Test blastické transformace ve sledování účinnosti imunosupresivní léčby

Transkript

1 Test blastické transformace ve sledování účinnosti imunosupresivní léčby The lymphocyte transformation test monitoring the effectiveness of immunosuppressive therapy TOMÁŠ VLAS 1,4, LENKA TYMKIVOVÁ 2, ANNA VELKOVÁ 2, DANIEL LYSÁK 3 1 Ústav imunologie a alergologie, Fakultní nemocnice Plzeň 2 Lékařská fakulta v Plzni 3 Hematologicko-onkologické oddělení, Fakultní nemocnice Plzeň 4 Fakulta zdravotnických studií, Západočeská univerzita v Plzni SOUHRN Lymfocytární transformační testy umožňují studovat ak tivaci lymfocytů in vitro. Lymfocyty mohou být stimulovány specifickými nebo nespecifickými podněty. Výslednou aktivaci lymfocytů lze sledovat pomocí průtokové cytometrie testováním změn zastoupení DNA nebo stanovením míry proliferace pomocí exprese specifických molekul (1 3). Výsledek měření může být ovlivněn současným onemocněním (imunodeficity) nebo léčbou (imunosuprese, imunomodulace) (4). V naší práci jsme sledovali skupinu 27 pacientů po transplantaci kostní dřeně se zahájenou imunosupresivní léčbou nebo kombinací kortikosteroidů a cyklosporinu A. Kontrolní skupinu tvořilo 15 zdravých dárců. Sledovali jsme procento aktivovaných lymfocytů po stimulaci mitogenem phytohemaglutininem (PHA) pomocí značení využívajícího interkalujícího barviva propidium jodidu (PI) nebo proliferačního markeru Ki-67. Zjistili jsme významné snížení exprese Ki-67 (o 45,23 %) u nemocných léčených kortikosteroidy v porovnání s kontrolní skupinou (p <,1). Rozdíl mezi zdravými dárci a pacienty léčenými kombinací kortikoidů a cyklosporinu A dosahoval 63,4 % (p <,1). Pacienti na kombinované imunosupresi (kortikosteroidy + cyklosporin A) vykazovali o 18,17 % (p <,1) nižší míru Ki-67 aktivity v porovnání s nemocnými léčenými pouze. Obě metody značení proliferujících buněk (Ki-67, značení DNA proprium jodidem) poskytovaly shodné výsledky (r =,895). Z našich měření vyplývá, že lymfocytární transformační test může být velmi úspěšně využitý k monitorování efektivity imunosupresivní léčby. Klíčová slova: proliferace, Ki-67, imunosuprese,, transplantace SUM MARY Lymphocyte transformation assays enable lymphocyte activation to be studied in vitro. Lymphocytes may be stimulated by specific or non- -specific antigens. The resulting activation of lymphocytes can be monitored with flow cytometry by testing changes in DNA representation or by determining the rate of proliferation by specific molecules (1 3). The result of measurement may be affected by ongoing disease (immunodeficiency) or treatment (immunosuppression, immunomodulation) (4). In our study, we monitored a group of 27 patients after bone marrow transplant who were on immunosuppression with corticosteroids or a combination of corticoids and cyclosporin A. The control group consisted of 15 healthy donors. We monitored the percentage of activated lymphocytes following stimulation with mitogen phytohemagglutinin (PHA) using the labeling with propidium iodide (PI) intercalating dye or the Ki-67 proliferation marker. We found a significant decrease of Ki-67 expression (of 45,23%) in patients treated with corticosteroids in comparison to the control group (p <.1). The difference between healthy donors and patients on the combination of corticoids and cyclosporin A reached 63.4% (p <.1). Patients receiving combined immunosuppression (corticosteroids + cyclosporine A) showed lower Ki-67 activity by 18.17% (p <.1) as compared to patients treated with corticosteroids alone. Both methods yielded the same results (r =.895). Our results confirm that a lymphocyte transformation test can be successfully used for the monitoring of the effectiveness of the immunosuppressive treatment. Key words: Proliferation, Ki-67, immunosuppression, corticosteroids, transplantation Úvod Lymfocytární transformační testy (LTT) využívají schopnosti lymfocytů reagovat na různé antigenní a mitogenní podněty aktivací a proliferací (1). V klinické praxi jsou LTT součástí diagnostického procesu imunodeficiencí a jiných poruch imunitního systému a je možné je využít i k hodnocení míry imunosupresivní léčby (1, 2). Cílem imunosupresivní léčby je tlumení nežádoucí aktivace imunitního systému. V klinické praxi se jedná nejčastější o transplantace tkání či orgánů nebo autoimunitní onemocnění (5). Při imunosupresivní léčbě dochází zejména k ovlivnění činnosti T- a B-lymfocytů, 42 Alergie 1/218

2 které se nemohou aktivovat, a tím je redukována nežádoucí imunitní odpověď (4 6). Imunosupresivní léčba musí být ideálně nastavena tak, aby došlo k potlačení nadměrné nebo patologické imunitní reakce a aby byla co nejvíce zachována imunitní odpověď na ostatní antigenní podměty (bakterie, viry, nádory) (7, 8). Použití imunosupresivní terapie je zpravidla spojeno se zvýšenou vnímavostí pacienta k infekcím, běžným i oportunním, které mohou uniknout dohledu oslabeného imunitního systému (9). Při terapii imunosupresivy existuje i zvýšené riziko vzniku malignit, zejména lymfomů, ale i solidních nádorů (1, 11). Tradičně byly k imunosupresivní léčbě využívány zejména cytotoxické látky (azathioprin, cyklofosfamid). Později se toto portfolium rozšířilo o kortikosteroidy, cyklosporin A, tacrolimus, sirolimus a mykofenolát mofetil (4, 5). Významný pokrok v imunosupresivní terapii byl zaznamenán se zavedením monoklonálních protilátek proti lymfocytárním antigenům, které umožnilo snížit některé vedlejší účinky nespecifické imunosuprese (5). LTT testy jsou pro své jednoduché provedení a silnou robustnost široce rozšířeny. Historické metody byly založeny na inkorporaci 3H-thymidinu (1). Tato metoda obsahuje radioaktivní prvek, proto je v současné době tendence nahrazovat ji jinými přístupy, které nevyužívají radioaktivní značení. Se zavedením průtokových cytometrů do imunologických laboratoří se objevila celá skupina testů založených na cytometrické detekci proliferujících buněk (1, 2, 12). Tyto testy využívají značení dělících se buněk nebo značení buněk, které vystoupily z G fáze. Laboratorní testy detekce proliferace lze rozdělit do několika skupin. První skupinou jsou testy, které detekují jadernou DNA jejím barvením fluorescenčními barvivy po odstranění interferující RNA. Barviva nedokáží rozlišit mezi buňkami v G a G1 fázi, principiálně detekují pouze změny v množství DNA v průběhu S a G2/M fáze. Nejčastějším barvivem pro toto stanovení je propidium jodid (PI) (1). Druhou skupinou jsou testy založené na barvení cytoplazmatických proteinů a jeho změnách v průběhu dělení buněk. Existuje celé řada cytoplazmatických barviv, nejčastěji je však využíván carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE). Zde hodnotíme pokles koncentrace značených cytoplazmatických proteinů při rozdělení buněk (2). Třetí skupinou jsou testy odvozené od proteinů, které jsou úzce spjaty s dělením buněk. Jedná se o intracelulární proteiny Ki-67, PCNA nebo nukleofosmin (B23, NPM). Tyto proteiny jsou produkovány poté, co buňka opustí fázi G, a je možné je detekovat pomocí monoklonálních protilátek s využitím intracelulárního značení. Nejvhodnější metodou pro využití v LTT je detekce Ki-67 (1). A G/G1 fáze S fáze G2/M fáze Cell Number B SO MultiCycle suggestions (a guideline only): No abnormal DNA content is observed. The diploid %S=4.3, %G2=9.36 The S Phase confidence is good 18 kontrola Cell Number C SO MultiCycle suggestions (a guideline only): No abnormal DNA content is observed. The diploid %S=29.3, %G2=6.65 The S Phase confidence is good Cell Number DNA Content 21 SO D MultiCycle suggestions (a guideline only): No abnormal DNA content is observed. The diploid %S=4.16, %G2=4.75 The S Phase confidence is good CsA DNA Content DNA Content Obr. 1: Analýza buněčného cyklu pomocí průtokové cytometrie značení propidium jodidem A metoda cytometrického stanovení využívá změn v intenzitě fluorescence proprium jodiu buněk v různých růstových fázích. Buňky v G2/M fázi mají dvojnásobnou intenzitu fluorescence oproti buňkám v G/G1 fázi. Příklad analýzy zastoupení transformovaných lymfocytů, B u zdravého dárce (transformované lymfocyty 4,3 %), C při terapii (29,7 %) a D při terapii a cyklosporinem A (15,1 %). Alergie 1/218 43

3 % proliferujících lymfocytů % exprese znaku Ki67 na T-lymfocytech kontrola CsA + kontrola CsA + Graf 1: Změny v zastoupení aktivovaných lymfocytů při imunosupresivní léčbě metoda detekce proprium jodid Vliv imunosupresivní léčby na výsledek testu blastické transformace s využitím značení PI. Kontrolní skupina medián % buněk v S a G2/M fázi 45,51. Terapie medián % buněk v S a G2/M fázi 3,25. Terapie a cyklosporinem A medián % buněk v S a G2/M fázi 16,4. Graf 2: Změny v zastoupení aktivovaných lymfocytů při imunosupresivní léčbě metoda detekce Ki-67 Vliv imunosupresivní léčby na výsledek exprese znaku Ki-67 na T- -lymfocytech. Kontrolní skupina medián % T-lymfocytů exprimující Ki-67 91,5. Terapie skupina medián % T-lymfocytů exprimující Ki-67 46,27. Terapie a cyklosporinem A skupina medián % T-lymfocytů exprimující Ki-67 26,57. Ki-67 (MKI67) je znak buněčné proliferace. Během interfáze je tento protein detekován uvnitř buněčného jádra, zatímco v mitóze dochází k jeho relokaci na povrch chromozomů. Protein Ki-67 je přítomen ve všech aktivních fázích buněčného cyklu (G1, S, G2, M) (13). To je pravděpodobně dáno regulační funkcí proteinu Ki-67, který se podílí na sestavení perichromozomálního kompartmentu v buňkách. Při tomto procesu reguluje Ki-67 fosfatázu-1 vázající protein, a tím konečnou fosforylaci nukleárního proteinu B23 (nukleofosminu) (14). V naší práci se zaměřujeme na změny LTT v průběhu imunosupresivní léčby. Cílem bylo posoudit využitelnost dvou LTT metod, a sice PI a Ki-67 značení, k analýze aktivace imunokompetentních buněk při imunosupresivní léčbě. Metody Vyšetření jsme provedli na vzorcích periferní krve 27 pacientů léčených pomocí imunosupresivní léčby s různými kombinacemi imunosupresiv. Jako kontrolní skupina bylo využito 15 vzorků od zdravých dárců. Vzorky byly odebrány do heparinu, nespecificky stimulovány pomocí PHA a inkubovány 72 hodin. Po ukončení inkubace byl u všech vzorku proveden LTT s využitím značení pomocí KI-67 a propidium jodidu. Testy byly prováděny z plné krve po aktivaci mitogenem, zpracování materiálu probíhalo ihned po odběru. Kultivace buněk 1 μl plné krve bylo kultivováno v 1 9 μl kultivačního média X-VIVO 1 (Lonza) s přídavkem 1% FBS (Lonza) a PHA (Sigma, USA) o konečné koncentraci 5 ug/ml. Inkubace probíhala po dobu 72 hodin při 37 C a 5% CO 2. Ke kultivaci byly použity tkáňové zkumavky (Sarstedt, Austrálie). Test aktivace lymfocytů značení propidium jodidem Pro stanovení procenta aktivovaných lymfocytů byla využita analýza fází buněčného cyklu lymfocytů pomocí průtokové cytometrie. Byla stanovována intenzita fluorescence jaderné DNA značené propidium jodidem po předchozí permeabilizaci buněčné membrány a odstranění interferující RNA (CycleTEST PLUS, Beton Dickinson, USA). Analýza byla provedena na průtokovém cytometru FC5 (Beckman Coulter, USA) pomocí softwaru MultiCycle AV DNA analysis (Beckman Coulter, USA), který umožňuje vyhodnocení a kvantifikaci jednotlivých růstových fází. Procenta aktivovaných lymfocytů v jednotlivých vzorcích byla kalkulována jako součet procent aktivovaných buněk v růstové fázi G2 a M fázi (obr. 1). Test aktivace lymfocytů značení Ki-67 Pro stanovení zastoupení aktivovaných lymfocytů bylo využito značení proteinu Ki-67. Pro intracelulární barvení byl využit kit PerFix-nc (Beckmann-Coulter, Francie) a protokol pro slabou fixaci s promýváním (Low Fixation, Wash). Směs buněk byla označena pomocí monoklonálních protilátek CD3 PB, CD45 KO, CD4 FITC (vše Beckman-Coulter, Francie), Ki-67 PE (Exbio, Česká republika). Vzorky byly analyzovány na průtokovém cytometru Navios (Beckman-Coulter, USA). Analýza byla provedena v programu Kaluza (Beckman-Coulter, Francie). Dot-ploty aktivovaných a kontrolních vzorků s analyzační strategií jsou uvedeny na obrázku Alergie 1/218

4 (x 1 3 ) 1 8 [Ungated] CD45 KO / SS INT (x 1 3 ) 1 8 [Ly] CD3 PB / SS INT SS INT 6 4 SS INT Ly CD45 KO 2 T-ly CD45 KO 1 8 A [T-ly] ki 67 PE 1 8 B [T-ly.] ki 67 PE 5 4 C [T-ly..] ki 67 PE Count A : 9.7% Count B : 73.46% Count C : 38.17% ki 67 PE ki 67 PE ki 67 PE kontrolní vzorek CsA + Obr. 2: Analýza proliferace lymfocytů pomocí stanovení exprese Ki-67 Strategie analýzy exprese Ki-67 po intracelulárním značení. Výběr lymfocytární populace je proveden v dot-plotu CD45/SS. Lymfocytární populace je rozdělená na CD3 pozitivní (T-lymfocyty) a CD3 negativní (B-lymfocyty a NK buňky). Exprese Ki-67 je vyšetřována na CD3 pozitivních lymfocytech. Příklad analýzy zastoupení transformovaných lymfocytů: A u zdravého dárce (transformované lymfocyty 9,22 %), B při terapii (73,61 %) a C při terapii a cyklosporinem A (38,36 %). Statistické metody Pro statistické zhodnocení byl zvolen Wilcoxonův test. Analýza byla provedena ve statistickém programu R project (The R Foundation for Statistical Computing). Výsledky Celkem jsme provedli 84 měření. Na vzorcích od pacientů s imunosupresivní léčbou jsme zaznamenali významné rozdíly, a to jak ve vztahu ke kontrolní skupině, tak mezi nemocnými léčenými různými imunosupresivními protokoly. Pokles aktivace lymfocytů potvrdily obě metody, tedy jak značení DNA pomocí propidium jodidu, tak stanovení intracelulární produkce proteinu Ki-67. V obou testech transformace lymfocytů hodnotíme procento transformovaných aktivovaných lymfocytů. U stanovení využívající barvení pomocí PI se jedná o součet procenta buněk v S a G2/M fázi. U metody Ki-67 se jedná o % T-lymfocytů exprimující tento znak. Při stanovení proliferace pomocí značení proprium jodidem jsme nalezli významné rozdíly mezi kontrolní skupinou a skupinou léčenou kortikosteroidy (rozdíl mediánů 15,26, p <,1), kontrolní skupinou a skupinou léčenou kombinací kortikosteroidů a cyklosporinu A (rozdíl mediánů 29,14, p <,1) a mezi skupinami na různé imunosupresivní terapii (rozdíl mediánů 13,85, p <,1), viz graf 1. Při stanovení proliferace pomocí značení Ki-67 jsme nalezli významné rozdíly mezi kontrolní skupinou a skupinou léčenou kortikosteroidy (rozdíl mediánů 15,26, p <,1), kontrolní skupinou a skupinou léčenou kombinací kortikosteroidů a cyklosporinu A (rozdíl mediánů 29,14, p <,1) a mezi skupinami na imunosupresivní terapii (rozdíl mediánů 13,85, p <,1). Korelace mezi výsledky detekce aktivovaných lymfocytů pomocí značení DNA propidium jodidem a měření exprese Ki-67 byla r =,895 (p <,1), viz graf. 2. Výsledky pro stanovení využívající propidium jodid jsou uvedeny v tabulce 1. Výsledky stanovení využívající detekci Ki-67 jsou uvedeny v tabulce 2. Diskuse Imunosupresivní terapie je důležitou součástí zvládání imunopatologických stavů. Velmi výraznou roli má Alergie 1/218 45

5 Tab. 1: Změny v LTT při imunosupresivní léčbě metoda značení proprium jodidem Skupina pacientů Kontrola / CS Kontrola / CS + CsA CS / CS + CsA rozdíl* 15,26 29,14 13,85 p <,1 <,1 <,1 CsA cyklosporin A, CS kortikosteriody, * rozdíl mediánů procentuálního zastoupení aktivovaných lymfocytů Tab. 2: Změny v LTT při imunosupresivní léčbě metoda značení Ki-67 Skupina pacientů Kontrola / CS Kontrola / CS + CsA CS / CS + CsA rozdíl* 45,23 63,4 18,17 p <,1 <,1 <,1 CsA cyklosporin A, CS kortikosteriody, * rozdíl mediánů procentuálního zastoupení aktivovaných lymfocytů 13,85, p <,1). Naše výsledky ukazují, že obě metody jsou vhodné pro detekci transformace lymfocytů (korelační faktor r =,895). Při porovnání s publikovanými pracemi využívajícími 3H-thymidinu se ukazuje, že obě metody poskytují podobné výsledky jako metoda zlatého standardu 3H značeného tymidinu (1, 13). Využití testu blastické transformace ke stanovení efektivity imunosupresivní léčby se jeví jako velmi vhodné zvláště u pacientů, kteří špatně odpovídají na léčbu nebo mají těžké nežádoucí reakce. U těchto pacientů by mohlo stanovení proliferačních schopností umožnit individualizovat dávky imunosupresiv nezávisle na klinickém protokolu, a tím snížit případné komplikace při zachování maximálního efektu léčby. Tento přístup individualizující imunosupresivní léčbu je však potřeba ověřit na větším souboru pacientů a porovnat jej s klinickou odpovědí. Podpořeno z programového projektu Ministerstva zdravotnictví ČR s reg. č A. Veškerá práva podle předpisů na ochranu duševního vlastnictví jsou vyhrazena. při transplantaci solidních orgánů i transplantaci krvetvorných buněk. Představuje nejen prevenci rejekce transplantátu, ale kontroluje také projevy reakce štěpu proti hostiteli (5). Mezi nejčastěji užívané imunosupresivní látky patří kortikosteroidy, které mají poměrně široké spektrum účinků. Kortikoidy přestupují do cytoplazmy, kde se váží na glukokortikoidní receptory (GR), což vede k modifikaci GR receptoru za vzniku homodimeru (GR/GR). Tento dimer se váže na specifická místa v genomu a způsobuje inhibici transkripce proteinů z rodiny jaderných aktivačních faktorů (NAFT nuclear factor of activated T-cells) (4, 15). To má za následek snížení transkripce genů důležitých pro produkci cytokinů, takže dochází k poklesu hladin IL-1, Il-2, Il-6, INF-γ, TNF-α (15). Cyklosporin A inhibuje antigenem navozenou aktivaci T-lymfocytů. K inhibici aktivace dochází v důsledku snížení produkce cytokinů IL-2, IL-3 a INF-γ (16, 17). Mechanismus účinku CsA je dán tvorbou komplexu s imunofilinem, který inhibuje kalcineurin serin-threonin-fosfatázu (kalmodulin) závislou na Ca 2+. Neaktivní kalcineurin není schopen aktivovat nukleární faktor aktivovaných T-buněk (NFAT) (18). Přesné mechanismy pro tento jev nebyly definovány, avšak bylo prokázáno, že okadaické kyseliny citlivé na serin-threonin-fosfázy zprostředkovávají CsA-rezistentní transaktivaci IL-2 promotoru pravděpodobně zaměřením na NFAT (19). Účinky imunosupresivní léčby můžeme sledovat jako pokles proliferační aktivity u obou použitých LTT testů, po nespecifické stimulaci pomocí mitogenu PHA. Při použití kombinované imunosupresivní léčby (kortikosteroidy a cyklosporin A) se účinky imunosupresivní terapie zvyšují, v tomto případě detekujeme nejnižší procento aktivovaných lymfocytů (4, 5, 2). Rozdílnou účinnost imunosuprese (C vs. C + CsA) ukazuje i statisticky významný rozdíl při porovnání obou imunosupresivních protokolů (rozdíl mediánů % aktivovaných lymfocytů LITERATURA 1. Lašťovička J, Rataj M, Bartůňková J. Assessment of lymphocyte proliferation for diagnostic purpose: Comparison of CFSE staining, Ki-67 expression and 3H-thymidine incorporation. Hum Immunol ; 77(12): Lyons AB. Analysing cell division in vivo and in vitro using flow cytometric measurement of CFSE dye dilution. Journal of Immunological Methods 2; 243(1): Shipkova M, Wieland E. Surface markers of lymphocyte activation and markers of cell proliferation. Clinica Chimica Acta 212; 413(17): Guichard A, Humbert P, Tissot M, Muret P, Courderot-Masuyer C, Viennet C. Effects of topical corticosteroids on cell proliferation, cell cycle progression and apoptosis: In vitro comparison on HaCaT. Int J Pharm 215; 479(2): Wallace CJ, Kingsmore DB. Transplantation and immunosuppressive therapy. Anaesthesia & Intensive Care Medicine 26; 7(6): Prémaud A, Rousseau A, Johnson G, Canivet C, Gandia P, Muscari F, et al. Inhibition of T-cell activation and proliferation by mycophenolic acid in patients awaiting liver transplantation: PK/PD relationships. Pharmacological Research 211; 63(5): Jaskula E, Dlubek D, Sedzimirska M, Duda D, Tarnowska A, Lange A. Reactivations of Cytomegalovirus, Human Herpes Virus 6, and Epstein-Barr Virus Differ with Respect to Risk Factors and Clinical Outcome after Hematopoietic Stem Cell Transplantation. Transplant Proc 21; 42(8): Luscalov S, Loga L, Dican L, Junie LM. Cytomegalovirus infection in immunosuppressed patients after kidney transplantation. Clujul Medical 215; 89(3): Admiraal R, de Koning CCH, Lindemans CA, Bierings MB, Wensing AMJ, Versluys AB, et al. Viral reactivations and associated outcomes in the context of immune reconstitution 46 Alergie 1/218

6 after pediatric hematopoietic cell transplantation. J Allergy Clin Immunol 217; Available online 7 April 217; In Press. doi.org/1.116/j.jaci Thanou-Stavraki A, James JA. Primary Sjogren s Syndrome: Current and Prospective Therapies. Semin Arthritis Rheum 28; 37(5): Luscalov S, Loga L, Dican L, Junie LM. Cytomegalovirus infection in immunosuppressed patients after kidney transplantation. Clujul Medical 215; 89(3): Rosato MT, Jabbour AJ, Ponce RA, Kavanagh TJ, Takaro TK, Hill JP, et al. Simultaneous analysis of surface marker expression and cell cycle progression in human peripheral blood mononuclear cells. Journal of Immunological Methods 21; 256(1): Soares A, Govender L, Hughes J, Mavakla W, de Kock M, Barnard C, et al. Novel application of Ki67 to quantify antigen- -specific in vitro lymphoproliferation. Journal of Immunological Methods 21; 362(1): Booth DG, Takagi M, Sanchez-Pulido L, Petfalski E, Vargiu G, Samejima K, et al. Ki-67 is a PP1-interacting protein that organises the mitotic chromosome periphery. elife /27;3:e Hadley KE, Louw A, Hapgood JP. Differential nuclear localisation and promoter occupancy play a role in glucocorticoid receptor ligand-specific transcriptional responses. Steroids 211; 76(1-11): Cho M, Ju JH, Kim K, Moon Y, Lee S, Min S, et al. Cyclosporine A inhibits IL-15-induced IL-17 production in CD4+ T cells via down-regulation of PI3K/Akt and NF-κB. Immunology Letters 27; 18(1): Létourneau S, Krieg C, Pantaleo G, Boyman O. IL-2 and CD25-dependent immunoregulatory mechanisms in the homeostasis of T-cell subsets. Journal of Allergy and Clinical Immunology 29; 123(4): Leitner J, Drobits K, Pickl WF, Majdic O, Zlabinger G, Steinberger P. The effects of Cyclosporine A and azathioprine on human T cells activated by different costimulatory signals. Immunology Letters 211; 14(1): Murphy LLS, Hughes CCW. Endothelial Cells Stimulate T Cell NFAT Nuclear Translocation in the Presence of Cyclosporin A: Involvement of the wnt/glycogen Synthase Kinase-3Î Pathway. J Immunol 22; 169(7): Murata M, Nakasone H, Kanda J, Nakane T, Furukawa T, Fukuda T, et al. Clinical Factors Predicting the Response of Acute Graft-versus-Host Disease to Corticosteroid Therapy: An Analysis from the GVHD Working Group of the Japan Society for Hematopoietic Cell Transplantation. Biology of Blood and Marrow Transplantation 213; 19(8): Ing. Tomáš Vlas Ústav imunologie a alergologie Fakultní nemocnice Plzeň Alej Svobody Plzeň vlast@fnplzen.cz Alergie 1/218 47