou a výsledkem je součet erytémů (v mm). Jeho hodnoty Curr Opin Allergy Clin Immunol/CS 2007;4:

14 Standardizace alergenových extraktů pro imunoterapii Becker, Vogel a Vieths Tabulka 1 Jednotky používané u alergenových přípravků/extraktů Jednotka Význam a) Historické jednotky Noonova jednotka Množství proteinu rozpustného ve vodě, které lze získat z 1 µg pylu. Platí tedy, že 1 g pylu obsahuje Noonových jednotek. Jednotka proteinového dusíku 1 PNU odpovídá 0,01 µg dusíku vystižitelného kyselinou fosfowolframovou, (protein nitrogen unit) tedy přibližně 0,06 µg proteinu. b) Jednotky založené na Histaminový ekvivalent ve 10 HEP odpovídá koncentraci alergenu, která při zkoušce vpichem biologicky standardizovaných zkouškách vpichem ( prick testu) vyvolá induraci stejné velikosti jako kontrolní koncentrace referenčních vzorcích ( prick testech) histamindihydrochloridu (10 mg/ml). Biologická jednotka BU/ml odpovídá 10 HEP. Bioekvivalentní alergenová jednotka Vychází z metody ID 50 EAL. BAU (bioequivalent allergen unit) bioekvivalentní alergenová jednotka; BU (biological unit) biologická jednotka; HEP (histamine equivalent prick test) histaminový ekvivalent ve zkouškách vpichem ( prick testech); ID 50 EAL hodnotu BAU určuje intradermální ředění potřebné k dosažení součtu erytémů v hodnotě 50 mm; PNU (protein nitrogen unit) jednotka proteinového dusíku pro různé stupně ředění se zobrazí v grafické podobě a vypočte se ředění, při kterém by součet erytémů dosahoval hodnoty 50 mm (D 50 ). Dohodou bylo stanoveno, že hodnota D 50 ve výši 14 odpovídá bioekvivalentních alergenových jednotek (bioequivalent allergen units, BAU) na 1 ml; alergenní účinnost neznámého vzorku lze vypočítat pomocí vzorce BAU/ml = (D50 14). Tabulka 2 Základy standardizace používané jednotlivými evropskými výrobci alergenů a (výrobci jsou uváděni anonymně) Výrobce Základ standardizace A In vivo HEP B In vivo HEP C In vivo HEP D In vivo BAU E In vitro Reaktivita IgE F In vivo HEP BAU (bioequivalent allergen unit) bioekvivalentní alergenová jednotka; HEP (histamine equivalent prick test) histaminový ekvivalent ve zkouškách vpichem ( prick testech) a Jednotky jsou pokaždé uváděny jinak [např. SQ (standardized quality) standardizovaná kvalita; SU (standardized units) standardizované jednotky; IR (index of reactivity) index reaktivity]. Tabulka 3 Biochemické a imunochemické metody používané pro standardizaci alergenů a) Biochemické proteinové b) Imunologické testovací metody metody Elektroforetické metody: Imunoelektroforéza SDS PAGE, IEF, kapilární metoda (CIE, CRIE, RIE) Cirkulárně dichroická spektrální Analýza Western blot analýza Analytická vylučovací chromatografie Dvourozměrná elektroforéza/ na principu HPLC / imunoblot Hmotnostní spektrometrická analýza Test inhibice vazby IgE (v kombinaci s dalšími metodami) (CAP, RAST, EAST) Rentgenová analýza s malým Reaktivita IgE v analýze úhlem rozptylu dot blot Analýza složení aminokyselin Analýzy založené na uvolňování mediátorů z bazofilů CIE (crossed immunoelectrophoresis) zkřížená imunoelektroforéza; CRIE (crossed rocket immunoelectrophoresis) zkřížená raketová imunoelektroforéza; EAST (enzyme allergosorbent test) enzymatický alergosorpční test; HPLC (high pressure liquid chromatography) vysokotlaká kapalinová chromatografie; IEF (isoelectric focusing) izoelektrická fokusace; RAST (radioallergosorbent test) radioalergosorpční test; RIE (rocket immunoelectrophoresis) raketová imunoelektroforéza; SDS PAGE (sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis) polyakrylamidová gelová elektroforéza s dodecylsulfátem sodným Naproti tomu skandinávská metoda používá zkoušky vpichem ( prick testy) u vysoce a středně senzibilizovaných jedinců (n = 20), rozsah indurace je vztahován k účinku referenční dávky histaminu v koncentraci 10 mg/ml a alergenovému extraktu, který vyvolá induraci téhož rozsahu, je připsána aktivita v hodnotě biologických jednotek (biological units, BU). Pomocí těchto dvou metod stanovení biologické aktivity alergenových extraktů byly pro tento účel vyvinuty různé systémy (tab. 1). V Evropě používá většina výrobců skandinávský systém biologické standardizace, používá se však i americká metoda (tab. 2). Imunologické a biochemické metody standardizace alergenů (standardizace in vitro) Existuje pestrá škála biochemických a imunochemických metod, jichž lze použít ke kontrole stálosti složení a aktivity alergenových přípravků. Přehled nejčastěji používaných postupů je uveden v tab. 3. V souladu se směrnicemi pro registraci [16,17] se pro měření celkové alergenní aktivity nejčastěji používá kompetitivní test inhibice vazby IgE [např. inhibiční radioalergosorpční test (radioallergosorbent test, RAST) nebo inhibiční enzymatický alergosorpční test]. Tato hodnocená vlastnost ale neodráží ani schopnost vyvolávat příznaky alergie (tj. degranulaci žírných buněk a bazofilů), ani terapeutický potenciál přípravku (tj. imunogenitu/imunomodulaci). Předpokládá se však, že inhibice vazby IgE zohledňuje všechny specificity IgE přítomné u alergických jedinců, a proto nejvěrněji odráží výsledky získané biologickou standardizací. Evropští výrobci tedy zpravidla vyvíjejí biologicky standardizované přípravky IHR pro nejvýznamnější léčebné alergenové extrakty, avšak ve většině případů upravují aktivitu nových šarží přípravků IHR s tímž alergenovým extraktem pomocí inhibičních testů. V této souvislosti stojí za zmínku, že analýzy zaměřené na efektorové buňky, například test uvolňování histaminu z bazofilů [24,25], využívají téhož mechanismu jako kožní testy, a odrážely by tedy biologickou aktivitu alergenů přesněji. Takové testy jsou ovšem technicky náročné a mnohem hůře proveditelné, přičemž systémy biologic 14 Curr Opin Allergy Clin Immunol/CS 2007;4:12 18

15 Standardizace alergenových extraktů pro imunoterapii Becker, Vogel a Vieths kých testů obecně vykazují nižší přesnost než testy založené na vazbě protilátek. Další možnost, jak zlepšit standardizaci alergenových přípravků, je založena na měření koncentrace jednotlivých hlavních alergenů [26], u níž se předpokládá korelace s biologickou účinností alergenových extraktů [27]. Tento přístup byl základem výzkumného projektu CREATE, financovaného Evropskou unií, který se prováděl v letech Projekt CREATE Projekt Vývoj certifikovaných referenčních materiálů pro alergenové přípravky a ověřování metod jejich kvantifikace (Development of Certified Reference Materials for Allergenic Products and Validation of Methods for their Quantification, CREATE) byl financován Evropskou komisí jako součást Pátého rámcového programu (Fifth Framework Programme) v oblasti standardizace alergenů [28]. Projektu se účastnily výzkumné laboratoře (n = 9), výrobci alergenových přípravků (n = 6), kliničtí výzkumníci (n = 11) a biotechnologické společnosti (n = 2) z devíti členských států Evropské unie. Byly vytyčeny tyto dva hlavní cíle: a) vývoj certifikovaných referenčních materiálů z purifikovaných přírodních či rekombinantních alergenů a b) ověření sendvičových enzymatických imunosorpčních analytických metod (enzyme linked immunosorbent assay, ELISA) pro stanovení aktivity hlavních alergenů. Hodnotilo se osm hlavních alergenů, a to přírodních i rekombinantních, nejvýznamnějších zdrojů vyvolávajících respirační alergie: Bet v 1 (březový pyl), Phl p 1 a Phl p 5 (pyl bojínku lučního), Ole e 1 (olivový pyl) a Der p 1, Der p 2, Der f 1 a Der f 2 (prachoví roztoči). Jelikož přírodní alergeny jsou tvořeny řadou izoforem a jsou měřítkem biologické funkce, bylo třeba především odpovědět na otázku, zda rekombinantní molekuly reaktivitou odpovídají svým přírodním protějškům obsaženým v extraktech a zda splňují kritéria správného prostorového uspořádání a podobné imunoreaktivity. K ověřování výše uvedeného problému byly použity testy RAST a inhibiční RAST. Reaktivita IgE nemocných vůči alergenům byla hodnocena analýzou dot blot a biologická aktivita pak pomocí testu uvolňování histaminu z bazofilů [29]. Navíc byla provedena i rozsáhlá fyzikálně chemická analýza, zahrnující cirkulárně dichroickou spektroskopii, hmotnostní spektrometrickou analýzu, kapilární elektroforézu, analytickou vylučovací chromatografii na principu vysokotlaké kapalinové chromatografie, rentgenovou analýzu s malým úhlem rozptylu a analýzu složení aminokyselin kombinovanou s kvantifikací proteinů [30]. Pomocí těchto velmi přesných metod bylo možno mezi rekombinantními a přírodními alergenovými přípravky nalézt jisté drobné rozdíly. Experimenty s přípravky a ověřování stability se prováděly v britském Státním institutu pro biologické standardy a kontrolu (National Institute for Biological Standards and Control, Londýn, Velká Británie). a) b) Nakonec byly pro každý z uvedených osmi alergenů posuzovány výsledky dvou až čtyř metod ELISA. Během projektu bylo stanoveno několik kritérií pro výběr kandidátů na certifikované referenční materiály. Za prvé, certifikované referenční materiály musí být rekombinantní, neboť přírodní materiály jsou tvořeny izoalergeny či izoformami a jejich složení je přirozeně proměnlivé. Naproti tomu obsah proteinů v rekombinantních alergenových přípravcích lze přesně upravit bez ohledu na roční období. Za druhé, protilátky použité u metod ELISA by měly být pokud možno monoklonální (produkované hybridomy), čímž lze na rozdíl od polyklonálních antisér (získávaných například od králíků) zajistit neomezený přísun imunoreaktantů stálé kvality. Přesto bylo jako další významné kritérium uvedeno široké rozpoznávání různých izoforem. Tato potřeba se stala zřejmou během výzkumu alergenu travního pylu Phl p 5, který se skládá ze dvou hlavních izoforem Phl p 5a a Phl p 5b. Dvě z metod ELISA pro hodnocení alergenu Phl p 5 se projevily jako nevhodné, protože nerozpoznávaly izoformu Phl p 5b [31]. V případě alergenů travního pylu tedy musí protilátky vykazovat specificitu vůči skupině alergenů podčeledi lipnicovité (Pooideae). Prozatím byly v rámci projektu CREATE zjištěny dvě velmi slibné metody ELISA pro rbet v 1 a pro rphl p 5a. Tyto purifikované rekombinantní alergeny jsou v současnosti prvními kandidáty na biologické referenční přípravky a budou posuzovány v další studii hodnotící jednotlivé metody ELISA. V budoucnu se stejný postup použije u dalších alergenů a metod ELISA z projektu CREATE. Nové poznatky v oblasti standardizace alergenů V posledních třech letech zavedlo kvantitativní analytické metody pro stanovení významných alergenů z různých zdrojů alergie i několik skupin v oblasti výzkumu mimo projekt CREATE (tab. 4) [32,33,34 36,37,38,39,40, 41 ]. Ve většině případů se jednalo o sendvičové metody ELISA, v nichž vazbu zajišťovala monoklonální protilátka (monoclonal antibody, mab) a stopovačem bylo monospecifické králičí antisérum. Probíhá i standardizace menších alergenních zdrojů v porovnání s obsahem hlavního alergenu nebo potravinových alergenů 1. třídy, jako jsou Ara h 1, Ara h 2 a Mal d 3. Jak ale prokázal projekt CREATE, představuje zavedení kvantitativních analýz pouze první krok k získání referenčních materiálů s reprodukovatelnými fyzikálně chemickými vlastnostmi. Duffort a spol. [32 ] hodnotili variabilitu poměru Ole e 1/Ole e 9 v různých šaržích extraktu olivového pylu a zjistili, že se tento poměr mění v rozmezí od 0,6 do 390,4 (tedy 650násobně), zatímco rozmezí biologické aktivity mezi oběma krajními hodnotami bylo 10násobné. Nejprve byl vytvořen referenční rekombinantní alergen Ole e 9 se správným prostorovým uspořádáním, a to pomocí oddělené exprese domén N konce a C konce Curr Opin Allergy Clin Immunol/CS 2007;4:

16 Standardizace alergenových extraktů pro imunoterapii Becker, Vogel a Vieths Tabulka 4 Nové analytické metody pro kvantifikaci hlavních alergenů Zdroj alergenů Alergen Analytická metoda Pracovní rozmezí Odkaz Pyly stromů Olea europaea Ole e 9 Sendvičová ELISA založená na mab ng/ml [32 ] Platanus acerifolia Pla a 1 Sendvičová ELISA založená na mab 3 25 ng/ml [33 ] Cupressus arizonica Cup a 1 Sendvičová ELISA založená na mab 62, ng/ml [34] Cupressus sempervirens Cup s 1 Sendvičová ELISA založená na mab 31, ng/ml [35] Travní pyl Cynodon dactylon Cyn d 1 Sendvičová ELISA založená na mab 1,1 9,2 ng/ml [36] Pyly bylin Parietaria judaica Par j 1, Par j 2 Sendvičová ELISA založená na mab pg/ml [37 ] Artemisia vulgaris Art v 1 Sendvičová ELISA založená na mab 0,2 10 ng/ml [38] Potravinové alergeny Arachis hypogaea Ara h 1 Kompetitivní analýza s bočním proudem 0,1 10 µg/ml [39 ] (competitive lateral flow assay) Arachis hypogaea Ara h 1, Ara h 2 Kompetitivní inhibiční ELISA 12 a 0,5 ng/ml [40] Malus domesticus Mal d 3 (LTP) Kompetitivní RIA ng/ml [41 ] Sendvičová ELISA založená na mab ng/ml Sendvičová analýza se zkříženou reaktivitou 5 20 ng/ml (cross reactive sandwich ELISA) ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) enzymatická imunosorpční analýza; LTP (lipid transfer protein) protein přenášející lipidy; mab (monoclonal antibody) monoklonální protilátka; RIA (radioimmunoassay) radioimunoanalýza v buňkách kvasinek Pichia pastoris. Byly vybrány monoklonální protilátky se specificitou jak proti N konci, tak i proti C konci Ole e 9, přičemž bylo nutno vyloučit reaktivitu vůči Ole e10, jehož sekvence je z 53 % shodná se sekvencí Ole e 9. Ze 40 monoklonálních protilátek jich 24 vykazovalo reaktivitu vůči C konci, šest vůči N konci a osm jich s Ole e 9 nereagovalo vůbec. Vlastnosti, které musí podle definice vykazovat specifická protilátka proti Ole e 9, byly zjištěny pouze u jedné mab. Tento nález zdůrazňuje nezbytnost standardizace. Protože většina alergenů je tvořena izoalergeny, je pro kvantitativní analýzy nutno mít k dispozici protilátky se specificitou vůči společnému epitopu. Arilla a spol. vyvinuli sendvičovou metodu ELISA pro kvantifikaci Pla a 1 v rozmezí 3 25 ng/ml [33 ] vyčištěním přírodního proteinu získaného z extraktu a proti této molekule vytvořili monoklonální a polyklonální protilátky. Tito autoři rovněž vyvinuli sendvičové metody ELISA pro kvantifikaci Cup a 1 [34], Cup s 1 [35] a Par j 1/2 [37 ]. Pracovní rozmezí těchto vysoce reprodukovatelných analýz, vyjádřené v ng, bylo nízké (u Pla a 1 a Par j 1/2) až středně vysoké (u Cup a 1 a Cup s 1); byla popsána dobrá korelace s IgE reaktivitou relevantních pylových extraktů. Jiná studie [36] se soustředila na alergen 1. třídy pylu troskutu prstnatého neboli bermudské trávy, přičemž monoklonální protilátky specifické vůči Cyn d 1 byly izolovány z buněk sleziny myší BALB/c očkovaných extraktem výše zmíněného pylu. Sendvič byl vytvořen kombinací jedné mab a králičího antiséra anti Cyn d 1 a jako referenční složka byl použit přírodní alergen Cyn d 1. Pracovní rozmezí bylo poměrně úzké (1,1 9,2 ng/ml) a obsah hlavního alergenu i měření alergenní aktivity byly porovnávány s 16 různými extrakty. Podobné metody ELISA byly popsány pro hlavní alergen pelyňku černobýlu Art v 1 [38], pro dva alergeny arašídů Ara h 1 a Ara h 2 [40] a pro jablečný protein přenášející lipidy Mal d 3 [41]. V případě alergenu Art v 1 byla prokázána dobrá korelace mezi obsahem alergenu v extraktech a alergenní aktivitou ve zkoušce vpichem ( prick testu)/ml histaminové ekvivalence, měřené inhibičním RAST. Příklad alergenu 5. skupiny Dactylis glomerata [42 ] obrátil pozornost k vlivu štěpených produktů, jejich dimerů a dimerických alergenů na účinnost protokolů pro standardizaci alergenů. Pro měření biologické účinnosti alergenů a alergenových extraktů byly vyvinuty buněčné testy napodobující efektorové mechanismy alergií I. typu, a to pomocí upravených a znovu senzibilizovaných bazofilů [24,25], buněčné linie bazofilní leukémie potkanů (RBL 2H3) nebo buněk RBL po transfekci geny lidského IgE receptoru s vysokou afinitou [25,43 ]. Tyto buněčné linie bylo možno pasivně senzibilizovat myším IgE (RBL 2H3) nebo lidským IgE (RBL po transfekci a upravené bazofily), získaným v prvním případě od imunizovaných myší a ve druhém ze séra alergických pacientů. Kaul a spol. [25] ve své studii použili pro analýzu účinnosti extraktů z pylu břízy a bojínku lučního, prachových roztočů, kočičích lupů a arašídů různé typy testů založených na uvolňování mediátorů; takto získané výsledky porovnávali s výsledky získanými z ověřené analýzy inhibice IgE. Vzhledem k tomu, že u biologických testů se zjistila dobrá korelace s údaji z inhibičních analýz, velmi vysoká analytická senzitivita a poměrně vysoká přesnost (koeficient variace do 15 %), dospěli autoři k závěru, že testy založené na uvolňování mediátorů by mohly být vhodné pro stanovení biologické aktivity alergenů a alergenových extraktů. Pomocí testů založených na uvolňování mediátorů se navíc podařilo prokázat kvalitativní rozdíly v biologické aktivitě či ve složení alergenových přípravků, které analýzami inhibice IgE nelze zjistit. Závěr Na rozdíl od období let 1980 až 1990 se hlavní pozornost ve výzkumu standardizace alergenů v posledních několika letech přesunula od měření účinnosti k analýzám 16 Curr Opin Allergy Clin Immunol/CS 2007;4:12 18

17 Standardizace alergenových extraktů pro imunoterapii Becker, Vogel a Vieths umožňujícím kvantifikaci koncentrací hlavních alergenů v extraktech. Na možnosti tohoto přístupu upozornil zejména projekt CREATE; přispěl však i k vymezení oblastí, v nichž je potřeba vyřešit zásadní problémy: Zajištění strukturální integrity a stálosti referenčních přípravků vyžaduje důkladnou fyzikálně chemickou charakterizaci, což umožňuje pouze použití purifikovaných alergenů. Významný vliv na kvantifikaci alergenů v extraktech má nejspíše i rozpoznávání epitopů monoklonálními protilátkami použitými v příslušných analýzách, přičemž je nutno brát v úvahu možnost detekce různých izoforem. Jelikož v blízké budoucnosti bude základem standardizace alergenů i nadále hodnocení biologické účinnosti, je třeba uskutečnit další studie, které by hodnotily korelaci mezi koncentrací jednotlivých alergenních molekul a účinností alergenových přípravků. Protože možnosti provádění takových studií u lidí jsou omezené, mohou se vhodnými nástroji k získání odpovědi na výše uvedené otázky stát ověřené analýzy uvolňování mediátorů nebo aktivace bazofilů. Poděkování Autoři děkují dr. Sibylle May a dr. Dirku Lüttkopfovi za pomoc s přípravou rukopisu a za cenné připomínky. Odkazy a doporučená literatura Zvláště významné práce zveřejněné během roku přípravy tohoto přehledového článku jsou označeny takto: = významné, = mimořádně významné. 1. Noon L. Prophylactic inoculation against hay fever. Lancet 1911;1: Freeman J, Noon L. Further observation on the treatment of hay fever by hypodermic inoculation of pollen vaccine. Lancet 1911;2: Lüttkopf D, Müller U, Skov PS, et al. Comparison of four variants of a major allergen in hazelnut (Corylus avellana) Cor a 1.04 with the major hazel pollen allergen Cor a Mol Immunol 2002;38: Pastorello EA, Vieths S, Pravettoni V, et al. Identification of hazelnut major allergens in sensitive patients with positive double blind, placebo controlled food challenge results. J Allergy Clin Immunol 2002;109: Schocker F, Lüttkopf D, Scheurer S, et al. Recombinant lipid transfer protein Cor a 8 from hazelnut: a new tool for in vitro diagnosis of potentially severe hazelnut allergy. J Allergy Clin Immunol 2004;113: Norman PS. WHO IUIS International Standards: advantages of these extracts. Arbeiten aus dem Paul Ehrlich Institut 1994;87: Berrens L. The WHO IUIS International Reference Preparations for Allergens: drawbacks. Arbeiten aus dem Paul Ehrlich Institut 1994;87: Niederberger V, Valenta R. Recombinant allergens for immunotherapy. Where do we stand? Curr Opin Allergy Clin Immunol 2004;4: Chapman MD, Smith AM, Vailes LD, Pomes A. Recombinant allergens for immunotherapy. Allergy Asthma Proc 2002;23: Ferreira F, Wallner M, Breiteneder H, et al. Genetic engineering of allergens: future therapeutic products. Int Arch Allergy Immunol 2002;128: Cromwell O, Suck R, Kahlert H, et al. Transition of recombinant allergens from bench to clinical application. Methods 2004;32: Niederberger V, Horak F, Vrtala S, et al. Vaccination with genetically engineered allergens prevents progression of allergic disease. Proc Natl Acad Sci USA 2004;101: Jutel M, Jäger L, Suck R, et al. Allergen specific immunotherapy with recombinant grass pollen allergens. J Allergy Clin Immunol 2005;116: The European Parliament and Council. Directive 2001/83/EC on the community code relating to medicinal products for human use. Official Journal of the European Communities 2001;L331: German Medicinal Products Act. Bundesgesetzblatt 2005;73: European Medicines Evaluation Agency. Note for guidance on allergen products. 1996, London, CPMP/BWP/243/ Monograph on allergen products. In: European Pharmacopoeia, 3rd ed. Strasbourg: Council of Europe p European Medicines Evaluation Agency. Committee for Medicinal Products for Human Use (CHMP). Concept paper on the revision of the note for guidance on allergen products (CPMP/BWP/243/96). Production and quality issues 2005, London, CHMP/BWP/229472/ European Medicines Evaluation Agency. Committee for Medicinal Products for Human Use (CHMP). Guideline on the clinical development of medicinal products for the treatment of allergic rhino conjunctivitis 2002, London, CPMP/EWP/2455/ European Medicines Evaluation Agency. Committee for Medicinal Products for Human Use (CHMP). Concept paper on the preparation of a guideline on the clinical development of products for specific immunotherapy of allergic diseases 2006, London, EMEA/CHMP/EWP/18504/ Slater JE. Standardized allergen extracts in the United States. Clin Allergy Immunol 2004;18: Turkeltaub PC. Biological standardization of allergen extracts. Allergol Immunopathol 1989;17: Nordic Council on Medicines. Registration of allergenic preparations. Nordic guidelines, Vol. 23, 2nd ed. Uppsala, Sweden: NLN Publications pp Kleine Budde I, de Heer PG, van der Zee JS, et al. The stripped basophil histamine release bioassay as a tool for the detection of allergen specific IgE in serum. Int Arch Allergy Immunol 2001;126: Kaul S, Lüttkopf D, Kastner B, et al. Mediator release assays based on human or murine IgE in allergen standardization. Clin Exp Allergy 2006;37. In press. 26. Grier TJ, Hazelhurst TM, Duncan EA, et al. Major allergen measurements: sources of variability, validation, quality assurance, and utility for laboratories, manufacturers, and clinics. Allergy Asthma Proc 2002;23: Dreborg S, Einarsson R. The major allergen content of allergenic preparations reflects their biological activity. Allergy 1992;47: van Ree R. and the CREATE consortium. The CREATE Project: an introduction. Arbeiten aus dem Paul Ehrlich Institut In press. 29. Fernández Rivas M, Aalbers M, Fötisch K, et al. Immune reactivity of candidate reference materials. Arbeiten aus dem Paul Ehrlich Institut In press. 30. Ferreira F, Wallner M, Gadermaier G. Physicochemical characterization of candidate reference materials. Arbeiten aus dem Paul Ehrlich Institut In press. 31. Becker WM. Validation of quantitative allergen specific ELISAs. Arbeiten aus dem Paul Ehrlich Institut In press. 32. Duffort O, Palomares O, Lombardero M, et al. Variability of Ole e 9 allergen in olive pollen extracts: relevance of minor allergens in immunotherapy treatments. Int Arch Allergy Immunol 2006;140: Tato studie názorně ilustruje, jak je náročné vyvinout správnou analytickou metodu pro standardizaci obsahu alergenu v příslušném extraktu. 33. Arilla MC, Ibarrola I, Mir A, et al. Development of a sandwich type ELISA for measuring Pla a 1, the major allergen of Platanus acerifolia pollen. Int Arch Allergy Immunol 2005;138: Dobře naplánovaný způsob, jak vyvinout test pro kvantifikaci hlavního alergenu Pla a 1 v pylu platanu. Analýza byla s výjimkou reaktivity vůči analogům Pla a 1 a dalším druhům platanů vysoce specifická a byla zaznamenána dobrá korelace mezi obsahem Pla a 1 v extraktech a reaktivitou IgE. 34. Arilla MC, Ibarrola I, Garcia R, et al. Quantification of the major allergen from cypress (Cupressus arizonica) pollen, Cup a 1, by monoclonal antibody based ELISA. Int Arch Allergy Imunol 2004;134: Arilla MC, Ibarrola I, Martinez A, Asturias JA. Quantification assay for the major allergen of Cupressus sempervirens pollen, Cup s 1, by sandwich ELISA. Allergol Immunopathol 2004;32: Duffort O, Calabozo B, Gonzalez R, et al. Monoclonal antibody based ELISA to quantify the major allergen of Cynodon dactylon (Bermuda grass) pollen, Cyn d 1. Int Arch Allergy Immunol 2004;135: Arilla MC, Gonzalez Rioja R, Ibarrola I, et al. A sensitive monoclonal antibody based enzyme linked immunosorbent assay to quantify Parietaria judaica major allergens, Par j 1 and Par j 2. Clin Exp Allergy 2006;36: Hlavní přírodní alergeny Par j 1 a Par j 2, oba patřící do rodiny proteinů přenášejících lipidy, byly získány purifikací z extraktů a byla vyvinuta specifická králičí antiséra i monoklonální protilátky. Alergeny Par j 1 a Par j 2 byly detekovány vysoce senzitivní sendvičovou analytickou metodou (s pracovním rozmezím 0,2 1,0 ng/ml). Nebyla pozorována reaktivita vůči alergenům jakýchkoli dalších pylů rodu Urtica a uvádí se dobrá korelace s alergenní účinností. 38. Jimeno L, Duffort O, Serrano C, et al. Monoclonal antibody based ELISA to quantify the major allergen of Artemisia vulgaris pollen, Art v 1. Allergy 2004;59: Wen HW, Borejsza Wysocki W, DeCory TR, Durst RA. Development of a competitive liposome based lateral flow assay for the rapid detection of the allergenic peanut protein Ara h 1. Anal Bioanal Chem 2005;382: Tato práce popisuje analýzu založenou na mab s bočním proudem, využívající liposomů značených alergeny Ara h 1. Hlavní přínos této metody spočívá v tom, že výsledky lze získat v krátkém časovém odstupu (30 minut), nicméně její senzitivita je poměrně nízká (0,1 10,0 µg/ml). Neuvádí se žádné využití pro účely standardizace alergenových extraktů ani korelace s alergenní účinností. 40. Schmitt DA, Cheng H, Maleki SJ, Burks AW. Competitive inhibition ELISA for quantification of Ara h 1 and Ara h 2, the major allergens of peanuts. J AOAC Int 2004;87: Zuidmeer L, van Leeuwen WA, Budde IK, et al. Lipid transfer proteins from fruit: cloning, expression and quantification. Int Arch Allergy Immunol 2005; 137: Curr Opin Allergy Clin Immunol/CS 2007;4:

18 Standardizace alergenových extraktů pro imunoterapii Becker, Vogel a Vieths Ačkoli je tato studie zaměřena především na klonování a charakterizaci Mal d 3, jablečného proteinu přenášejícího lipidy, zároveň se v ní potvrzuje princip vypracování tří odlišných metod kvantifikace Mal d 3 jedné vysoce senzitivní kompetitivní radioimunoanalýzy a dvou sendvičových metod ELISA. 42. Van Oort E, Dieker MC, de Heer PG, et al. The major grass pollen group 5 allergen from Dactylis glomerata and its C terminal split product both behave as dimers: implications for allergen standardization. Int Arch Allergy Immunol 2005;136: Zajímavá studie, která prokázala, že štěpené produkty či oligomery mohou významně ovlivňovat výsledky měření obsahu hlavních alergenů a že vliv na účinnost analýzy a výsledky takových artefaktů mohou záviset na rozpoznávání epitopů použitými protilátkami. 43. Vogel L, Lüttkopf D, Hatahet L, et al. Development of a functional in vitro assay as a novel tool for the standardization of allergen extracts in the human system. Allergy 2005;60: V této práci je popsáno vytváření stabilní linie bazofilů s výrazným uvolňováním, která může vázat lidské protilátky IgE. Tato linie byla s vysokou senzitivitou a přesností použita k měření biologické účinnosti různých alergenových přípravků. Korelace s imunochemickými metodami byla velmi dobrá a analýza založená na uvolňování mediátoru se ve většině případů uspokojivě shodovala s klinickými údaji získanými u vysoce senzibilizovaných pacientů. 18 Curr Opin Allergy Clin Immunol/CS 2007;4:12 18

19 Desenzibilizácia pri alergii na lieky Mariana Castells a,b,c Význam prehľadu Desenzibilizácia pri alergii na lieky znamená navodenie stavu dočasnej klinickej neschopnosti odpovedať na liekové antigény. Postupné obnovenie podávania malých dávok antigénu v pevne stanovených časových intervaloch umožňuje podať plné terapeutické dávky a uchrániť tak pacienta od anafylaktickej reakcie. Rýchla desenzibilizácia umožňuje použiť nevyhnutné antibiotiká v prípade závažných infekcií u alergikov alebo kyselinu acetylsalicylovú u pacientov s kardiovaskulárnym ochorením a so súčasnou precitlivenosťou na kyselinu acetylsalicylovú, u ktorých sa previedla revaskularizácia. V práci autori podávajú prehľad o indikáciách a výsledku liečby alergie na antibiotiká a kyselinu acetylsalicylovú pomocou aktuálne používaných desenzibilizačných protokolov. Aktuálne výsledky Napriek úspechom s rýchlou desenzibilizáciou dodnes dobre nepoznáme celulárne a molekulárne mechanizmy inhibície. In vitro modely mastocytov a bazofilov naznačujú úlohu signálnych molekúl syk a STAT6. Protokoly rýchlej desenzibilizácie umožňujú liečiť reakcie I. typu viazané na mastocyty a IgE, ako je anafylaxia. Tieto reakcie sa objavujú po penicilínoch, cefalosporínoch a ďalších antibiotikách. Podobne môžu byť rýchlou desenzibilizáciou riešené aj anafylaktoidné reakcie spôsobené úvodnou expozíciou lieku a s podobnou klinickou prezentáciou ako reakcie sprostredkované IgE, ako v prípade kyseliny acetylsalicylovej, vankomycínu a taxánov. Súhrn Úspešné protokoly rýchlej desenzibilizácie na riešenie nežiaducich reakcií na antibiotiká a kyselinu acetylsalicylovú umožňujú liečbu kriticky infikovaných pacientov a kardiakov precitlivených na kyselinu acetylsalicylovú. Štandardizované protokoly s vysokou účinnosťou sa musia stať súčasťou bežnej praxe. Kľúčové slová antibiotiká, desenzibilizácia, hypersenzitívne reakcie, kyselina acetylsalicylová Desensitization for drug allergy Curr Opin Allergy Clin Immunol 2006;6: Lippincott Williams & Wilkins, Inc. a Harvard Medical School, Boston, Massachusetts, USA, b Adverse Drug Reactions and Desensitization Program, Brigham and Women s Hospital, Boston, Massachusetts, USA, a c Allergy and Clinical Immunology Training Program, Brigham and Women s Hospital, Boston, Massachusetts, USA Adresa pre korešpondenciu: Mariana Castells MD, PhD, One Jimmy Fund Way, Smith Building, Room 626D, Boston, MA 02115, USA E mail: mcastells@partners.org Skratka NSAID nesteroidné protizápalové lieky (nonsteroidal anti inflammatory drugs) Úvod Cieľom vývoja protokolov rýchlej desenzibilizácie v riešení liekovej hypersenzitivity je poskytnúť nevyhnutnú liečbu a súčasne ochrániť pacienta pred ťažkou reakciou anafylaktického alebo anafylaktoidného typu. Závažné nežiaduce liekové reakcie sa vyskytujú u 6,7 % hospitalizovaných pacientov a nežiaduce účinky sú šiestou až štvrtou príčinou úmrtia hospitalizovaných pacientov [1]. Liekom navodené hypersenzitívne reakcie I. typu, ako je anafylaxia, sú dôsledkom uvoľnenia mediátorov z IgE senzibilizovaných mastocytov a bazofilov. Anafylaxia spojená s liekmi sa môže spustiť po beta laktamových antibiotikách, ako je penicilín a cefalosporíny, po chemoterapeutických liekoch, ako je platina, po terapeutických monoklonálnych protilátkach a ďalších liekoch [2,5,6,7 ]. Premostenie molekúl IgE liekovým antigénom môže viesť k obmedzenej kožnej reakcii (začervenanie, svrbenie, urtikária, angioedém) alebo k multiorgánovému systémovému postihnutiu (kýchanie, opuch prínosových dutín a nosa, kašeľ, sťažený nádych, piskoty na hrudníku, bolesti brucha, nauzea, vracanie, hnačka) s hypotenziou a s kardiovaskulárnym kolapsom počas anafylaxie. Hypersenzitívne reakcie navodené antigénmi liekov po ich prvom podaní, bez predchádzajúcej senzibilizácie a s príznakmi podobnými reakciám sprostredkovaným IgE, sa označujú ako anafylaktoidné reakcie. Tieto reakcie môžu byť dôsledkom priameho uvoľnenia mediátorov z mastocytov alebo z bazofilov, ako je to v prípade syndrómu červeného človeka po vankomycíne, intravenóznych kontrastných látok alebo taxánov. Rýchla desenzibilizácia princípy, celulárne a molekulové mechanizmy Desenzibilizácia po hypersenzitívnych reakciách I. typu u pacientov s alergiou na penicilín sa prvýkrát začala používať pred 50 rokmi [8]. Prípady úspešného rýchleho a postupne sa zvyšujúceho obnoveného podávania penicilínu viedlo k predstave dočasnej klinickej tolerancie [3]. Podávanie suboptimálnych dávok liekových antigénov a následné podávanie plnej terapeutickej dávky bolo úspešné u ťažkých alergikov, čo umožnilo liečbu závažných infekcií [4]. Po úvodnom úspechu s antibiotikami sa vypracovali ďalšie empirické protokoly na liečbu hypersenzitivity na základné lieky, ktoré nemôžu byť u alergikov nahradené. Takýmito liekmi sú kyselina acetylsalicylová pri liečbe a prevencii srdcových ochorení [5], inzulín u diabetikov [6 ], chemoterapeutiká počas relapsu karcinómu [7,8] Curr Opin Allergy Clin Immunol/CS 2007;4:

20 Desenzibilizácia pri alergii na lieky Castells a v súčasnosti chimerické a humanizované monoklonálne protilátky pri chronických zápalových ochoreniach [7 ]. Nakoľko sa pri rýchlej desenzibilizácii u silne precitlivených pacientov opakovane podávajú potenciálne letálne dávky, je potrebné objasniť molekulové mechanizmy, aby sa tak zvýšila účinnosť a bezpečnosť takejto liečby. Nedávno realizované in vitro štúdie s rýchlou desenzibilizáciou naznačili, že cieľovými bunkami sú mastocyty a bazofily, ale aj signálna molekula syk [9] a STAT6 [10], prenášač signálu a aktivátor transkripcie zodpovedný za transkripciu IL 4 a IL 13. Desenzibilizácia na antibiotiká Rýchlou desenzibilizáciou môžeme riešiť anafylaxiu a anafylaktoidnú reakciu navodenú antibiotikami. Najviac preskúmanými antibiotikami sú beta laktamové antibiotiká, cefalosporíny, vankomycín a chinolóny. Penicilín a cefalosporíny U pacientov s alergiou na penicilín je súčasne zvýšené riziko reakcie aj na cefalosporíny. Skríženú reaktivitu medzi cefalosporínami a penicilínmi je možné zistiť u 4 11 % pacientov v dôsledku príbuznosti štruktúry beta laktamového jadra [11]. Špecifické IgE protilátky proti cefalosporínom môžu byť namierené proti determinantom bočných reťazcov, ktoré sa nezhodujú s liekmi obsahujúcimi beta laktamové jadro [12], čo znamená menšie riziko pre pacientov s alergiou na penicilín. Ďalšie antibiotiká, ktoré obsahujú beta laktamové jadrá, ako sú monobaktámy (aztreonam), nemajú významnejšiu skríženú reaktivitu s penicilínmi. Nedávno sa v prípade imipenemových antibiotík ukázalo, že sú dobre tolerované pacientmi s alergiou na penicilín a na beta laktamové antibiotiká [13 ]. Na rýchlu desenzibilizáciu sú vhodné len reakcie I. typu na penicilín a beta laktamové antibiotiká. Iné reakcie, ako sú makulopapulárny výsev, erythema multiforme, Stevensov Johnsonov syndróm, toxická epidermálna nekrolýza, bulózny erytém, erytrodermia, sérová choroba, hemolytická anémia, neutropénia, trombocytopénia a akútna intersticiálna nefropatia, nie sú na rýchlu desenzibilizáciu vhodné. Všetci pacienti s anamnézou hypersenzitivity sprostredkovanej IgE a s pozitívnymi kožnými testami na minoritné alebo majoritné penicilínové determinanty nesmú dostať akékoľvek lieky obsahujúce beta laktamové jadro, vrátane penicilínu, amoxicilínu, ampicilínu a cefalosporínov. Aztreonam a imipenem sa môžu použiť v prípade citlivosti infekčného agens. Rýchla desenzibilizácia je indikovaná v prípade, že je nevyhnutné použiť v liečbe penicilín alebo cefalosporín, na základe závažnosti infekcie alebo jej pôvodcu. Rýchla desenzibilizácia na beta laktamové antibiotiká, vrátane penicilínu a cefalosporínov Prvýkrát sa rýchla desenzibilizácia pomocou zvyšovaných perorálnych dávok použila v prípade penicilínu na liečbu 15 tehotných žien infikovaných syfilisom [14]. Neskôr bol vypracovaný intravenózny protokol na liečbu 15 ťažko infikovaných pacientov. V tomto protokole sa dávky zvyšovali 10násobne [15]; u 30 % pacientov sa rozvinuli nežiaduce účinky, ktoré nemali život ohrozujúci charakter, vrátane sérovej choroby. Odvtedy sa v literatúre objavil veľký počet kazuistík, ale žiadna skupina pacientov, u ktorej by sa mohla overiť účinnosť a bezpečnosť rôznych protokolov. Po opakovanej expozícii beta laktamovým antibiotikám máva až 30 % pacientov s cystickou fibrózou hypersenzitívne reakcie, čo vyžaduje rýchlu desenzibilizáciu [16,17]. Jedna z novších štúdií ukázala, že je možné bez Tabuľka 1 Rýchla intravenózna desenzibilizácia na 1 g ceftazidimu u pacienta s cystickou fibrózou Plná dávka 1000,0 mg Celkové množstvo podané injekčne v každej fľaštičke (mg) Roztok ml z 0,040 mg/ml Roztok ml z 0,400 mg/ml Roztok ml z 3,969 mg/ml Krok Roztok Rýchlosť (ml/h) Čas (min) Podaná dávka (mg) Kumulatívna dávka (mg) ,0200 0, ,0500 0, ,1000 0, ,2000 0, ,5000 0, ,0000 1, ,0000 3, ,0000 7, , , , , , , , ,0000 Celkový čas = 351 min 20 Curr Opin Allergy Clin Immunol/CS 2007;4:19 24