Masarykova univerzita Lékařská fakulta

Transkript

1 Masarykova univerzita Lékařská fakulta Klinický význam vyšetření nádorových markerů, metody jejich stanovení Bakalářská práce v oboru zdravotní laborant Vedoucí diplomové práce: RNDr. Zdeněk Veškrna Autor: Hana Říhová Brno, duben 2012

2 Jméno a příjmení autora: Hana Říhová Název bakalářské práce: Klinický význam vyšetření nádorových markerů, metody jejich stanovení Pracoviště: Nemocnice Znojmo, Oddělení klinické biochemie Vedoucí bakalářské práce: RNDr. Zdeněk Veškrna Rok obhajoby bakalářské práce: 2012 Souhrn: Práce podává stručný a ucelený přehled o používaných nádorových markerech a jejich vlastnostech. Podrobně popisuje metodiku stanovení nádorových markerů na Oddělení klinické biochemie Nemocnice Znojmo včetně preanalytické fáze a ekonomiky vyšetření. V experimentální části ukazuje na příkladě pěti kazuistik praktické využití nádorových markerů při terapii různých nádorových onemocnění (karcinom prostaty, ovaria, prsu, tlustého střeva a zhoubný novotvar mediastina). Klíčová slova: nádorový marker, OKB, Nemocnice Znojmo, CA 15-3, CA 125, PSA

3 Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci vypracovala samostatně pod vedením RNDr. Zdeňka Veškrny a uvedla v seznamu literatury všechny použité literární a odborné zdroje. V Brně dne....

4 Děkuji svému školiteli RNDr.Zdeňkovi Veškrnovi za odborné vedení při psaní bakalářské práce, za cenné rady a připomínky. Zároveň děkuji Mgr. Miladě Nezvedové za pomoc při řešení problémů a celé své rodině za trpělivost a ochotu po celou dobu studia.

5 Obsah Úvod Obecná část Nádory Molekulární podstata vzniku nádorů Třídění nádorů Nádorové markery Rozdělení nádorových markerů Vlastnosti nádorového markeru Využití nádorových markerů Frekvence vyšetření nádorových markerů Interpretace a zdroje interference vyšetření nádorových markerů Nejčastěji používané nádorové markery Méně časté nádorové markery Potenciální nové nádorové markery Speciální část Cíl práce Metodika a přístrojové vybavení OKB Analyzátor Beckman Coulter UniCel DxI Analyzátor Roche Cobas e Analyzátor Siemens IMMULITE Informace o nádorových markerech Preanalytické požadavky Analytické parametry metod Ekonomika stanovení nádorových markerů Programy CRACTES a BIANTA Experimentální část...44 Závěr...56 Seznam literatury a použitých zdrojů...57

6 Použité symboly a zkratky BRCA.breast cancer CA..carbohydrate antigen CD..cluster designation CRP c-reaktivní protein ČSKB.Česká společnost klinické biochemie GIT.gastrointestinální trakt TM..tumor marker TNF tumor necrosis factor ZN...zhoubný novotvar

7 Úvod V posledních letech dochází k výraznému zvýšení výskytu zhoubných novotvarů, které patří hned po kardiovaskulárních nemocech k nejčastějším příčinám úmrtí ve všech civilizovaných zemích. Nejvyšší incidence byla zaznamenána u maligních nádorů tlustého střeva a konečníku, ledvin, plic, prostaty u mužů a prsu u žen. Cílem současné medicíny je co nejčasnější diagnóza, což znamená záchyt nádoru v jeho počátečním stádiu a bez generalizace. Zobrazovací metody mají schopnost postihnout nádor o hmotnosti asi 1 g a obsahu 10 9 buněk. Imunochemickými metodami lze prokázat nádor až tisíckrát menší. Sérové nádorové markery proto představují důležité parametry, které usnadňují sledování léčby a predikci vývoje onemocnění u onkologických pacientů. Racionální využití nádorových markerů předpokládá znalost správné indikace vyšetření, jejich významu v diagnostickém procesu, klinické senzitivity a specifičnosti, analytických možností, preanalytických faktorů i interferencí a znalost významu pro určení stadia maligního onemocnění. 7

8 1 Obecná část Nádorové onemocnění je různorodá skupina chorob, jejichž společným rysem je, že některá populace vlastních buněk organismu se vymkne kontrole a začne relativně autonomně růst. Za normálních okolností jsou buňky schopny mutaci detekovat a opravit nebo se seberozložit apoptózou. Bujení pak může být naprosto neškodné, ale také může v poměrně krátké době nemocného zahubit. Obvykle se považuje za projev zhoubnosti (malignity) to, že nádor roste infiltrativně do okolí, je schopen se rozsévat po těle a zakládat vzdálená ložiska, tzv. metastázy. Výjimku z tohoto pravidla představují maligní nádory mozku, které jen vzácně zakládají metastázy. 1.1 Nádory Nádor zpravidla původně vychází z mutací jedné buňky, ale proces nádorové transformace je vícestupňový, to znamená postupná kumulace několika mutací, tak že se postupně stává geneticky heterogenní. Průběh nádorového onemocnění lze shrnout do tří fází: iniciace nádorového zvratu buňky jedná se o ireverzibilní mutaci určitého kritického genu, promoce bývá dlouhá, někdy i desetiletí, mutované buňky musí být stimulovány dalšími faktory k výraznější proliferaci ( např. hormonální stimulace, fyzikální iritace, působení karcinogenní látky nebo onkogenní viry), progrese narůstá mutací genů stimulace růstu, kontrolních bodů buněčného cyklu, transkripčních faktorů; nádor prorůstá do okolí, metastazuje na vzdálená místa nebo prorůstá cévami. (Kopecká, 2006) Molekulární podstata vzniku nádorů Všechny nádory jsou důsledkem genetické poruchy, a to klíčových genů kontroly buněčného cyklu. Rozlišují se tři skupiny zasažených genů: protoonkogeny geny, jejichž normální funkcí je stimulace růstu a dělení buněk, mutovaný gen je zvýšeně aktivní, dělení je nekontrolované, tumor supresorové geny označované také jako antionkogeny, zpomalují nekontrolovaný růst i u buněk nádorově transformovaných, 8

9 DNA reparační geny geny, jejichž funkcí je oprava poškozené DNA, pokud jsou mutovány neopravená změna může být přenesena do dceřinných buněk. (Nečas, 2000) Genetická změna může vzniknout chybou replikace DNA a dělení buňky. Dále působením zevních faktorů (karcinogenů): biologických některé RNA a DNA viry nebo helminti, chemických působení organických látek, toxinů, těžkých kovů, fyzikální záření o vysoké energii, zejména ionizující záření, hormonální dlouhotrvající hormonální stimulace některých tkání může způsobit jejich přeměnu v nádor Třídění nádorů Nádory dělíme podle: a) biologických vlastností nádorů a to na: benigní (nezhoubné) nádory rostou pomalu, expanzivně, jsou ohraničené, bývají opouzdřené, netvoří metastázy, nádory jsou většinou chirurgicky odstranitelné, intermediární nádory představují rozhraní mezi benigními a maligními nádory, maligní nádory rostou rychle, invazivně, destruktivně, jsou neohraničené, tvoří metastázy, chirurgicky obtížně odstranitelné. b) původu to znamená podle histologického vzhledu nádorů: epiteliální, mezenchymální, neuroektodermové. (Mačák, 2004) 1.2 Nádorové markery Nádorové markery jsou definovány jako molekuly převážně proteinového charakteru, které jsou přítomny v organismu v důsledku vzniku a vývoje maligního procesu. Jejich výskyt ve tkáni zhoubného nádoru (celulární nádorové markery) a v tělních tekutinách (humorální nádorové markery) souvisí s růstem nádoru v organismu. Nádorové markery jsou produkovány samostatným nádorem (s nádorem asociované antigeny) nebo jinými tkáněmi jako odpověď na maligní proces v organismu (indukované nádorové markery). Přítomnost 9

10 nádorových markerů v tělních tekutinách je podmíněna přechodem těchto látek z místa syntézy do oběhu. Koncentrace nádorových markerů v séru má obvykle přímý vztah k typu a rozsahu onemocnění. (Šimíčková, 2004) Chemická struktura nádorových markerů je různorodá. Jedná se o glykoproteiny, cukerné determinanty glykoproteinů, sacharidy, glykolipidy, polypeptidy, imunoglobuliny a polyaminy (Králíková, 2003). Řada z nich má enzymovou aktivitu, s vyjímkou LD se zpravidla stanovují jako antigeny pomocí specifických protilátek většinou monoklonálních. (Zima, 2007) Rozdělení nádorových markerů Nádorové markery se mohou dělit do tří skupin, mezi kterými však neexistuje ostré rozhraní: Onkofetální antigeny molekuly, které organismus produkuje fyziologicky ve fetálním období vývoje a po narození je tvoří jen v souvislosti s onemocněním, zejména nádorovým. Příkladem mohou být karcinoembryonální antigen, α1- fetoprotein a lidský choriový gonadotropin. Tkáňové nebo orgánově specifické antigeny látky, které se normálně nacházejí ve zdravé tkáni nebo orgánu a mimo něj pronikají jen v minimálním množství. Teprve při nádorovém onemocnění, ale také v malé míře při zánětech nebo traumatizaci, se uvolňují. Jsou to například prostatický specifický antigen, neuron specifická enoláza, protein S-100b, tkáňový polypeptidový antigen, CYFRA 21-1, antigeny CA 15-3, CA 125, CA19-9, CA 72-4, antigen skvamózních buněk nebo thyreoglobulin. Nespecifické antigeny a nádorové markery mezi které patří ferritin, laktádehydrogenáza, thymidinkináza či β2- mikroglobulin.(zima, 2007) Vlastnosti nádorového markeru Pro nejlepší klinickou využitelnost by měl mít ideální nádorový marker stoprocentní specifitu (správnou negativitu) při co nejvyšší senzitivitě (správné pozitivitě, tj. správný záchyt nemocných). Vzhledem k širokému spektru nádorových onemocnění neexistuje univerzální nádorový marker a ani senzitivita při dostatečné specifičnosti nedosahuje ideálních 100%. Nezvýšená 10

11 koncentrace nádorového markeru tedy neznamená nepřítomnost maligního onemocnění, a naopak pozitivní výsledek nemusí znamenat zhoubný nádor. (Šimíčková, 2004) Senzitivita a specifita testu spolu souvisí a jejich poměr je závislý na hodnotě, která je považována za hraniční pro hodnocení testu, tzv. cut-off value. Senzitivitu lze zvýšit kombinací několika tumorových markerů, potom je ovšem nutné počítat s nižší specifičností a tím větším výskytem falešně pozitivních výsledků.(zima, 2007) Vztah senzitivity a specifity vyjadřuje ROC-křivka ( Receiver Operating Charakteristics). Obr.1 ROC-křivka pro CEA a CA 15-3 pacientek s diagnózou karcinomu mammae Koncentrace tumorového markeru je závislá na: rozsahu nádoru (staging), stupni zralosti nádorových buněk (grading), schopnosti produkce příslušného markeru, schopnosti vyplavení markeru do krve dáno stupněm prokrvení nádoru Využití nádorových markerů Screening Vzhledem ke své nedostatečné specifičnosti a relativně nízké citlivosti se tumorové markery nehodí k vyhledávání zhoubných nádorů u asymptomatických jedinců. Mohou být ovšem užitečné při vyšetřování symptomatických jedinců nebo u rizikových skupin lidí, kteří jsou ohroženi nádorovým onemocněním. Zavedení screeningu karcinomu prostaty pomocí PSA u mužů nad 50 let řeší dlouhodobě odborné společnosti a zdravotní pojišťovny, zatím bez dosažení stejného názoru. Dalším příkladem může být vyšetřování AFP u nemocných s jaterní cirhózou vzhledem k možnosti vzniku hepatocelulárního karcinomu nebo vyšetřování 11

12 kalcitoninu v rodinách s familiárním výskytem medulárního karcinomu štítné žlázy nebo stanovení nádorového markeru CA 15-3 v rodinách s mutacemi v genech BRCA1 a BRCA2 (ČSKB, 2008). Stanovení nového nádorového markeru HE4 v kombinaci s antigenem CA 125 může být významnou diagnostickou pomůckou pro včasné odhalení ovariálního karcinomu. Primární diagnostika Tumorové markery nejsou podobně jako screening vhodné pro primární diagnostiku nádorů. Při určování stádia nádoru jsou významné především vysoké hodnoty markeru, které obvykle znamenají pokročilé onemocnění. Staging a prognóza Je určení rozsahu nádoru. Vysoká hodnota nádorového markeru v séru může upozornit na špatně stanovené nižší stadium nemoci. Vysoké hodnoty nádorových markerů mohou ukazovat na pokročilé stádium onemocnění (ČSKB, 2008) Sledování průběhu nemoci a účinku terapie Sledování průběhu onemocnění a efektu terapie je hlavní doménou indikace nádorových markerů, kdy je nutné stanovit jejich hladinu před léčbou. Analýza hladin nádorových markerů bývá přínosná pro hodnocení remise nebo při podezření na reziduální nádor, někdy i měsíce před objevením klinických příznaků. Tab. 1 ukazuje nádorové markery vhodné k monitorování průběhu onemocnění či účinnosti terapie. Vzhledem k různým biologickým poločasům jednotlivých markerů (tab.2) je nutné volit vhodně intervaly odběrů krve k vyšetření tak, aby se skutečně postihla účinnost terapie a ne lysis-fenomén tzn. prudké přechodné zvýšení koncentrace markeru v séru v důsledku úspěšné terapie. (Šimíčková, 2004) 12

13 Tab. 1 Nádorové markery vhodné pro monitorování průběhu choroby a účinnosti terapie (ČSKB, 2008) Nádor - lokalizace Markery základní Markery doplňkové Žaludek CA 72-4, CEA Jícen - horní třetina SCC CYFRA 21-1 Jícen - dolní třetina CA 72-4, CEA Pankreas CA 19-9, CEA Játra CA 19-9, CEA Játra - cholangiocelulární CA 19-9 Játra - metastázy CEA Mléčná žláza CA 15-3, CEA TPA/TPS Ovarium - nemucinózní CA 125 TPA/TPS Ovarium - mucinózní CA 19-9, CA 72-4 CEA Ovarium - germinativní AFP, hcg Cervix - epidermoidní SCC CYFRA 21-1, CEA Cervix - adenokarcinomy CEA Corpus uteri CA 125 CEA Vulva SCC Ledviny TPA/TPS, CEA NSE Močový měchýř TPA/TPS CYFRA 21-1 Prostata PSA, fpsa Chromogranin A Testes - seminomy hcg, AFP NSE Testes - neseminomy hcg, AFP Karcinoid 5-hydroxy,3-indolyoctová kys.,nse Štítná žláza - medulární kalcitonin, CEA NSE Štítná žláza - anaplastické TPA/TPS Melanom NSE, S100 beta TK Plíce - SCLC CEA, NSE TPA/TPS Plíce - NSCLC CYFRA 21-1, CEA SCC Hlava, krk SCC CYFRA 21-1 CNS - neuroblastomy NSE CNS - gliomy CEA CNS - astrocytomy TK Leukemie TK, FER, LD Lymfom - hodgkinký B2M, FER, LD Lymfom - non-hodgkinký TK, B2M, LD Mnohočetný myelom B2M, paraproteiny 13

14 Tab. 2 Biologický poločas nádorových markerů v séru (ČSKB, 2008) Marker Dny Hodiny AFP 5 B2M 0,7 BHCG 1 CA CA CA CEA 14 CYFRA FER 2 fpsa 7 hcg 1 NSE 1 PSA 2 SCC 0,3 TG 2,5 TK 2 TPA Frekvence vyšetření nádorových markerů Pro frekvenci stanovení nádorových markerů platí kritéria doporučená WHO a podle zkušeností kliniků i statistiků, kteří hodnotí dynamiku změn nádorových markerů ve vztahu ke klinickému vývoji choroby je nutné dodržet doporučenou frekvenci vyšetření. Nejčastěji jsou navrhovány intervaly: 1 měsíc v prvním půl roce po primární terapii, 2 měsíce ve druhé polovině roku, v první polovině následujícího roku každé 3 měsíce, po roce a půl a v dalších letech 1x za 6 měsíců. Koncentrace nádorového markeru má být dále vyšetřena před nasazením léčby, po ukončení terapie obvykle týden podle biologického poločasu rozpadu nádorového markeru, dále při změně léčby a při nejasném průběhu nemoci.(čskb, 2008) 14

15 1.2.5 Interpretace a zdroje interference vyšetření nádorových markerů Pro správnou interpretaci změn v hladinách nádorových markerů, zejména při dlouhodobém sledování nemocných s nádorovými chorobami, je třeba vyloučit všechny faktory, které by mohly stanovní ovlivnit již v preanalytické fázi. Některé vyšetřovací zásahy mohou ovlivnit hladiny nádorových markerů, příkladem může být rektální vyšetření prostaty. Kontaminace vzorku při odběru může též znehodnotit stanovení např.stanovení SCC je citlivé na kontaminaci slinami či NSE, kde vadí hemolýza, proto je třeba oddělit sérum od krevních elementů do jedné hodiny po odběru. Zvýšené hladiny nalézáme také u nemaligních onemocnění, nebo při poruchách jejich vylučování při zhoršené funkci ledvin a jater. (Šimíčková, 2001) Příklady analytických interferencí: zkřížená reaktivita strukturálně podobných molekul jedná se o neoddělitelnou vlastnost imunologických metod, které nedocílí naprosté specifity protilátky vzhledem k zachycované molekule, hook-efekt způsobený vysokou koncentrací markeru jedná se o stav, kdy velmi vysoká koncentrace analytu překročí vazebnou schopnost pevné fáze, přenos analyzovaného markeru mezi jednotlivými vzorky, tzv. carry-over jde o jev daný nedokonalým očistěním pipetovacích systémů od stop předchozího vzorku o vysoké koncentraci, interference heterofilních a lidských anti-myších protilátek (HAMA) lidské heterofilní protilátky jsou endogenní imunoglobuliny, které reagují s myšími nebo králičími imunoglobuliny in vivo a také in vitro. Lidské anti-myší protilátky jsou imunoglobuliny, jenž specificky reagují s epitopy myších imunoglobulinů. Mechanismus interference heterofilů nebo lidských anti-myších protilátek spočívá buď v přemostění vazebného místa pro ligand, kdy se protilátka chová jako pozitivní interferent, v blokaci primární či sekundární protilátky, nebo v přednostním vychytání antigenu před jeho vazbou na primární protilátku navázanou na pevnou fázi. Heterofilní myší protilátky se mohou objevit v tělních tekutinách jako důsledek reakce organismu na myší bílkoviny, podané za účelem diagnostiky a terapie. (ČSKB, 2008) Podle doporučení Working Group on Tumor Marker Criteria bývají jako signifikantní posuzovány tyto změny nádorových markerů: bez terapie (v klinické remisi) výrazný nárůst koncentrace ve třech následujících odběrech i v hladinách v rozmezí cut-off značí recidivu nebo progresi onemocnění, 15

16 během terapie vzestup hladin o více než 25% značí progresi onemocnění, pokles o více než 50% značí parciální remisi (kompletní remise nemůže být hodnocena jenom pomocí změn v hladinách nádorových markerů) Nejčastěji používané nádorové markery Karcinoembryonální antigen, CEA CEA je onkofetální glykoprotein, který je za fyziologických podmínek produkován vyvíjejícím se embryem a v dospělosti je syntetizován epiteliálními buňkami střevní sliznice, žaludku a bronchů. Nachází se především ve tkáni karcinomů tlustého střeva, konečníku, plic, u medulárního thyroideálního karcinomu, mléčné žlázy, močového měchýře, ledvin, prostaty, testikulární teratomy, nádorů ženských pohlavních orgánů, endometriální nádory a nádory děložního těla. Zvýšené hladiny nacházíme u benigních onemocnění jako jsou cirhóza jater, Crohnova choroba, střevní polypy, onemocnění plic, ledvin, žlučníku, pankreatitida, benigní onemocnění prsu, dále u alkoholiků a kuřáků. Hodnota cut-off je kolem 5,0 µg/l. Pro screening i diagnostiku maligního onemocnění nelze CEA použít. Je vhodný pro potvrzení stádia choroby a rozhodnutí o průběhu terapie. K základním využití CEA patří monitorování průběhu onemocnění. Hodnoty vyšší než 10 µg/l znamenají obvykle progresi maligního procesu, hodnoty vyšší než 50 µg/l svědčí o jaterních nebo kostních matastázách. Senzitivita a specifita stanovení kolísá podle typu nádoru a stádia onemocnění. Pro nádory zažívacího traktu se senzitivita pohybuje při návratu onemocnění pro kolorektální karcinom kolem 60 %, pro nádory žaludku asi 50 %. Pokles hodnot CEA po chirurgickém zákroku může poskytnout údaj o úspěšnosti terapie.(čskb 2008, Šimíčková, 2004) Alfa 1 -fetoprotein, AFP Alfa 1 fetoprotein je glykoprotein velikosti albuminu, produkovaný buňkami žloutkového vaku (od 10. dne po oplodnění do 10. týdnu gravidity) a později fetálními játry plodu, s minimální koncentrací v krvi dospělých. AFP v séru matky, kam přechází přes placentu, je důležitým ukazatelem fyziologického průběhu těhotenství. Významná je jeho role trasportní (vazba steroidů, některých těžkých kovů, bilirubinu, mastných kyselin, antibiotik, drog apod.). Hodnota cut off je 10 µg/l. 16

17 Zvýšené koncentrace AFP nacházíme u primárních maligních nádorů jater, u germinativních ovariálních a testikulárních nádorů. Zvýšené hladiny s nemaligními příčinami bývají akutní virová i chronická hepatitida, cirhóza jater, těhotenství. Použití pro klinické účely má screening maligního onemocnění pouze u symptomatických nemocných s jaterní cirhózou nebo u nemocných s podezřením na germinativní nádor varlat. K základním využitím AFP patří monitorování průběhu onemocnění. Pro hepatocelulární karcinom je AFP markerem první volby senzitivita u neléčeného onemocnění je až 80 %. (ČSKB 2008, Šimíčková, 2004). Antigen CA 15-3 CA 15-3 je glykoproteinový antigen polymorfního epiteliálního mucinu (PEM), nazývaný též MUC1. V dospělosti je syntetizován epiteliálních buňkách vývodů mléčné žlázy. Hodnota cut-off je 35 ku/l. Koncentrace CA 15-3 je výrazně zvýšena u maligního procesu v prsu. Dále je zvýšena u benigního onemocnění prsu, u poškození jater a ledvin, u zánětů plic, revmatického onemocnění a fyziologicky v těhotenství. Stanovení CA 15-3 se využívá především k posouzení úspěšnosti léčby a včasného záchytu recidivy karcinomu prsu (ČSKB 2008, Šimíčková, 2001) Antigen CA 19-9 Antigen CA 19-9, nazývaný též GICA (gastrointestinal cancer antigen) se vyskytuje jako glykolipid ve tkáni nebo mucin v séru, obsahuje determinanty krevní skupiny Lewis 5 10% populace tento antigen netvoří. Hodnota cut-off je kolem 40 ku/l. Zvýšené koncentrace CA 19-9 se nacházejí u karcinomu pankreatu, jater a ovárií. Benigní a zánětlivá onemocnění žaludku, střeva, pankreatu a jater též zvyšují hladiny. Pro screening a stanovení diagnózy maligního onemocnění není vhodný i přes vysokou senzitivitu pro nádory pankreatu. Pro monitorování průběhu onemocnění je CA 19-9 markerem první volby pro karcinom pankreatu, kde se klinická specifita a senzitivita pohybují v rozmezí 70 90%. Vysokou senzitivitu dosahuje tento marker i podle závažnosti onemocnění u karcinomů kolorekta (18-58%), u cholangiocelulárních karcinomů, u nádorů 17

18 žlučových cest a žaludku. Koncentrace CA 19-9 dobře korelují s účinností terapie. (ČSKB 2008, Šimíčková, 2004) Antigen CA 125 Antigen CA 125 je glykoprotein poprvé prokázaný na povrchu buněk ovariálního karcinomu. Fyziologicky se vyskytuje v epiteliální výstelce ženského genitálního traktu, v parietálních a mezoteliálních buňkách peritonea, pleury a perikardu. Hodnota cut-off je 35 ku/l. Zvýšené koncentrace CA 125 se nacházejí u karcinomů ovárií, dělohy, pankreatu, plic, mléčné žlázy a žlučových cest. Zvýšené hladiny způsobené nemaligním onemocněním zahrnují chronická onemocnění jater, peritonitidu, leiomyom, selhání ledvin, benigní onemocnění ovárií a endometria. Pro screening je CA 125 vhodný pouze u pacientek v případě rodinné predispozice ke karcinomu ovárií. Je vhodný pro potvrzení stadia choroba, nárust koncentrace může předcházet klinickou diagnózu o 1 8 měsíců. Pro monitorování průběhu onemocnění je CA 125 markerem první volby pro karcinom ovárií. Výhodou CA 125 je dobrá korelace s velikostí nádoru, zvláště v případě serózních nádorů. Klinická senzitivita je 81 98%. (ČSKB 2008, Šimíčková, 2004) Antigen CA 72-4 CA 72-4 je antigen glykoproteinového typu. Za fyziologického stavu jej produkuje vyvíjející se plod epiteliálními buňkami žaludku, jícnu a pankreatu. Hodnota cut-off je 7,0 ku/l. Zvýšené koncentrace jsou typické pro karcinom žaludku, pankreatu, žlučových cest a tlustého střeva. Příčiny zvýšení u benigních chorob zahrnují jaterní cirhózu, akutní pankreatitidu, chronickou bronchitidu, vředovou chorobu žaludku a zánětlivá onemocnění GIT. Pro screening a stanovení diagnózy se CA 72-4 neužívá. Je vhodný pro monitorování maligních nádorů u karcinomu žaludku, dolní třetiny jícnu, tlustého střeva, pankreatu a mucinového typu ovariálního karcinomu. (ČSKB 2008, Šimíčková, 2004) 18

19 CYFRA 21-1 CYFRA 21-1 je rozpustný fragment cytokeratinu 19, bílkoviny nacházející se ve všech buňkách. Hodnota cut-off je kolem 3,3 µg/l. Zvýšené koncentrace jsou charakteristické pro nemocné s karcinomy plic, močového měchýře, děložního čípku, nádorů hlavy a krku. Z benigních onemocnění je nutné zvažovat falešně pozitivní hodnoty u pacientů s cirhózou jater, s chronickým selháním ledvin, astma a infekce respiračního traktu. Pro screening a stanovení diagnózy maligního procesu se CYFRA 21-1 nepoužívá. Hlavním využitím markeru je monitorování průběhu onemocnění a úspěšnosti terapie u epidermoidních karcinomů plic, význam má též sledování nemocných s karcinomem močového měchýře epidermoidních nádorů cervixu a nádorů oblasti hlavy a krku. (ČSKB 2008, Šimíčková, 2004) Lidský choriový gonadotropin, hcg hcg je glykoprotein hormonální povahy, vznikající v trofoblastických buňkách placenty, tvořený dvěma rozdílnými podjednotkami α a β. Jeho funkcí je tlumit v průběhu těhotenství T lymfocyty a tím podporovat imunotoleranci matky vůči plodu. Podobnou funkci má i v nádorových buňkách tlumí imunitní reakce organismu vůči nádorovým buňkám. Stanovení hcg, zvláště její podjednotky β (specifická pro molekulu hcg, α podjednotka hcg je společná pro všechny glandotropní hormony hypofýzy), má význam i diagnostický vysoké hodnoty se nacházejí u mola hydatidosa a při jejím přechodu v choriokarcinom neustále stoupají, v tomto případě je senzitivita až 100 %. Vysoké koncentrace této podjednotky se nachází i u germinativních nádorů varlat a ovária. Hodnota cut-off je 5 ku/l. Zvýšené koncentrace hcg jsou nacházeny při fyziologickém i patologickém těhotenství, u žen s myomy a ovariálními cystami. Screening maligního procesu pomocí hcg v séru lze provádět u symptomatických osob to je u osob s podezřením na germinativní nádory varlat ( nesestouplé varle, nádor testes u sourozence). Koncentrace hcg má význam pro zhodnocení stadia onemocnění, pro potvrzení histologické charakterizace nádorů testes a choriokarcinomů a pro jejich monitorování. (ČSKB 2008, Šimíčková, 2004) 19

20 Tkáňový polypeptidový antigen, TPA, TPS TPA - tkáňový polypeptidový antigen, TPS - tkáňový polypeptidový specifický antigen. TPA je polypeptid ze solubilních fragmentů cytokeratinů typu středních filament (cytokeratin 8, 18 a 19). TPS je antigen s velice podobnou charakteristikou definovaný na podkladě reaktivity s jinou monoklonální protilátkou (odpovídající cytokeratinu 18). Hodnota cut-off je kolem 140 U/l. Tyto antigeny jsou spíš ukazatelem buněčné proliferace než specifickým markerem určitého nádoru. Jeho zvýšení bylo pozorováno u řady rychle rostoucích zhoubných nádorů jako je karcinom prsu, bronchiálního, kolorektálního, močového měchýře, ovaria, děložního čípku. Není tedy příliš specifický, jeho předností je vyšší citlivost, kdy v případě účinné terapie jeho koncentrace v krvi rychle klesá. Jeho zvýšené hladiny byli prokázány také u nemaligních onemocnění jako jsou zánětlivá onemocnění plic, jater a urogenitálního ústrojí. Pro screening, stanovení diagnózy a odhadnutí závažnosti onemocnění se nepoužívají. Pro monitorování je sérový TPA/TPS marker vhodný pro dlouhodobé sledování nemocných s nádory plic, prsu, močového měchýře. (ČSKB 2008, Šimíčková, 2004) Prostatický specifický antigen PSA, fpsa PSA - prostatický specifický antigen, fpsa volná frakce PSA. PSA je serinová proteáza produkovaná buňkami prostaty, umožňující zkapalnění seminální tekutiny, čímž usnadňuje pohyb spermiím. Jeho určité množství lze prokázat i v séru, z toho větší část je vázána na α 2 makroglobulin a α 1 - antichymotrypsin a malá část je ve volné formě. Hodnoty cut off se mění v závislosti na věku: do 50 let = 2,5 µg/l, do 60 let = 3,5 µg/l, do 70 let = 6,5 µg/l. Frakce fpsa/psa bývá u maligních nádorů 0 15 %, hraniční hodnoty jsou %, u benigního onemocnění nad 20 %. Zvýšení koncentrace se nachází u karcinomu prostaty, ale může být způsobeno i její hyperplazií benigního původu nebo při palpaci prostaty při vyšetření per rectum, katetrizaci močového měchýře či jiném mechanickém dráždění prostaty. 20

21 Význam screeningu karcinomu prostaty pomocí sérového PSA u asymptomatických mužů jedenkrát ročně od 50 let není zatím definitivně uzavřeno. Sreening je výhodné provádět u starších mužů se symptomy poruch močového traktu nebo u mužů s rodinnou zátěží. Pro stanovení diagnózy má význam stanovení poměru volného a vázaného PSA pro odlišení benigní hyperplasie prostaty od karcinomu. Koncentrace PSA nad 30 µg/l mohou ukazovat na vzdálenější metastázy. PSA se používá při monitorování pacientů v remisi, při léčbě radioterapií nebo hormonoterapií. (ČSKB 2008, Šimíčková, 2004) Thymidinkináza, TK Thymidinkináza je enzym katalyzující fosforylaci thymidinu v přítomnosti adenosintrifosfátu na thymidinmonofosfát, jde o vedlejší cestu syntézy DNA, která nevyžaduje vitamín B 12. Aktivita tohoto enzymu odráží míru buněčné proliferace. Za fyziologických podmínek je syntetizována v játrech vyvíjejícího se plodu. Hodnota cut-off je 9 U/l. (ČSKB 2008, Šimíčková, 2004) Zvýšení hladin TK provází řadu zhoubných onemocnění karcinom prsu, plic, kolorektální, lymfomy, leukémie, mnohočetný myelom, ale i některá virová onemocnění - herpes viry, HIV, zánětlivá onemocnění plic a psoriázu. Normální cesta syntézy DNA bývá blokována cytostatiky, proto je nutné stanovit hladinu TK před zahájením léčby, aby výsledky nebyly falešně pozitivní po nastartování vedlejší cesty syntézy DNA. (Racek a kol., 1999) Pro screening a stanovení diagnózy se TK obvykle neužívá. Hlavní oblast využití markeru je pro monitorování průběhu onemocnění úspěšnosti terapie. Neuron specifická enoláza, NSE Neuron-specifická enoláza je izoenzym specifický pro nervovou tkáň. Fyziologicky je NSE produkována v nervové i plicní tkáni plodu, v dospělosti je syntetizována ve tkáních neuroendokrinního původu. Hodnota cut-off je 15µg/l. Zvýšená aktivita NSE se nachází u mozkových tumorů a maligních nádorů neuroektodermálního původu jako je malobuněčný karcinom plic, karcinoid, feochromocytom. Může být pozorována též u nemaligních plicních a jaterních onemocnění. Vzhledem k obsahu NSE v erytrocytech a trombocytech je nutné provést separaci krevních elementů do jedné hodiny po odběru. Pro screening a stanovení diagnózy není NSE vhodná. Monitorování průběhu onemocnění má význam především pro pacienty s neuroblastomy, 21

22 malobuněčným karcinomem, meduloblastomem, retinoblastomem, s nádorem ledvin. (ČSKB 2008, Šimíčková, 2004) Antigen skvamózních buněk, SCC Antigen skvamózních buněk je glykoprotein, patřící mezi serin-proteinasové inhibitory. Je definován jako složka směsného antigenu TA-4, prokázaném v séru žen s karcinomem děložního čípku. Byly identifikovány dva homologní proteiny SCC1 a SCC2, které byly charakterizovány jako serin proteinázové inhibitory serpiny. Marker je velmi citlivý na kontaminaci slinami nebo potem v preanalytické fázi. Hodnota cut-off je 1,5 µg/l. Zvýšené hladiny jsou u karcinomu děložního čípku, u dalších gynekologických nádorů, u epidermoidního karcinomu plic a nádorů hlavy a krku. Zvýšená exprese byla prokázána u benigních gynekologických, plicních a jaterních onemocnění. Pro screening a stanovení diagnózy se neužívá. Monitorování průběhu onemocnění se provádí u pacientů s nádory orofaciální oblasti, děložního čípku, těla dělohy, endometria, vulvy, vaginy a epidermoidních nádorů plic. (ČSKB 2008, Šimíčková, 2004) ß 2 mikroglobulin, B2M B2M je glykoprotein s poměrně nízkou molekulovou hmotností a proto prochází glomerulárním filtrem. B2M tvoří lehký řetězec lidského leukocytárního antigenu HLA I.třídy a to extracelulární doménu. Je přítomen téměř ve všech buňkách kromě erytrocytů a trofoblastických buněk. Odbouráván a vylučován je převážně ledvinami. Hodnota cut-off je 2,4 mg/l. Jeho nejvyšší koncentrace se nachází u nádorů odvozených od lymfocytů a plazmocytů. Při stanovení vyšší hladiny tohoto mikroproteinu je ovšem nutné zvážit, zda pacient netrpí poruchou glomerulární filtrace, kdy nedochází k filtraci Β 2 M glomerulem do moči. Nespecifické zvýšení lze pozorovat u pacientů s chronickými zánětlivými a autoimunními onemocněními. Pro screening a diagnostiku maligního onemocnění nelze stanovení použít. Je velice vhodný při sledování účinku léčby a u mnohočetného myelomu má i význam prognostický, kdy pacienti se zvýšenou koncentrací tohoto markeru mají nekolikanásobně kratší dobu přežití než nemocní s normální hladinou této bílkoviny. (ČSKB 2008, Šimíčková, 2004) 22

23 Ferritin, FER Ferritin je vysokomolekulární bílkovina fungující jako zásobárna železa v organismu. Za fyziologických podmínek je ferritin produkován retikuloendoteliálními buňkami sleziny, jater a kostní dřeně. Fyziologická hladina v séru je ovlivněna koncentrací železa v organismu. Hodnota cut-off pro premenopauzální ženy je 150 µg/l, pro muže a postmenopauzální ženy je hodnota 400 µg/l. Molekulu ferritinu s kyselejším charakterem produkují buňky některých nádorových onemocnění jako jsou akutní myeloblastické leukemie, Hodgkinův lymfogranulom a mnohočetný myelom. Zvýšení sérových hladin můžeme pozorovat u zánětlivých onemocnění, hematochromatóz, sideróz a po krevních transfuzích. Snížení hladiny může indikovat anémii z nedostatku železa. Pro screening a stanovení diagnózy se neužívá. U hematologických malignit koreluje se závažností onemocnění. Hlavní oblastí využití tohoto markeru je monitorování průběhu onemocnění a monitorování terapie. (ČSKB 2008, Šimíčková, 2004) Laktátdehydrogenáza, LD Laktátdehydrogenáza je enzym tvořený dvěma polypeptidovými řetězci, které formují 5 izoenzymů. Hodnota cut-off je horní mez referenčního intervalu laboratoře. Na zvýšení hladiny LD u maligních onemocnění se podílí zejména izoenzym LD-1 a LD- 2. LD-1 je často nalézána u testikulárních nádorů, u kterých představuje nezávislý prognostický faktor. U non-hodgkinského lymfomu je stanovení hladiny LD součástí mezinárodního prognostického indexu (IPI). LD je tedy vhodným doplňkovým markerem pro monitorování pacientů s diferencovanými lymfocytárními i histiocytárními typy non-hodgkinských lymfomů, leukémií a solidních nádorů. (ČSKB 2008) 23

24 Alkalická fosfatáza, ALP Alkalická fosfatáza je enzym katalyzující hydrolýzu různých monoesterů kyseliny fosforečné v alkalickém prostředí. Rozlišují se tři izoenzymy placentární, střevní a izoenzym obsažený v kostech, játrech a ledvinách. Hladina kostního izoenzymu je zvýšená u osteosarkomu a osteoplastických metastáz do kostí, jaterní izoenzym je zvýšen u metastatického postižení jater, ale také u nenádorových hepatopatií. (Racek, 1999) Tyreoglobulin, TG TG je glykoprotein obsahující jód a 10% sacharidů. Je tvořen dvěma identickými podjednotkami. Za účinku TSH je jodován do stupně trijódtyroninu (T3) a tyroxinu (T4). Hodnota cut-off je v závislosti na použité metodě kolem 33 µg/l. Zvýšené hladiny jsou u maligních onemocnění štítné žlázy, u Graves-Basedowovy choroby, eufunkční nodózní strumy a zánětů štítné žlázy. Pro screening a diagnostiku se vyšetření neužívá. Vhodný je pro monitorování pacientů s dobře diferencovaným karcinomem štítné žlázy po operaci a léčbě radioaktivním jodem. Při stanovení TG je důležité zjistit přítomnost autoprotilátek proti TG, které mohou způsobit falešně negativní výsledky. (ČSKB 2008, Šimíčková, 2004) Kalcitonin Kalcitonin je polypeptid, za normálních okolností je kalcitonin produkován parafolikulárními buňkami (C buňky) štítné žlázy. Stimulem pro sekreci je hyperkalcémie. Hodota cut-off je 19 ng/l. Zvýšené hladiny kalcitoninu se nacházejí u medulárních nádorů štítné žlázy. (ČSKB 2008, Šimíčková, 2004) Monoklonální imunoglobuliny Monoklonální imunoglobuliny jsou abnormální imunoglobuliny paraproteiny, produkovány jedním klonem B-lymfocytů, resp. plazmocytů. Volné lehké řetězce přecházejí glomerulární filtrací do moče jako tzv. Bence Jonesova bílkovina. 24

25 Screening a kvantifikace monoklonálních imunoglobulinů se provádí pomocí elektroforézy sérových bílkovin. Nově zachycený paraprotein se určuje pomocí imunofixace, kde se identifikuje těžký řetězec (IgG, IgA, IgM, případně IgD, IgE) a lehký řetězec (kappa nebo lamda). Kvantifikaci paraproteinu a jeho typ laboratoř poskytuje spolu se slovní interpretací nálezu. Za výrazné snížení nebo zvýšení hladiny monoklonálního proteinu se považuje změna o více než 10 g/l. Monoklonální imunoglobuliny v séru nebo v moči se vyskytují u mnohočetného myelomu, Waldensrtrömovy makroglobulinémie, lymfomů, chronické lymfocytární leukémie, amyloidózy, maligních tumorů, lymfotropní virózy a MGUS ( monoclonal gammapathy of undermined significance) zahrnující nejasný výskyt či preneoplastický výskyt paraproteinů. Stanovení monoklonálních imunoglobulinů v séru a moči je vhodné pro monitorování odpovědi na léčbu u myelomu nebo plazmocytomu. (ČSKB 2008) Protein S-100b Protein S-100b je kalcium, zinek a měď vázající protein cytosolu, který se vyskytuje ve formě homo- či heterodimeru z podjednotek α a β. Fyziologicky se nalézá v nervové tkáni. Hodnota cut-off je kolem 0,2 µg/l. Zvýšené hladiny nacházíme u maligního melanomu, u mozkového infarktu, úrazu, po srdeční zástavě, operaci, mnohočetné sklerózy, Creutzfeld-Jacobs choroby, neurodegenerativních chorob a také u akutních psychotických stavů. Protein S-100b je vhodným parametrem při monitorování pacientů s maligním melanomem. (ČSKB 2008, Šimíčková, 2004) Lidský epididymální protein 4, HE 4 HE4 patří do rodiny proteinů označovaných jako whey acidic four-disulfide core (WFDC) s vlastnostmi podobnými inhibitoru trypsinu. Jeho fyziologické funkce nejsou zatím objasněné, má zřejmě antimikrobiální a protizánětlivé účinky. HE4 byl poprvé detekován v epitelu distálního nadvarlete. Vykazuje nízkou expresi respiračních a reprodukčních tkání, ale vykazuje vysokou expresi ve tkáni ovariálního nádoru. Vysoké hladiny HE4 se nacházejí u pacientek s karcinomem ovárií. Jako jediný nádorový marker má HE4 nejvyšší senzitivitu pro detekci epiteliálního karcinomu ovárií (EOC), zejména v 1.stádiu stádiu onemocnění, v raném nesymptomatickém stádiu. Stanovení hladiny 25

26 HE4 je významnou diagnostickou pomůckou i pro včasné odhalení opětovného výskytu ovariálního karcinomu u léčených pacientek. Kombinace stanovení HE4 a CA 125 může přispět ke zjištění, zda je nádor v malé pánvi benigní nebo maligní u žen před a po menopauze. (Bálková,2012) Méně časté nádorové markery Antigen CA 549 Antigen CA 549 je vysokomolekulární glykoprotein (mucin) obalující mléčné tukové partikule. Je prokazatelný na membránách epiteliálních buněk. Hodnota cut-off je 12 ku/l. Může být zvýšen u karcinomu mléčné žlázy, endometria, ovaria, plic a tlustého střeva. Antigen CA 549 není vhodný pro screening. Je užívaný při monitorování nemocných s nádorem prsu. Jeho hladina koreluje s hladinou CA 15-3.(Šimíčková, 2001) Mucin-like cancer associated antigen, MCA MCA je glykoprotin s vysokým obsahem kyseliny sialové. Fyziologicky je tvořen během těhotenství, u zdravých žen v epiteliálních buňkách mléčné žlázy a distálních tubulech ledvin. Hodnota cut-off je 15 ku/l. Zvýšené hladiny nacházíme u všech typů nádoru prsu, ovárií, enometria, kolorekta, pankreatu, prostaty, ledvin, plic a urologických nádorů. MCA je vhodný k monitorování léčby karcinomu prsu. (Šimíčková, 2001) Antigen CA 50 CA 50 je sialinizovaný laktotetraosaceramidový antigen, který je tvořený i u osob Lewis negativních. Hodnota cut-off je 25 ku/l. Jeho vyšetření má význam pro nemocné s nádorem pankreatu, dalších nádorů GIT, nádorů těla a hrdla děložního. (Šimíčková, 2001) 26

27 Antigen CA 195 CA 195 je hetrogenní glykoprotein. Hodnota cut-off je 10 ku/l. Ve zvýšených koncentrací je prokazatelný u nádorů GIT. Je vhodný pro monitorování nemocných s nádory kolorekta, pankreatu a jater. (Šimíčková, 2001) Antigen CA 242 CA 242 je nádorový marker se specifitou pro GIT. Hodnota cut-off je kolem 20 ku/l. Jeho využití je při monitorování léčby zvláště karcinomu pankreatu a kolorektálního.(kopáč, 2004) Chromogranin A, CgA Chromogranin A je ve vodě rozpustný kyselý glykoprotein. Je obsažen v sekrečních granulích endokrinních a neuroendokrinních buněk. Hodnota cut-off je 18 U/l. Jeho hladina odráží masu nádoru i jeho biologickou aktivitu. Má význam při sledování nemocných s neuroendokrinními nádory. (Šimíčková, 2001) Prostatický specifický antigen izoformy, [-2]proPSA Sérový prostatický specifický antigen PSA existuje buď ve volné formě fpsa nebo v komplexní formě cpsa. Bylo zjištěno, že %fpsa (poměr fpsa/psa) v séru zlepšuje rozlišení karcinomu prostaty od benigní hyperplazie prostaty. Vyšší %fpsa v séru koreluje s nižším rizikem karcinomu prostaty, hodnoty fpsa pod 10% s vyšším rizikem karcinomu. ProPSA a BPSA jsou rozdílné formy fpsa prokazující lepší korelaci s onemocněním než PSA a fpsa. Zkrácené formy propsa jsou zvýšené v periferní zóně tkáně karcinomu v porovnání s tkáněmi benigní hyperplasie prostaty. ProPSA v nativní formě obsahuje 7 aminokyselin pro vedoucí peptid ([-7proPSA]) společně se zkrácenými formami, které obsahují menší počet aminokyselin ([-5,-4,-2]pro PSA). V extraktech z tumorů byla nalezena primární forma [-2]proPSA, ze zjištěných forem propsa je nejstabilnější. Při studiích bylo prokázáno, že [-2]proPSA zlepšovalo specifitu detekce karcinomu vůči %fpsa. 27

28 Prekurzorní formy PSA nastupují jako důležité diagnostické sérové markery pro rozšíření a zlepšení detekce karcinomu prostaty.(lapišová, 2010) Potenciální nové nádorové markery V budoucnu by se novými nádorovými markery mohly stát látky, které mají význam v dějích důležitých pro přežití buněk, jejich dělení, diferenciaci a metastázování regulace buněčného cyklu, apoptóza, signální trasdukce, adheze a angiogeneze. Řadu markerů lze detekovat v cirkulaci a jejich měření by mohlo umožnit efektivní léčbu. Markery spojené se signální transdukcí c-erb B-2 (HER-2/neu) protoonkogen na chromosomu 17, zvýšené hladiny jsou u karcinomu prsu, C-myc onkoproteiny, EGF epidermální růstový faktor, zvýšená exprese je typická pro řadu malignit, IGF-1, IFG-IR, interleukiny, Ras protein, TGF-β, TNF α. Markery spojené s regulací buněčného cyklu cykliny, inhibitory cyklin-dependentních kináz. Markery spojené s apoptózou Bcl-2 protein, sfas, sfasl, protein produkt mutovaného genu p53 a protilátky proti proteinu p53. Markery spojené s angiogenezí Angiogeneze novotvorba cév, je předpokladem pro růst nádoru a jeho metastázování. Některé faktory působí stimulačně a jiné inhibičně: 28

29 angiostatin, angiogenin, bfgf, CD 105, endostatin, trombospodin, VEGF vaskulární endoteliální růstový faktor. Markery spojené a adhezí Buněčné adhezní molekuly jsou potřebné pro progresi nádoru a metastazování. E-cadherin, CD44, E-selektin, ICAM -1 - intercelulární adhezní molekula, VCAM -1 vaskulární buněčná adhezní molekuly. Markery spojené se specifickými vlastnostmi nádorových buněk vztah k zánětu CRP, souvislost s nekrózou nádorových buněk, matrixové metalloprotinázy, cyklooxygenáza 2. Výše uvedené nové markery by mohly mít v budoucnu význam pro cílenou terapii, včasnou detekci a monitorování léčby. (Zima, 2007) 29

30 2 Speciální část 2.1 Cíl práce Cílem této práce je: 1) popsat používané markery na OKB Nemocnice Znojmo, metody jejich stanovení včetně analytických parametrů, preanalytické požadavky a ekonomické náklady 2) ukázat na základě několika kazuistik význam a použití nádorových markerů při léčbě pacientů s nádorovým onemocněním 30

31 2.2 Metodika a přístrojové vybavení OKB Nádorové markery by se měly stanovovat v akreditovaných laboratořích splňující podmínky interní a externí kontroly kvality. OKB splnilo podmínky získání Auditu I i II NASKL a celá Nemocnice Znojmo je držitelem certifikátu ISO 9001:2000. Preanalytické a analytické podmínky stanovení nádorových markerů jsou v rutinní praxi velmi důležité. Nádorové markery by měly být stanovovány jednou metodikou a v jedné laboratoři za standardních podmínek. Diagnostické kity od různých výrobců mohou vykazovat rozdílné hodnoty hladin nádorových markerů u jednoho vzorku. Oddělení klinické biochemie disponuje třemi analyzátory na vyšetření hladin nádorových markerů UniCel DxI 800, Cobas e 411 a Immulite Analyzátor Beckman Coulter UniCel DxI 800 Obr. 2 Analyzátor UniCel DxI Analyzátor Beckman Coulter UniCel DxI 800 (obr.2) je kompaktní plně automatický uzavřený systém, který umožňuje provádění imunochemických stanovení metodou chemiluminiscence. Systém je založen na použití alkalické fosfatázy jako markeru, paramagnetických mikročástic jako nosiče protilátek resp. antigenů a luminiscenční detekci využívající přeměny dioxetanfosfátu na dioxetan. Analyzátor má vysokou detekční citlivost při širokém koncentračním rozmezí, velmi dobrou přesnost a reprodukovatelnost výsledků. 31

32 Na začátku analýzy je ze vzorku vytvořen alikvot, z kterého je část odipetována do reakční kyvety. Pomocí reagenčního pipetoru je ke vzorku přidána reagencie a proběhne inkubace. Během inkubační doby se analyt naváže na paramagnetické částice z činidla. Po ukončení inkubace je kyveta přesunuta do promývacího karuselu. V další fázi jsou paramagnetické částice pomocí magnetu přitaženy ke stěnám reakční kyvety a odstraněn promývací roztok s nenavázaným analytem. Po tomto kroku je napipetován chemiluminiscenční substrát, který reaguje s analytem, na nějž je navázán enzym, při této reakci dochází k emisi fotonů, která je měřena luminometrem. Výstup z luminometru je vyjadřován v relativních světelných jednotkách (RLU), které se používají spolu s kalibračními daty k výpočtu výsledku. Analyzátor využívá kompetitivní nebo nekompetitivní enzymoimunoanalýzu. Příkladem kompetitivní (soutěživého) principu je stanovení FT3 (volného trijódtyroninu): volný T3 je kompetitivní vazebné enzymoimunoanalytické stanovení. Vzorek je přidán do reakční kyvety spolu s monoklonální protilátkou proti T3, konjugovanou s ALP. Během inkubace volný T3 ve vzorku reaguje s protilátkou pro T3. Do směsi jsou potom přidány částice potažené streptavidinem a biotynylovaným analogem T3. Neobsazená vazebná místa na protilátce proti T3 jsou navázána na částici prostřednictvím analogu T3. Po inkubaci v reakční kyvetě jsou látky navázáné na pevnou fázi zadrženy pomocí magnetického pole, nenavázané látky jsou odstraněny promytím. Do kyvety je následně přidán chemiluminiscenční substrát Lumi-Phos*530 a světlo vytvořené při reakci se měří luminometrem. Produkce světla je nepřímo úměrná koncentraci volného T3 ve vzorku. Množství analytu přítomného ve vzorku se stanoví z vícebodové kalibrační křivky. (orig.návod FT3,2005) 32

33 Obr. 3 Obecné schéma kompetitivní enzymoimunoanalýzy Příkladem nekompetitivního (sendvičového) principu je stanovení CEA: CEA je sendvičové imunoenzymatické stanovení využívající dvě myší monoklonální protilátky proti CEA, které reagují s různými epitopy CEA. Vzorek se přidá do reakční kyvety spolu s konjugátem první myší monoklonální protilátky proti CEA s ALP a s druhou myší monoklonální protilátkou proti CEA navázanou na paramagnetické částice. Po inkubaci následuje magnetická separace a promytí. Do reakční kyvety se pak přidá chemiluminiscenční substrát Lumi-Phos*530 a světlo vytvořené při reakci se měří luminometrem. Produkce světla je přímo úměrná koncentraci CEA ve vzorku. Koncentrace analytu ve vzorku se stanoví podle vícebodové kalibrační křivky. (orig.návod CEA, 2008) Na sendvičovém principu je založeno i stanovení ostatních nádorových markerů analyzátoru UniCel DxI. 33

34 Obr.4 Obecné schéma nekompetitivní enzymoimunoanalýzy 34

35 2.2.2 Analyzátor Roche Cobas e 411 Obr. 5 Analyzátor Cobas e 411 Analyzátor Cobas e 411 (obr.5) je plně automatický stolní analyzátor. Je určen pro in vitro kvantitativní a kvalitativní stanovení pomocí elektrochemiluminiscenční technologie ECLIA. (uživatelská příručka,2006). Vzorek a reagencie jsou napipetovány do reakční kyvety v pipetovací stanici, která je přesunuta do inkubátoru, kde je ponechána až 9 minut a jsou přidávána další činidla nebo mikročástice v závislosti na metodě. V další fázi je kyveta přesunuta do aspirační stanice, kde jehla nasaje k přípravě měřící komůrky roztok Pro Cell a potom komůrku naplní reakční směsí. Paramagnetické mikročástice s navázanými imunokomplexy jsou přichyceny ke stěnám komůrky a nezreagované složky vymyty roztokem ProCell. Za světelnou emisi je zodpovědný rutheniový chelát, kterým je označena protilátka. Iniciátorem elektrochemiluminiscence je tripropylamin (TPA), jehož funkcí je přenos elektronu na rutheniový chelát. Přenos se uskutečňuje po vložení napětí na elektrodu a oxidaci TPA a rutheniového chelátu. Tím dochází k redukci rutheniového chelátu na nestabilní excitovanou formu a při návratu do stabilního stavu dochází k vyzáření fotonu. K měření se používá fotonásobič. Pomocí analog-digitálního konvektoru dojde ke kvantifikaci vyzářených fotonů. Jejich množství je přímo úměrná koncentraci analytu ve vzorku. (referenční příručka,2010) Jako příklad lze uvést stanovení antigenu CA 72-4 : CA 72-4 je nekompetitivní (sedvičová) imunoanalýza. Ke vzorku se přidá biotinylovaná monoklonální protilátka proti CA 72-4 (CC49) a monoklonální specifická protilátka proti CA 72-4 (B72.3), značená rutheniovým komplexem, probíhá první inkubace za tvorby sendvičového komplexu. Poté následuje druhá inkubace - po přidání mikročástic, potažených streptavidinem se komplex váže na pevnou fázi prostřednictvím interakce mezi biotinem a streptavidinem. Dále je reakční směs nasáta do měřící cely, kde jsou mikročástice zychyceny magnetickým polem na 35

36 povrchu elektrody. Nenavázané složky jsou odstraněby roztokem ProCell. Přivedené napětí na elektrodě vyvolá chemiluminiscenční emisi fotonů, která je změřena fotonásobičem. Výsledky jsou hodnoceny z kalibrační křivky, která je specificky vytvořena pro analyzátor 2-bodovou kalibrací a master křivky, dodané v čárovém kódu činidla (orig.návod CA72-4,2010) Na sendvičovém principu probíhá měření i ostatních nádorových markerů na analyzátoru Cobas e Analyzátor Siemens IMMULITE 1000 Obr. 6 Analyzátor IMMULITE 1000 Analyzátor IMMULITE 1000 (obr.6) provádí automatizovaná chemiluminiscenční stanovení. Systém využívá plastové kuličky potažené protilátkou nebo antigenem specifickým pro daný test jako pevnou fázi, činidlo značené ALP a chemiluminiscenční substrát. Potažená kulička je uložena v patentovaném plastovém pouzdře, které se nazývá testovací jednotka. Testovací jednotka slouží jako reakční nádobka pro imunitní reakci, proces inkubace, promývání a vývoj signálu. Postup stanovení (obr.7) vzorky a testovací jednotky se vloží do podavače, po spuštění analyzátoru se do testovací jednotky automaticky napipetuje činidlo, jednotka je pak inkubována při 37 C a promíchávána (obr.a). Po inkubaci se reakční směs oddělí vertikálním odstředěním při vysokých otáčkách podél svislé osy (obr.b). Celý kapalný obsah se zachytí do 36

37 koaxiální odpadní komory v testovací jednotce (obr.c). Kulička zůstane bez zbytkového nenavázaného značení. Potom se stanoví množství navázaného značení pomocí dioxetanového substrátu, který produkuje světlo (obr.d). Emitované světlo se změří fotonásobičem a vypočítá se výsledek každého vzorku (IM 1000 návod k obsluze, 2010) Obr.7 Postup stanovení a) b) c) d) Nevýhodou tohoto principu je poměrně dlouhá doba analýzy 45 minut, resp. 75 minut u dvoukrokových stanovení. Ta je způsobena malým reakčním povrchem jedné velké kuličky potažené protilátkou. Konstrukce Immulitu 1000 navíc neumožňuje pozitivní identifikaci vzorku čárovým kódem. 2.3 Informace o nádorových markerech Preanalytické požadavky Po doručení biologického materiálu kontroluje pracovník na příjmu dodržení preanalytických požadavků, zejména typ odběrové zkumavky a čas odběru. Informace o odběrech pro všechna oddělení nemocnice jsou uvedeny v laboratorní příručce. Typ 37