10 Bioreaktor. I Základní vztahy a definice. Petr Kočí, Lenka Schreiberová, Milan Jahoda (revize )

Transkript

1 10 Boreaktor Petr Kočí, Lenka Schreberová, Mlan Jahoda (revze ) I Základní vztahy a defnce Chemcké reaktory jsou zařízení, v nchž probíhá chemcká přeměna surovn na produkty. Vsádkové reaktory jsou charakterzovány přetržtým provozem s perodckým vstupem a výstupem reakční směs. V průmyslu jsou využívány především př výrobě specálních chemkálí, např. léčv, barvv, pestcdů apod. Reakční rychlost složky r je defnována jako rychlost změny látkového množství složky n v jednotkovém objemu reakční směs V důsledkem chemcké reakce d n 1 r, (10-1) V d kde symbol označuje čas. Podělíme-l reakční rychlost složky jejím stechometrckým koefcentem υ, získáme rychlost chemcké reakce r r 1 d n. (10-2) V d Jestlže se v průběhu reakce nemění objem reakční směs (V = konst.), můžeme dosazením za látkové množství n = c n V do rovnce (10-2) vyjádřt rychlost chemcké reakce vzhledem k molární koncentrac složky c n d c 1 n r. (10-3) d Často používanou velčnou charakterzující změnu složení reakční směs je konverze složky, která je defnovaná jako podíl zreagovaného látkového množství složky a množství, které do reakce vstupovalo n 0. (10-4) n n 0 Boreaktorem nazýváme zařízení, ve kterém přeměna výchozích látek na produkty probíhá pomocí mkroorgansmů nebo bochemcky aktvních látek (např. enzymů), které byly těmto organsmy vyprodukovány. Knetka reakcí, v nchž vystupují klascké (bologcky neaktvní) látky, bývá často popsována tzv. mocnnovým tvarem r k n A B c c k c n A n B n n A,B,, (10-5) tedy jako součn rychlostní konstanty k n a koncentrací reaktantů c n umocněných koefcenty (řády reakce vůč jednotlvým složkám). Pro pops rychlost enzymatckých reakcí je často třeba využít složtějších knetckých modelů. První významný posun v této oblast nabídl v roce 1913 Leonor Mchaels a Maud Mentenová, kteří svou teor vystavěl na několka klíčových předpokladech: () enzym (E) se na substrát (S) váže vratně za vznku enzym- 1

2 substrátového komplexu (ES), který poté nevratně dsocuje na produkt reakce (P) a enzym (vz schéma 10-6), () celková koncentrace enzymu a enzym-substrátového komplexu se během reakce nemění. E + S ES E + P (10-6) Aplkací výše uvedených prncpů odvodl rovnc popsující závslost rychlostí enzymatcké reakce r na koncentrac substrátu c S : r V max S, (10-7) K M c c S kde V max je maxmální (lmtní) rychlost enzymatcké reakce a K M označuje Mchaelsovu konstantu. Závslost reakční rychlost r na koncentrac substrátu c S vykazuje u enzymatcké reakce podle knetky Mchaelse-Mentenové saturační charakter, vz obr Př nžších koncentracích substrátu reakční rychlost závsí na c S téměř lneárně, což odpovídá reakc prvního řádu. Je tomu tak proto, že pro koncentrace c S «K M lze koncentrac substrátu ve jmenovatel rovnce (10-7) oprot hodnotě K M zanedbat. Potom je možné aproxmovat rovnc (10-7) následujícím vztahem, který odpovídá reakc prvního řádu s rychlostní konstantou k = V max / K M : r V max c k c, (10-8) S S K M Př vyšších koncentracích substrátu dochází k zakřvení závslost r na c S (vz obrázek 10-1) a je nutné použít původní rovnc (10-7). Př velm vysokých koncentracích substrátu (c S» K M ) přestává reakční rychlost na c S závset a dostává se k lmtě r = V max (maxmální rychlost enzymatcké reakce), vz obr v 0 reakční rychlost r V max knetka reakce prvního řádu, rovnce (10-8) enzymová knetka podle Mchaelse a Mentenové, rovnce (10-7) 1 2 V max 0 K M koncentrace [S] substrátu c S Obr Závslost rychlost enzymatcké reakce na koncentrac substrátu podle knetky Mchaelse a Mentenové ( ) v porovnání s reakcí prvního řádu ( ). 2

3 Pokud proces probíhá ve vsádkovém reaktoru, koncentrace substrátu uvntř reaktoru v důsledku probíhající reakce postupně klesá. S klesající koncentrací substrátu se pak snžuje reakční rychlost. Vývoj koncentrace substrátu c S v čase τ vyjadřuje následující dferencální blance, platná pro zotermní vsádkový reaktor s konstantním objemem reakční směs. Blance obsahuje pouze akumulační a zdrojový člen (vstupy a výstupy jsou ve vsádkovém reaktoru během blancovaného období nulové): d c S r (10-9) d Abychom získal řešení této blance, musíme za r dosadt závslost reakční rychlost na proměnné koncentrac substrátu z rovnce (10-7) nebo (10-8) a ntegrovat. Pro nžší koncentrace substrátu, které budou používány v této prác, postačí jednodušší vztah (10-8), po jehož dosazení do (10-9), ntegrac a odlogartmování dostaneme c k S ( ) c S0 e, (10-10) kde c S0 je počáteční koncentrace substrátu ve vsádce a τ čas od rozběhnutí reakce (přdání enzymu). Vztah (10-10) vyjadřuje exponencální pokles c S v čase a platí jak pro molární tak pro hmotnostní koncentrace substrátu. Jeho použtelnost je však omezena na oblast, kde lze knetku enzymové reakce aproxmovat knetkou prvního řádu (vz obr. 10-1). Mchaelse a Mentenovou vedly k formulac jejch modelu výsledky expermentů s hydrolýzou sacharózy, která se v přítomnost enzymu nvertázy (přesněj -Dfruktofuranosdázy) štěpí na glukózu a fruktózu. Ekvmolární směs těchto dvou monosachardů, obvykle nazývaná nvertní cukr, je významnou komodtou v cukrovarnctví. Štěpení sacharózy na nvertní cukr pomocí enzymu nvertázy je předmětem také této laboratorní úlohy. Protože aktvta enzymů obecně velm dramatcky závsí na teplotě a ph okolního prostředí, je třeba tyto velčny udržovat v průběhu reakce konstantní. Enzym nvertáza používaný v této prác dosahuje nejvyšší aktvty v oblast okolo ph = 5. Chceme-l získat nformace o průběhu (bo)chemcké reakce, je zapotřebí měřt v průběhu expermentu koncentrac reaktantů, resp. produktů. Vzhledem k tomu, že sachardy jsou optcky aktvní látky, tj. jejch molekuly stáčí rovnu procházejícího polarzovaného světla, používá se na určení jejch koncentrace v roztoku nejčastěj technka zvaná polarmetre. Polarmetr je přístroj měřící úhel, o nějž se otočla rovna polarzovaného světla př průchodu optcky aktvním látkam nebo jejch roztoky. Úhel stočení měřený př C závsí na délce vzorku (resp. kyvety) a hmotnostní koncentrac optcky aktvní látky c podle vztahu c D,, (10-11) kde symbol D, označuje tzv. měrnou otáčvost (specfckou rotac) charakterstckou pro danou optcky aktvní látku, určenou př C za použtí světelného dubletu o vlnové délce 589 nm ze sodíkové výbojky. Významným a v polarmetr hojně využívaným poznatkem je Botovo pravdlo o adtvtě, které říká, že roztok dvou optcky aktvních látek A a B o hmotnostních koncentracích c A a c B vykazuje otáčvost danou algebrackým součtem příspěvků obou optcky aktvních složek: c c (10-12) D, A A D, B B 3

4 II Cíle práce 1. Naměření optcké otáčvost reakční směs v průběhu enzymatcké reakce. 2. Výpočet koncentrace sacharózy z naměřených hodnot optcké otáčvost roztoku. 3. Sestrojení grafu závslost konverze sacharózy na čase. 4. Sestrojení grafu závslost koncentrace sacharózy na čase a vyhodnocení rychlostní konstanty k podle vztahu (10-10). III Pops zařízení Expermentální zařízení je schématcky nakresleno na obr Skleněný válcový boreaktor s temperačním pláštěm 4 je v horní část opatřen otvory. Levý otvor 3 slouží k zasazení skleněné nálevky a následný vstup jednotlvých složek do reakčního prostoru. V pravém otvoru 2 je zasazen dgtální snímač teploty pro kontrolu teploty reakční směs. Snímaná hodnota teploty je aktuálně zobrazována na dsplej umístěném na zd nalevo od reaktoru. Reakční směs je míchána rotačním lopatkovým míchadlem 1. Spodní část reaktoru je opatřena otočným ventlem 6 sloužícím k odebrání vzorku a vypuštění obsahu reaktoru. Teplota reakční směs je udržována termostatem, proud temperované vody prochází pláštěm reakční cely. Panel termostatu je blíže zobrazen a popsán na obr Součástí aparatury je rovněž automatcký dgtální polarmetr a polarmetrckou trubcí (kyvetou) o délce = 1 dm, sada kádnek (skleněné a plastové), plastová nálevka, odměrné válce, střčka, dva pětltrové kanstry s destlovanou vodu, papírové ubrousky, dgtální phmetr a požadované chemkále (sacharóza, enzym nvertáza a pufr pro úpravu ph). 1 ovládací panel míchadla 2 teploměr 3 vstupní otvor 4 plášť reaktoru napojený na termostat 5 výtokový otvor 6 ventl pro ovládání výtokového otvoru Obr Vsádkový boreaktor 4

5 IV Postup práce IV.1 Příprava práce Na počátku práce je nutné se ujstt, jestl jsou síťové přívody míchačky, termostatu a polarmetru přpojeny do zásuvek a zdal je zavřený otočný ventl 6 ve spodní část reaktoru. Polarmetr zapneme mechanckým spínačem umístěným na zadní straně přístroje poblíž napájecího kabelu a necháme jej mnmálně 15 mnut stablzovat. Zapneme termostat pomocí zeleného spínače s podsvícením a crkulac vody do pláště reaktoru pomocí sousedního černého spínače. Dsplej na panelu termostatu zobrazuje aktuální hodnotu teploty vody v plášt reaktoru. Na termostatu je standardně přednastavena požadovaná teplota 50 C, po zapnutí by tedy mělo automatcky docházet k postupnému ohřevu až na tuto teplotu. V případě potřeby je po konzultac s asstentem možné změnt nastavení termostatu pomocí křížového ovladače u dspleje. Vypočteme hmotnost sacharózy tak, aby po smíchání se zadaným objemem destlované vody vznkl roztok sacharózy o požadovaném hmotnostním zlomku (vz zadání v protokolu). Vypočítané množství sacharózy necháme zkontrolovat asstentem. Sacharózu navážíme do plastové kádnky a za stálého míchání přpravíme požadovaný vodný roztok sacharózy. Roztok vljeme přes nálevku otvorem 3 do reaktoru. Př nulových otáčkách spustíme míchadlo a poté nastavíme otáčky na zadanou hodnotu. V průběhu celé přípravné fáze sledujeme na samostatném dsplej teplotu v reaktoru (pozor, teplota v reaktoru reaguje na změnu teploty pláště se zpožděním). Vlastní experment je možné začít po zmenšení odchylky teploty v reaktoru od požadované hodnoty na 1,5 C nebo méně. Během čekání na ustálení teploty se budeme věnovat úpravám ph roztoku, nastavení polarmetru a přípravě roztoku enzymu, jak je popsáno v následujících odstavcích. Pro optmální aktvtu enzymu je třeba upravt kyselost roztoku sacharózy v reaktoru na hodnotu okolo ph = 5. To provedeme přdáním ml pufru pomocí ppety přes otvor 3. Pufr zajstí stablzac ph během celého expermentu. Po úpravě ph necháme reakční směs alespoň mnutu promíchat. Před vlastním expermentem je ještě vhodné nakalbrovat pozadí polarmetru na nulu. V kyvetovém prostoru zařízení se nachází prázdná polarmetrcká trubce. Trubc vyjmeme z kyvetového prostoru a několkrát vypláchneme destlovanou vodou pro odstranění případných nečstot. Poté trubc naplníme destlovanou vodou tak, aby se v ní nenacházely bublny a kapalna vyplňovala celou hlavní část s okénky, kudy prochází optcká dráha polarmetru. Bublny lze vypudt nakláněním trubce ze strany na stranu. Polarmetrckou trubc umístíme do kyvetového prostoru polarmetru a zavřeme víko. Na dotykovém dsplej stskneme tlačítko (vlevo dole), čímž se dostaneme k nabídkám nastavení polarmetru. Vybereme volbu Blank a potvrdíme tlačítkem Start na dotykovém dsplej. Po několka sekundách se zobrazí naměřená hodnota pozadí. Pokud se hodnota výrazně lší od nuly, konzultujeme stuac s asstentem. V případě hodnoty blízké nule můžeme potvrdt měření pozadí stskem tlačítka Save. Na závěr přípravných prací požádáme asstenta o enzym. Zadané množství enzymu v mlgramech navážíme na laboratorních analytckých vahách a rozpustíme v 50 ml 5

6 destlované vody (v odměrné baňce). Pečlvě promícháme, aby byl enzym zcela rozpuštěný. Zatím enzym nepřdáváme do reaktoru. IV.2 Vlastní experment Měření koncentrací sacharózy a nvertního cukru během reakce spočívá ve stanovení optcké otáčvost odebraného vzorku reakční směs. Vzorek odebíráme v pravdelných časových ntervalech, přčemž čas reakce se počítá od okamžku přdání enzymu do reaktoru. Na úplném začátku expermentu ještě před přdáním enzymu odebereme po opatrném pootevření ventlu 6 z výtokového otvoru 5 do skleněné kádnky přblžně 60 ml vzorku roztoku sacharózy k analýze. Ihned poté přes plastovou nálevku naljeme do reaktoru všechen roztoku enzymu (celých 50 ml), čímž rozběhneme reakc. Zbytky enzymu na nálevce spláchneme do reaktoru destlovanou vodou ze střčky. Na dsplej snímače teploty odečteme teplotu reakční směs a zapíšeme j v protokolu do kolonky měření číslo 1 (čas τ=0 mn). Odebraným vzorkem roztoku sacharózy dvakrát propláchneme polarmetrckou trubc a poté j naplníme tímto vzorkem po okraj, přčemž nakláněním trubce ze strany na stranu vypudíme bublny. Polarmetrckou trubc se vzorkem umístíme do kyvetového prostoru polarmetru, zavřeme víko a stskneme na dotykovém dsplej konu (v pravém dolním rohu), čímž se spustí měření otáčvost α. Po několka sekundách se na dsplej objeví naměřená hodnota, kterou vydělíme 10, abychom dostal otáčvost v úhlových stupních, a výsledek zaznamenáme v protokolu do kolonky α t. Poté kyvetu vyjmeme, vzorek a zbytek z proplachování polarmetrcké trubce vljeme přes nálevku zpět do reaktoru. Nakonec ještě polarmetrckou trubc propláchneme nejméně dvakrát destlovanou vodou. Prvních 30 mnut stejným způsobem odebíráme a měříme vzorek reakční směs každých 5 mnut, poté následujících 70 mnut odebíráme a měříme vzorek každých 10 mnut, přčemž vždy do protokolu zaznamenáváme okamžtou hodnotu optcké otáčvost α t a teplotu reakční směs t př odběru. Mez jednotlvým odběry nkdy nesmíme opomenout propláchnout kyvetu daným vzorkem a poté oplachovat destlovanou vodou. Rovněž nezapomínáme mez jednotlvým odběry opláchnout destlovanou vodou an vzorkovací skleněnou kádnku. IV.3 Ukončení měření Po odebrání posledního vzorku vypneme míchačku, termostat a polarmetr. Pokud jsme kontroloval ph roztoku pomocí ph-metru, opláchneme ho, zakrytujeme a vypneme. Z boreaktoru se reakční směs vypustí spodním ventlem do přpravené nádoby a následně vylje do odpadní výlevky. Boreaktor se propláchne destlovanou vodou. Polarmetrcká trubce se několkrát vypláchne destlovanou vodou, osuší a umístí do kyvetového prostoru polarmetru. Vntřní prostor polarmetru se důkladně otře suchým papírovým ubrouskem. Pokud někde v polarmetru došlo k zaschnutí cukerného roztoku, odstraníme znečštění nejprve slabě navlhčeným hadříkem a poté vytřeme dosucha papírovým ubrouskem. V umyvadle se umyje použté laboratorní vybavení, vlhkým hadrem a následně suchým ubrouskem se otřou všechna znečstěná místa. 6

7 V Bezpečnostní opatření 1. Věnujeme zvýšenou pozornost př prác s pufrem a enzymem a nepoužíváme je na jné účely, než jak je uvedeno v postupu práce. 2. S polarmetrem se zachází opatrně, dodržuje se čstota a suché prostředí v jeho okolí kyvetovém prostoru a je nezbytné přesně dodržovat postup uvedený v návodu nebo nstrukce od výrobce umístěné v prvním šuplíku pracovního stolu. 3. V případě nečnnost nebo poškození polarmetru se přvolá asstent, je zásadně vyloučeno zasahovat do polarmetru bez odborného dohledu. 4. Př prác s polarmetrckou trubcí je potřeba být opatrný a njak j nepoškodt nebo neznčt. Jedná se o drahý materál a není k dspozc náhradní kus. VI Zpracování naměřených hodnot Údaj odečtený na dsplej polarmetru je třeba nejprve vydělt 10, abychom dostal úhel stočení ve stupních. Tuto hodnotu zapíšeme do protokolu do sloupce α t (úhel stočení př teplotě měření t). Dále vypočteme odpovídající úhel stočení př C (značený jako α ) dle vztahu t a b, (10-13) přčemž hodnoty konstant teplotní korekce a, b jsou uvedeny v tab. 1. Tab. 1. Konstanty pro teplotní korekc t 50 C a 1,000 b 0,876 Pro první bod měření (čas = 0 mn) vypočítáme počáteční hmotnostní koncentrac přpraveného roztoku sacharózy c S0 (kg dm -3 ) dle vztahu (10-11) a výsledek zapíšeme do tabulky. Po přídavku enzymu určíme koncentrac sacharózy a vznkajícího nvertního cukru na základě užtí pravdla o adtvtě (10-12). Hmotnostní koncentrac sacharózy po přídavku enzymu c S vypočteme ze vztahu: c c M c, (10-14) S S 0 I kde M je poměr molárních hmotností sacharózy M S (342 g mol -1 ) a nverzního cukru M I (360 g mol -1 ) a c I je hmotnostní koncentrace nvertního cukru, kterou získáme dosazením rovnce (10-14) do rovnce popsující pravdlo o adtvtě (10-12): c I M c D, S S 0. (10-15) D, S D, I Invertní cukr je ekvmolární směs glukózy a fruktózy, jejchž molární hmotnost jsou totožné. Pro koncentrac glukózy resp. fruktózy tedy platí, že 7

8 c c I c. (10-16) G F 2 Koncentrac sacharózy pak dopočteme podle rovnce (10-14). Hodnoty jednotlvých konstant užtých ve výše uvedených rovncích jsou shrnuty v tab. 2. Tab. 2 Hodnoty konstant. Konstanta Význam Hodnota Jednotka M poměr molárních koncentrací sacharózy a nvertního cukru 0,95 1 měrná otáčvost sacharózy př C +66,53 úhlové dm 2 kg -1 D, S měrná otáčvost nvertního cukru př C,59 úhlové dm 2 kg -1 D, I délka polarmetrcké trubce 1,00 dm VII Symboly mocnny rychlostní rovnce (10-5) 1 a, b konstanty pro rovnc (10-13) 1 α t naměřený úhel stočení př teplotě t úhlové α úhel stočení př C úhlové měrná otáčvost sacharózy př C úhlové dm 2 kg -1 D, S měrná otáčvost nvertního cukru př C úhlové dm 2 kg -1 D, I c n molární koncentrace složky mol dm -3 c hmotnostní koncentrace složky kg dm -3 c I hmotnostní koncentrace nvertního cukru kg dm -3 c F hmotnostní koncentrace fruktózy kg dm -3 c G hmotnostní koncentrace glukózy kg dm -3 c S hmotnostní koncentrace substrátu (sacharózy) kg dm -3 c S0 počáteční hm. koncentrace substrátu (sacharózy) kg dm -3 E enzym - ES enzym-substrátový komplex - k n obecná rychlostní konstanta chemcké reakce závsí na řádu reakce k rychlostní konstanta reakce prvního řádu mn -1 K M Mchaelsova konstanta mol dm -3 délka polarmetrcké trubce dm n látkové množství složky mol P produkt - S substrát (sacharóza) - r rychlost chemcké reakce mol dm -3 mn -1 r reakční rychlost složky mol dm -3 mn -1 8

9 υ stechometrcký koefcent složky 1 τ čas mn konverze složky 1 V objem reakční směs dm 3 V max maxmální (lmtní) rychlost enzymatcké reakce mol dm -3 mn -1 VIII Kontrolní otázky 1. Co je cílem práce, jaké velčny budete nastavovat a jaké měřt? 2. Jaký typ reaktoru je v laboratoř? 3. Jak přpravíte reakční směs? 4. Jak upravíte ph reakční směs? 5. K čemu slouží polarmetr? 6. Může se nastavená teplota během expermentu měnt? 7. V jakých časových ntervalech budete odebírat vzorky a v jakém množství? 8. Jak se bude měnt koncentrace sacharózy v průběhu expermentu? 9. Jaký parametr charakterzující rychlost reakce vyhodnotíte z naměřených dat? 9