Kvantifikace proteinů pomocí hmotnostní spektrometrie

Transkript

1 Kvantifikace proteinů pomocí hmotnostní spektrometrie Diplomová práce Eva Srbová Vedoucí práce: doc. RNDr. Zbyněk Zdráhal, Dr. Konzultant: Mgr. David Potěšil Brno 2013

2 Bibliografický záznam Autor: Název práce: Bc. Eva Srbová Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav Biochemie Kvantifikace proteinů pomocí hmotnostní spektrometrie Studijní program: Studijní obor: Vedoucí práce: Biochemie Analytická biochemie doc. RNDr. Zbyněk Zdráhal, Dr. Akademický rok: 2012/2013 Počet stran: 67 Klíčová slova: proteomika, hmotnostní spektrometrie, ESI MS, relativní kvantifikace, dimethylace

3 Bibliographic Entry Author Title of Thesis: Degree programme: Field of Study: Supervisor: Bc. Eva Srbová Faculty of Science, Masaryk University Department of Biochemistry Protein quantification by mass spectrometry Biochemistry Analytical biochemistry doc. RNDr. Zbyněk Zdráhal, Dr. Academic Year: 2012/2013 Number of Pages: 67 Keyword: proteomics, mass spektrometry, ESI MS, relative quantification, dimethylation

4 Abstrakt Dimethylace je účinná metoda relativní kvantifikace hmotnostní spektrometrií, která využívá značení stabilními izotopy. Probíhá jednoduchým mechanismem, kdy reaguje formaldehyd s N-koncem nebo postranním řetězcem lysinu a vzniká Schiffova báze, která je redukována kyanoborohydridem sodným. Kombinací těchto sloučenin izotopicky značených a neznačených lze kvantifikovat až pět vzorků najednou. V této práci byla dimethylace použita ve spojení s metodou přípravy vzorku FASP, která využívá cut off filtry pro separaci proteinů od nízkomolekulárních látek s následným štěpením proteinů trypsinem přímo na filtru. Naštěpené peptidy jednotlivých vzorků jsou následně naznačeny příslušnou značkou, smíchány a kvantifikovány pomocí hmotnostní spektrometrie. Cílem této práce bylo porovnat variabilitu jednotlivých kroků při zpracování vzorku před samotnou hmotnostně spektrometrickou analýzou. Naše výsledky prokázaly, že zásadním zdrojem variability není dimethylace, ale příprava biologických replikátů. Klíčová slova: proteomika, hmotnostní spektrometrie, ESI MS, relativní kvantifikace, dimethylace Abstract Dimethylation is an effective method for relative quantification mass spectrometry, which uses stable-isotope labeling. The mechanism is simple, formaldehyde reacts with the N-terminus or a side chain of lysine to form Schiff base, which is reduced by sodium cyanoborohydride. By combination of these isotopically labeled and non-labeled compounds up to five samples can be quantified simultaneously. In this work dimethylation was used in conjunction with the method of sample preparation FASP, which uses the "cut off" filters to separate proteins frow low molecular weight compounds and on filter protein digestion with trypsin. The digested peptides of particular samples are labeled by selected tag, samples are pooled and then quantified by mass spectrometry. The aim of this study was to assess variability of sample processing steps prior to the mass spectrometric analysis. Our results have shown that the major source of variability is not dimethylation, but the preparation of biological replicates. Keywords: proteomics, mass spektrometry, ESI MS, relative quantification, dimethylation

5

6

7 Poděkování: Ráda bych poděkovala vedoucímu své diplomové práce doc. RNDr. Zbyňku Zdráhalovi, Dr. a Mgr. Davidu Potěšilovi za cenné rady, ochotu a trpělivost. Dále bych ráda poděkovala všem ostatním členům Oddělení funkční proteomiky a genomiky za příjemnou pracovní atmosféru. V neposlední řadě děkuji rodičům za jejich podporu při studiu. Prohlášení: Prohlašuji, že jsem svou diplomovou práci vypracovala samostatně s využitím informačních zdrojů, které jsou v práci citovány. Brno 14. dubna 2013 Eva Srbová

8 Obsah 1. Úvod Teoretická část Hmotnostní spektrometrie (MS mass spektrometry) Historie Instrumentace Identifikace proteinů Kvantifikace Absolutní kvantifikace Relativní kvantifikace Metody bez použití značek (label-free) Dimethylace Princip metody Design značení Cíl práce Praktická část Materiál a metody Chemikálie Biologický materiál Měření ph Lýze vzorků Měření koncentrace proteinů pomocí autofluorescence tryptofanu FASP Měření koncentrace peptidů pomocí nanofotometru Dimethylace MS analýza Analýza dat Výsledky a diskuse Design experimentu Měření koncentrace proteinů pomocí autofluorescence tryptofanu a FASP Měření koncentrace peptidů pomocí nanofotometru Počet kvantifikovaných proteinů Peptidové poměry správnost Proteinové poměry správnost Proteinové poměry přesnost Shrnutí výsledků a diskuse Závěr Seznam zkratek Literatura Přílohy

9 1. Úvod Proteomika je významný a stále se rozvíjející obor. Jak již název napovídá, proteomika se zabývá studiem proteomu. Slovo proteom bylo poprvé použito v roce 1994 Marcem Wilkinsem a označuje soubor proteinů v buňce (tkáni či v celém organismu), včetně jejich posttranslačních modifikací, jejich funkce, struktury a vzájemných interakcí. V této tzv. postgenomické éře nám již nestačí pouze informace o genomu různých organismů, která nevypovídá o variabilitě funkcí proteinů, jež genom kóduje. Studium proteinů je mnohem složitější a rozmanitější, už jen proto, že primární struktura genů je kombinována ze 4 nukleových bází, kdežto proteiny se mohou skládat z 20 různých aminokyselin. Dále je studium ztíženo proměnlivostí proteomu, který je, na rozdíl od relativně statického genomu, dynamický. Také sekundární, terciární a kvartérní struktura proteinů se může měnit během buněčného růstu a diferenciace, ale i vlivem funkčních produktů jiných buněčných typů či vnitřního prostředí organismu, které se mění v závislosti např. na stárnutí, při adaptaci na změny vnějšího prostředí nebo v průběhu nemoci. Proteiny se mohou také měnit v závislosti na alternativním sestřihu DNA. Komplexita proteomu narůstá také tvorbou posttranslačních modifikací (např. fosforylace, glykosylace), které hrají důležitou roli v buněčných procesech. Proteiny také velmi často interagují s jinými proteiny a spojují se do větších molekulárních celků (1). To vše ovlivňuje fenotyp organismu, který nejsme v celé šíři schopni postihnout studiem genomu a současně významně navyšuje složitost proteomické analýzy. 9

10 2. Teoretická část Existuje mnoho různých přístupů k proteomickým experimentům. Obecně lze proteomiku rozdělit na tři základní celky expresní, strukturní a funkční. Expresní proteomika je zaměřena na popis kvalitativních a kvantitativních rozdílů v expresi jednotlivých proteinů mezi odlišnými vzorky, které srovnáváme. Na základě těchto informací je možno identifikovat nové proteiny v signálních drahách nebo identifikovat proteiny, které jsou specifické pro danou nemoc (2). Strukturní proteomika se zabývá studiem prostorové struktury jednotlivých proteinů, protein-proteinových komplexů a komplexy proteinů s dalšími typy látek (např. léčiva). Cílem funkční proteomiky je pak určení funkce proteinů, zahrnuje izolaci proteinových komplexů nebo používání proteinových ligandů k izolaci specifických typů proteinů a charakterizaci proteinových celků na základě společné funkce. Zabývá se protein-proteinovými interakcemi a identifikací proteinů v komplexech nebo v organelách. Obecně, proteomické experimenty jsou velmi náročné na citlivost a přesnost, a proto bylo nutné vyvinout celou řadu specifických technologií pro identifikaci a kvantifikaci proteinů, pro charakterizaci komplexů s různým množstvím proteinů a pro identifikaci posttranslačních modifikací. Mezi separační metody patří dvourozměrná gelová elektroforéza (2-DE two-dimensional electrophoresis), což je technika založena na izoelektrické fokusaci, kdy se proteiny rozdělují podle izoelektrického bodu v elektrickém poli na IPG proužcích s imobilizovaným ph gradientem (1. rozměr) a na dělení proteinů v elektrickém poli podle molekulové hmotnosti (2. rozměr). Ten využívá klasickou polyakrylamidovou gelovou elektroforézu s přídavkem dodecyl sulfátu sodného (SDS-PAGE sodium dodecylsulfate-polyacrylamid gel electrophoresis). Tato metoda však není příliš reprodukovatelná, proto byla vyvinuta tzv. diferenční elektroforéza (DIGE difference gel electrophoresis), kdy oba vzorky separujeme v jednom gelu s následnou detekcí pomocí fluorescenčních barviček. Takto jsou eliminovány odlišnosti jednotlivých gelů, jsou sníženy nároky na čas a náklady. Naopak je zvýšena reprodukovatelnost, přesnost a citlivost metody proteomických studií (3,4). Vedle 2-DE je nejrozšířenější technikou pro separaci proteinů a peptidů kapalinová chromatografie (LC liquid chromatography). LC je velmi často přímo spojená s hmotnostní spektrometrií (MS mass spectrometry). 10

11 Hmotnostní spektrometrie je v dnešní době jedna z nejpoužívanějších metod v proteomice. Tato analytická metoda separuje nabité částice na základě poměru hmotnosti a náboje. Nabízí současně identifikaci proteinů a porovnávání rozdílu v množství proteinů v definovaném proteomu. V kombinaci s jinými vhodnými biochemickými metodami, usnadňuje studium funkčních aspektů, jako jsou subcelulární lokalizace, protein-proteinové interakce a posttranslační modifikace. Navíc kvantitativní MS techniky mohou být užitečné k získání hlubšího pohledu na dynamiku a pohyb proteinů v jejich funkčním kontextu (5). 2.1 Hmotnostní spektrometrie (MS mass spektrometry) Hmotnostní spektrometrie se stala jednou z nejužitečnějších analytických metod pro kvantitativní i kvalitativní analýzu malých i velkých biomolekul z komplexní směsi. Díky spojení MS s kapalinovou chromatografií se ukázalo, že tato technika je, díky své citlivosti, přesnosti a správnosti, vysoce výkonná pro identifikaci a charakterizaci proteinů i v komplexních směsích. Vedle vlastní identifikace proteinů je vhodná i pro charakterizaci posttranslačních modifikací a pro sledování změn proteinové expresní úrovně (relativní i absolutní kvantifikaci proteinových vzorků). K zdokonalení této techniky přispěl i rozvoj bioinformatiky, která nám umožňuje zpracování velkého množství získaných dat (3) Historie Základy hmotnostní spektrometrie byly položeny již před více než sto lety Sirem Josefem Johnem Thomsonem, britským fyzikem a držitelem Nobelovy ceny za fyziku. Tento vynález byl dále vylepšen Arthurem Jeffreym Dempsterem (USA) a později Francisem Williamem Astonem (VB), studentem J.J.Thompsona a držitelem Nobelovy ceny z roku 1922 za chemii. Dalšími významnými vědci v souvislosti s hmotnostní spektrometrií byli Hans Georg Dehmelt (USA) a Wolfgang Paul (Německo). Tito držitelé Nobelovy ceny za fyziku z roku 1989 se zabývali rozvojem hmotnostního analyzátoru na bázi iontové pasti. K nejvýznamnějším objevům umožňujícím současnou širokou analýzu biomolekul došlo až v polovině 80. let 20. století, kdy byly vyvinuty nové jemné ionizační techniky. Koichi Tanakou (Japonsko) metoda ionizace laserovou desorpcí za účasti matrice a Johnem Bennettem Fennem (USA) metoda ionizace elektrosprejem, za které v roce 2002 dostali Nobelovu cenu za chemii (6,7). 11

12 2.1.2 Instrumentace Princip MS metody spočívá v měření poměru hmotnosti m a náboje z analyzované látky. Po nástřiku vzorku dochází k jeho ionizaci vybranou ionizační technikou a molekula dostává náboj. Následně dochází k separaci nabitých částic v hmotnostním analyzátoru, právě podle jejich poměru m/z. Nakonec částice dopadají na detektor (Obr.1). Výsledkem měření je hmotnostní spektrum (závislost intenzity na m/z). Až na některé typy ionizací, všechny kroky probíhají ve vakuu, aby nedocházelo k nechtěným srážkám a následným fragmentacím analyzovaných iontů. Iontový zdroj Hmotnostní analyzátor Detektor Obrázek 1: Schéma hmotnostního spektrometru. Hmotnostní spektrometr je tedy v podstatě rozdělen na 3 základní části: iontový zdroj, hmotnostní analyzátor a detektor. Ionizace Ionizační techniky lze rozdělit na tzv. tvrdé a měkké. Typickým zástupcem tvrdých ionizačních technik, které se používají takřka výhradně pro ionizaci látek s nízkou molekulovou hmotností, je ionizace elektrony s vysokou energií elektronů (EI electron impact). Pro ionizaci biomolekul se dnes používají nejčastěji techniky měkké, ionizace elektrosprejem (ESI electrospray ionisation) a ionizace laserem za přítomnosti matrice (MALDI matrix-assisted laser desorption/ionization), které jsou šetrné ke vzorku a snižují množství fragmentů, což zjednodušuje MS spektrum. Metoda ESI vyžaduje vzorek v roztoku, který je vstřikován kapilárou do iontového zdroje. Tam pomocí elektrického napětí vznikají nabité kapičky vzorku, které se zvýšením teploty nebo proudem vysušujícího plynu (např. dusíku) odpařují. Nabité kapičky zmenšují svou velikost odpařováním a následně tzv. Coulombickou explozí, kdy se kapičky rozpadnou velkou povrchovou hustotou náboje a vznikají z nich vícenásobně nabité ionty. Ty potom putují dále do spektrometru, kde jsou analyzovány (8,9). 12

13 Výhodami ionizace elektrosprejem jsou šetrnost, průběh za atmosférického tlaku a proto poměrně snadné spojení s kapalinovou chromatografií, nejčastěji s reverzní fází. LC složitou směs separuje (2) a takto umožňuje hmotnostnímu spektrometru analyzovat větší počet komponent směsi. Nutnost zvýšení citlivosti a zavedení chromatografických kolon s malým průměrem přinesl vývoj nanospreje. Při MALDI je vzorek smíchán s roztokem matrice. Matrice je nízkomolekulární, organická látka, která absorbuje UV záření (např. 2,5-dihydroxybenzoová kyselina nebo α-kyano-4-hydroxy skořicová kyselina). Tento roztok je nanesen na vzorkovací destičku, na které se vzorek s matricí nechá zaschnout, a tím vzniknou směsné krystaly. Po ozáření destičky laserem, vzorek přechází do plynné fáze, ionizuje se a pourychlení v elektrickém poli putuje k detektoru (10). Hmotnostní analyzátory Analyzátory separují ionty na základě podílu hmotnosti a náboje. Jsou součástí spektrometrů, které jsou umístěny ve vakuu. Nejběžnější analyzátory jsou měřiče doby průletu iontů (TOF), iontové pasti (IT) a kvadrupólové analyzátory (Q). Výjimkou není ani jejich kombinace v tandemových hmotnostních spektrometrech. Kvadrupóly jsou jedny z nejběžnějších analyzátorů. Jsou složeny ze 4 paralelních kovových tyčí, které tvoří elektrické pole. Vždy dvě protilehlé tyče jsou připojeny ke stejnému napětí se stejnosměrnou a střídavou složkou. Nastavená napětí jsou v určitém okamžiku zvolena tak, aby v daném okamžiku kvadrupól propouštěl ionty jen o určitém m/z. Plynulou změnou těchto napětí můžeme dosáhnout analýzy všech iontů v určitém rozsahu m/z. Ten však není příliš široký. Tyto analyzátory jsou proto používány při analýzách anorganických a lehce či středně těžkých organických sloučenin. Velký význam v proteomice však má tandemové uspořádání tří kvadrupólů (QqQ trojitý kvadrupól) nebo kombinace dvou kvadrupólů a průletového analyzátoru (Q-TOF). Průletové analyzátory (TOF time of flight) jsou konstrukčně jedny z nejjednodušších. Jsou tvořeny v podstatě jen trubicí, kterou prolétávají ionty s dodanou kinetickou energií. Urychlené ionty jsou separovány podle jejich hmotnosti těžší ionty se pohybují nižší rychlostí než ionty lehčí. Součástí těchto analyzátorů bývá reflektronové iontové zrcadlo, umístěné na konci letové trubice, které prodlužuje délku letu iontů a srovnává drobné rozdíly v kinetické energii analyzovaných iontů. Reflektron takto zvyšuje 13

14 rozlišení zejména peptidů. Proteiny jsou obvykle měřeny v tzv. lineárním módu (tedy bez iontového zrcadla). Nejčastěji bývají spojovány s ionizační technikou MALDI. Stejně jako kvadrupólové analyzátory mohou být zapojeny tandemově nebo v kombinaci s jiným typem analyzátoru (Q-TOF). Další analyzátory iontové pasti (IT ion trap) jsou v podstatě trojrozměrné kvadrupóly. Lze si je představit jako ohnutý kvadrupól, který tvoří uzavřenou smyčku. Iontová past se skládá z prstencové střední elektrody a dvou kruhových elektrod s hyperbolickým průřezem. Na prstenec je vloženo kombinované stejnosměrné a radiofrekvenční napětí (11). Ionty jsou zachyceny v iontové pasti a teprve potom jsou vypuzovány z cely podle jejich m/z a detekovány. Výhodou tohoto analyzátoru je možnost vybrat jeden ion, který nás zajímá (prekursorový ion). Ten je zachycen v IT, izolován od ostatních iontů a dále fragmentován. Záznamem hmotnostní jeho fragmentů vzniká tzv. MS/MS spektrum nesoucí informace o struktuře daného prekursoru. Nejpoužívanějším typem fragmentace v proteomice je kolizně indukovaná disociace (CID collision-induced dissociation), kdy fragmentace iontů je způsobena srážkami se vzácným plynem (např. helium). Tyto nízkoenergetické srážky oslabují peptidovou vazbu a rozdělují ji na predikované iontové fragmenty b/y (a/x, c/z). Pokud náboj po fragmentaci náboj zůstane na N-konci, vznikají fragmenty série b, zůstane-li na C-konci, vznikají y- fragmenty (Obr. 2). Názvosloví iontů fragmentů je navrženo tak, aby obsáhlo všechny varianty štěpení. Obojí ionty mohou odštěpovat molekuly jako NH 3 (17 Da), H 2 O (18 Da) a CO (28 Da), což se projeví na výsledném spektru. Z rozdílu hmotností mezi sousedními b-, resp. y- ionty lze určit druh aminokyseliny v daném místě sekvence. Lze tak určit i celou sekvenci peptidů/proteinů, dokonce i těch neznámých (de novo sequencing), data tandemové hmotnostní spektrometrie (MS/MS) z proteinů se známou sekvencí jsou porovnávána s již existujícími databázemi sekvencí (např. Uniprot, NCBI, ExPASy) pomocí prohledávacích programů (např. MASCOT). Problémem je rozlišení aminokyselin se stejnou hmotností (např. leucin a izoleucin). MS/MS je významné také pro vyhledávání místa a určování druhu posttranslačních modifikací. (2,12,13). 14

15 Obrázek 2: Fragmentace peptidů (14): Zůstane-li po fragmentaci náboj na N-konci, vznikají fragmenty série a,b a c; zůstane-li na C-konci, vznikají fragmenty x, y a z. Nejčastěji používané typy iontových pastí jsou kvadrupólová (QIT quadrupol ion trap) - (trojrozměrná) a lineární (LIT linear ion trap), které mohou být kombinovány s jinými analyzátory. Iontová past je také základem pro spektrometry založené na iontové cyklotronové rezonanci s Fourierovou transformací (FT-ICR Fourier transform ion cyklotron resonance) nebo vybavené Orbitrapem, které dosahují vysokého rozlišení a mohou být spojovány jak s ESI, tak s MALDI ionizací. Detektory Koncovým zařízením je detektor. Existuje několik běžně používaných detektorů Faradayův detektor, elektronový násobič a Dalyho detektor. V proteomice se však nejčastěji používá Dalyho detektor, který využívá Dalyho konverzní elektrodu, na níž je velký negativní potenciál, scintilační zařízení a fotonásobič. Ion dopadající na konverzní elektrodu uvolní sekundární elektrony, které jsou urychleny a při interakci se scintilátorem dochází k emisi fotonů a fotonový signál je zesilován ve fotonásobiči (15) Identifikace proteinů Klasickými postupy při identifikaci proteinů jsou bottom up, kdy jsou nejdříve enzymaticky nebo chemicky proteiny štěpeny na peptidy, které jsou pak analyzovány hmotnostní spektrometrií a top down analýza celého proteinu. Ty jsou základem k vývoji dalších efektivnějších proteomických strategií, u kterých je klíčovým elementem separace peptidů a proteinů (Obr. 3). 15

16 Strategie bottom up využívá enzymatického štěpení jednotlivých proteinů nebo komplexních proteinových směsí na peptidy. K této strategii lze přiřadit dva přístupy. První pracuje s proteiny, které jsou před štěpením separovány 2-D elektroforézou a potom jsou soubory vzniklých peptidů analyzovány pomocí MS. Data z analýzy jsou porovnávána s in silico vytvořenými peptidovými mapami proteinů v databázi pomocí peptidového mapování (PMF peptide mass fingerprinting). U druhého přístupu jsou proteiny štěpeny a separovány jsou až naštěpené peptidy. Ty jsou analyzovány tandemovým hmotnostním spektrometrem. Proteiny jsou pak identifikovány na základě porovnání získaných MS/MS dat s proteinovými databázemi (16) pomocí speciálních prohledávacích programů. Mezi tyto techniky patří také vícerozměrná identifikace proteinů (MudPIT multidimensional protein identification technology), která je v dnešní době používaná v analýzách kompletních buněčných lyzátů, organismů a buněčných extraktů. Výhodou metody MudPIT je zlepšení peptidové separace pomocí dvourozměrné kapalinové chromatografie, dalším zlepšením separačních možností je zavedení ultra vysokotlaké kapalinové chromarografie (UHPLC ultra high pressure liquid chromatography) (17). Novější strategií je top down zahrnující ionizaci intaktních proteinů a následnou hmotnostně spektrometrickou analýzu proteinových iontů, které jsou štěpeny uvnitř spektrometru bez předchozí digesce (na rozdíl od bottom up ). Tato metoda umožňuje získat celistvý obraz sekvence proteinu a posttranslačních modifikací. Ačkoliv tento přístup představuje velmi lákavou možnost charakterizace proteinů a jejich modifikací, primárně je určen pro analýzu jednotlivých proteinů nebo jednoduchých proteinových směsí (17). 16

17 Obrázek 3: Schéma proteomických strategií (upraveno dle 17) Štěpení proteinů Důležitým krokem přípravy vzorku ( bottom up přístupy) je štěpení proteinů na kratší peptidové úseky. Štěpení může probíhat jak v gelu, tak i v roztoku. Po separaci v gelu (např. 2-DE) je určitý protein nejprve z gelu vyříznut a podroben štěpení. Proteiny mohou být štěpeny chemicky nebo enzymaticky. Chemické štěpení není příliš běžné a je používáno, spíše jako doplňkové. Enzymatické štěpení je naopak používané často, protože je velmi specifické a účinné. Nejběžněji používaným enzymem je trypsin, který proteiny specificky štěpí na C-konci za lysinem a argininem, pokud nenásleduje prolin. Trypsin je serinová proteasa získávaná z trávicího traktu obratlovců (většinou z dobytka), která pracuje v mírně alkalickém prostředí (ph = 7,8) při teplotě 37 C. Mezi další proteasy, které se používají pro štěpení, patří: chymotrypsin, která má menší specifitu štěpení než trypsin; Glu-C z bakterie Staphylococcus aureus, která štípe za kyselinou glutámovou; Lys-C z bakterie Lysobacter enzymogenes, která štípe za lysinem a další. Před samotnou digescí je potřeba odstranit disulfidické můstky a zabránit tvorbě nových. Pro jejich 17

18 redukci slouží např. dithiothreitol (DTT), následná alkylace (blokace cysteinu) je prováděna pomocí např. iodacetamidu (IAA) (3). 2.2 Kvantifikace Proteiny lze kvantifikovat pomocí mnoha různých metod. Mezi nejběžnější patří spektrofotometrické (např. metoda Bradfordové, Lowryho m.), které umožňují stanovení množství celkového proteinu ve vzorku, dále pak metody elektroforetické (např. 2-DE) a imunoblottovací (western blott), které již dokáží postihnout i kvantitativní chování jednotlivých proteinů. Nejspolehlivějšími i nejefektivnějšími se však stávají metody využívající pro kvantifikaci přímo hmotnostní spektrometrie díky její vysoké citlivosti, rychlosti měření, specifitě a jednoduché interpretaci spekter. Kvantitativní proteomika je jedním z nejlepších nástrojů například ke sledování proteinové exprese během diferenciace tkáňových buněk nebo vyšetřování změn koncentrace proteinů v hostitelských buňkách během virové infekce. Kvantifikace může být rozdělena na dva typy: absolutní a relativní. Absolutní kvantifikace umožňuje stanovení přesného množství nebo koncentrace proteinů ve směsi pomocí izotopicky značeného peptidového standardu o známém množství ze sledovaného proteinu, kdežto relativní kvantifikace určuje up- nebo down- regulaci proteinu. Tak je možno určit snížení či zvýšení exprese ve dvou a více sledovaných stavech buňky (18). V dnešní době existuje mnoho rozmanitých metod pro relativní i absolutní kvantifikaci (Obr. 4). Technicky lze metody opět rozdělit na dvě skupiny: metody využívající izotopicky značených sloučenin a metody založené na zpracování naměřených dat (tzv. label-free metody). Pro izotopické značky se používají těžké stabilní izotopy, jako jsou 13 C, 15 N, 18 O nebo 2 H (deuterium). Umělé začlenění izotopových značek do struktury proteinu je prováděno metabolicky, chemicky nebo enzymaticky. V prvním případě značky bývají do buňky inkorporovány během jejich růstu v médiu obsahujícím izotopicky označené sloučeniny (např aminokyseliny). Chemické značení je prováděno na peptidové nebo proteinové úrovni pomocí derivatizační reakce. Při enzymatickém značení jsou těžké izotopy začleněny do peptidů při proteinové hydrolýze. Začlenění těžkých izotopů (resp. značek tyto izotopy obsahující) způsobuje změnu hmotnosti peptidů a výsledný posun 18

19 peptidových píků (včetně jejich izotopové obálky) v hmotnostním spektru umožňuje rozlišit příslušnost peptidů k jednotlivým srovnávaným vzorkům. Dále se využívají také tzv. label-free metody, které nevyužívají izotopové značky, ale jsou založeny na statistickém zpracování MS, resp MS/MS dat. Obrázek 1: Schéma metod kvantitativní proteomiky (upraveno dle 19): Schéma naznačuje rozdělení často i méně často používaných metod. Vybrané z nich jsou zmíněny v dalších kapitolách Absolutní kvantifikace Metoda absolutní kvantifikace využívající izotopové značení, tzv. AQUA (absolute quantification approach), byla vyvinuta k přesnému určení exprese proteinu a PTMs. Využívá synteticky vytvořeného interního standardu o známé koncentraci přidaného do proteinového isolátu během digesce. K detekci a kvantifikaci přirozených i izotopicky značených peptidů lze použít metody tandemové MS SRM (selected reaction monitoring), kdy je sledována jen jedna vybraná reakce nebo častěji využívaná MRM (multiple reaction monitoring), při které sledujeme více reakcí, kdy reakcí se rozumí detekce vybraného fragmentu od daného peptidu. Množství analyzovaného proteinu lze 19

20 vypočítat z poměru hmotnostních spekter interního standardu a analytu. Jednoduchost a senzitivita této metody ve spojení s MS/MS z ní dělá velmi užitečnou pro proteomické experimenty, v případech, kdy je třeba sledovat předem vybrané proteiny (20,21) Relativní kvantifikace Pro relativní kvantifikaci bylo vyvinuto mnoho rozmanitých metod, avšak nejčastěji jsou tyto metody založeny na izotopovém značení, jak už bylo řečeno v úvodu této kapitoly. Jsou k dispozici také tzv. label-free metody (např. spectral counting). Jak již bylo zmíněno v úvodu kapitoly, izotopové značky jsou na proteiny vázané metabolicky, chemicky nebo enzymaticky, což koresponduje rozdělením do dvou kategorií podle toho, kde jsou vázány během přípravy vzorku in vivo nebo in vitro. Několik nejčastějších bude dále popsáno podrobněji. Metabolické značení (in vivo) Začlenění izotopových značek je nejdříve možné během buněčného růstu a dělení. Do kultivačního média jsou přidávány pouze izotopově značené aminokyseliny (resp. Jiné sloučeniny) a ty jsou pak během kultivace členěny do všech produkovaných proteinů. Buňky tedy musí být metabolicky aktivní. Výhodou těchto metod je možnost smíchání dvou (u metody SILAC i více) vzorků rostoucích v jiných médiích před všemi preparativními a analytickými kroky (18). Prvním úspěšným experimentem metabolického značení bylo začlenění 15 N do kvasinek a bakterií. Později byla tato metoda použita na některé další eukaryotní buňky, zahrnující Caenorhabditis elegans, Drosophila melanogaster, Arabidopsis thaliana a Rattus norvegicus. Nakonec se ukázalo, že je tato metoda výhodná pro autotrofní organismy, jako jsou rostliny a bakterie. I když jsou tyto organismy schopné syntetizovat vlastní aminokyseliny a začlenění izotopicky značených aminokyselin z média nemusí být kompletní, u Arabidopsis thaliana bylo prokázáno velké procento úspěšnosti (více než 95 % všech začleněných AK, obsahovalo 15 N). Nevýhodou je proměnlivý počet navázaných 15 N u různých peptidů, proto se přesně nedá předpovědět posun hmotnostních spekter a analýza se stává mnohem náročnější (18, 22). 20

21 Účinnějším přístupem, který překonává problém s predikcí hmotnostních spekter, je metoda SILAC (stable-isotope labeling by aminoacid in cell culture). Do média se přidávají izotopově značené aminokyseliny nebo se vytvářejí z přidaných solí, působením organismu přímo v médiu. Během buněčného růstu a dělení jsou původní aminokyseliny nahrazeny izotopově značenými. Po extrakci buněk z média jsou proteiny se začleněnými značenými aminokyselinami štěpeny pomocí trypsinu. Nejpoužívanější aminokyseliny, které se přidávají do živného média, jsou lysin a arginin. Pro jejich značení se nejčastěji používají kombinace těžkých izotopů 13 C a 15 N (23). Různé kombinace umožní značení tří a více vzorků najednou. Protože mnoho tryptických peptidů syntetizovaných z proteinů s těmito aminokyselinami (Lys, Arg), obsahují alespoň jednu izotopovou značku, zvyšují tak možnost kvantifikace velké části proteinů (18). Arginin však může být během buněčného dělení konvertován na prolin, což může vést k nepřesnostem v konečné kvantifikaci. Jednou z možností řešení je snížit hladinu argininu v médiu tak, aby přeměna na prolin nebyla preferována. Tato metoda sice přeměnu sníží, ale úplně jí nezabrání, což vedlo k vývoji dalšího řešení, které spočívá v přídavku dostatečného množství prolinu do média. Metoda SILAC výborně funguje na buňkách, které jsou schopny začlenit určité aminokyseliny. Vhodné jsou například buňky savců, které na rozdíl od rostlin, neumí syntetizovat všechny své aminokyseliny (18,24) Enzymatické značení (in vitro) V tomto případě probíhá začleňování izotopů během proteolytického štěpení trypsinem, který tuto reakci může katalyzovat. Během proteolýzy dochází k navázání 16 O nebo 18 O izotopů na C-konec peptidů v přítomnosti 16 O nebo 18 O vody. Aby nedošlo ke kontaminaci vzorku 16 O musí být před digescí pořádně vysušen. Tato technika produkuje těžké a lehké peptidy lišící se o 2 4 Da (1 x 18 O, 2 x 18 O), které tak můžou být kvantifikovány. Nevýhodou této metody je špatné začleňování izotopů. K dosažení vyššího stupně inkorporace 18 O značky přispívá prodloužená inkubace po proteolytickém štěpení. Další nevýhodou je nedostatečný hmotnostní posun mezi izotopovými obálkami, což také ovlivňuje kvantifikaci. Také je tento přístup jenom duplexová technika (25). Chemické značení (in vitro) Technologie chemického značení in vitro je založena na inkorporaci stabilních izotopových značek na specificky vybranou část peptidu/proteinu chemickou reakcí. Zahrnuje značení cílených peptidů na jejich aminoskupině (N-konci), karboxylové skupině 21

22 (C-konci) nebo na postranních řetězcích některých aminokyselin jako je cystein, lysin, tyrosin atd. (19). Nejstarší in vitro metodou, využívající postranní řetězec cysteinu, je ICAT (isotope-coded affinity tags) (26). Cystein je specificky značen činidlem (Obr. 5), které obsahuje v původní variantě 8 deuterií v těžké nebo 8 vodíků v lehké formě. Dále zahrnuje thiol-specifickou reaktivní skupinu (iodoacetamid) a biotinovou skupinu, která se využívá k avidin afinitnímu přečištění značených peptidů před MS analýzou (22). Po reakci s činidlem jsou proteiny ze dvou vzorků smíchány, proteolyticky štěpeny na peptidy, separovány afinitní chromatografií a následně analyzovány LC-MS/MS. Poměr iontové intenzity lehké a těžké formy peptidů (s posunem hmotnostních spekter o 8 Da na značený cystein) určuje jejich relativní množství (19,27) Obrázek 2: Biotinové činidlo pro ICAT (upraveno dle 19): Skládající se z biotinové skupiny, linkeru, který nese značené izotopy a thiol-specifické skupiny Tato metoda již byla aplikována na různé druhy organismů (jako bakterie, kvasinky, myši a lidé) jak ve formě buněčných kultur, tkání či tělních tekutiny. Výhodou této metody je redukce komplexnosti vzorku, díky specifickému značení cysteinu, což je aminokyselina, která se v proteinech vyskytuje relativně zřídka. Současně to však snižuje spolehlivost měření, protože kvantifikace je založena právě jen na velmi omezeném počtu peptidů v proteinu (18,27). Další nevýhodou může být velký počet deuterií, který může vést k posunům retenčního času chromatografických spekter HPLC na reverzní fázi. I proto došlo k obměně této metody a značení osmi 1 H/ 2 H bylo nahrazeno značením devíti 12 C/ 13 C tzv. cicat. Navíc ICAT činidlo obsahuje kyselinou štěpitelný linker, který umožňuje 22

23 odstranění velké afinitní značky před MS analýzou. To také vede ke zlepšení kvality CID spekter, tedy i identifikaci vyššího počtu proteinů (18). Pro značení postranních řetězců dalších aminokyselin lze použít i jiné metody. Například značení tryptofanových reziduí je umožněno reakcí s 2-nitrobenzensulfenyl chloridem (NBSCl), který obsahuje značený 13 C 6 (28). Další aminokyselina, která může být cílem značení je lysin a jeho ɛ-aminoskupina. Tato metoda je založena na guanidinylaci proteinů pomocí O-methylisourei a nazývá se MCAT (mass-coded abundance tagging) (19). Další metodou, která využívá ke značení četné volné aminoskupiny izolovaných intaktních proteinů, se nazývá ICPL (Isotope-coded protein label). Toto značení je zprostředkováno nicotinyl-n-hydroxysuccinimidem (Nic-NHS), který obsahuje čtyři deuteria v těžké nebo žádná ve své lehké formě. Inkorporováním izotopu 13 C, navíc získáme pro značení další dvě formy. Celý soubor čtyř rozdílných forem je označován jako kvadruplex a ten tedy umožňuje porovnávat až čtyři vzorky zároveň (29). Pravděpodobně nejúspěšnější a nejrozšířenější metoda je nazývaná itraq (isobaric tags for relative and absolute quantification). Činidla používané v itraq se specificky váží na postranní řetězec lysinu a N-konec peptidů. Skládají se z reportérové skupiny (základ je N-methylpiperazin), vyrovnávací skupiny (karbonyl) a peptidové reaktivní skupiny (NHS ester) (Obr. 6). Reportérová skupina je značka s hmotností od 114 do 117 Da 4-plexové a 113 až 121 Da v 8-plexové variantě (18). Aby byla celá značka isobarická, rozdílná hmotnost jednotlivých reportérových skupiny musí být vyrovnávána druhou částí celého činidla, tj. vyrovnávací skupinou s hmotností od 31 do 28 Da (u 4- plexu). Celková hmotnost celé značky je tedy 145 Da. Vysoké variability bylo dosaženo pomocí kombinace různých izotopů ( 13 C, 15 N a 18 O) a je tak umožněna kvantifikace až osmi vzorků najednou, což je velkou výhodou této metody. Protože jsou tyto značky isobarické, během separace kapalinovou chromatografií ani během MS analýzy nejsou rozeznatelné, a proto nelze měřit výšku nebo plochu jejich píků v MS spektru. Teprve při fragmentaci v MS/MS módu se odštěpí specifický ion (reportérový ion), podle kterého lze rozeznat jednotlivé vzorky (30). 23

24 Obrázek 3: itraq kvadruplexové značení (upraveno dle 30): A) Struktura itraq reagentu; B) možnosti kombinací izotopů, z kterých se skládá izobarická značka; C) schéma skládání itraq reagentu a jeho fragmentace na MS/MS. Výhodou této metody je její průběh na peptidové úrovni. Tím, že by měly být naznačeny všechny tryptické peptidy, se zvyšuje spolehlivost kvantifikace i jeho identifikace. Problémem tohoto značení může být interference s kontaminanty blízko isobarických iontů ve vzorku, které jsou spolu s nimi izolovány a fragmentovány a snižují tak přesnost kvantifikace (31). Vedle metody itraq jsou další metody jako mtraq, využívající stejné chemie, která přidává izotopové značky na peptidy tak, aby byly rozpoznatelné lépe v peptidovém než v tandemovém hmotnostním spektru. Tyto reagenty jsou hlavně používané při rychlém růstu ploch cílových peptidů při SRM. Tuto metodu lze využít i při kvantifikaci komplexních proteinů a také fosfopeptidů, i když itraq se zdá být stále výhodnější technikou (19, 31). Na stejných principech jako itraq, je založena i metoda tandemových hmotnostních značek, tzv. TMT (tandem mass tags), která umožňuje značení až šesti vzorků v jednom experimentu. Tato metoda stejně jako itraq vyžaduje kvantifikaci v MS/MS módu. V poslední době byla také vyvinuta thiol reaktivní TMT činidla, která se 24

25 používají ve spojení s imunopurifikačními metodami. Dovolují tak navázání TMT značek na peptidy obsahující cystein (na stejném principu byla vyvinuta i metoda cystraq). Obě dvě techniky umožňují lepší analýzu ve stejné oblasti jako ICAT, s větší multiplexovou kapacitou danou isobarickými značkami a kvantifikací pomocí MS/MS (32). Další metodou je značení izotopovými značkami pomocí dimethylace, která byla použita v praktické části mé diplomové práce a bude jí věnována samostatná kapitola (viz. 2.3) Metody bez použití značek (label-free) Metody založené na izotopovém značení nemusí být vždy praktické nebo proveditelné. Alternativou jsou tzv. label-free metody, které jsou zaměřeny na srovnávací analýzu proteinového množství bez využití izotopových značek. Tím odpadá potřeba těchto někdy drahých značených reagencií. Výhodou je eliminace mnohakrokového postupu značení, který někdy může vést ke špatné reprodukovatelnosti a ztrátě cílového peptidu. Nevýhodou těchto metod je jejich nižší přesnost a náročnost zpracování dat. Jednou z možností jak zjistit absolutní zastoupení proteinu je využití počtu pozorovaných a teoreticky pozorovatelných tryptických peptidů. Jejich poměr určuje PAI (protein abundance index), který udává předběžný odhad absolutního zastoupení proteinu v komplexní směsi. Tento index byl později pozměněn na exponenciálně modifikovaný PAI (empai exponenciální PAI minus jedna), který je přesnější (33). Metoda nazvaná absolutní proteinová exprese (APEX absolute protein expression) byla vyvinuta pro měření koncentrace proteinů v buňce. Vychází ze znalostí možných tryptických peptidů, které byly odhadnuty z experimentálních dat. To může být použito k predikci množství tryptických peptidů, které byly očekávány při detekci a tato hodnota je porovnávána s experimentálními daty odhadovaného absolutního množství proteinů. Tato kvantifikace je dostatečně přesná a také vykazuje dobrou korelaci s ostatními metodami (23). Lze také využít techniku ( TOP3 ) založenou na sledování MS signálu tří nejintenzivnějších tryptických peptidů. Předpoklad, že malé množství peptidů (unikátních) existuje pro každý protein proteomu a že intenzita jejich MS signálu je přibližně stejná. To 25

26 znamená, že intenzita tří nejvíce citlivých peptidů v každém proteinu může být využita jako míra proteinové abundance (18, 23). Při absenci adekvátní vnitřní kontroly, metody založené na kvantifikaci intenzity, jsou nespolehlivé, zejména u malých molekul. Řešením tohoto problému je analýza využívající pseudo-interních standardů (PISs), což jsou proteiny, které za odlišných podmínek nemění svou úroveň exprese. Tato metoda je jednoduchá a nevyžaduje použití dalších standardů. Obecně srovnání MS běhů komplexních biologických vzorků je velmi náročné a bylo třeba vyvinout účinné softwary pro pomoc při analýze (22). Principy těchto metod mohou být samozřejmě využity při relativní kvantifikaci. Narozdíl od kvantifikace pomocí izotopového značení, jsou zde dva vzorky připravovány separátně a následně podrobeny LC-MS/MS. Relativní kvantifikace je obecně založena na dvou principech měření. První je měření intenzity, založené na změnách ploch nebo výšek peptidových píků v chromatografickém záznamu, kdy ion s určitým m/z je detekován a zaznamenán s určitou intenzitou v určitém čase a výška, resp. plocha píku je úměrná koncentraci vzorku. Avšak díky proměnlivosti signálů běh od běhu, zapříčiněnou variabilitou v rámci jednotlivých experimentů (např. přípravou vzorků, nástřikem vzorků atd.) je nutná normalizace. Posun v retenčních časech a poměru m/z také značně komplikuje přímé a přesné porovnávání LC-MS dat. Pro vyrovnání se s těmito problémy a možnost zpracování velkého množství dat byly vyvinuty složité algoritmy, které jsou základem pro mnohé softwary. Druhý princip je spectral count. Relativní kvantifikace při tomto přístupu lze dosáhnout porovnáváním počtu identifikovaných MS/MS spekter ze stejného proteinu v každém z mnoha LC-MS/MS. Zvýšené množství proteinu typicky znamená zvýšení v počtu proteolytických peptidů. To také značí větší pokrytí sekvence, množství identifikovaných unikátních peptidů a tím i množství identifikovaných MS/MS spekter pro každý protein. Tento faktor se ukázal, jako jediný, lineárně související s relativní abundancí proteinu. Spectral count v porovnání s metodou založenou na intenzitě chromatografických píků je lépe reprodukovatelný a nevyžaduje specifické nástroje nebo algoritmy, nicméně normalizace a statistická analýza dat je nezbytná pro přesnost a správnost detekce proteinových změn v komplexní směsi (33). 26

27 2.3 Dimethylace V této samostatné kapitole je popsána metoda relativní kvantifikace, využívající izotopového značení, která byla použita pro účely této práce. Základy pro vývoj této metody byly položeny již před mnoha lety, kdy byla tato reakce modifikující lysin popsána. Pro značení proteinů pak byla používána zejména pro zlepšení citlivosti 13 C NMR analýzy (34). Využití pro MS analýzu v kvantitativní proteomice publikoval Hsu a spol. roku Od té doby dochází k jejímu vylepšování a stále častějšímu používání Princip metody Reduktivní alkylace (methylace), jak lze nazvat tento princip metody, je jednoduchou chemickou reakcí primárních aminů s formaldehydem a kyanoborohydridem sodným (NaCNBH 3 ), která převede všechny aminy na N-konci a ɛ-postranním řetězci lysinu na dimethyl. Reakcí aminu a formaldehydu vzniká Schiffová báze, která je hned redukována přídavkem NaCNBH 3 (Obr. 7). Toto redukční činidlo je používáno z důvodu větší stability v kyselém prostředí a proto je vhodnější pro reakci, jejíž ph optimum se může pohybovat v rozmezí 5 až 9. Je také mnohem slabší než kdysi používaný tetrahydridoboritan sodný (NaBH 4 ) a proto není schopen redukovat aldehydy a ketony, ale pouze Schiffové báze, což zamezuje postranním reakcím a zvyšuje začlenění formaldehydu do proteinů. Tato reakce také neumožňuje redukce disulfidických vazeb nebo cross-linkování formaldehydem, při němž vznikají methylenové vazby mezi proteiny a nukleovými kyselinami (34). Obrázek 4: Reakce reduktivní methylace (35). Primární amin reaguje s formaldehydem za vzniku Schiffové báze, která je redukovaná kyanoborohydridem sodným. Jak už bylo řečeno, methylové značky se váží na N-konce a postranní řetězec lysinu. To znamená, že při použití trypsinu ke štěpení proteinových vzorků, peptidy vytvořené štěpením za argininem obsahují jednu značku (na jejich N-konci) a peptidy vytvořené štěpením za lysinem značky dvě (na N-konci a na postranním řetězci lysinu). 27

28 Jestliže je preferován stejný počet dimethylových skupin na peptid, může být nejdříve provedena reakce pro ochranu postranního řetězce lysinu a to guanidinací. Výsledkem jsou pouze dimethylované N-konce aminokyselin a tato metoda se nazývá 2MEGA (36). Ačkoliv je tato metoda založena na jednoduché chemické reakci, lze ji využít pro mnoho různých typů organismů a buněk, ať už lidských, myších, hovězích či buněk bakterií E.coli. Díky vývoji různých typů protokolu lze pro značení použít rozdílných množství vzorku (od mikrogramů po miligramy) téměř se stoprocentní úspěšností značení. Reakce může probíhat v roztoku (in-solution), on-line na koloně (on-column) a probíhá velmi rychle (37). Během několika minut je obsazena většina aminových skupin, na které se váží methylové skupiny. Nebyl prokázán ani žádný negativní dopad na MS/MS analýzu. Další výhodou této reakce je její finanční nenáročnost a dobrá dostupnost všech chemikálií Design značení Původním a nejjednodušším uspořádáním značení je duplex, který má tedy jen dvě formy. Pro lehkou formu je použit formaldehyd (-d 0 ) a těžká forma vzniká reakcí aminu s formaldehydem (-d 4 ), který obsahuje místo vodíků, deuteria. Redukce pak u obou proběhne pomocí kyanoborohydridu. Vzniklá methylová skupina je tak tvořena dvěma vodíky (resp. deuterii) z formaldehydu a jedním vodíkem z redukčního činidla (Obr. 8). Celková hmotnost izotopové značky je tak v případě lehké formy 28 Da a v případě těžké formy 32 Da. Hmotnostní posun, který činí 4 Da, je pro bezproblémovou analýzu hraniční (38). Obrázek 5: Schéma reakce duplexu (38): Primární amin reaguje s formaldehydem (-d0) nebo (-d4), redukován kyanoborohydridem. Posunem v této technice bylo využití modifikovaného formaldehydu (-d 4 ) i redukčního činidla tzn. kyanoborodeuteridu (-d 3 ) pro vytvoření kvadruplexu. Kombinací modifikovaných a normálních reagencií lze vytvořit až čtyři rozdílné formy značek o hmotnosti m/z 28, 30, 32 a 34 Da (tab. I). Hmotnostní posun mezi jednotlivými typy 28

29 značek je zde pouze 2 Da a může tak vést k určitým těžkostem při MS analýze, zvláště u mnohonásobně nabitých peptidů. Pro zjednodušení analýzy a ujištění, že každý peptid má přinejmenším dvě vazebná místa, lze využít místo trypsinu proteasu Lys-C, která selektivně štěpí pouze za lysinem. Tím je zajištěn dostatečný hmotnostní rozdíl pro kvantifikaci běžnou MS analýzou (39). Tabulka I: Kombinace reagencií pro kvadruplex formaldehyd redukční činidlo hmotnost značky (Da) 1 formaldehyd-d0 NaCNBH formaldehyd-d0 NaCNBD formaldehyd-d4 NaCNBH formaldehyd-d4 NaCNBD 3 34 Těmito kombinacemi dosáhneme až čtyř různých značek s hmotnostním posunem o 2, 4 a 6 Da. Posledním vylepšením této metody je použití formaldehydu, který obsahuje, jak čtyři deuteria, tak i uhlík 13 C. Tento typ je vhodný pro vytvoření triplexu, kde lehká forma je tvořena z nemodifikovaných sloučenin a střední je kombinací formaldehydu (-d 4 ) a nemodifikovaného redukčního činidla. Nová těžká forma se v tomto případě skládá z formaldehydu (-d 4 ) s modifikovaným uhlíkem a kyanoborodeuteriem (Obr. 9). Hmotnostní posun je v tomto typu značení o 4 Da, což umožňuje poměrně kvalitní MS analýzu bez častých překryvů izotopových obálek. Obrázek 6: Uspořádání reagencií pro triplex (40): Tři různé formy lišící se o 4 Da. 'Light' je "lehká", 'intermediate' je "střední" a 'heavy' je "těžká" forma. 29

30 Jedinou komplikací této metody je posun retenčních časů v chromatogramu, způsobený přítomností deuterií namísto vodíků v přidaných methylových skupinách. Retenční čas (RT retention time) může napomáhat identifikaci peptidů, ačkoliv není pro ni určujícím faktorem. Stejný RT dvou peptidů, naznačuje možnost, že jsou tyto peptidy identické s izotopicky odlišnými značkami. Posun RT, způsobený počtem deuterií, tedy může mít negativní vliv na identifikaci a kvantifikaci peptidů/proteinů. K obecnému využití této strategie, může být navíc úspěšně využita také v kombinaci se specifickými metodami, které slouží ke kvantifikaci PTMs, hlavně pro fosforylované peptidy. Tento přístup zahrnuje IMAC (immobilized metal ion affinity chromatography), TiO 2 afinitní chromatografii a stejně tak i imunoprecipitaci peptidů obsahujících fosforylované tyrosinové zbytky (36). 30

31 3. Cíl práce Tato práce je zaměřena na metody relativní kvantifikace. Vybraná metoda využívající izotopického značení (dimethylace) byla navržena tak, aby vyhovovala kvadruplexovému uspořádání. Metoda přípravy vzorku spojená s enzymatickým štěpením FASP byla provedena na 10kDa a 30kDa cut off filtrech. Jako vzorky byla použita pylová zrna (EPP částice) z rostliny Nicotiana tabacum. Cílem této práce bylo posoudit použitou metodu z hlediska spolehlivosti. Dalším cílem bylo zhodnotit vliv zpracování vzorku na kvantifikaci proteinů a zhodnotit míru variability jednotlivých fází zpracování vzorku předcházejícího hmotnostně spektrometrické analýze a to: 1) příprava biologického materiálu včetně lýze vzorků 2) metoda FASP odstranění nízkomolekulárních kontaminant a enzymatické štěpení 3) značení vzorků izotopickými značkami dimethylace a vlastní MS analýza 31

32 4. Praktická část 4.1 Materiál a metody Chemikálie Acetonitril ACN (Fluka, St. Louis, Missouri, USA) Acetát sodný NaAc (Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, USA) Dithiotreitol DTT (Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, USA) Dodecylsíran sodný SDS (Serva, Heidelberg, Germany) Formaldehyd H 2 (Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, USA) Formaldehyd D 2 (Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, USA) Formaldehyd C 13, D 2 (Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, USA) Hydrogenuhličitan amonný AB (Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, USA) Hydroxid amonný (Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, USA) Iodoacetamid IAA (Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, USA) Kyanoborohydrid sodný (Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, USA) Kyanoborodeuterid sodný (Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, USA) Kyselina chlorovodíková HCl (Penta, Praha, ČR) Kyselina mravenčí FA (Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, USA) Kyselina octová AA (Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, USA) Močovina (Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, USA) TRIS 2-Amino-2-hydroxymethyl-propan-1,3-diol (Serva, Heidelberg, Germany) Trypsin (Promega, Fitchburg, wisconsin, USA) Tryptofan (Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, USA) 32

33 4.1.2 Biologický materiál Biologický materiál byl obdržen od Dr. Saida Hafidha z Laboratoře biologie pylu, Ústavu experimentální botaniky, Akademie věd ČR, Praha Vzorky byly extrakty z pylových zrn rostliny Nicotiana tabacum, označované jako EPPs (EDTA/pyromycin rezistentní částice). Pylová zrna byla získána z rostlin, které byly pěstovány podle Honys a spol (41) Extrakce EPP částic začala homogenizací mg nezralého pylu nebo pylového stádia a 200 µl homogenizačního pufru (LS pufr 200mM Tris-HCl ph = 9, 25mM KCl, 60mM MgOAc, 2mM DTT, 0,5mM PMSF, 1% PTE, 1mM Cykloheximid, 250mM sacharosa) ve vymrazené sterilní třecí misce s dusíkem. Postupně byl LS pufr přidáván do konečného množství 8 ml. Takto zpracovaný homogenizát byl centrifugován v centrifugační zkumavce při rpm a 4 C po dobu 10 min (Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, USA rotor 1214-H). Supernatant byl přenesen opět do nové sterilní centrifugační zkumavky (9,5ml) a opět centrifugován při rpm a 4 C po dobu 15 min. Během centrifugace bylo pipetováno µl 30% sacharosové vrstvy v LS gradientovém pufru (40mM Tris-HCl ph = 9, 15mM KCl, 30mM MgOAc, 2mM DTT, 0,5mM PMSF, 1mM Cykloheximid, 60% sacharosa) do ultracentrifugační zkumavky (Beckman Bottle Sasy, PC 10,4 ml, Beckman Coulter Czech republic s.r.o., Praha, ČR) a po centrifugaci byl na tuto vrstvu opatrně přenesen supernatant. Poté probíhala centrifugace při rpm a 4 C po dobu 3 hod a 20 min. Sediment byl rozvolněn v HSEP pufru (200mM Tris-HCl ph = 9, 500mM KCl, 2mM MgOAc, 2mM DTT, 50mM EDTA, 0,5mM PMSF, 1% PTE, 0,2mM Puromycin, 250mM sacharosa) pomocí tyčinky a vortexu (30 min, 4 C). Homogenizát byl nanesen na µl 30% sacharosové vrstvy v HSEP gradientovém pufru (400mM Tris-HCl ph = 8,5, 200mM KCl, 1mM MgOAc, 2mM DTT, 0,5mM PMSF, 50mM EDTA, 0,2mM Puromycin, 30% sacharosa) a centrifugován (Beckman Coulter Czech republic s.r.o., Praha, ČR rotor 70,1 Ti) při rpm a 4 C po dobu 3 hod 20 min. Výsledný sediment představoval izolované EPP částice, které byly dále uchovávány při - 80 C. Tyto extrakce byly prováděny přímo v Laboratoři biologie pylu, ÚEB AV ČR v Praze. 33

34 4.1.3 Měření ph Všechna měření ph byla provedena elektrodou InLab Routine Pro-ISM, na přístroji SevenCompact ph/ion S220 (Mettler Toledo, Kolumbus, OH, USA), který je schopen měřit ph v rozsahu Před každým měřením byl přístroj kalibrován pomocí kalibračních roztoků pro potřebnou ph oblast (dvoubodová kalibrace). Přibližné měření ph bylo prováděno pomocí univerzálních indikátorových ph papírků 0-12 (Lach-Ner, Neratovice, ČR) Lýze vzorků Nejprve byla provedena lýze vzorků v SDT pufru, který se skládá ze 4% (w/w) SDS, 0,1M DTT, 0,1M Tris-HCl ph = 7,6. Peletky byly třepány v 200 µl SDT pufru po dobu 1,5 hod, při 1200 rpm a 25 C na Thermomixer comfort (Eppendorf, Hamburk, Německo). Pro odstranění pevných částí peletu byly vzorky centrifugovány po dobu 1 hod při x g a 20 C na centrifuze 5417R (Eppendorf, Hamburk, Německo). Odebraný supernatant byl použit pro další postup a pro měření koncentrace na spektrofluorimetru. Obrázek 7: "Cut off" filtry pro FASP (42) Měření koncentrace proteinů pomocí autofluorescence tryptofanu Pro zjištění koncentrace proteinů v lyzátech EPP částic byla využita autofluorescence aminokyseliny tryptofanu. Podmínky měření (tab. II) jsou dány fluorescenčním chováním tryptofanu excitační maximum 295 nm a emisní maximum 353 nm (43). Fluorescence byla měřena v křemenné kyvetě na přístroji FluoroMax -4 Bench-top Spectrofluorometer (HORIBA Jobin Yvon, Longjumeau, Francie). 34

35 Tabulka II: Podmínky měření fluorescence podmínky měření excitační 295 nm emisní nm odečítání emise 360 nm velikost štěrbiny 2 mm teplota 25 C Před měřením vlastních vzorků byla změřena kalibrační křivka pro tryptofan. Standard tryptofanu byl ředěn na příslušné koncentrace 8M močovinou připravenou v 20mM Tris-HCl pufru (ph = 7,6). Rozsah kalibrační křivky byl 0 1 ng/µl. Pro měření fluorescence vzorku bylo použito 15 µl vzorku v SDT pufru, ředěných 1: 8M močovinou v 20mM Tris-HCl (ph = 7,6). Změřená intenzita fluorescence byla dle kalibrační křivky přepočtena na množství tryptofanu v měřeném vzorku. Tento postup byl převzat a upraven podle Wiśniewski a spol (44) FASP Na cut off filtry Vivacon 500 (Vivaproducts, Littleton, MA, USA) s celulosovou membránou Hydrosart 10 a 30kDa byly naneseny alikvoty odpovídající 150 µg proteinů (podle koncentrace zjištěné u konkrétního vzorku bylo doplněno do 40 µl SDT pufrem viz.tab VI v sekci 4.2). Tyto filtry byly označeny jako B (B10 nebo B30 dle použitého filtru). Pro vytvoření technických replikátů bylo ze supernatantů jednotlivých vzorků odebráno a smícháno 310 µg proteinů ( zásobní roztok 1 ). Z něj pak byly pipetovány na FASP kolonky označené jako T (T10 nebo T30 dle použitého filtru) alikvoty odpovídající 150 µg proteinů a opět doplněny na 40 µl SDT pufrem. Dále bylo na všechny filtry pipetováno 400 µl 8M močoviny (v 0,1M Tris-HCl ph = 8,5). Takto připravené filtry byly centrifugovány při 20 C a x g (tyto podmínky platí pro všechny centrifugace, není-li uvedeno jinak; 30kDa filtry byly stáčeny po dobu přibližně 15 min a 10kDa filtry po dobu přibližně 30 min). Přídavek 400 µl 8M močoviny (v 0,1M Tris-HCl ph=8,5) a centrifugace byl následně 2x zopakován. Dalším krokem byla redukce a alkylace cysteinů. Na filtr bylo dále přidáno 400 µl 0,1M DTT a mícháno v termomixéru po dobu 1 min při 25 C a 600 rpm. Poté bylo zastaveno míchání a inkubace při 25 C probíhala dalších 20 min pro dokončení redukce. Redukční směs byla odstraněna centrifugací a dále byly filtry promyty 400 µl 8M 35

36 močoviny. Pro alkylaci cysteinů bylo použito µl čerstvě připraveného 50mM IAA filtry byly míchány při 600 rpm a 25 C po dobu 1 min ve tmě. Další inkubace bez třepání probíhala opět ve tmě po dobu 20 min při 25 C. Přebytek alkylačního činidla byl odstraněn centrifugací a následovalo promytí 8M močovinou. V dalším kroku byly filtry propláchnuty pomocí 50mM AB 1x400 µl AB a 2x 200 µl AB. K proteinovému vzorku na filtru byl přidán trypsin v poměru 1: (trypsin:proteiny), který byl doplněn do množství 50 µl 50mM rozstokem 50mM AB. Filtr byl omotán parafilmem pro zamezení vyschnutí. Digesce probíhala po dobu 14 hod při 40 C v termomixéru za mírného třepání (300 rpm). Poté se teplota snížila na 4 C pro ukončení štěpení a uchování vzorku pro další postup. Po digesci byl filtr přesunut do nové zkumavky a k naštěpeným peptidům na filtru byl přidán roztok B6E (směs 6 proteinů, Bruker; 5 µl) o koncentraci 1 pmol/ µl (20% ACN a 1% FA). Pro promíchání byl filtr umístěn na 30 min do termomixéru s mírným třepáním (300 rpm; 4 C). Výsledné peptidy byly centrifugací přeneseny do spodní zkumavky a filtr byl následně dvakrát propláchnut 50 µl 50mM AB. Výsledný objem peptidových směsí z jednotlivých FASP kolonek byl přibližně 150 µl. Peptidové směsi z FASP zpracování byly zahuštěny pomocí Speedvac Concentrator model SPD111V-230 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Zakoncentrování bylo prováděno 20 min při teplotě 35 C, objem se snížil přibližně na jednu třetinu původního objemu Měření koncentrace peptidů pomocí nanofotometru Koncentrace peptidů byla měřena na přístroji Nanophotometer TM P Class (P300) (Implen, Mnichov, Německo). Absorbance byla měřena pro 280 a 320 nm použit byl nástavec LID 10. Pro měření byl pipetován vzorek o objemu 3 µl. Pro výpočet koncentrace byl použit vzorec (45) a univerzální faktor A280 pro BSA: c = (Abs280 Abs320) * faktor A280 * LID faktor c koncentrace Abs280 absorbance při 280 nm Abs320 absorbance při 320 nm LID faktor = 10 (použití 1 mm víčka) faktor A280 univerzální pro BSA = 1,45 (45) 36

37 4.1.8 Dimethylace Pro značení byl z každé řady (B10, B30, T10 a T30) a provedení (1. až 4.) pipetován do vlastní čisté zkumavky objem odpovídající 20 µg celkového množství peptidů a tento objem byl doplněn pomocí 50mM AB na celkový objem 20 µl. Mimo těchto šestnácti zkumavek byly zakoncentrované alikvoty peptidových směsí (T1 T4) použity pro vytvoření zásobního roztoku 2 a to zvlášť pro varianty s 10kDa a 30kDa FASP kolonkami. Ze zásobního roztoku 2 pak bylo dle vypočtené koncentrace peptidů opět pipetováno 20 µg celkového peptidového množství do 4 nových zkumavek pro 10kDa i 30kDa variantu a objem byl pomocí 50mM AB doplněn na 20 µl (řada P). Směsi peptidů v 50mM AB byly ředěny acetátovým pufrem na celkový objem µl. Acetátový pufr (ph = 6, 0,5M) byl připraven smícháním 0,5M kyseliny octové a 0,5M acetátu sodného v poměru 52,2:947,8. Peptidové směsi byly značeny po čtveřicích pomocí kvadruplexu s využitím značených a neznačených formaldehydů a redukčních činidel (Tab. III). Ke vzorkům v acetátovém pufru bylo nejdříve přidáno 10 µl 4% formaldehydu a poté 10 µl 1M redukčního činidla). Po 5 min byla reakce ukončena přídavkem 10 µl 4% hydroxidu amonného (NH 4 OH). Tabulka III: Rozdělení vzorků pro kvadruplex lehká medium + 2 medium + 4 těžká 1B30 1B10 2B30 2B10 3B30 3B10 4B30 4B10 1T30 1T10 2T30 2T10 3T30 3T10 4T30 4T10 1P30 1P10 2P30 2P10 3P30 3P10 4P30 4P10 formaldehyd-d0 formaldehyd-d0 formaldehyd-d4 formaldehyd-d4 NaCNBH 3 NaCNBD 3 NaCNBH 3 NaCNBD 3 Po ukončení značení byly smíchány vždy čtyři vzorky (stejné řady) v poměru 1:1:1:1 a k výslednému roztoku bylo přidáno 25 µl 5% kyseliny mravenčí MS analýza LC-MS/MS analýzy naznačených peptidových směsí (3 analýzy na vzorek) byly provedeny na RSLCnano systému spojeném s hybridním hmotnostním spektrometrem 37

38 Orbitrap Elite (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Před samotnou LC separací, byly tryptické digesty online koncentrovány a odsolovány ne předkolonce ( μm 30 mm) naplněné sorbentem X-Bridge BEH 130 C18 (velikost částic 3,5 μm, Waters, Milford, MA, USA). Po promytí zachytávací kolony 0,1% FA, byly peptidy eluovány (průtok 300 nl/min) na analytickou kolonu Acclaim Pepmap C18 column (75 μm 250 mm; velikost částic: 2 µm; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) pomocí níže uvedeného gradientového programu, kde mobilní fáze (MF) A představuje 0,1% FA ve vodě a mobilní fáze B je složena z ACN:methanol:2,2,2-trifluoroethanol (6:3:1; v/v/v) obsahující 0,1% FA. Gradientová eluce začala na 1% MF B a během prvních 220 min se zastoupení MF B zvyšovalo z 1% až na 40% (1% v 5. min, 25% ve 160. min a 40% ve 220. min), v následujících 5 minutách se zastoupení MF B lineárně zvýšilo ze 40% na 80 % a v tomto stavu setrvalo dalších 15 min. Ekvilibrace zachytávací a analytické kolony byla provedena před dávkováním vzorku do dávkovací smyčky. Výstup z analytické kolony byl přímo spojen s iontovým zdrojem Nanospray Flex Ion Source (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). MS data byla získána data-závislou strategií vybírající až 20 prekurzorů z MS skenu (rozsah m/z, rozlišení pro 400 m/z, akumulace iontů po dobu maximálně 200 ms, jeden mikrosken). Pro MS/MS spektra měřená v lineární iontové pasti hybridního hmotnostního spektrometru bylo akumulováno iontů po dobu maximálně 50 ms s izolačním oknem 2 m/z. CID (collision induced dissociation; relativní energie 35%) fragmentace byla použita pro zisk fragmentů prekurzoru. MS/MS spektrum bylo získáno v rozsahu dle m/z a náboje prekurzoru v rychlém režimu skenování. Měření MS/MS bylo provedeno paralelně s průběhem záznamu MS spektra v Orbitrap analyzátoru. Dynamická exkluze prekurzorů byla povolena po dobu 45 s po jednom měření MS/MS spektra. Analýza MS a MS/MS dat byla provedena pomocí softwaru Proteome Discoverer (verze 1.3) s využitím prohledávacího programu Mascot. Mascot hledání bylo provedeno proti proteinové databázi UniRef (taxonomie Green Plants; databáze stažena z Hmotnostní tolerance byla nastavena pro peptidy 5 ppm a pro MS/MS fragmenty 0,5 Da. Pro všechna hledání byla nastavena jako variabilní modifikace oxidace methioninu a maximálně jedno přeskočené štěpné místo enzymu (trypsin). Varianty dimethylových značek byly postupně nastaveny ve čtyřech oddělených Mascot hledáních jako statické modifikace spolu s karbamidomethylací cysteinu. Percolator implementovaný v programu Proteome Discoverer byl použit pro závěrečné 38

39 zpracování výsledků Mascot prohledání (q-value zvolena jako hodnotící kritérium statistické významnosti). Pouze peptidy s peptidovým skóre odpovídající falešně pozitivní míře (FDR) peptidové identifikace menší než 1%, s pořadím identifikace 1 a peptidy dlouhé alespoň 6 aminokyselin, byly uvažovány v dalším vyhodnocování Analýza dat Pro identifikované peptidy byly programem Proteome Discoverer konstruovány extrahované chromatogramy (tolerance od experimentálně pozorované m/z 2 ppm) a výsledné píky peptidů byly integrovány. Poměry ploch pro jednotlivé peptidy byly exportovány a zpracovány pomocí aplikace Microsoft Excel (Microsoft). Pro analýzu byly vybrány peptidy, které obsahovaly dvě dimethylové skupiny, tedy peptidy, které měly jako C-terminální aminokyselinu lysin. Peptidy, které byly štěpeny za argininem, byly z analýzy vyřazeny z důvodu většího překryvu izotopových obálek. Pro každý peptid a poměr byl počítán průměr ze tří LC-MS/MS analýz. Před hodnocením peptidových poměrů byly tyto poměry normalizovány na základě mediánu ze všech pozorovaných peptidových poměrů. V případě hodnocení proteinových poměrů byly nejdříve vypočteny proteinové poměry na základě nenormalizovaných peptidových poměrů. Následně byl pro každý vzorek a poměr zjištěn medián ze všech proteinových poměrů a ten byl použit pro normalizaci původních peptidových poměrů. Normalizované peptidové poměry byly použity pro výpočet normalizovaných proteinových poměrů 39

40 4.2. Výsledky a diskuse Tato práce byla zaměřena na určení a zhodnocení variability jednotlivých fází postupu pro relativní kvantifikaci vzorků (EPP částice z pylu tabáku) předcházejících MS analýzu. Byly hodnoceny tři části procesu zpracování a to: 1) značení vzorků izotopickými značkami (dimethylace) a LC-MS/MS analýza (řada P); 2) metoda FASP (odstranění nízkomolekulárních kontaminant a enzymatické štěpení) včetně následujícího značení a LC-MS/MS analýzy (řada T) a; 3) kompletní postup zpracování vzorků EPP a to včetně jejich přípravy, lýze a kroků zahrnutých v bodě 2 (řada B). Jednotlivé fáze byly zpracovávány odděleně za stejných podmínek ve čtyřech kopiích (viz.obr.11), aby bylo možno na konci experimentu použít pro značení vzorků dimethylací kvadruplexové uspořádání a poměry jednotlivých forem peptidů následně použít pro zhodnocení variability metody s hrubou lokalizací jejich zdrojů. Lokalizace zdrojů může být využita pro další optimalizaci této metody kvantifikace proteinů, která bude využívána pro další výzkum Design experimentu Experiment byl navržen tak, aby bylo možné zhodnotit vybrané části kompletního postupu zpracování vzorků EPP částic z pohledu vnesené variability (Obr. 11). Pro experiment byly vzaty 4 vzorky EPP částic (EPP1 EPP4), které byly připraveny totožným způsobem, ale paralelně bez vzájemného ovlivnění. Celkový postup zpracování vzorku EPP částic obsahoval následující kroky (viz. obr. 11): 1) lýze EPP částic 2) přenesení alikvotu lyzátu EPP částic na FASP kolonku 3) FASP procedura zahrnující výměnu roztoku (SDT pufr zaměněn za roztok močoviny), redukci a alkylaci proteinů (blokace cysteinů), digesci proteinů pomocí trypsinu a vypláchnutí výsledných peptidů skrz filtr FASP kolonky do čisté zkumavky 4) přenesení alikvotu tryptických peptidů do čisté zkumavky 5) značení peptidů pomocí dimethylace 40

41 6) spojení naznačených peptidů jednotlivých vzorků dané řady (P, T, B) v poměru 1:1:1:1 7) LC-MS/MS analýza spojených peptidových směsí tři LC-MS/MS analýzy na finální vzorek FASP procedura (krok 3) se prováděla s použitím FASP kolonek s 10kDa a 30kDa filtry (další zpracování peptidů po FASP kroku se provádělo paralelně pro 10kDa a 30kDa variantu). Kompletní postup pro zpracování EPP částic byl proveden pro řadu B. U řady T byl jeden identický lyzát EPP částic zásobní roztok 1 vytvořený smícháním alikvotů vzorků (EPP1 EPP4) paralelně zpracován od FASP procedury (kroky 3 6 viz. obr. 11). V případě řady P pak bylo provedeno paralelně pouze značení identické směsi peptidů (krok 5). Řada P by tak měla odrážet variabilitu způsobenou značením peptidů, LC-MS/MS analýzou a vyhodnocením LC-MS/MS dat. U řady T je navíc zohledněn také vliv FASP procedury. V případě B řady je pak zahrnuta také lýze EPP částic a vlastní příprava biologického vzorku. 41

42 Obrázek 8: Design experimentu: čtyři paralelně připravované vzorky: 1. lýze EPP částic; 2. rozpipetování lyzátu na 8 cut off filtrů (8x 10kDa a 8x 30kDa); 3. FASP; 4. rozpipetování na 12 peptidových směsí (12x pro variantu po FASP s 10kDa a 12x pro variantu po FASP s 30kDa filtry); 5. dimethylace; 6. smísení značených peptidů stejné řady; 7. LC-MS/MS analýza a zpracování dat Měření koncentrace proteinů pomocí autofluorescence tryptofanu a FASP Vzorky EPP částic byly lyzovány v SDT pufru. Po centrifugaci byla v odebraném supernatantu měřena koncentrace proteinů pomocí autofluorescence. Vnitřní fluorescence buněk je dána některými biomolekulami, mezi které patří i proteiny. Jejich fluorofory jsou tryptofan, tyrosin a fenylalanin. Fenylalanin se na fluorescenci téměř nepodílí, fenolový 42