9. Měření kinetiky dohasínání fluorescence ve frekvenční doméně

Transkript

1 9. Měření knetky dohasínání fluorescence ve frekvenční doméně

2 Gavolův experment (194) zdroj vzorek synchronní otáčení fázový posun detektor

3 Měření dob žvota lumnscence Frekvenční doména - exctace harmoncky modulovaným světlem Fázový posuv Φ a demodulace emse m Intenzta modulace B/A m = b/a fáze Φ a b A Čas B Exctace Emse Pro jedno-exponencální dohasínání tg Φ = τ P = π f τ P m = τ P = τ m 1 1+ τ Příklad 9.1: Př frekvenc harmoncké modulace světla f = 30 MHz bylo zjštěno, že emse má fázový posun Φ = 45. Jaká je doba žvota exctovaného stavu měřeného fluoroforu? Jaká je demodulace emse, pokud je knetka dohasínání jedno-exponencální? m Tato rovnost ndkuje, že se knetka dohasínání daného fluoroforu je jednoexponencální f... frekvence, [Hz]... úhlová frekvence, [rad.s -1 ]

4 τ = 5 ns Původ demodulace.5 M H z e x c ta c e e m s e ntenzta ntenzta modulace pomalejší než knetka dohasínání 5 M H z č a s e xc ta ce e m se č a s ntenzta ntenzta ntenzta 5 0 M H z ča s e x c ta c e e m s e ntenzta č a s modulace rychlejší než knetka dohasínání č a s č a s

5 Odvození vztahů pro posun fáze a demodulac př 1-exponencálním dohasínání Exctujeme snusově modulovaným světlem L(t) = a + b sn(t) takže m L = b/a je modulace dopadajícího světla. Předpokládáme, že populace exctovaného stavu se bude měnt se stejnou frekvencí, ale fáze a modulace budou jné F(t) = A + B sn(t-φ) Nyní musíme nalézt vztah mez dobou žvota fluorescence τ a posunem fáze a demodulací. Předpokládejme, že knetka dohasínání fluorescence po exctac δ-pulsem je 1-exponencální I(t) = I 0 exp(-t/τ) zdervováním pak dostaneme di(t)/dt = - 1/τ I(t) což udává knetku depopulace exctovaného stavu. Pokud současně vzorek exctujeme světlem s časovým průběhem L(t), pak pro populac exctovaného stavu platí di(t)/dt = - 1/τ I(t) + L(t) Dosazením vztahu pro F(t) dostaneme vztah mez τ, Φ a demodulací B cos(t-φ) = -1/τ [A + B sn(t-φ)] + a + b sn(t)

6 Odvození vztahů pro posun fáze a demodulac S použtím vztahů sn (x-y) = sn x cos y - cos x sn y cos (x-y) = cos x cos y + sn x sn y můžeme rovnc upravt na B [cos(t) cos Φ + sn (t) sn Φ )] = -1/τ {A + B [sn(t) cos Φ) - cos(t) sn Φ)]} + a + b sn(t) Tato rovnce musí platt pro všechny časy, sdružíme tedy konstantní členy, snové a kosnové členy a dostáváme rovnce a - A/ τ = 0 cos Φ - (1/ τ) sn Φ = 0 sn Φ + (1/ τ) cos Φ = b/b Z druhé rovnce pak plyne sn Φ / cos Φ = tg Φ = τ Φ Ze součtu druhých mocnn druhé a třetí rovnce s použtím A = a τ dostaneme m = (B/A) / (b/a) = [1+ ( τ m ) ] -1/

7 Indkace 1-exponencální knetky τ Φ τ m jsou stejné pro všechny frekvence τ Φ = τ m na každé frekvenc Pro zjštění hodnoty τ př 1-exponencálním dohasínání stačí měřt na 1 frekvenc, pro složtější knetky je potřeba proměřt Φ a m na více frekvencích. Příklad 9.: Př měření na frekvenc 30 MHz jsme naměřl fázový posun Φ = 30 a demodulac m = 0,5. Má měřený fluorofor jednoexponencální knetku dohasínání? Je potřeba měřt ještě na dalších frekvencích?

8 Rozsah frekvencí Rozsah měřících frekvencí je třeba přzpůsobt době žvota fluoroforu, typcky frekvence zhruba v ntervalu 0,1/( πτ) až 10/( πτ)

9 Analýza dat Obecně pro knetku dohasínání I(t) (jakoukolv neexponencální) snová transformace N = 0 I ( t) sn( t) 0 I ( t) dt dt Pro sumu exponencál N = α τ + 1 τ α τ cosnová transformace D = 0 I ( t) cos( t) 0 I ( t) dt dt D = α τ + 1 τ α τ normalzace na celkovou steady-state ntenztu

10 Analýza dat Vypočítané hodnoty fázového posunu Φ c a demodulace m c jsou pak dány D N tan Φ c = D N m c + = Φ Φ Φ = δ ν δ ν χ m m m c c R Kvalta ftu δφ a δm jsou emprcky určené chyby měření pro Φ a m

11 Expermentální uspořádání - MHz oblast

12 Cross-correlaton detecton umožňuje zpracování sgnálu na nízkých frekvencích Časová závslost ntenzty sgnálu I(t) = I 0 [1+m cos(t+φ)] Zesílení na detektoru je také snusově modulováno G(t) = G 0 [1+m C cos( C t+φ C )] Vynásobením dostaneme, že sgnál je roven S(t) = I 0 G 0 [1 + m cos(t+φ) + m C cos( C t+φ C ) + mm C cos(t+φ) cos( C t+φ C ) ] Poslední člen je pak roven mm C / [cos( t+ Φ) + cos( C t+ t+ Φ)] kde = C - a Φ = Φ C - Φ Máme tedy členy s frekvencem, C, + C a. První tř jsou elektroncky odfltrovány a posledníčlen stále nese nformac o demodulac a fázovém posunu.

13 Měření v MHz oblast ntenzta ref. PMT Φ 1 Φ Φ = Φ -Φ 1 čas ref. vzorek měřený vzorek Měření je omezeno vlastnostm elektrooptckého modulátoru (do zhruba 00 MHz) a frekvenčním vlastnostm fotonásobče ( MHz). Omezení EO modulátoru je možno obejít použtím modulovaného zdroje světla (LED). referenční vzorek - rozptyl, nebo vzorek se známým τ

14 Expermentální uspořádání - GHz oblast Exctace pulsním laserem 4MHz Jako detektor nutno použít MCP-PMT nebo rychlou fotododu 5 ps 5,1 MHz 77 GHz

15 Fázově rozlšená spektra Detektor zapnut jen na půl perody s fázovým posuvem Φ D F(λ,Φ D ) = k F(λ) m cos (Φ D -Φ) Pro Φ D = Φ + 90 je F = 0 Možnost selektvního potlačení spektra jedné komponenty v komplexní směs

16 Srovnání měření v časové a fázové doméně Obě metody jsou teoretcky ekvvalentní, poskytují stejné nformace, neboť harmoncká odezva je jen Fourerovou transformací odezvy na δ-puls. Moderní přístroje používají stejné zdroje světla, detektory optcký modul, odlšná je pouze elektronka, takže cena je srovnatelná. Rozdílné jsou metodky, přčemž každá má své výhody a nevýhody Pulsní metoda umožňuje vzualzac knetky dohasínání, zatímco představt s j na základě posunu fáze nebo demodulace je problém. Pulsní metoda je založena na detekc jednotlvých fotonů a má tedy obrovskou ctlvost, zatímco pro přesné vyhodnocení analogového sgnálu ve fázové doméně potřebujeme slnější sgnál. Ve fázové doméně nepotřebujeme dělat dekonvoluc, zatímco v pulsní doméně je to často nezbytné a zejména pro velm rychlé knetky je potřeba změřt IRF s velkou pečlvostí. Dobře defnovaná statstka v TCSPC je velkou výhodou pulsní domény př analýze dat, ve fázové doméně určení směrodatné odchylky pro fáz a demodulac nemusí být jednoduché. V časové doméně je jednodušší měření TRES. Dekompozce spekter na základě doby žvota je jednodušší ve fázové doméně. Rychlost měření závsí na složtost sgnálu. Pro 1-exponencální knetku je rychlejší měření ve fázové doméně (výhoda v mkroskop), pro více-exponencální jsou časy srovnatelné (buďto je potřeba nasbírat mnoho fotonů, nebo měřt př mnoha frekvencích)

17 Shrnutí Prncp měření doby žvota ve fázové doméně - exctace harmoncky modulovaným světlem Měřené velčny - fázový posuvφa demodulace emse m, výpočet doby žvota z těchto parametrů Analýza dat - velm rychlá pro jednoexponencální knetky, velm složtá pro složtější modely Expermentální uspořádání, prncp cross-correlaton detecton Expermentální uspořádání pro měření v GHz oblast (exctace pulzním laserem, detektory s rychlou frekvenční odpovědí) Fázově rozlšená spektra Výhody a nevýhody měření v časové a fázové doméně