Kinetika dohasínání fluorescence

Transkript

1 Praktkum z mkroskope a spektroskope Knetka dohasínání fluorescence Teore Knetka dohasínání fluorescence po exctac -pulzem je jedním z fundamentálních parametrů, který charakterzuje molekulární systém. Je určena stavem a nkol počtem molekul a tudíž nezávsí na koncentrac fluoroforu, což může být výhodné v aplkacích, ve kterých je problém přesně určt koncentrac fluoroforu. Vzhledem k tomu, že knetka dohasínání fluorescence se typcky odehrává na časové škále nanosekund, vyžaduje přesné proměření knetky dohasínání fluorescence expermentálně náročné metody. Metoda časově korelovaného čítání fotonů (tme-correlated sngle photon countng, TCSPC) rekonstruuje křvku dohasínání tím způsobem, že vzorek je ozařován sérí krátkých pulzů (deálně -pulzů) a po každém z nch je detekován nejvýše 1 emtovaný foton. Pro něj je přesně změřeno, s jakým zpožděním po exctačním pulzu přletěl na detektor a výsledná hodnota je uložena do hstogramu. Vzhledem k tomu, že ntenzta fluorescence je přímo úměrná počtu emtujících molekul, je pravděpodobnost toho, že emtovaný foton je vyzářen v daném čase po exctac úměrná počtu fotonů zaznamenaných v hstogramu pro dané časové zpoždění a pro velký počet zaznamenaných fotonů (typcky jch detekujeme několk mlónů) tedy hstogram věrně rekonstruuje knetku dohasínání fluorescence. V nejjednodušším případě je knetka dohasínání fluorescence po exctac -pulsem popsána exponencální funkcí t (1) I( t) I(0). e v prax se ovšem setkáváme s tím, že dohasínání je komplkovanější a nejčastěj je ftováno jako suma exponencálních funkcí (2) I( t) A e t Další komplkací v reálném měření je to, že funkce přístrojové odezvy (nstrument response functon, IRF) není -funkce a je tedy třeba uvážt, že naměřená knetka dohasínání fluorescence je výsledkem konvoluce přístrojové funkce s hledanou odezvou na -pulz (3) I( t) IRF A e t Skutečný tvar IRF nemívá analytcké vyjádření, v prax je změřen pro dané nastavení přístroje pomocí roztoku, jež rozptyluje světlo (rozptyl je velm rychlý proces a tedy 0) a konvoluce je prováděna numercky. Intenzta fluorescence na dané vlnové délce je úměrná parametru A (jenž závsí na počtu molekul, kvantovém výtěžku, pravděpodobnost vyzáření fotonu na dané vlnové délce, atd.) a tedy př měření knetky dohasínání na různých vlnových délkách platí (4) I( t, ) IRF A ( ) e t

2 Pro většnu vzorků je rozumný předpoklad, že hodnota každé komponenty je konstantní přes celé emsní spektrum a označujeme jako globální parametry. Pomocí globálního ftu pak můžeme získat závslost A = A (), což jsou emsní spektra příslušející jednotlvým komponentám dohasínání (decay-assocated spectra, DAS). Ta nám mohou pomoc př dentfkac jednotlvých složek komplexních směsí nebo př sledování dynamckých procesů a reakcí v exctovaném stavu. Klíčovým úkonem př těchto expermentech je vyhodnocení naměřených dat. Je zjevné, že př použtí nesprávného modelu př ftování získáme parametry, které nebudou mít reálný fyzkální smysl. Velkou předností metody TCSPC je její statstcký charakter, který umožňuje na základě statstckých krtérí dentfkovat nesprávné modely. Nejčastěj sledovaným krtér jsou N EXP FIT ( X X ) R 2 N p 1 kde N je počet ftovaných bodů, p počet volných parametrů, X EXP a X FIT jsou expermentální a naftovaná hodnota v daném bodě a σ je teoretcky předpokládaná směrodatná odchylka v daném bodě, přčemž z possonovského charakteru statstky plyne, že σ 2 = X EXP. Pro správný ft očekáváme hodnoty R 2 blízké 1,00. Dalším krtérem správnost ftu je náhodnost rozložení rezduí (tedy hodnot X EXP - X FIT ) okolo nuly. Úkol: 1) Seznamte se s prncpem fungování přístroje a s jeho komponentam. 2) Proměřte knetku dohasínání fluorescence 6-coumarnu a D,L-tryptofanu. 3) Vyhodnoťte parametry knetky dohasínání fluorescence pomocí (mult)exponencálního modelu s dekonvolucí přístrojové funkce. 4) V případě D,L-tryptofanu proměřte knetku dohasínání fluorescence pro různé vlnové délky emse a pomocí globálního ftu určete emsní spektra svázaná s jednotlvým komponentam (decay-assocated spectra, DAS). 5) Dskutujte získané výsledky. Postup: 1) Přpravte do fluorescenčních kyvet následující roztoky: a) destlovaná voda b) 1% roztok Ludoxu c) 5 M roztok 6-coumarnu v etanolu d) 20 M roztok D,L-tryptofanu ve vodě 2) Zapojte vhodný zdroj exctačních pulzů (pro 6-coumarn pulzní laserovou dodu s ex = 445 nm, pro D,L-tryptofan laserovou LED s ex = 298 nm), a podle návodu zapněte přístroj, počítač, spusťte program PcoHarp a ncalzujte monochromátor. 3) Seznamte se s významem všech položek v menu.

3 4) Proměřte knetku dohasínání fluorescence 6-coumarnu v etanolu, pro ex = 445 nm, em = 520 nm, repetční frekvence 20 MHz, štěrbny 1 mm, polarzátory pod magckým úhlem, rozlšení 16 ps/chl. Přístrojovou funkc změřte pro em = 445 nm s destlovanou vodou. 5) Proměřte knetku dohasínání fluorescence D,L-tryptofanu ve vodě, pro ex = 298 nm, em = 350 nm, repetční frekvence 10 MHz, štěrbny 2 mm, polarzátory pod magckým úhlem, rozlšení 32 ps/chl. Přístrojovou funkc změřte pro em = 298 nm s roztokem Ludoxu. 6) Proměřte knetku dohasínání fluorescence D,L-tryptofanu ve vodě za výše uvedených podmínek v ntervalu emsních vlnových délek nm (s krokem 10 nm). 7) Vyhodnoťte naměřená data v programu FluoFt. Pro měření z bodů 4 a 5 nalezněte správný model a určete parametry nejlepšího ftu knetky dohasínání fluorescence. Pro měření z bodu 6 určete pomocí globálního ftu decay-assocated spectra (DAS).

4 Studum nterakcí Na + /K + -ATPazy s fluoronovým barvvy metodam fluorescenční spektroskope. Vypracoval: Mroslav Hulčak Úkol 1: Změřte emsní spektra fluoronových barvv samotných a v přítomnost Na + /K + - ATPazy a na základě změn ve spektrech dskutujte možné nterakce barvv s protenem. Úkol 2: Na základě měření dob žvota fluorescence fluoronových barvv a dob žvota týchž látek v přítomnost Na + /K + -ATPazy zjstěte nterakc zkoumaných látek s enzymem. Úvod: Na + /K + -ATPaza (sodno-draselná pumpa) je membránový proten přítomný ve všech žvočšných buňkách. Transportuje 3 sodné onty ven z buňky a 2 draselné onty do buňky za využtí energe z hydrolýzy jedné molekuly ATP. Vytváří gradenty pro tyto onty, které jsou důležté v některých procesech jako například regulace buněčného objemu, regulace ntrobuněčného ph, regulace osmotckého tlaku, sekundární transport a přenos vzruchů v nervových buňkách. Jeho struktura sestává ze dvou hlavních podjednotek označovaných jako α a β. Podjednotku α tvoří 10 transmembránových helxů označovaných čísly 1 až 10 a velká cytoplazmatcká část, na které se nacházejí 3 domény označované P, A, N. Podjednotku β tvoří jeden transmembránový segment a velká exracelulární část, která je glykosdovaná. Do struktury Na + /K + -ATPazy je možno ještě zařadt krátký segment, který patří do rodny FXYD protenů a někdy bývá označován jako podjednotka γ (obr. 1). Nesprávná funkce tohoto enzymu může vést k řadě různých chorob, proto s látky, které nteragují s tímto enzymem a mohou ovlvnt funkc tohoto enzymu, zaslouží zvláštní pozornost. Obr. 1. Struktura Na + /K + -ATPazy. Transmembránová část α podjednotky je zobrazena šedou barvou, doména P zelenou, doména A červenou a doména N modrou barvou. Podjednotka β je zobrazena žlutou barvou a podjednotka γ světle modrou. Obrázek byl vytvorěn pomocí programu PyMol, PDB kód protenu je 3B8E.

5 Fluoronové barvva (fluorescen, eosn, erythrosn a bengal rose, obr. 2) jsou látky s vysokým kvantovým výtěžkem fluorescence. Běžně jsou využívány v klncké prax na lepší zobrazování buněk př některých vyšetřeních, jako součást šrokého spektra léčv, nebo se používají v potravnářském průmyslu jako barvva. Možné nterakce se sodno-draselnou pumpou by mohly vysvětlt některé nežádoucí účnky, které jsou nápadně podobné s projevy dsfunkce sodno-draselné pumpy. Možné nterakce Na + /K + -ATPazy s fluoronovým barvvy budeme zkoumat pomocí fluorescenčních měření. Obr. 2. Struktury fluoronových barvv a) fluorescen, b) eosn, c) erythrosn, d) bengal rose Fluorescenční měření mohou být rozděleny na dvě skupny: steady state (ustálená fluorescence) nebo tme-resolved (časově rozlšena fluorescence). Steady state měření se provádí ozařováním vzorku kontnuálním zdrojem světla a sleduje se ntenzta fluorescence nebo spektrum. Druhým typem měření fluorescence je tme-resolved, které se používá k měření dohasínání fluorescence. Př těchto expermentech se vzorek ozařuje krátkým pulsy světla (deálně δ puls). Př zkoumání nterakcí sodno-draselné pumpy s fluoronovým barvvy použjeme obě tyto metody. Materály a pomůcky: Chemkále (sodno-draselná pumpa, fluorescen, eosn, erythrosn, bengal rose), fluorescenční kyvety, termoblok na kyvety, spektrofluormeter HITACHI F4500, spektrometr PcoQuant se zdrojem pulzní laserové dody LDH-PC-440, termostat, ph metr, běžné laboratorní pomůcky (váhy, ppety, kádnky, míchadlo, chladítko, stojany a další). Postup měření: Přpravt chemkále na měření. Přpravte zásobní roztoky fluoronových barvv. Př měření budeme používat 1mM zásobní roztoky o objemu 1ml. Nejprve je třeba vypočítat hmotnost látky, kterou je třeba navážt, aby po přdání 1 ml vody měla tato látka požadovanou koncentrac. K výpočtu použjte molekulovou hmotnost látky uvedenou na orgnálním obalu. K určení hmotnost použjte laboratorní váhy. Dále přpravte 100 ml pufru 140 mm NaCl, 10 mm KCl a 10 mm TRIS a upravte ph na hodnotu 7,5. ph metr je třeba před měřením správně nakalbrovat. Použjte dvoubodovou kalbrac. Na upravení ph použjte buď kyselnu chlorovodíkovou nebo hydroxd sodný, podle toho, zda ph chcete snížt, nebo zvýšt. Dále s nachystejte zásobní roztok protenu následujícím způsobem. Obsah lahvčky s protenem od frmy Sgma rozpusťte v 1 ml 20 mm Trs s ph 7,5. Přdejte detergent oktaetylénglykolmonododecyléter (C 12 E 8 ) tak, aby poměr hmotnost proten: C 12 E 8 byl 1:1. Proten po celou dobu držte v chladítku, abyste zabránl jeho degradac.

6 Steady state měření. Seznamte se s obsluhou spektrofluormeteru HITACHI F4500. Zvláštní pozornost je třeba věnovat zapnutí a vypnutí přístroje, protože př nedodržení přesného postupu může dojít k poškození xenonónové lampy. Přesný postup zapnutí je k dspozc vedle přístroje. Dále je třeba nastavt termostat na teplotu na 25 C. Před měřením nejprve kyvety umístěte do termobloku, aby se zahřály na požadovaných 25 C. Dále nastavte spektrofluormeter na následující hodnoty: režm "wavelenght scan", rozsah měření od 400 nm do 700 nm, šířky štěrbn 5 nm. Exctační vlnovou délku volíme pro každou látku jnou, protože každá z látek má jné exctační maxmum. Tyto vlnové délky byly určeny na základě absorpčních spekter daných látek (obr. 3). Hodnoty exctační vlnové délky jsou pro jednotlvé látky následující: fluorecseín 490 nm, eosn 516 nm, erythrosn 526 nm a bengal rose 549 nm. Obr. 3. Absorpční spektra fluoronových barvv. Do kyvety nappetujte následující objemy vzorků: a) pro měření spektra samotného barvva: 2 μl 60 μm fluoronového barvva (výsledná koncentrace 1μM) 118 μl pufru 140 mm NaCl, 10 mm KCl a 10 mm TRIS ph 7.5 b) pro měření spektra barvva s protenem: 2 μl 60 μm fluoronového barvva (výsledná koncentrace 1 μm) 8,57 μl 28 μm Na+/K+-ATPazy (výsledná koncentrace 2 μm) 109,4 μl pufru 140 mm NaCl, 10 mm KCl a 10 mm TRIS ph 7.5

7 Koncentrace Na+/K+-ATPazy je dvojnásobná oprot koncentrac fluoronového barvva z toho důvodu, aby došlo k navázání všech molekul barvva na proten. Po nappetování vzorku do kyvety, nechte kyvetu as 10 mnut nkubovat v termobloku. Pak změřte emsní spektra látek samotných a také látek v přítomnost Na+/K+-ATPazy. Sestrojte graf závslost ntenzty fluorescence na vlnové délce a dskutujte změny ve spektrech. Časově rozlšené měření Seznamte se s obsluhou spektrometru PcoQuant. Př zapnutí a ovládání přístroje se řďte podle návodu přloženém u přístroje. Ještě před samotným zapnutím přístroje je třeba zapnout termostat a nastavt ho na požadovanou teplotu 25 C. Jako zdroj budeme používat pulzní laserovou dodu LDH-PC-440. Na spektrometru nastavte následující parametry: ntenzta 3,2 jednotek, repetční frekvence 10 MHz a ukončení měření po dosažení fotonů nebo po uplynutí 300 sekund. Pro měření znovu použjte fluorescenční kyvety předem předehřáté v termobloku na 25 C. Do kyvety nappetujte následující objemy vzorků: a) pro měření dohasínání fluorescence samotného barvva: 2 μl 60 μm fluoronového barvva (výsledná koncentrace 1 μm) 118 μl pufru 140 mm NaCl, 10 mm KCl a 10 mm TRIS ph 7.5 b) pro měření dohasínání fluorescence barvva s protenem: 2 μl 60 μm fluoronového barvva (výsledná koncentrace 1 μm) 8,57 μl 28 μm Na+/K+-ATPazy (výsledná koncentrace 2 μm) 109,4 μl pufru 140 mm NaCl, 10 mm KCl a 10 mm TRIS ph 7.5 Po nappetování vzorků do kyvety, nechte kyvetu as 10 mnut nkubovat v termobloku. Následně změřte dohasínání fluorescence jednotlvých vzorků. Př měření používejte pro každou látku příslušné emsní vlnové délky, které mají následující hodnoty: fluorescen 512 nm, eosn 536 nm, erythrosn 546 nm a bengal rose 575 nm. Jako poslední změřte přístrojovou funkc (IRF), která nám slouží ke zjštění přístrojové odezvy. Pro měření přístrojové funkce použjte fluorescenční kyvetu naplněnou deonzovanou vodou. Př měření IRF nezapomeňte změnt vlnovou délku fotonásobče na hodnotu emsné vlnové délky zdroje (445 nm), protože rozptyl nemění vlnovou délku.

8 Na vyhodnocení výsledků použjte software FluoFt 4.2.1, přčemž na určení střední doby žvota fluorescence používejte dvojexponencálny ft s dekonvolucí (pro volné barvvo) respektve trojexponencálny ft s dekonvolucí (barvvo navázané na proten). Sledujte změny v dobách dohasínání fluorescencí daných látek a tyto změny dskutujte. Vyhodnocení měření Výsledky přehledně zpracujte do grafů a porovnejte změny v emsních spektrech a v dohasínání fluorescence fluoronových barvv po přdání Na+/K+-ATPazy a tyto změny dskutujte. Na základě měření určete, které látky nteragují s daným protenem a u kterých k nterakc nedochází. Lteratura Joseph R. Lakowcz, Prncples of Fluorescence Spectroscopy, 3rd edton, Sprnger, 2006