Pokročilé praktikum z fyzikální chemie. Návody k úlohám

Transkript

1 Pokročlé praktkum z fyzkální cheme Návody k úlohám

2 VYSOKOÚČINNÁ KAPALINOVÁ CHROMATOGRAFIE ZADÁNÍ ÚLOHY Metodou vysokoúčnné kapalnové chromatografe separujte směs s-traznových herbcdů, sledujte vlv složení moblní fáze na separac. Proveďte kvaltatvní analýzu neznámého vzorku. TEORETICKÝ ÚVOD Vysokoúčnná kapalnová chromatografe (HPLC Hgh Performance Lqud Chromatography) se řadí mez nejčastěj používané separační metody. Vynká vysokou účnností, dobrou opakovatelností a robustností. Tato metoda je vhodná pro dělení netěkavých a polárních látek, jejchž analýza příbuznou plynovou chromatografí bývá často obtížná. HPLC je založena na separac analytů na základě jejch dstrbuce mez staconární a moblní fáz. Během separace dochází k mnoha typům nterakcí. Uplatňují se nterakce analytů s moblní fází, nterakce moblní fáze se staconární fází a sorpce analytů na staconární fáz. Za předpokladu, že př přechodech analytu (A) z moblní fáze do fáze staconární se chromatografcký systém přblíží rovnovážnému stavu, lze tuto dstrbuc mez obě fáze popsat dstrbuční konstantou K D. kde [A] je rovnovážná koncentrace analytu ve staconární fáz, [A] rovnovážná koncentrace s m analytu v moblní fáz. Na základě rozdílné velkost této dstrbuční konstanty jsou některé analyty na koloně zadržovány méně a některé více. To se projeví rozdílem v jejch retenc, která je většnou porovnávána pomocí retenčních faktorů k. kde t je retenční čas analytu (tj. doba od nadávkování vzorku po čas, kdy detektor zaznamená R maxmum píku), t je mrtvý čas (tj. retenční čas látky nenteragující se staconární fází. M Parametry popsující separac Separace látek může být posuzována pomocí několka základních parametrů, mez něž patří účnnost, rozlšení a separační faktor (pro dvojc látek), které jsou určeny selektvtou separace. Rozlšení R 1,2 dvou píků je dáno vztahem kde w 1, w 2 jsou šířky píků př základně. 2

3 Rozlšení dvou píků je ve vztahu k parametrům kolony vyjádřeno následující rovncí: kde n je účnnost kolony (vyjádřená jako počet teoretckých pater), je separační faktor, který je měřítkem selektvty, k je retenční faktor složky eluující pozděj. 2 Rozlšení R = 1 odpovídá 95% separac látek, která je př optmalzac metody považována 1,2 za dostatečnou. Rozlšení téměř na základní ln, odpovídající 99,7% separac látek, nabývá hodnoty 1,5. Pro výpočet účnnost kolony/separačního systému platí následující vztah: kde t je retenční čas, w je šířka píku př základně a w je šířka píku v polovně výšky. Ze R 1/2 vztahu (matematckého vyjádření) je patrné, že pro různé píky v chromatogramu bude tato hodnota různá. Dalším parametrem, který se často používá pro posouzení kvalty kolony (separačního systému) je výškový ekvvalent teoretckého patra H:, kde L je délka kolony. Parametr sloužící k posouzení tvaru píku se nazývá symetre píku, resp. asymetrcký faktor A : s A = B/A, s kde A, B jsou šířky píku v 10% jeho výšky ke kolmc na základnu spuštěné z vrcholu píku-z náběžné strany (A) a z druhé (často chvostující) (B). Systémové píky V chromatografckých systémech je často obtížné najít vhodný marker mrtvého času, neboť se na retenc podílí mnoho typů nterakcí. Zajstt, aby zvolený marker skutečně se staconární fází nenteragoval žádným typem nterakce, je téměř nemožné. Proto je snahou využívat k určení mrtvého času rozpouštědlového (systémového) píku. V chromatogramech často pozorujeme jeden č více poztvních nebo negatvních píků příp. kombnac obou typů, které někdy používáme k určení mrtvého času potřebného pro výpočet retenčního faktoru, a tedy k charakterzac analytu v daném systému. Systémové píky mohou vznkat v kapalnové chromatograf pokud moblní fáze obsahuje více než jednu složku. Po nadávkování vzorku do vícesložkové moblní fáze se na výsledném chromatogramu objeví více píků, než kolk analytů je ve vzorku. Systémové píky bývají 3

4 někdy chybně zaměňovány s píky měřených analytů. V chromatografckém systému se ustavuje rovnováha (mez staconární a moblní fází) př průtoku moblní fáze systémem. Tato rovnováha se poruší náhlou změnou moblní fáze, např. po nadávkování vzorku (neboť když je vzorek dávkován v moblní fáz, složení (koncentrace) jednotlvých složek moblní fáze je poněkud změněna (porušena) a tato porucha se objeví v podobě systémových píků v chromatogramu). Po narušení rovnováhy začne chromatografcký systém hned směřovat k novému rovnovážnému stavu. Výsledkem tohoto jevu je chromatogram obsahující píky analytů a píky složek moblní fáze, tj. systémové píky. Hydrofobcta Hydrofobcta se řadí mez významné toxkologcké parametry. Rozdělovací koefcent látky (A) mez n-oktanol (představuje hydrofóbní prostředí) a vodu (představuje hydroflní, polární rozpouštědlo) K (P) resp. jeho logartmcká forma log K (log P) je jeden z ow ow parametrů popsující hydrofobctu. Tato vlastnost sloučenn se používá např. v ekotoxkologckých studích k predkc dstrbuce dané sloučenny (např. pestcdů) v odlšných přírodních kompartmentech. Velčna K resp log P se objevuje v rovncích pro ow odhad boakumulace sloučenn v rostlnách a žvočších. Log K je také významným ow parametrem v QSAR (Quanttatve Structure Actvty Relatonshps, tj. kvanttatvním vztahy mez strukturou a působením (účnností)) modelech. Model QSAR je využíván ve farmakolog a farmac k optmalzac struktur účnné látky; v predkční toxkolog slouží tento model k odhadu toxcty dané látky. Analogcké modely např. QSRR (Quanttatve Structure Retenton Relatonshps) se používají např. v kapalnové chromatograf ke korelac retence analytu měřené za určtých podmínek s jeho fyzkálně-chemckým, topologckým nebo geometrckým vlastnostm (tyto vlastnost jsou popsány pomocí deskrptorů, P ). Pro retenční faktor dané látky platí následující funkce: k = f (P ), mez P deskrptory se řadí fyzkálně-chemcké deskrptory (log P, hydrofobní substtuční konstanty π apod.); geometrcké deskrptory (van der Waalsův objem, van der Waalsův specfcký povrch, parametr tvaru atd.); topologcké deskrptory (elektronové deskrptory, Hammetovy konstanty, parametry odrážející proton-donorovou a proton-akceptorovou schopnost molekul atd.). Během chromatografckého procesu dochází k mnoha typům nterakcí, jejchž výsledkem je doba zadržení analytu v separační koloně tedy jeho retence. Herbcdy Herbcdy jsou významnou podskupnou pestcdů, tj. sloučenn určených pro lkvdac škůdců všeho druhu. Používání pestcdních přípravků má často negatvní efekt na žvotní prostředí, především vede ke znečstění hydrosféry a také dochází ke kumulac těchto látek v potravním řetězc. Působení herbcdů je směřováno k nčení rostlnných škůdců. Významnou skupnou herbcdů, které se aplkují do půdy, jsou sloučenny odvozené od s-traznové základní kostry. Prometon (log P = 2,99), prometryn (log P = 3,51), propazn (log P = 2,93) a atrazn (log P = 2,61) jsou použty jako modelové sloučenny v této úloze. Prometryn, propazn a prometon jsou analogy lšící se substtucí v poloze 1, tj. -SCH, -Cl resp. -OCH. Atrazn a 3 3 propazn jsou naopak oba Cl-derváty lšící se substtucí (jednou methylovou skupnou) v 4

5 poloze 3. Výběr takto strukturně podobných sloučenn umožní vysledovat obecné trendy vlvu složení moblní fáze na separac. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST K separac směs čtyř s-traznových pestcdů bude použt vysokoúčnný kapalnový chromatograf Allance (Waters 2695 Separaton Module) od frmy Waters. Tato aparatura se skládá ze čtyř vysokotlakých pump (A, B, C a D); PDA detektoru (Photodode Array Detector Waters 2996); autosampleru; pět karuselů (A, B, C, D, a E; každý z karuselů má kapactu 24 válek), které jsou temperovány na zadanou teplotu; kolonového termostatu a počítače. Pro řízení aparatury, sběr a následné zpracování dat bude využt software Empower (návod na ovládání tohoto softwaru je k dspozc u přístroje). K měření bude použta kovová kolona Symmetry C18 od frmy Waters o rozměrech 75 mm x 4,6mm (vntřní průměr) naplněná endkapovanou oktadecylslkagelovou staconární fází, zrnění 3,5 µm. Moblní fáze bude v zokratckém módu dvousložková, tvořená směsí acetontrlu (ACN) a vody - ACN/voda 35/65 (v/v), průtoková rychlost bude 1 ml/mn. Př gradentové analýze bude mít moblní fáze prvních 6 mnut konstantní složení (ACN/voda 35/65 (v/v)), od 6. do 7. mnuty se bude složení moblní fáze lneárně měnt do jednosložkové moblní fáze tvořené 100% ACN, průtoková rychlost bude po celou dobu analýzy 1 ml/mn. Detekční vlnová délka bude určena po proměření spekter v rozmezí nm. Teplota v kolonovém termostatu a teplota v karuselu budou nastaveny na 25 C. Úkoly: 1. Navrhněte retenční pořadí herbcdů na základě jejch struktury a známých hodnot log P. 2. V zokratckém módu proměřte spektra (v rozmezí nm) herbcdů. Dobu analýzy zvolte 20 mnut. Vyberte optmální vlnovou délku pro další měření. 3. Expermentálně ověřte navržené retenční pořadí př zokratckém eluc. 4. Proveďte separac stejné směs za podmínek gradentové eluce. Dobu analýzy zvolte 10 mnut. 5. Mrtvý čas kolony zjstěte nadávkováním acetontrlu za podmínek zokratcké eluce. 6. Zjstěte/spočítejte a porovnejte jednotlvé chromatografcké parametry - retenční faktory, separační účnnost, symetr píků, rozlšení mez sousedním píky a separační faktory - získané př separac v zokratcké a gradentové eluc. 7. Proveďte kvaltatvní analýzu herbcdů v neznámém vzorku. Struktury vybraných herbcdů: PROMETRYN = 2,4-bs-(sopropylamno)-6-methyltho-1,3,5-trazn 5

6 PROPAZIN = 2,4-bs-(sopropylamno)-6-chloro-1,3,5-trazn PROMETON = 2,4-bs-(sopropylamno)-6-methoxy-1,3,5-trazn ATRAZIN = 2-chloro-4-ethylamno-6-sopropylamno-1,3,5-trazn 6

7 Sze Excluson Chromatography (SEC) Studum degradace poly[(4-pentylfenyl)acetylen]u v roztoku metodou SEC 1. Teore 1.1. Metoda SEC SEC (Sze Excluson Chromatography), známá též pod starším názvem gelová permeační chromatografe (Gel Permeaton Chromatography, GPC) je metoda dělení látek na základě velkost (přesněj hydrodynamckého objemu) jejch molekul. Je založena na dfus molekul rozpuštěné látky do vntřních pórů zrntého porézního gelu, kombnované s tokem rozpouštědla kolonou vyplněnou tímto gelem. V analytckém uspořádání se používá k molekulárně hmotnostní charakterzac polymerů, v uspořádaní preparatvním pak k frakconac polymerů. Z fyzkální cheme je známo, že rozpuštěné částce (včetně makromolekul) v roztocích dfundují z míst s vyšší koncentrací do míst s koncentrací nžší. Převrstvíme-l porézní gel nabotnalý rozpouštědlem roztokem polymeru ve stejném rozpouštědle, přčemž makromolekuly polymeru budou menší v porovnání s rozměry pórů nabotnalého gelu, budou makromolekuly dfundovat do pórů gelu a po ustavení rovnováhy bude koncentrace makromolekul v roztocích uvntř gelu mmo gel stejná. Budou-l ovšem makromolekuly polymeru větší než rozměry pórů gelu, nebude k jejch dfus do gelu docházet a makromolekuly zůstanou v roztoku nad gelem, zatímco uvntř gelu bude nadále čsté rozpouštědlo. Převrstvíme-l nabotnalý gel roztokem polydsperzního polymeru (např. směsí roztoků uvažovaných v předchozích dvou případech), zůstanou velké molekuly opět v roztoku mmo gel, zatímco malé pronknou do gelu, a to dokonce ve větší míře, než když byly v roztoku samotné, neboť vyrovnávají koncentrační spád za velké makromolekuly. Nyní uvažujeme kolonu naplněnou rozpouštědlem nabotnalým zrntým gelem s póry různých velkostí. Na začátek kolony vpravíme menší množství roztoku polydsperzního polymeru a kolonu začneme promývat čstým rozpouštědlem (standardní chromatografcký postup). Kapalna bude protékat kolonou nejrychlej v prostorech mmo zrna gelu, zatímco uvntř zrn gelu bude její průtok pomalý (póry gelu fungují jako úzké kapláry). Během průchodu roztoku polymeru kolonou dfundují jeho makromolekuly do pórů gelu. Pro malé makromolekuly je přístupná většna pórů, a proto setrvají v koloně nejdéle, s narůstající velkostí makromolekul klesá frakce pórů, do kterých mohou makromolekuly pronknout, a klesá tedy doba jejch setrvání v koloně. Na výstupu z kolony se proto nejprve objeví největší makromolekuly analyzovaného polymeru, s narůstajícím retenčním časem pak molekuly stále menší. Umístíme-l na výstup kolony koncentrační detektor (zaznamenává koncentrac makromolekul v roztoku vytékajícím z kolony) získáme jako výsledek měření závslost koncentrace makromolekul (popř. velčny koncentrac úměrné) na retenčním čase, t r, která se nazývá SEC chromatogram. SEC chromatogram je spojtá křvka, která je určtou varantou dferencální dstrbuční funkce molárních hmotností, M, analyzovaného polymeru (většnou je SEC chromatogram blízký logartmcké váhové dstrbuční funkc M, t.j. závslost hmotnostního zlomku makromolekul s příslušnou hodnotou M na log M). Metoda SEC používající na výstupu z kolony pouze koncentrační detektor není absolutní metodou molekulárně hmotnostní charakterzace. SEC chromatogram je proto možno vyhodnott pouze na základě kalbrace, která přřazuje každému retenčnímu času molární hmotnost v tomto čase eluovaných makromolekul. Kalbrace příslušné aparatury SEC se provádí pomocí kalbračních standardů, t.j. sére polymerů stejného typu s různou hodnotou M vykazujících mnmální polydsperstu (hodnota M standardů je určena absolutně, nejčastěj 7

8 pomocí rozptylu světla s touto technkou se seznámíte v rámc jných úloh tohoto praktka). Pro tyto standardy se na dané aparatuře určí hodnoty t r odpovídající maxmu na SEC chromatogramu a sestrojí se kalbrační křvka, nejčastěj jako závslost log M na t r. Aparatura SEC, kterou budete používat, byla jž okalbrována, a to pomocí sére polystyrenových (PS) standardů, kalbrační závslost má tvar: log M = a 0 + a 1 t r + a 2 t r 2 + a 3 t r 3 (1) kde a jsou koefcenty získané matematckým zpracováním kalbračních měření, jejch hodnoty jsou zadány do programu, který použjete k vyhodnocení SEC analýz Vyhodnocení SEC chromatogramů Matematckým zpracováním SEC chromatogramů je možno získat tvary jednotlvých dstrbučních funkcí molárních hmotností a střední hodnoty (průměry) molárních hmotnostní. Střední hodnoty molárních hmotností představují základní molekulárně hmotnostní charakterstky polymeru, přpomeňme proto jejch defnce. Početně střední molární hmotnost M n : M = M f ( M ) m n (2) n n = / Váhově střední molární hmotnost M w : M w = M f ( w M ) = ( M m ) / m (3) Zetově střední molární hmotnost M z : = M f z ( M ) = M ) 2 z ( M m ) / ( M m (4) V těchto rovncích n představuje celkové látkové množství a m celkovou hmotnost makromolekul v analyzovaném vzorku, m je hmotnost makromolekul s molární hmotností M, f n je početní, f w váhová a f z zetová dferencální dstrbuční funkce molárních hmotností. Polymer je dále charakterzován pomocí tzv. ndexů polydspersty vyjadřujících šířku dstrbuce molárních hmotností. Nejdůležtější ndexy, I n a I w, jsou defnovány: I n = M w /M n (5) I w = M z /M w (6) Střední hodnoty molárních hmotností jsou z SEC chromatogramů určeny následujícím způsobem: souřadnce t r SEC záznamu je rozdělena na ekvdstantní úseky a každému z nch je přřazena jednak hodnota odezvy koncentračního detektoru, y, a jednak hodnota M (na základě rovnce (1)). Hledané střední hodnoty jsou pak spočteny ze vztahů (7) (9). 8

9 M n = y / ( y / M ) (7) M w = ( M y ) / y (8) 2 M z = ( ym ) / ( ym ) (9) 3. Substtuované polyacetyleny a jejch degradace Substtuované polyacetyleny patří mez polymery s konjugovaným hlavním řetězcem, které jsou s ohledem na své elektroncké a optoelektroncké vlastnost ntenzvně studovány jako potencálně aplkační materály. Díky konjugovanému charakteru hlavního řetězce však představují tyto polymery (na rozdíl od polymerů s nasyceným hlavním řetězcem) poměrně reaktvní systém. V důsledku reakce s kyslíkem podléhají polyacetyleny degradac, tedy procesu, kterým se makromolekuly polymeru štěpí na menší fragmenty. Tato degradace je poměrně rychlá zejména nachází-l se polyacetyleny rozpuštěné v roztoku přpraveném a uchovávaném v kontaktu se vzduchem, tedy v roztoku, který obsahuje rozpuštěný vzdušný kyslík. Degradace polymerů může probíhat různým mechansmy. Mezním případem je depolymerzace, př které se štěpí pouze vazby mez koncovým monomerním jednotkam a zbytkem řetězce, v průběhu depolymerzace jsou tedy z konců postupně se zkracujících polymerních řetězců oddělovány pouze molekuly monomeru. Druhým mezním případem je náhodná degradace, př které je pravděpodobnost štěpení každé vazby polymerního řetězce stejná, v průběhu degradace tedy vznkají různě dlouhé fragmenty původního řetězce. V závslost na typu zatížení degradujícího polymeru mohou být tyto fragmenty různě funkconalzované a v některých případech mohou podléhat následným reakcím. Omezíme-l se na degradace lneárních polymerů bez následných reakcí degradací vznklých fragmentů, je možno knetku degradace obecně popsat Smhovou-Montrollovou rovncí (10), která ukazuje, jak se počet polymerních řetězců, N X, o polymerzačním stupn X mění s degradačním časem: dn dt X = X 1 k( X, p) N + 2 X p= 1 S = X+ 1 k( S, X ) N S (10) V této rovnc jsou k(x,p) a k(s,x) rychlostní konstanty štěpení řetězců o polymerzačním stupn X resp. S v bodě p resp. X od konce řetězce. N X a N S jsou počty makromolekul o daném polymerzačním stupn v čase degradace t. Př čstě náhodné degradac jsou všechny rychlostní konstanty v rovnc (10) shodné, což umožňuje získat řešení této rovnce v jednoduchém tvaru závslost recprokých hodnot polymerzačních stupňů na čase t: 1 P 1 P = 0 n n 1 P w 1 = P +ν t n ν t w + 0 w 3 0 I dt w (11) (12) 9

10 kde P n a P w značí početně střední a váhově střední polymerzační stupeň v čase t, P n 0 a P w 0 tyto průměry pro t = 0, ν n a ν w jsou rychlostní konstanty degradace. Hodnoty P n a P w jsou v jednoduchém vztahu se středním hodnotam molárních hmotností: P n = M n /M j (13) P w = M w /M j (14) kde M j značí molární hmotnost monomerní jednotky. Zpracování dat získaných v průběhu degradace podle rovnc (11) a (12) umožňuje rozhodnout, zda studovaná degradace je náhodného charakteru, popř. odhadnout míru odchylky od náhodnost. Degradac lze považovat za náhodnou, pokud jsou splněna krtera: () závslost 1/P n vs. t a 1/P w vs. t jsou lneární, a () z těchto závslostí rezultující hodnoty ν n a ν w jsou shodné. 4. Úloha Sledujte průběh degradace poly[(4-pentylfenyl)acetylen]u (PPePhA) rozpuštěného v tetrahydrofuranu (THF) na základě změn molekulárně hmotnostních charakterstk získaných metodou SEC. Výsledky zpracujte podle rovnc (11) a (12) a rozhodněte, zda je studovaná degradace náhodného charakteru. 5. Postup Za atmosférckých podmínek přpravte do války se šroubovacím uzávěrem roztok PPePhA v THF (koncentrace 0,8 1,0 mg PPePhA na 1 ml THF, objem přpraveného roztoku 2 3 ml). Roztok přpravte až po stablzac nulové lne detektoru SEC aparatury. Ihned po rozpuštění PPePhA proveďte první SEC analýzu (objem njektovaného roztoku: 0,02 ml). Roztok PPePhA nechte dále stárnout v uzavřené válce př teplotě 50 o C na vodní lázn a analyzujte ho v ntervalech zhruba 45 mn (celkem 5 až 6 SEC analýz). Analýzy vyhodnoťte a výsledky zpracujte podle rovnc (11) a (12), jako čas degradace (t) uvažujte dobu od začátku rozpouštění PPePhA do okamžku nástřku vzorku na kolony SEC aparatury, pro zjednodušení vyhodnocení dosaďte do rovnce (12) za hodnotu I w časově nezávslou hodnotu, kterou spočtete jako artmetcký průměr hodnot I w získaných v rámc všech vašch měření. 10

11 Fluorescenční spektroskope Stanovení krtcké mcelární koncentrace dodecylsulfátu sodného ve vodě 1. Teore fluorescence Molekula se po přechodu do elektroncky exctovaného stavu může vrátt zpět do základního elektronckého stavu dvěma typy ntramolekulárních procesů: Buď zářvě, tedy emsí fotonu v ultrafalové, vdtelné, nebo blízké nfračervené oblast, nebo nezářvě, t. j. přechodem do vbračně vzbuzeného základního stavu (který se dále deaktvuje postupnou dspací vbrační energe během srážek s okolním molekulam, tzv. vbrační relaxací). Zářvou, resp. nezářvou deaktvac, př níž nedochází ke změně multplcty, nezýváme fluorescencí, resp. vntřní konverzí. Zářvou, resp. nezářvou deaktvac, př níž se elektronová multplcta mění, nazýváme fosforescencí, resp. mezsystémovým přechodem. Fosforescence a mezsystémový přechod jsou u většny látek o několk řádů pomalejší než fluorescence a vntřní konverze, a proto je také většnou za běžných podmínek (měření v roztocích za pokojové teploty) nepozorujeme. Naprot tomu výraznou fluorescenc vykazuje celá řada látek, zpravdla organckých sloučenn s konjugovaným dvojným vazbam. Jelkož konverze z vyšších sngletových exctovaných stavů bývá většnou mnohem rychlejší než fluorescence z těchto stavů, pozorujeme v emsním fluorescenčním spektru většnou pouze jedný elektroncký pás, který přísluší přechodu z prvního sngletového exctovaného stavu do základního stavu, t. j. S 1 S 0 (tzv. Kashovo pravdlo) a který je prot odpovídajícímu absorpčnímu pásu, S 0 S 1, posunut k vyšším vlnovým délkám (tzv. Stokesův posun). Příčnou tohoto posunu je vbrační relaxace během doby žvota exctovaného stavu, jíž se část absorbované energe dspuje nezářvě. Vzhledem k poměrně dlouhé době, kterou molekula setrvává ve stavu S 1 (typcky 10-8 s), jsou fluorescenční spektra mnohem více ovlvněna ntermolekulárním nterakcem, než spektra absorpční. Měření fluorescenčních spekter proto může, pokud vhodně zvolíme fluoreskující látku, fluorofor, přnést např. nformace o polartě č vskoztě v bezprostředním okolí (do vzdálenost několka nm) tohoto fluoroforu, které mohou být úplně jné než průměrná polarta a vskozta celého roztoku a které v podstatě nelze změřt jným způsobem. Proto je fluorescenční spektroskope velm vhodnou metodou pro studum např. domén v polymerech a protenech, mcel, bologckých membrán, mezfází, apod. Podle toho, zda jsou ve studovaném systému vázány slabým mezmolekulovým nterakcem nebo kovalentně, rozdělujeme fluorofory na fluorescenční sondy a fluorescenční značky. 2. Technka měření fluorescence Spektrometry používané k měření fluorescenčních spekter (obr. 1) mají zpravdla polychromatcký zdroj záření, např. xenonovou výbojku, takže exctační záření o potřebné vlnové délce musí být vybráno exctačním monochromátorem (Exc. M) Záření emtované vzorkem je analyzováno emsním monochromátorem (Em. M). K detekc se používá fotonásobč (PM). Regstruje se buď ntenzta proudu, který protéká fotonásobčem, nebo počet dopadů jednotlvých fotonů na fotokatodu (mpulsů) za jednotku času (tzv. SPC, sngle photon countng, počítání jednotlvých fotonů) 11

12 Obr. 1. Schéma fluorometru Fluorolog FL3-11 Běžně se snímají fluorescenční spektra dvojího typu: Emsní spektrum je závslost ntenzty fluorescence na vlnové délce emtovaného záření př konstantní vlnové délce exctačního záření. Naopak exctační spektrum je závslost ntenzty fluorescence na vlnové délce exctačního záření př konstantní vlnové délce emtovaného záření. Měření spekter je komplkováno závslostí ntenzty záření zdroje, odrazvost dfrakčních mřížek a účnnost fotonásobče na vlnové délce. Zejména výrazná je závslost ntenzty exctačního záření na vlnové délce (daná spektrem použté výbojky), která hraje rol př měření exctačních spekter, a je proto vždy třeba na n tato spektra korgovat. 3. Úloha Pyren (obr. 2) vykazuje ntenzvní fluorescenc v blízké ultrafalové oblast. Jeho emsní spektrum má výraznou vbrační strukturu. Vbronový pás I s maxmem př 372 nm přísluší symetrcky zakázanému přechodu a ve spektru se objevuje pouze v důsledku nterakcí molekuly pyrenu s jejím solvátovým obalem. Relatvní ntenzta prvního vbronového pásu vzhledem k ostatním pásům proto závsí na síle této nterakce a obecně roste s polartou solvátového obalu. Z těchto důvodů se pyrenu často využívá jako fluorescenční sondy ke studu polarty mkrookolí, kdy se měří poměr ntenzty vbronového pásu I ku ntenztě symetrcky povoleného vbronového pásu III s maxmem kolem 383 nm, I I /I III. Čím je tato hodnota vyšší, tím polárnější je použté rozpouštědlo. 12

13 Intenzta fluorescence (10 3 cps) I III λ (nm) Obr. 2. Pyren a jeho emsní spektrum ve vodě (exctace 336 nm) s vyznačeným vbronovým pásy I a III. V této úloze užjete fluorescenčních vlastností pyrenu ke stanovení krtcké mcelární koncentrace anontového surfaktantu a běžné složky čstících prostředků, dodecylsulfátu sodného (SDS) ve vodě. Anon SDS má tzv. amfflní charakter, neboť obsahuje jak slně polární, hydroflní skupnu sulfát, tak skupnu nepolární a hydrofobní dodecyl. U látek tohoto typu exstuje v roztocích rovnováha mez volným molekulam a multmolekulárním asocáty, mcelam, v nchž jsou solvatoflní skupny exponovány na povrchu, zatímco solvatofobní skupny jsou uloženy uvntř a nejsou s molekulam rozpouštědla ve styku. Rovnovážná koncentrace volných molekul amfflní látky koexstujících s mcelam se označuje jako krtcká mcelární koncentrace, c.m.c. V případě vodných roztoků SDS je povrch mcel tvořen sulfátovým skupnam a vntřek alfatckým řetězc. Vntřek mcel je tudíž zcela nepolární prostředí a mohou v něm být rozpušteny (a tak stablzovány ve vodném roztoku) různé hydrofobní sloučenny, což je prncpem čstících účnků SDS jných surfaktantů. Bude-l ve vodném roztoku SDS o koncentrac menší než c.m.c. přítomen pyren jako fluorescenční sonda, naměříme hodnotu I I /I III odpovídající vodnému prostředí. Pokud však zvýšíme koncentrac SDS nad c.m.c. a začnou se tvořt mcely, hodnota I I /I III prudce poklesne díky fluorescenc pyrenu solvatovanému dodecylovým skupnam uvntř mcel namísto vody, v níž je pyren velm špatně rozpustný. Vaším úkolem bude změřt emsní spektra pyrenu ve vodě za přítomnost SDS př různých koncentracích surfaktantu a ze závslost I I /I III na koncentrac SDS odečíst jeho krtckou mcelární koncentrac. 4. Postup Přpravte 5 ml 0,1 M zásobního vodného roztoku SDS. Do sedm ampulek odppetujte postupně 50, 100, 150, 200, 250, 300 a 350 μl tohoto roztoku a do každé přdejte 2 ml nasyceného roztoku pyrenu ve vodě (ca. 0,5 μmol l -1 ). Směs nechte as 30 mn ekvlbrovat a poté změřte jejch spektra v rozmezí nm př exctační vlnové délce 336 nm. (Další parametry měření: štěrbny 3 nm na exctac a 0,5 nm na ems, krok 0,5 nm, ntegrační čas 0,5 nm.) Za stejných podmínek změřte též samotný nasycený roztok pyrenu. Z naměřených spekter odečtěte ntenzty pásů I a III, vyneste jejch poměr prot koncentrac SDS a z tohoto grafu odečtěte krtckou mcelární koncentrac. 13

14 Dynamcká kompenzační kalormetre (DSC) Stanovení teplot a enthalpí fázových přechodů KNO 3 1. Teore DSC Dynamcká kompenzační kalormetre (dfferental scannng calormetry, DSC) je expermentální technka, používáná k určování teplot enthalpí fázových přechodů, jako jsou tání č skelný přechod, případně enthalpí chemckých reakcí, nebo ke stanovování tepelných kapact. Měření lze provádět jen s látkam č směsm látek, které ve zvoleném teplotním rozmezí netěkají, an nereagují za vznku těkavých zplodn. Výstupem měření DSC je teplotní závslost ntenzty tepelného toku ze vzorku do okolí, nebo naopak z okolí do vzorku. Ze směrnce této závslost lze určt tepelnou kapactu vzorku př dané teplotě. Fázové přechody se na této závslost projeví jako píky, exotermní jako poztvní píky a endotermní jako negatvní. Z poloh maxm, resp. mnm těchto píků lze odečíst teploty fázových přechodů, z ploch pod píky pak hodnoty enthalpí těchto fázových přechodů. 2. Technka měření DSC Př měření DSC se zahřívají zkoumaný vzorek (studovaná látka v množství řádově jednotek až desítek mg uložená v hlníkové msce s víčkem) a kontrolní vzorek (což zpravdla bývá jen prázdná mska), každý samostatným topením, tak, aby jejch teplota, měřená odporovým teploměry, byla vždy stejná a rostla předem nastavenou rychlostí. Současně s teplotou se jako funkce času zaznamenává rozdíl mez elektrckým příkonem přváděným na topení zkoumaného vzorku a elektrckým příkonem přváděným na topení kontrolního vzorku, který odpovídá tepelnému toku z nebo do zkoumaného vzorku. Se vzorky, které by za vyšších teplot podléhaly oxdac vzdušným kyslíkem, se pracuje v nertní atmosféře. Př měření je nutno přhlížet k tomu, že teplota vzorku se kontnuálně mění, a proto se nestačí během fázového přechodu ustavt mez oběma fázem rovnováha, takže naměřené teploty fázových přechodů neodpovídají termodynamcky přesným hodnotám. Aby byla chyba v důsledku tepelné setrvačnost co nejmenší, provádí se ohřev, resp. ochlazování v okolí teploty předpokládaného fázového přechodu co nejpomalej (to samozřejmě platí jen pro rovnovážné přechody, jejchž teplota nezávsí na tepelné hstor vzorku, nkolv tedy např. pro měření skelného přechodu polymerů). Kalormetr Setaram DSC 141, na němž budete měřt zadanou úlohu, umožňuje prác v teplotním rozmezí od 150 C (chlazení kapalným dusíkem) do 600 C. 3. Úloha: Zadání a postup Vaším úkolem bude stanovt teploty a enthalpe fázových předchodů dusčnanu draselného v teplotním rozmezí 25 C 345 C. K měření odvažte do měrné hlníkové msky přesně as 4 mg vzorku KNO 3 a msku zavíčkujte. Vzorek zahřívejte rychlostí 20 C mn -1, v oblastech přechodů, t.j. 120 C 140 C (změna krystalové struktury) a 325 C 345 C (tání) rychlostí 1 C mn -1. K odečtení teplot a enthalpí obou fázových přechodů použjte software z příslušenství kalormetru. 14

15 Rozptyl světla Stanovení gyračního a hydrodynamckého poloměru částc polystyrenového latexu ve vodném roztoku 1. Teore rozptylu světla Prochází-l světlo látkou, ndukuje elektrcké pole světelné vlny v molekulách osclující dpólové momenty, které působí jako zdroje rozptýleného světelného záření, jehož ntenzta je nepřímo úměrná čtvrté mocnně jeho vlnové délky λ. Zatímco v optcky zcela homogenním prostředí (krystalová mřížka) toto rozptýlené záření zanká vzájemnou destruktvní nterferencí jednotlvých rozptylových center, v kapalnách má díky fluktuacím polarzovatelnost vyvolaným hustotním, teplotním č (u roztoků) koncentračním fluktuacem rozptyl světla z různých míst vzorku různou ntenztu, a k jeho zánku nterferencí tudíž nedochází. Obzvlášť slně rozptylují světlo roztoky kolodních částc o rozdílném ndexu lomu, než má rozpouštědlo. V těchto roztocích plní rol velm výrazných fluktuací polarzovatelnost samy kolodní částce, které jž nejsou zanedbatelně malé prot vlnové délce světla. Intenztu záření rozptýleného z jednotkového objemu roztoku měříme v závslost na velkost rozptylového vektoru q (t.j. rozdílu vlnových vektorů prmárního a rozptýleného paprsku), která je dána vztahem 4πn 0 θ q = sn, (1) λ 2 kde n 0 je ndex lomu rozpouštědla a θ je rozptylový úhel, tedy úhel mez směrem prmarního paprsku a směrem rozptýleného paprsku. Uvažujme nyní nejjednodušší případ rozptylu souborem vzájemně nenteragujících částc. Předpokládejme dále, že prmární záření je lneárně polarzované a ntenztu záření I rozptýleného jednotkou objemu vzorku do směru q měříme v rovně kolmé k vektoru polarzace. (Toto uspořádání je př měření rozptylu světla obvyklé.) Jsou-l částce zanedbatelně malé ve srovnání s vlnovou délkou použtého světla, nebude ntenzta rozptýleného záření závset na q. Pokud však jsou částce větší než přblžně λ/20, stane se velčna I směrově závslou v důsledku nterference světelných vln rozptýlených z různých míst uvntř jedné částce. Průběh funkce I(q) je proto dán velkostí a tvarem rozptylujících částc. Dá se ukázat, že pro Sq < 1 (tzv. Gunerova oblast), kde S je gyrační poloměr částc, platí pro I(q) nezávsle na tvaru částc přblžný vztah I ( q) I (0) 1 S q, (2) 3 z něhož plyne, že vynesením I(q) prot q 2 dostaneme přímku, z níž lze získat hodnotu S 2 jako poměr směrnce ku úseku na ose y. (Jelkož př nulovém úhlu, tedy ve směru prmárního paprsku, není pochoptelně možné ntenztu rozptylu měřt, je hodnotu I(0) nutné získat extrapolací.) Skutečnost, že rozptyl světla je podmíněn hustotním, teplotním č koncentračním fluktuacem, se projevuje tím, že okamžtá časová hodnota ntenzty rozptýleného záření (t,q) náhodně oscluje kolem časové střední hodnoty I(q)= (q,t). Rychlost, s jakou se tyto 15

16 časové fluktuace mění, charakterzuje časová autokorelační funkce ntenzty rozptýleného záření, defnovaná vztahem T 1 g( τ, q) = lm ( t, q) ( t + τ, q)dt. (3) T T 0 Hodnota této funkce v čase τ popsuje průměrnou míru korelace mez velkostm fluktuací, oddělených od sebe časovým ntervalem τ. Čím rychlej tedy g(τ,q) s časem τ klesá, tím rychlej se fluktuace ntenzty rozptýleného záření mění. Funkce g(τ,q) může být dost složtá, avšak v nejjednodušším případě, kdy jsou fluktuace vyvolány translační dfúzí monodsperzních sférckých částc o dfúzním koefcentu D, má tvar [ 1+ β exp( 2Dq 2 τ )] g( τ, q) = A, (4) kde A je ampltuda a β je tzv. koherenční faktor, závslý na geometr expermentálního uspořádání (teoretcky β = 1). Proložením naměřených dat exponencální funkcí (5) lze získat dfúzní koefcent částc a z něj hydrodynamcký poloměr R H pomocí Enstenova-Stokesova vztahu R H = kt 6πη D, (5) 0 kde k je Boltzmannova konstanta, T teplota a η 0 vskozta rozpouštědla. 2. Technka měření rozptylu světla Fotometr pro měření rozptylu světla (obr. 1) je prncpálně velm jednoduchý. Jeho hlavním součástm jsou zdroj monochromatckého světla (Z), atenuátor (A), kterým je možné regulovat ntenztu prmárního paprsku, snímanou referenčním detektorem (R), cylndrcká měrná cela (M), zpravdla termostatovaná, do níž se vkládá cylndrcká kyveta se vzorkem (V), a otáčvý gonometr (G), na němž je namontován detektor (D). Z A M V G R D Obr. 1. Zařízení pro měření rozptylu světla. Měření dynamckého rozptylu světla, t.j. autokorelačních funkcí ntenzty, využaduje použtí koherentního zdroje záření (=laseru) a snímání rozptylu z velm malého detekčního objemu. Sgnál z detektoru, t.j. nformace o regstrac jednotlvých fotonů, se přvádí do zvláštního zařízení, zvaného korelátor. Jde v podstatě o specalzovaný procesor, provádějící 16

17 výpočet autokorelační funkce. Dnes používané korelátory nepracují s konstantní, nýbrž s přblžně exponencálně narůstající šířkou kanálů, což umožňuje měření relaxačních časů v rozpětí mnoha řádů. Aby nedocházelo k rušení měření nežádoucím lomem rozptýleného záření na vnějších stěnách kyvety, je měrná cela naplněna tzv. zorefraktvní kapalnou, t. j. kapalnou o stejném nebo velm podobném ndexu lomu, jako má sklo. Této podmínce dobře vyhovují např. dekaln, xylen a toluen. Vzorky je před měřením třeba dokonale zbavt prachu, protože ntenzvní rozptyl z prachových částc přítomných v roztoku může měření zcela znehodnott. Naměřenou úhlovou závslost ntenzty rozptýleného světla je nutné korgovat na ozářený objem vzorku, z něhož je rozptyl snímán, protože tento objem závsí na rozptylovém úhlu (obr. 2): I θ ) I ( θ ) snθ, (6) ( D kde I D (θ) je poměr sgnálů na měřícím a referenčním detektoru naměřený pod úhlem θ. Obr. 2. Objemová korekce př měření rozptylu světla Přístroj frmy ALV, na němž bude měřena zadaná úloha, je vybaven helumneonovým laserem o výkonu 22 mw (vlnová délka 632,8 nm). Referenčním detektorem je fotododa, jako detektoru rozptýleného světla, jehož ntenzta je o ca. 6 řádů nžší než ntenzta prmárního záření, se používá velm ctlvé tzv. lavnové fotodody (APD, avalanche photodode), pracující v režmu počítání jednotlvých fotonů. Korelátor ALV 5000/EPP má 288 kanálů s šířkou od 125 ns do s. 3. Úloha: Zadání a postup Změřte hodnotu poměru I D (θ) pro částce polystyrenového latexu ve vodném roztoku o koncentrac 0,02 g l -1 v rozmezí po 5. Gyrační poloměr latexu lze určt z poměru směrnce a úseku na y-ové ose závslost I D (θ)snθ prot sn 2 (θ/2) (potřebný vztah s odvoďte z rovnc (1), (2) a (6)). Naměřený poměr I D (θ) obsahuje samozřejmě příspěvek rozptylu z rozpouštědla (vody), ten však lze v tomto případě vzhledem k ntenztě rozptylu na rozpuštěných latexových částcích bez obav zanedbat. Pro jednotlvé úhly změřte rovněž normalzovanou autokorelační funkc ntenzty g(τ,θ)/a (výstup z korelátoru je ve tvaru g(τ,θ)/a 1) a ověřte platnost vztahu (4), ev. vysvětlete zjštěné odchylky. S využtím vztahů (1), (4) a (5) vypočtěte hodnotu R H a porovnejte j s hodnotou S. (Jaký je poměr mez hydrodynamckým a gyračním poloměrem tuhé koule?) 17

18 Kaplární zónová elektroforéza: smulace a experment ZADÁNÍ ÚLOHY Navrhněte vhodný separační systém pro sadu analytů pomocí programu PeakMaster. Metodou kaplární zónové elektroforézy stanovte dsocační konstantu p-ntrofenolu. TEORETICKÝ ÚVOD Optmalzace separace Proces optmalzace spočívá v nalezení separačního systému, ve kterém jednotlvé složky vykazují dobré rozlšení, dostatečný sgnál detektoru a který umožňuje separac v co nejkratším čase. Rozlšení je určováno především rozdíly v aktuálních pohyblvostech separovaných látek, je však významně snžováno elektromgrační dsperzí. Ta je důsledkem nelneární povahy kaplární elektroforézy a způsobuje rozšřování píků (trojúhleníkovtý tvar píků). Tendence analyzované složky k elektromgrační dsperz je komplexní jev, který závsí na pohyblvostech, dsocačních konstantách a nábojových číslech daného analytu a složek základního elektrolytu a na složení základního elektrolytu. Mez další požadované charakterstky separace patří dostatečný sgnál detektoru. Optmalzace separace často probíhá metodou pokus-omyl. Jelkož emprcké vyhledávání vhodných separačních podmínek je časově materálně velm náročné, nabízí se velký prostor pro počítačové smulace. MATEMATICKÝ A POČÍTAČOVÝ MODEL PEAKMASTER 5 Program PeakMaster 5 představuje užtečný nástroj k vyhledávání optmálních podmínek pro separac. Program umožňuje předpovědět důležté parametry separačního systému a smuluje výsledek separace. Program dále počítá pohyblvost systémových píků; v případě, že se jejch pohyblvost blíží pohyblvost některého z analytů, dochází k tzv. rezonanc, která značně ztěžuje, ne-l znemožňuje analýzu daného analytu. Výsledek smulace může užvatel vzuálně vyhodnott a rozhodnout se, je-l daný systém vhodný. Je tedy možné vrtuálně měnt složení základního elektrolytu tak, abychom separac, ale detekc optmalzoval. Návrh metody pomocí programu PeakMaster 5 Zadejte složení základního elektrolytu (ndvduální složky mohou být zadány z ntegrované databáze) vz Obr. 1. Zadejte složení vzorku (jednotlvé analyty mohou být zadány z databáze). Vložte expermentální parametry (Run parameters) vz Obr.1. Stskněte tlačítko Calculate. Získáte charakterstky základního elektrolytu (především ph, ontovou sílu a pufrační kapactu), charakterstky analytů (hodnoty efektvních moblt, elektromgračních dsperzí a velčny úměrné odezvám UV a vodvostní detekce) a smulac elektroferogramu. Rozhodněte, zda je metoda vhodná pro separac daných analytů, případně pozměňte vstupní údaje a postup opakujte. Složení základního elektrolytu. Jednotlvé složky se mohou zadávat z ntegrované databáze pomocí tlačítka Add. Jednotlvé složky vzorku. 18

19 OBR. 1 Okno programu PeakMaster 5. Kaplární zónóvá elektroforéza Smulace elektroferogramu. Kaplární zónová elektroforéza (CZE capllary zone electrophoress) patří mez elektromgrační separační analytcké metody, jejchž separační prncp je založen na rozdílné mgrační rychlost elektrcky nabtých částc v elektrckém pol. Klíčovým pojmem všech těchto metod je pohyblvost μ ontu, defnovaná jako mgrační rychlost tohoto ontu v v elektrckém pol o jednotkové ntenztě v μ =, (1) E kde E je ntenzta elektrckého pole. Pro ntenztu elektrckého pole lze odvodt vztah U E =, (2) l C ve kterém U je vložené napětí a l C délka kapláry. Pohyblvost ontů se zvyšuje s hodnotou náboje daného ontu a klesá s jeho rostoucím hydrodynamckým poloměrem a vskoztou prostředí. Díky především coulombckým nterakcím ontů je též funkcí ontové síly. Maxmální tzv. lmtní hodnoty μ nabývá v nekonečně zředěném roztoku. Pohyblvost př konečné ontové síle se pak nazývá aktuální μ, μ. Pro látky tvořené více formam, mez + nmž dochází k rychlému ustavování rovnováhy (např. slabé elektrolyty, knetcky lablní komplexy) byla zavedena TZV. efektvní pohyblvost μ ef, která vysthuje pohyblvost dané látky jako celku a je defnována vztahem m μ μ ef = c z sgn, (3) = 1 c 19

20 kde c, z a μ ι označují koncentrac, relatvní náboj a aktuální pohyblvost -té ontové formy dané látky, jejíž celková látková (analytcká) koncentrace je c. Pro slabé jednosytné kyselny č zásady nabývá výraz pro efektvní pohyblvost jednoduchého tvaru μef = μ A α, (4) ve kterém α je stupeň dsocace. Efektvní pohyblvost slabých elektrolytů lze tedy snadno ovlvňovat prostřednctvím ph roztoku. Uspořádání expermentu je schematcky znázorněno na obr. 2. Separace probíhá v křemenné kapláře, jejíž konce jsou ponořeny do roztoku v elektrodových nádobkách. Celý tento systém je naplněn tzv. základním elektrolytem (BGE background electrolyte), což je vhodně zvolený pufr. Na elektrody se vkládá napětí z vysokonapěťového stejnosměrného zdroje. Detektor (zpravdla UV fotometr) je umístěn před tzv. výstupním koncem kapláry, OBR.2. SCHÉMA CZE APARATURY vzorek je dávkován opačným, tedy vstupním koncem kapláry. Po nadávkování vzorku a vložení elektrckého pole na daný systém dochází v kapláře ke dvěma základním transportním jevům. Jedním je jž zmíněná mgrace ontů (onty putují k opačně nabté elektrodě), přčemž na základě rozdílné rychlost mgrace se onty separují. Druhým jevem je elektroosmóza způsobující tok celého roztoku, tzv. elektroosmotcký tok (EOF electroosmotc flow). Křemenné kapláry obsahují povrchové slanolové skupny -SOH, které mohou být v roztoku dsocovány na SO - v závslost na ph prostředí. Na rozhraní stěna kapláry-roztok se pak vytváří elektrcká dvojvrstva, kdy negatvně nabtý povrch kapláry (nepohyblvý) je v roztoku kompenzován volně pohyblvým katonty. V roztoku tedy převládají kladně nabté onty a roztok jako celek je v elektrckém pol unášen směrem ke katodě. Rychlost elektroosmotckého toku závsí na ph a ontové síle roztoku. Se zvyšujícím se ph a klesající ontovou slou se rychlost elektroosmotckého toku zvyšuje. V křemenné kapláře př ph>2 je rychlost EOF větší než rychlost mgrace většny ontů. Jestlže katoda je u výstupního konce kapláry (uspořádání používané u této úlohy - vz obr.2.), lze v jednom expermentu analyzovat jak katonty, tak anonty. K detektoru nejprve doputují katonty s nejvyšší elektroforetckou pohyblvostí, následovány jsou katonty s nžší pohyblvostí. Všechny neutrální částce jsou unášeny k detektoru pouze elektroosmotckým tokem. Nelze je tedy separovat, ale využívá se jch jako tzv. značkovačů (markerů) k určení rychlost EOF. Nakonec jsou k detektoru dopraveny též anonty, přčemž jako poslední budou detekovány ty, jejchž elektroforetcká pohyblvost je nejvyšší. Určení pohyblvost z expermentálních dat Výstupem expermentu je elektroferogram, což je časový záznam sgnálu detektoru. Z elektroferogramu tedy získáme nformac o čase t, za který doputuje -tá složka od vstupního konce kapláry k detektoru, tedy urazí dráhu l D. Celkovou rychlost pohybu -té složky v tedy určíme jako ld v =. (5) t Celková rychlost složky nesoucí kladný náboj v,+ je dána součtem velkostí rychlost mgrace této složky v,+,mg a rychlost EOF v EOF, tedy 20

21 v, + = v, +,mg + veof. (6) Pro celkovou rychlost složky nesoucí záporný náboj pak platí analogcky v, = veof v,,mg. (7) Rychlost EOF určíme z času t EOF, za který doputuje k detektoru marker. Aktuální pohyblvost μ,+ a μ,- (respektve μ ef,+ a μ ef,- u slabých elektrolytů) vypočítáme ze vztahů v, +,mg l DlC = = 1 1 μ, + (8) E U t, + teof A v,,mg l DlC = = 1 1 μ,. (9) E U teof t,- Stanovení dsocační konstanty metodou CZE Dsocační konstanta slabé jednosytné kyselny HA je dána vztahem a + a - H3O A K A =, (10) aha ve kterém a značí aktvty. S využtím aproxmace, že aktvtní koefcent neutrálních částc je jedna, můžeme tento vztah upravt na tvar α α K A = a + γ resp. pk = ph log logγ H 3O A, (11) 1 α 1 α ve kterém α představuje stupeň dsocace, γ je aktvtní koefcent anontu A - a c analytckou koncentrací slabé kyselny. Zavedením smíšené rovnovážné konstanty K* vztahem K*=K/γ, záps rovnce zjednodušíme α p K * A = ph log. (12) 1 α Dosadíme-l stupeň dsocace ze vztahu (4), získáme následující rovnc μ μ μ A ef Rovnc (13) lze přepsat ve funkční závslost efektvní pohyblvost na ph μ A μ ef =. pk* ph ef p K * A = ph log. (13) Ke stanovení pk A dané slabé kyselny je tedy třeba proměřt závslost efektvní pohyblvost na ph základního elektrolytu. Rovnc (14) lze za předpokladu konstantní ontové síly základního elektrolytu použít k regres těchto expermentálních dat. Z parametrů * * regresní křvky získáme smíšenou dsocační konstantu K A resp. pk A a lmtní ontovou pohyblvost anontu kyselny př dané ontové síle. Smíšenou dsocační konstantu pak přepočítáme na pravou termodynamckou podle vztahu známého ze zkladního praktka. (14) Základní nformace o aparatuře Aglent CE Klíčové součást každé aparatury pro CZE jsou zřejmé z obr.2. Aglent CE obsahuje spektrofotometrcký UV-VIS detektor ( nm) s dodovým polem (DAD- dode array detector). Kaplára je umístěna v kazetě umožňující její temperování v šrokém rozsahu teplot. Jako elektrodové nádobky a nádobky na vzorky č méda k proplachování kapláry se 21

22 využívají polyethylenové nebo skleněné valky o obsahu cca 1 ml. Valky se vkládají do karuselu s očíslovaným pozcem. Dále aparatura obsahuje kompresor vzduchu k proplachování kapláry a tzv. hydrodynamckému dávkování vzorku (na hladnu kapalny ve vstupní valce se aplkuje nastavtelný tlak vzduchu). Nedílnou součástí aparatury je počítač s nanstalovaným programem Aglent Capllary Electrophoress (on lne) pro řízení aparatury, sběr a vyhodnocení dat. Experment provádí aparatura automatcky podle sledu příkazů zadaných v tzv. metodě. Pro tuto úlohu byla vytvořena metoda Praktk. Hlavní nformace, které metoda musí zahrnovat, jsou uvedeny v tabulce 1. Tabulka1. Parametry metody Obecný pops Hodnoty zvolené v metodě Praktk Pozce valek v karuselu obsahující BGE 8, 9 Teplota kazety s kaplárou 25 o C Vkládané napětí - polarta + -odpovídá obr.2. - hodnota 30 kv Dávkování vzorku - způsob hydrodynamcký - tlak resp. Δp 10 mbar - čas, po který je tlak aplkován 5 s Vlnové délky, př kterých má být zaznamenán 214 nm, 320 nm, 400 nm elektroferogram Proplachování kapláry před expermentem - pozce valek z do 1. krok krok čas, po který je aplkován tlak 940 mbar 1. krok 1 mn 2. krok 1 mn Čas, za který má být experment ukončen 15 mn Dalším nezbytným údaj, které však nejsou součástí metody, jsou údaje o konkrétním expermentu. Musí být zadaná pozce valky v karuselu, kde se nachází vzorek, a jméno souboru, do kterého budou uložena data z daného expermentu. Dále je vhodné zadat název vzorku a jméno operátora. Příkazy k proplachování kapláry, aplkac napětí, dávkování vzorku apod. lze zadávat jednotlvě. Slouží např. k promývání kapláry po skončení všech expermentů. Zadávání parametrů metody a údajů o expermentu, spouštění expermentů a provádění samostatných příkazů je přístupné z okna obrazovky Method and Run Control, které je znázorněno na obr.3. K prohlížení a dalšímu zpracování naměřených elektroferogramů slouží okno obrazovky Data Analyss. Ukázka tohoto okna je na obr

23 Volba okna Údaje o expermentu zadávají se do tabulky, která se otevře po klknutí na Schéma On lne okna zobrazují aktuálně sgnál detektoru, tzn. že zobrazují sgnál během jednotlvě zadávaných příkazů vz text. Obr. 3 Okno Method and Run Control programu Aglent Capllary Electrophoress (on lne). Obr. 4 Okno Data Analyss programu Aglent Capllary Electrophoress (on lne). 23

24 POSTUP PRÁCE Navrhněte vhodný separační systém pro sadu analytů pomocí programu PeakMaster 5. K demonstrac základních jevů uplatňujících se v CZE bude vám analyzovaný vzorek obsahovat kromě p-ntrofenolu a thomočovny jako značkovače EOF, dále ještě tyramn (4- (2-amnoethyl)fenol), který se v dané oblast ph chová jako slná zásada, a p- toluensulfonovou kyselnu, která patří mez slné kyselny. Tyramn není obsažen v ntegrované databáz, přdejte jeho charakterstky pomocí tlačítka Add (lmtní ontová moblta u(+1) je rovna 38, pka (+1) ční 9,5. Navrhněte složení základního elektrolytu tak, aby bylo ph blízko pk A p-ntrofenolu. Tak bude jeho efektvní moblta ovlvněna převážně ph základního elektrolytu a separační systém bude vhodný pro určení dsocační konstanty p-ntrofenolu. Rozhodněte, zda navržená metoda splňuje požadavky na optmalzovanou separac a zda je tato metoda vhodná pro určení dsocační konstanty p-ntrofenolu. Příprava základních elektrolytů Pro určení dsocační konstanty p-ntrofenolu je potřeba určt závslost efektvní pohyblvost p-ntrofenolu na ph základního elektrolytu v okolí této pk A, tzn. přpravt řadu pufrů, jejchž ph leží v okolí pk A p-ntrofenolu, ph se v nch mění přblžně ekvdstantně a všechny roztoky mají nízkou a přblžně stejnou ontovou sílu. Ze zásobních roztoků 0,01 M NaH 2 PO 4 a 0,01 M Na 2 HPO 4 přpravte do 25 ml odměrných baněk pět pufrů podle tabulky 2. Odměrné baňky doplňte deonzovanou vodou. Změřte ph těchto pufrů a naměřené hodnoty porovnejte s hodnotam vypočteným, které jsou uvedeny v Tabulce 2. Nevyhovující pufry přpravte znovu. Z každého pufru odppetujte vždy 600 μl do dvou valek. Tabulka 2. Spotřeby zásobních roztoků jednotlvých složek potřebných k přípravě 25 ml fosfátového pufru o daném ph a ontové síle I. Pufr č. V[ml] ph. I[mmol.dm -3 ] 0,01 M NaH 2 PO 4 0,01 M Na 2 HPO 4 1 4,00 1,30 6,64 3,16 2 2,80 1,65 6,90 3,10 3 1,90 2,00 7,15 3,16 4 1,20 2,25 7,40 3,18 5 0,75 2,50 7,65 3,30 Příprava vzorku K dspozc máte zásobní roztoky 0,005 M tyramnu, 0,0025 M thomočovny, 0,0025 M p-ntrofenolu a 0,0025 M kyselny m-xylen-4-sulfonové. Do 4 ml lahvčky přpravte vzorek smíšením těchto komponent v objemových poměrech 1:2:2:1 podle uvedeného pořadí. 300 μl této směs odppetujte do valky. Příprava aparatury k měření K promývání kapláry naplňte tř valky deonzovanou vodou a dále s přpravte dvě prázné valky. Jednu použjete na propláchnutí kapláry vzduchem, druhou jako odpadní př promývání kapláry. Valky umístěte do karuselu přístroje podle tabulky Val Table, kterou 24

25 naleznete v nabídce Instument v okně Method and Run Control. Jako první základní elektrolyt použjte pufr č.1. Kapláru propláchněte vodou - z každé valky vždy po dobu 2 mnut. Vlastní měření Proměřte elektroferogramy vzorku v přpravených pufrech. Nezapomeňte zadat parametry pro jednotlvé expermenty (vz obr. 3). Ukončení expermentální práce Kapláru propláchněte vodou - z každé valky vždy po dobu 2 mnut. Vyprázdněte odpadní valku. Vodu ve valkách vyměňte a proplachování zopakujte. Nakonec vysušte kapláru proudem vzduchu 1 mnutu proplachujte z prázdné valky. Použté nádobí pečlvě vymyjte deonzovanou vodou. Vyhodnocení expermentů Záznamy z expermentů vytskněte ve formě Report. Jednotlvé píky na elektroferogramech přřaďte příslušným látkám ze vzorku a přřazení zdůvodněte. K dentfkac zóny p-ntrofenolu využjte znalostí ze základního praktka. Vypočítejte pohyblvost elektroosmotckého toku (rychlost EOF vztažená na jednotkovou ntenztu elektrckého pole) a aktuální resp. efektvní pohyblvost separovaných látek. Hodnoty uspořádejte do tabulky a ty, u nchž to má smysl, statstcky zpracujte ( μ, σ n 1 ). Závslost efektvní moblty na ph proložte vlastní regresní funkcí dle rovnce (14). Pro určení parametru pk A zadejte nástřelovou hodnotu 7, pro parametr μ zvolte hodnotu A m 2 s -1 V -1. Stanovte pravou termodynamckou dsocační konstantu p-ntrofenolu. Určete dávkovaná látková množství sloučenn ve vzorku. Dále vypočítejte, kolkrát se vymění objem kapláry př proplachování po dobu jedné mnuty. Parametry použté kapláry nezbytné k výpočtům jsou uvedeny na kazetě. 25