Im unologická diagnostika a monitorování

Transkript

1 Im unlgická diagnstika a mnitrvání léčeb né dpvě di u nádrvých nemcnění krvetvrby v dětském věku MUDr. Ester Mejstříkvá Šklitel: Dc. MUDr. Ondřej Hrušák, Ph.D Univerzita Karlva v Praze 2. lékařská fakulta 2008

2 UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE, v, 2. LEKARSKA FAKULTA V PRAZE D IZERTAČNÍ PRÁCE 2008 MUDr. Ester Mej stříkvá

3 E. Mejstříkvá, strana 1 Imunlgická diagnstika a mnitrvání léčebn é dpvědi u nádrvých nemcnění krvetvrby v dětském věku l.l. Akutní lymfblastická leukémie Prgnstické faktry a klasifikace ALL Imunlgická klasifikace ALL I. ALL z prekurzrů B Iymfcytů (BCP ALL) ALL z prekurzrů T Iymfcytů (T ALL) Gentypvá klasifikace ALL II Genetické pdtypy BCP ALL Genetické pdtypy T ALL Klinické a bilgické prjevy ALL při diagnóze Bilgické prjevy ALL Fannakgenetika AL L Princip terapie AL L Odpvěď na léčbu ALL Kmpletní remise Krelace pčtu blastů v den 8 v periferní krvi p krtikidvé před fázi - prednisnvá dpvěď Hdncení pklesu bla s tů v kstní dřeni před dsažením remise Minimální reziduální nemc (MRN) P řístup k pacient m s relapsem ALL a k primárně vysce rizikvé ALL Indikace transplantace kstní dřeně (SCT) u pacientů v první kmpletní remisi ALL _ J Přístup k pacientům s fúzním genem BCR! ABL Přístup k pacientům s vysce rizikvu T ALL 19 I. J.2.4. P řístup k pacient ům s relapsem ALL Akutní myelidní leukémie (AML) J. Prgnstické faktry a klasifikace AML Imunlgická klasifikace AML Gentypvá klasifikace, epigenetické změny u AML a jej ich význam pr terapii AML s fúzním genem AMLI /ETO, CBF/MYH II a PMLlRARa AM LlMDS u pacientů s knstitutivní trizómií 21 (m. Dwn) AM L spřestavbamigenumll(llq23) AM L s FL T3 interní tandemvu duplikací (ITD) neb aktivační mutací FL T3(D835) Klinické a bilgické prjevy AML, primárně extramedulární leukémie Farmakgenetika AML Princip léčby AML, perspektivní nvá léčiva Léčba AML M3 s fúzním genem PML/RARa 28 J.2. J.5.2. Imunterapie AML Inh ibitry kináz Inh ibitry histn deacetyláz, demetylující látky, terapeutické vlivnění epigenetických změn u leukemických buněk Nvá cytstatika Odpvěď na léčbu AML, terapeutické vlivnění leukemické kmenvé buňky Odpvěď na léčbu definvaná mrflgicky Mlekulárně genetické a cytgenetické cíle detekce MRN Princip detekce MRN cytmetricky u AML Přístup k pacientům s relapsem AML a k primárně vysce rizikvé AML 33 2 N Výsledky a Diskuse Imunlgická diagnstika ALL J.1. ALL z prekurzrů B Iymfcytů (BCP ALL) I.2. Aberantní exprese antigenů Akutní hybridní leukémie 38

4 E. Mejstříkvá, strana 2 3.IA. Leukémie s nálezem blastů z různých linií a linivý přesmyk během časné fáze léčby před dsažením kmpletní remise Imunlgická diagnstika terapeutických cílů na leukemické buňce. Anti-CD33 léčba, perspektiva využití dalších mnklnálních prtilátek v léč bě dě tské ALL Léčba leukémie, mnitrvání účinnsti léčby Hdncení minimální reziduální nemci Imunfentypvá detekce MRN u ALL Cytmetrická reziduální nemc v mezinárdní studii Mini-Mini Mlekulárně genetická detekce MRN u ALL Sledvání MRN u ALL pmcí přestaveb imunreceptrvých gen ů (lgitcr) Sledvání MRN u ALL pmcí fúzních genů Nepřímé sledvání MRN pmcí chimérismu p algenní SeT Léčebný prtkl ALL IC-BFM 2002 pr primární léčbu de nv ALL Detekce MRN p relapsu ALL a u pacientů indikvaných k algenní SCT A. Detekce MRN u pacientů s AML 56 Závěr Myelidní antigeny u ALL 56 Význam diferenciačníh antigenu CD10 57 Minimální reziduální nemc Seznam zkratek 57 Lliffura M 6.1. Pužitá literatura Přilžené publikace simpact faktrem 77 Přílha I 77 Crrelatin f CD33 with prer prgnsis in childhd ALL implicates a ptential f anti-c D33 frntline therapy 77 Př ílha 2 82 Transfer f genmics infrmatin t tlw cytmetry: expressin f C D27 and C D44 discriminates subtypes f acute lymphblastic leukemia 82 Přílha 3 86 Mye lid antigens in childhd Iymphblastic leukemia:clinical data pint t regulatin fcd66c distinct frm ther myelid antigens 86 Přílha 4 98 Residual disease mnitring in childhd acute myelid leukemia by multiparameter tlw cytmetry: the MRD-AML-BFM study grup 98 Přílha Detectable minimal residual disease befre allgeneic hematpietic stem cell transplantatin predicts extremely pr prgnsis in children with acute Iymphblastic leukemia 106 Přílha B-cell recstitutin after allgeneic stem cell transplantatin impairs minimal residual disease (MRD) mnitring in children with ALL 115 Přílha Minimal residual disease (MRD) analysis in the nn-mrd-based ALL lc-bfm 2002 prtcl fr childhd ALL: is it pssible t avid MRD testing? 116 Přílha CD44 and CD27 del ineate B-precursr stages with different recmbinatin status and with an uneven distributin in nnmalignant and malignant hematpiesis 126 Příl ha Childhd secndary ALL after ALL treatment 13 7 Přílha Allgeneic stem cell transplantatin in children with leukemia using human leukcyte antigenmismatched unrelated dnrs Přilžené publikace před desláním 151 Přílha II 151

5 E. Mejstříkvá, strana 3 Detectin f residual B precursr lymphblastic leukemia by unifrm gating flw cytmetry Přilžené publikace bez impakt faktru 163 Přílha lmunfentypizace d ětskýc h leukémií 163

6 E. Mejstříkvá, strana 4 Im unlgická diagnsti ka a mnitrvání léčebné d pvědi u nádrvých n emc n ě ní krvetvrby v dětském vě ku 1. Úvd Mezi základní pdtypy maligních nemcnění krve tvrby u dětí patří především akutní leukémie. U dětí leukémie tvří nejčastější maligní nemcnění. Leukémii lze definvat jak skupinu chrb, u kterých genetické změny v nezralé krvetvrné buňce vedu k růstvé výhdě a/neb pruše apptózy. Nejčastějším pdtypem u dětí je leukémie z lymfcytámích prekurzrů (ALL), která tvří asi 77% ze všech leukémií. Další pdtypy maligních nemcnění krvetvrby u dětí jsu: akutní myelidní leukémie (AML), která tvří asi 11 %, chrnická myelidní leukémie (2-3%) a myeldysplastický syndrm (1-2%). Léčebný úspěch u dětské ALL představuj e jednu z nejúspěšnějších kapitl medicíny minuléh stletí, v průběhu 40 let, kdy na pčátku byla prakticky nulvá šance na vyléčení, se daří v sučasnsti více než 80% pacientů dluhdbě vyléčit. Již d pčátku léčby ALL je snaha pacienty c n jvíce stratifikvat pdle míry rizika selhání l éčby. AML je na rzdíl d dspělých u dětí vzácná a výsledky jsu přes pdstatně agresivnější léčbu prti ALL stále neuspkjivé. Myeldysplastický syndrm (MOS) je v dětském věku velmi vzácné nemcnění, s dlišnu bilgií nemci d dspělých a v léčbě u dětí se uplatňuje především algenní transplantace kstní dřeně (SCT). V rámci diferenciální diagnózy MOS a akutních leukémií je nutné zmínit i aplasticku anémii, nemcnění vznikající na pdkladě autimunitníh pškzení kmenvých buněk kstní dřeně J. Sledvání redukce nádrvé masy (reziduální nemci) metdikami přesnějšími a citlivějšími, než je klasická ptická mikrskpie, je čím dál důle ž itějším parametrem stratifikace pacientů v mderních léčebných prtklech. Nejčastěji pužívanými metdikami jsu u ALL sledvání klnálních přestaveb genů pr imunglbuliny a T -buněčné receptry (lg/tcr) pmcí kvantitativní PCR (RQ PCR) a průtkvá cytmetrie. U AML lze u části pacientů pužít pr detekci MRN fúzní geny (AMLlIETO, PMLlRARa, CBF / MYHl1) neb průtkvu cytmetrii. Přes svji relativní eknmicku nenárčnst a dstupnst je ale cytmetrie stále metdu pužívanu pr MRN pměrně mál, všechny dsud publikvané práce jsu bud' mezené na jednu instituci, či jednu centrální labratř. Jedním z důvdů je i nedstatečná standardizace tét kmplexní metdiky. V rámci svéh pstgraduálníh studia jsem se zabývala zapjením

7 E. Mejstříkvá, strana 5 prutkvé cytmetrie a její standardizací v kntextu dalších metd u hematlgických malignit v dětském věku Akutní lymfblastická leukémie v České republice nemcní rčně přibližně dě tí. Prgnóza dětí v ČR je srvnatelná se světvými výsledky. U naprsté většiny pacientll neznáme pře sně etilgii nemci, vzhledem ke kumulaci nemcnění u dětí v předšklním věku lze čekávat, že významnu úlhu v leukemgenezi hraje pstupné setkávání se s infekcemi a závislé na lymfcytech 2. získávání adaptivní imunity U menšíh pčtu pacientů jsme schpni identifikvat geneticku pruchu, která je spjená s vyšší incidencí ALL. Typicky se jedná geneticky pdmíněné pruchy kntrly buněčnéh cyklu (např. Bl m ů v syndrm, ataxia teleangiectasia, Nijmegen breakage syndrme) ALL rv něž může vzniknut jak sekundární nemcnění p nklgické léčbě pr jinu malignitu (včetně ALL) (sekundární ALL p léčbě ALL shrnujeme v přílze 9) Za pstupným zlepšváním prgnózy dětí s ALL stály především randmizvané studie. Hlavní pdíl na nynější úspěšnsti mají přitm léky bjevené před rkem V sučasnsti se pstupně d léčby dstávají nvá léčiva, čast cíleně namířená na struktury leukemických buněk (mnklnální prtilátky, inhibitry tyrsinkináz). Tat lé čiv a v sučasns ti se ale pužívají u specifických pdtypů leukémie (např. BCRlABL pzitivní ALL) neb u nemci refrakterní na klasicku léčbu Prgnstické faktry a klasifikace ALL Mrf lgická klasifikace - rzlišení zralé a prekurzrvé BALL Nej starší dělení je na Ll, L2 a L3 subtyp (L 1 - hmgenní malé blasty, L2 - blasty různé veliksti, L3 - typická je vakulizace s intenzivní bazfilní cytplazmu při barvení pdle Wright - Giemsy). Diagnsticky a léčebně je důležitý zejména pdtyp L3, který dpvídá imunlgicky zralé B leukémii (leukemizvaný nn hdgkinský Iymfm (NHL) Burkittva typu s více než 25% infiltrací kstní dřeně neb periferní krve nádrvými buňkami). U zralé BALL se pužívá jiná léčebná strategie prti typické ALL, s pužitím krátkých intenzivních blků chemterapie, nesprávné zařazení může vést k selhání léčby a následnému relapsu nemcnění 7. Cytgeneticky asi u 85% pacientů se zralu B leukémií nacházíme typicku translkaci t(8; 14)(q24;q32), u zbývajících pacientů nacházíme translkace t(2;8)(pll;p24) a t(8;22)(q24;q l l) Translkace mají splečné t, že se prtnkgen MYC přesuvá d blasti gen ů, včetně jejich prmtrů, pr těžký neb lehké řetězce imunglbulinů. Diagnsticky svízelný m ů že být nález tzv. "transitinal" praeb ALL s pzitivitu

8 E. Mejstříkvá, strana 6 pvrchvéh IgM (ll řetězec) /0 a někdy i s expresí jednh z lehkých řetězců (kapa neb lambda), zpravidla však ne na všech blastech. N ěkd y s u č asně mrflgicky nacházíme i vzhled připmínající L3. Publikvaných dat je mál, nicméně cytgeneticky nenacházíme výše zmíněné přestavby MYC prtnkgenu typické pr zralu BALL ll. 12. U takt sprných případů je klíčvá infrmace z cytgenetickéh vyšetření a případná léčba nemcnění je indikvána pdle ní. Sučasná pzitivita lehkéh řetězce kapa a lambda je zpravidla artefaktem, způsbeným nízku tepltu při transprtu vzrku. Diagnstické rzpaky při pdezření na leukémii může rvněž přinést zvýšený pčet tzv. hematgnů v kstní dřeni u pacientů s regenerující hematpézu (např. při virvém infektu neb p chemterapii), které mhu připmínat blasty ALL. Tyt hematgny v pdstatě představují zmnžené prekurzry B lymfcytů, imunfentypizace je v těcht situacích dkáže správně dlišit d fentypu leukemických buněk /3. Nejzralejší stádia těcht B prekurzrů (zpravidla slabě CDlOpZ a jasně CD20 P0 7.) lze nalézt v malém pčtu i v periferní krvi /4, částečně tyt buňky dpvídají ppulaci tzv. "transitinal" B lymfcytů / Imunlgická klasifikace ALL Leukemické buňky jsu částečně imunfentypvě pdbné svým nemaligním prtějškům, částečně nacházíme v expresi jedntlivých antigenů četné asynchrnie a aberace dlišující je d nemaligních buněk. Klasifikaci, kteru v sučasné chvíli pužíváme u dětských ALL vychází z upravené a aktualizvané klasifikace EGIL (Eurpean Grup fr the lmmunlgical Characterizatin f Acute Leukemias/ 6. /7. Diagnsticky důležité je rvněž správné imunlgické dlišení d AML.

9 '1:::s \.::)..... Os:.:.CIl >::l... CIl- "l F?.., 'ť5... C\) t',.s ::a::- 5' t', ::::, t', J... "'= Cll ;:s-. "l< N"'= C\) _. " ;:". -e \.::).. ' N O 5:. (:), ::s-... N " "'" \.::) '" ::::-:.. ;:::... V) ('\:) _ O N t', \.::) t--l< :::-. t',', 6 "'; ;::: Iymphid, prgenitr cell -. C\) \.::) \.::):::- HLA-DR CD34 <. (C0117) f.t prthymcyte "2... HLA-DR t'1 C\) Oe CD34 CD7 E.i -8 Vl ::s- :3. C02.-<: C\),<:, O -<: -<: \.::) <-2. :::=-. C\) t', -- ' "'= <: O ' '--..., t', C\). C\) '" >::l...;:'-. ;::,- t', _ 0 O."'"'... '<:' "'"' ::::-:'1:::s..." "", C\) C\) t', ::s. ::s- t'" C\) \.::) '" \.::)...::"..,... \.::), e- ' ;:; (=;: lc.. II '> II -I II 1 [ t 1 II j,"' 1 r"', I I ----e @-----GY pre-pre-b-cell pre-b-<:el! transitinal intermediate mature (fl.) pst-fllicular immuncyte plasma cell HLA-DR HLA-DR pre-b-cell B-Iymphcyte B-Iymphcyte B-Iymphcyte HLA-DR (HLA-DR) (CD34) (CD34) HLA-DR HLA-DR HLA-DR HLA-DR CD19 CD38 CD19 CD19 CD19 CD19/CD22 CD19/CD22 CD19 CD22 CD138 CD22 CD22 CD22 CD20 CD20 (COllc) CD22 (CD20) C010 CD10 C010 CD37 CD31 g,2) C020 (C031) (C020) (CD20) (C020) Smlg-C079 Smlg-CD79( C031 (C0138) pra-b cmpl&x (COS/CD6) CD10 Smlg-CD79 Smlg-CD79 (C023) (CD38) Ili!l, f( "-ir-i! 'j 1...,11 C ' l 'ífmiiee." (D3) --8CF-1 elj /TCF-l mature helperl activated helperl thymcyte i1ducer inducer T -Iymphcyte CD7 T-Iymphcyte (CD7) CD2 (CD7) CD2 CD5 CD2 CDS CD4 C05 CD4 TCR-CD3 CD4 TCR-CD3 TCR-CD3 HLA-DR CD2S I I I I I. -, I L... L,...1 r"- 1 1 CD7 C02 CDS COS TCR-CD3 (CD16/CD56ICD57) HLA-DR CD25 N, i.'" I I fl (r I j N f<_cl'( II (>'l NKcell CD7 (CD2) (C08) CD16 CD56 (CD 57) (HLA-DR) (rj. C/>... :J :;.;-- O <: J>' C/> ::l '-.J

10 E. Mejstříkvá, strana ALL Z prekurzrů B lymfcytů (BCP A LL) B prekurzrvá leukémie je dminujícím pdtypem ALL jak u dětí, tak i u dspělých. Základní imunfentypvé rzdělení je v tabulce 1, lastní výsledky a pdrbnější rzbr tht pdtypu uvádím v kapitle Kategrie Kritéria Pdtř í da Kritéria B prekurzrvá 2 neb 3 z následuj ících : CD I 9 PO" prb ALL CD I OJ"!; CD20 lleg (intra)cd79apz a CD22 PZ CD3 1leg call CD I Opz intralgm"eg intracd3" eg llg K a A JIt!; praeb ALL intralgmpoz 2 neb 3 z následuj ÍCÍch: CD I 9 Pz, (intra)cd79a Pz a CD22 pz zralá B CD3 neg Bez další subklasifikace intracd3 1l eg PZ K neb A P > v, lb Tabulka 1. Klasifikace ALL Brady, adaptvana pdle EGIL, kteraje pouzlvana " v ramci prtklů skupiny BFM (Berlin - Frankfurt - Munster) pr léčbu dětské ALL ALL Z prekurzrů T lymfcytů (T ALL) T ALL jsu méně častým pdtypem, z dětských leukémií tvří asi 10 až 15%. Čast při diagnóze nacházíme nádrvu infiltraci thymu, veducí k tumru mediastina, který může způsbvat syndrm hrní duté žíly, respektive dušnst na pdkladě bstrukce dýchacích cest /9. Tat nádrvá infiltrace v sbě dráží nrmální vývj T lymfcytů, který právě z větší části prbíhá v thymu. Není nebvyklé, že u těcht pacientů při prvním kntaktu s lékařem nacházíme je š tě nrmální krevní braz a během krátkéh intervalu dchází k tzv. leukemizaci d periferní krve a kstní dřeně. Hranice mezi lymfblastickým lymfmem a ALL je tak dána arbitrárně prcentem 25% blastů v kstní dřeni. Terapeutický přístup je ale v sučasné dbě k běma jedntkám velmi pdbný 20. Retrspektivní analýzu přežití dětí diagnstikvaných s de nv ALL mezi zářim 1996 a srpnem 2006 nevidíme v ČR signifikantní rzdíl mezi T a Bep ALL (brázek 2). Pstupné zlepšvání je například dkumentván v analýze prvedené klegy z Německa u vysce rizikvých T ALL, kde se mezi prtkly ALL BFM 90 a ALL BFM 95 dšl zlepšil přežití bez událsti v 5 letech d diagnózy 20% 2/. Pdle imunfentypu lze T ALL děl it pdle EGIL klasifikace /6.22 na prt, praet, intermediární T a zralu T (tabulka 2)23, tt členění má částečně i prgnstický význam.

11 I E. Mejstříkvá, strana 9 Cmplele + Censred 1,00 11Ir ,95 0,90 0,85 0,80 0,75 0,70 _ 0,65 '" 0,60 0,55 0,50 0,45 0,40 UJ 0,35 0,30 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 L-... rky - T B _ -----' Obrázek. 2. Analýza přežití dětí diagnstikvaných mezi lety 1996 až Rzdíl mezi přežitím pacientů bez událsti s T ALL a BCP ALL není signifikantní (Cx-Mantelův test). Celkem d analýzy zahrnut 582 pacientů (83 T ALL, 499 BCP ALL). Událs/je definvána jak relaps, sekundární malignita neb smrt. Medián sledvání khrty pacientů s T ALL je 3,9 let a BCP ALL 4,4 let. Pravděpdbnst přežití (PEFS) pacientli st ALL v 5 letech je 72%±5%, s BCP ALL 75%±2, I%. Kategrie Kritéria Pdtřlda Kritéria prt ALL pret ALL CD2 neg CDS neg CD8 neg CD2 pz a/neb CDS PZ a/neb CD8 pz TALL intermediámí T ALL CD 1 a (intra)cd3 POZ a P >. CD7 PZ zralá T ALL CD3 PZ CD 1 a"es TCR apz T ALL TCRyů POZ T ALL TCRaPz TCRyP Z Tabulka 2. Klasifikace ALL T rady, adaptvana pdle EG!L prtkhi skupiny BFM pr léčbu dětské ALL.,ktera Je pouzlvana v ramcl v, l b '. v, T ALL lze rvněž členit pdle typu genetických změn (viz kapitla Genetické pdtypy T ALL) 24-26_ Lepší prgnóza u dětí i u dspělých je spjena s pdtypem intermediámí, resp. tzv. "thymic" T ALL 27, 28. Srvnání přežití s pacienty s Bep ALL a rzdělení pdle zralsti T imunfentypu u českých dětí je na brázku 2 a 3. Studie z knce 80. let v rámci studie POG 7865 a 8035 neprkázala asciaci zralsti pdle imunfentypu s prgnózu, ukázala však, že pacienti s nezralu frmu T ALL častěji nedsáhnu kmpletní remise 29. Naše data dkumentují prgnstický význam zralsti T ALL (brázek 3), i když jsu mezena velikstí

12 E. M ejstn vlk va, I strana 10 subru. V rámci prtklů GMALL pr dspěl u ALL (Německ) jsu Je imunfentyp intermediární T ALL jedním z kritérií standardníh rizika 30. Alternativní imunfentypvu klasifikaci, která lépe dráží vývj T řady z phledu přestaveb T buněčnéh receptru pdle našich sučasných znalsti, navrhla skupina pd vedením prfesrky Macintyrvé (tabulka 3) 3/-34. Pdtyp T ALL nezralá T ALL Exprese antigenů Cyt_neg, pvrchvá CD3 neg, TCRaneg a TCRy8 neg pre-ap T ALL Cyt_pz, pvrchvá CD3 neg, TCRaneg a TCRy8 neg TCR-ap T ALL pvrchvá CD3 Pz, TCR-aPz TCR-y T ALL pvrchvá CD3 Pz, TCR- y8 pz Tabulka 3. Klasifikace T ALL pdle Macintyrvé Skupina prfesrky Macintyrvé rvněž prkázala, že s věkem až d pzdní dspělsti přibývá nezralých T ALL a ubývá zralých prekurzrvých frem T ALL, zejména TCR-a 33. Tent jev pravděpdbně suvisí s pstupnu invlucí thymu v průběhu živta O, 9 0,90 0,85 0, , s.. 2:: 0,60 0,55 C mplell! + Cem;Dr.d.! 0,50 _ 0,45! Q ) Ol-S 020 0,1 5 - mbii!'t io - lntermedjme es.rtyt rky Obrázek 3. Prgnóza dětí s de nv T ALL (n=80); pdtypy zralá [ma ture] T n=33, intermediární [intermediary] T n=31 a nezralá [early] T n=17 ('Ihrnující: praet n=16 a pr T n=l), Je zřetelná signfikantně hrší prgnóza skupiny s nezralu T ALL (pefs v 5 letech 44%± /4%) prti skupině s intermediární T ALL (Cx-Mantel, p =O.Ol, pefs skupiny s intermediární T v 5 letech 84%±6, 6%). Rzdíly mezi skupinu nezralu T a zralu T, resp. mezi zralu a intermediární signifikantní nejsu (pefs skupiny se zralu T v 5 letech 76%±7,5%).

13 E. Mejstříkvá, strana Genetické pdtypy BCP ALL Nej častějšími změnami gentypu u dětských leukémií je hyperdiplidie a přítmnst fúzníh genu TEL/AMU. Tyt dvě aberace jsu přítmn y celkem asi u 50% dětských BCP ALL a krelují s dbru prgnózu Pdle něk terý ch studií jsu pr dbru prgnózu hyperdiplidní ALL specificky významné trizómie chrmzómů 4, 10 a 17, cž může být zhledněn i léčebně 39. Hyperdiplidii, respektive hypdiplidii lze krmě klasických cytgenetických metd rvněž stanvit pmcí flurescenčních barviv, schpných stechimetricky vázat nuklevé kyseliny (např. prpidium jdid, DAPl neb HOECI-IST). Zmnžení DNA vyjadřujeme tzv. DNA indexem (pměr mdu GOl fáze aneuplidní ppulace ku mdu G01 fáze euplidní kntrly). Krelace cytmetrickéh DNA indexu s cytgenetickým vyšetřením není stprcentní. Důvdem jedi n ě lý ch diskrepancí m ůž být jak hrší senzitivita cytmetrickéh vyšetření u méně výraznéh zmnžení genetickéh materiálu, tak i pměrně špatná schpnst leukemických buněk prlifervat in vitr, která čast vede k selhání cytgenetickéh vyšetření. Hdnta DNA indexu nad 1,16 a pd 1,6 kreluje s dbru prgnózu u BCP ALL 40 (brázek 5 a 6). Napak hypdiplidie pd 0,8 je spjena s hrší prgnózu, (hypdiplidie «45 chrmzómů) až haplidie (23-29 chrmzómů) 4/. Nález signifikantní hypdiplidie «44 chrm zómů neb DNA index <0,81) kvalifikuje příslušnéh pacienta v některých léčebných prtklech d vyskéh rizika 39. U části pacientů dchází ke zdvjení genetickéh materiálu části hypdiplidníh klnu a nacházíme pak s učasně jak hypdiplidní tak hyperdiplidní kln. Ve studii Nachmana et a!. se tt zdvjení častěji děje u pacientů s pčtem chrmzómů 24 až 29 a méně čast u pacientů s pčtem chrmzómů 33 až 39 4/. Prgnóza pacientů se zdvjeným hypdiplidním klnem je stejně špatná jak u pacientů bez tht zdvjení. Správná identifikace hypdiplidníh klnu je důležitá pr správnu stratifikaci pacientů 42. Nález velmi vyské hyperdiplidie až téměř tetraplidie je velmi vzácná (incidence ze všech ALL asi 1 % až 2%), u BCP ALL kreluje s fúzním genem TEL! AML Špatná prgnóza je rvněž spjena s přestavbami genu MLL (11 q23) zejména u d ětí mladších 1 rku 46, u starších dětí s MLL přestavbu je zřejmá ni žší kumulativní incidence relapsů prti kjencům v rámci BFM prtklů 47. Negativní vliv na prgnózu má translkace (9;22) veducí ke vzniku fúzníh genu BCRJABL U d ě t í, narzdíl d dspělých, j e tent fúzní gen pměrně vzácný. Přestže je znakem špatné prgnózy i u dětí, neprj evuje se pr celkvu vzácnst významně na celkvé prgnóze u

14 E. Mejstříkvá, strana 13 ALL. U dspělých tvří až 30% (brázek 4) a pdílí se na vý znamně hrší prgnóze ALL v tét věkvé skupině. Cumulatl ve Prpnin Surviving (Kaplan-Meier) Cm plete + Censred 0,8 (j) "- ll! 0,6 0,4 0,2 - tém ěr t e traplid ni (01)=1.6) euplidní (01=1,0) DI nezměre n - hyperdlplidni (01)=1.16 a <1.6) _.- nízce hyperdlplidni (01) 1,0 a <1.16) hypdiplidnl (01<1.0 a >0.8) - nízce hypdiplidni (01<=0.8) 0,0 r ky Obrázek 5. Přežití českých pacientů s BCP ALL pdle bsahu DNA. Kategrie jsme definvali pmci DNA indexu (DI). (euplidní n=307, hyperdiplidní n=112, nízce hyperdiplidní n=35, hypdiplidní n=l, nízce hypdiplidní n=6 a téměř tetraplidní n=6. Analýza v ech pdskupin najednu ptvrzuje signifikantní rzdíly (p =0, Ol 7). Pr úplnst je ukázán přežití bez událsti i u pacienttt, kde pr nedstatek materiálu neb technicku závadu na pnstrji nebyl DNA index změřen (n=34). Rzdíl mezi pdskupinu euplidní a hyperdiplidní je signfzkantní (p = 0,023). Prgnóza statních pdskupin se d euplidní BCP ALL neliší. C urn.j ail.e Prqx:rtin&.l'\.il.ing (Ia(l.Meer), Crrp" e + Ce-lsred 1,0 0, ,6, t,, I 1 "':> "'r., I I I I,'Jl} '" ',I.,: Ol 0,5 0.4 I "' 0,3 0,2 0,1 - beztwerdpdeantetl.m1 - - t?,perd pimi a n te/an 1... tet -.m1 - j-';i h)pápde a ml teu.m 1 0, rl<\l Obrázek 6. Prgnstický význam DNA indexu v kntextu TELIAJv/Ll gentypu: vyská hyperdiplidie (DNA index -:::'1,16 a <1,6) n=112, pacienti s jakukli hypdiplidií n=6, TELlAMLlP= pacientll n=141 a statní n=218, Rzdíly jsu celkvě signifikantní (p =0,00007). nechny svrky znázrňují signifikantní rzdíly mezi dvěma pdtypy (p <O,Ol). Z brázku je zřejmá pdbná prgnóza pacientů s TELIAML a pacientů s vysku hyperdiplidi[

15 E. Mejstříkvá, strana Genetické pdtypy T ALL Pr relativní vzácnst T ALL je vztah gentypu a prgnózy stále pněkud méně bjasněný než u BCP ALL. Zhruba u 5% T ALL nacházíme téměř tetrapldii, která nemá prgnstický význam. Zhruba u 50% dětí s T ALL nacházíme rekurentní chrmzmální trans lkace 50. D v ě tšiny těc h t translkací je zavzat T - bu něč ný r ceptr TCR-a/ neb TCR- s předpkladem, že se jedná chybu vzniklu při fyzi lgickém p řestavvání genů pr TCR. Další geny čast zapjené d přestaveb jsu MYC, TAL1, TAL2, L YL1, bhlhb I, LMO I, LM02, hmebxvé geny (HOXll/TLXl, HOXII L2/TLX3 neb HOXA cluster). Vzácnu translkací u T ALL, která demnstruje slžitý vztah gentypu a fentypu, je fúzní gen CALM/AFlO, vzniklý na pdkladě translkace (10;11). UT ALL se fúzní gen CALM/AFIO pjí s přest avbam i TCR y 5/. Tat translkace však způsbuje i AML neb např. histicytární Iymfm 52. Zhruba u plviny pacientů st ALL nacházíme mutace v genu NOTCH 1, které vedu k upregulaci signalizační dráhy, d níž je NOTCHl zapjen 53. Důležité pr terapii T ALL je, že existují inhibitry tét dráhy (inhibitry y-sekretázy) 54. Nej eví se zatím jednznačná asciace gentypvých změn a zralsti dle imunfentypu Klinické a bilgické prjevy ALL při diagnóze Leukémie se klinicky při diagnóze nemci prjevuje především příznaky ze selhání nemaligní krvetvrby, tzv. leukemicku trias: anémií, krvácivstí, zejména na pdkladě trmbcytpenie a imundeficitem na pdkladě redukce pčtu nrmálních imunkmpetentních buněk. Jak již byl zmíněn výše, T ALL čast infiltruje thymus a způsbuje kmpresi fyzilgických anatmických struktur přítmných v mediastinu s typickými klinickými důsledk y (syndrm hrní duté žíly, bstrukce dýchacích cest apd.). Rvněž při leukcytóze může nastat leukstáza (prucha mikrcirkulace na pdkladě zvýšené viskzity krve). Typicky u ALL dále nacházíme infiltraci jater a sleziny (hepatsplenmegalii), případně lymfatických uzlin. Dále u části pacientů Je zřetelná blestivst kstí a subfebrilie až febrilie, část těcht příznaků je způsbená i cytkiny, které pravděpdbn ě vyplavují jak leukemické buňky, tak i aktivvané buňk y imunitníh systému Bilgické prjevy ALL Věk a leukcytóza při diagnóze jsu již dluhu dbu známým důležitým prgnstickým faktrem. Pměrně čast jsu zmiňvána tzv. NCI (Natinal Cancer Institute) kritéria Pdle těcht NCI kritérií standardní rizik splňuje pacient 1 až 10 let věku a s iniciální

16 E. Mejstříkvá, strana 15 leukcytózu nižší než 50000/IlL, statní pacienty řadí NCI klasifikace d vyskéh rizika. Kjenci (děti mladší 1 rku) jsu naprti tmu velmi rizikvu skupinu ALL s čast nepříznivu cytgenetiku a špatnu dpvědí na léčbu. O adlescentech je znám, že částečně hůře dpvídají na léčbu a zejména dívky trpí vyšší txicitu léčby; ba tyt faktry se pdílejí na hrší prgnóze dětí mezi 15 až 18 lety 56. Pstižení CNS při diagnóze ALL je rvněž nepříznivým faktrem, který ale lze překnat u tě cht pacientů intenzivnější cílenu léčbu, jak chemterapií, tak i raditerapií Farmakgenetika ALL Snížená akumulace aktivních metablitů cytstatik v leukemické buňce, ať už je způsbena zvýšenu c1earence, inaktivací či jinými důvdy, je spjena s hrší prgnózu. Nedávn byla publikvána řada studií zabývající se dlišnu expresí genů důležitých pr metablizaci léků. Sučasné pdání některých antiepileptik (např. fenytin, fenbarbital neb karbamazepin) významně zvyšuje c1earence některých cytstatik prdukcí cytchrmu P-450. Plymrfismy genů, které kódují metablizující enzymy, transprtéry, receptry jsu zdpvědné za významné rzdíly v dpvědi na jedntlivé léky. Tyt plymrfismy se ne vždy drážejí v l éčebných výsledcích 3. Jedinu významnu výjimku je vztah plymrfismů thipurin methyltransferázy. Pacienti s vrzenu hmzygtní či heterzygtní deficiencí enzymu thipurin methyltransferázy, který katalyzuje S-metylaci (inaktivaci) merkaptpurinu, mají signifikantně vyšší rizik txických nežáducích účinků, na druhu stranu mají lepší dpvěď na léčbu v prtklech bsahujících tent lék Princip terapie ALL Většina léků pužívaných v léčbě leukémií interferuje s buněčným cyklem. Léky pstihující syntézu DNA nazýváme antimetabjity a pškzují především dělící se bunky. Patří sem např. mettrexát blkující enzym dihydrflát reduktázu, která je zdpvědná za redukci kyseliny listvé na kysel inu tetrahydrlistvu, která hraje klíčvu v syntéze purinů. Dalším dů l ežitým antimetablitem je cytsin arabinsid (ara-c), 6-merkaptpurin a 6-thiguanin. Alkylační cytstatika pškzují více dělící se buňky, narušují ale i strukturu DNA v nedělící se buňce (např. dlučení purinvých bází, zlmy v jednm či bu vláknech DNA). Patří sem např. cyklfsfamid a ifsfamid. Antracyklinvá antibitika (např. dxrubicin a daunrubicin) blkují především enzym tpizmerázu II. Rstlinné alkalidy vinkristin, vinblastin a vinrelbin se především váží na mikrtubuly dělícíh se vřeténka. Významným lékem v léčbě ALL je asparagináza, která necílí na syntézu či strukturu DNA, ale způsbuje

17 E. Mejstříkvá, strana 16 depleci extrace1ulární aminkyseliny asparaginu, cž pstihuje především prtesyntézu leukemických buněk, které nedkáží kmpenzvat nedstatek tét aminkyseliny. Krtikidy becně p pasivní difúzi buněčnu membránu se váží na specifický krtikidvý receptr a s ním jsu transprtvány d jádra. Glukk0l1ikidy mají mim jiné výrazný ú či n ek na buňky imunitníh sysť mu zejména na lymfidní buňky, u kterých ve farmaklgických dávkách indukují apptózu. Léčba a ddržení léčebnéh schématu bez dluhých prdl ev v terapeutickém schématu je velmi důležitým prgnstickým faktrem. Velkým zdrjem pučení jsu studie srvnávající prgnózu adlescentů a mladých dspělých léčených pediatrickým prtklem neb prtklem pr dspě lé. Pdle publikvaných studií je prgnóza pacientů léčených prtklem pr dspělé hrší Za tímt rzdílem může stát nižší intenzita prtklů pr dspělé i vyšší prtklární cmpliance a úspěšnější pdpůrná léčba na pediatrických pracvištích. Sučasná léčba ALL v jedntlivých prtklech J pstavena na něklika léčebných principech: 1) indukční léčba ALL má za cíl dsáhnut kmpletní remlse «5% blastů v KD a nrmálně fungující hematpéza, redukce extramedulárníh pstižení např. tumru mediastina, sanace mzkmíšním mku d blastů při iniciální CNS infiltraci apd.). V rámci indukce se zpravidla uplatňuje kmbinace krtikidů (prednisnu neb dexamethasnu) s vinkristinem a dále s asparaginázu neb antracykliny (resp. s běma). V rámci BFM prtk lů je strategie v indukci u všech pacientů stejná (stejná krtikidvá před fáze s prednisnem a jednu dávku intrathekálníh mettrexátu, pkračvání v krtikterapii splu s vinkristinem, asparaginázu a daunrubicinem. 2) velmi časně pdaná léč ba CNS, jak prkazatelnéh, tak subklinickéh pstižení (např. pmcí intrathekálně pdanéh mettrexátu) 3) knslidace remise a rein dukční léčba v dbě, kdy pacient již má dbře fungující nrmální krvetvrbu s cílem léčit zbytky resistentních leukemických buněk 4) udržvací lé č ba, např. v rámci BFM prtklů s perrálním 6-merkaptpurinem a mettrexátem. Přesný mechanismus účinku udržvací léčby není znám, ale její zkrácení např. v průběhu studie ALL BFM 1990 vedl k signifikantnímu nárůstu relapsů ve skupině SR rizika 49. Je mžné, že dluhdbé pdávání cytstatik p sknčení intensivní části léčby ničí leukemické buňky s pmalejším dělením. Napak intenzivnější prvek v pdbě pulsů vinkristinu a dexamethasnu v průběhu udržvací

18 E. Mejstříkvá, strana 17 léčby se ukázal jak neúčinn ý v rámci sučas néh typu léčby (v prtklu ALL BFM 95/ Histrický význam těcht pulsů mhl vyplývat z becně nižší intenzity předchzí léčby. 5) zařvání CNS je v sučasné dbě pužíván jen u pdskupiny s největším rizikem pr CNS relaps (např. diagnóze). pacienti st ALL, vyské rizik ALL, infiltrace CNS při Odpvěď na léčbu ALL Kmpletní remise Stav, kdy nacházíme v kstní dřeni pticku mikrskpií méně než 5% blastů a kdy dšl k reknstituci fyzilgické hemat pézy a v případě extramedulárníh pstižení (CNS, mediastinum) je zřetelná sanace d blastů, resp. redukce tumru mediastina na zbrazvacích metdách více než třetinu d iniciální veliksti, nazýváme termínem kmpletní remise. Standardně se daří kmpletní remise dsáhnut u více než 98% dětských pacientů s ALL. Nedsažení kmpletní remise p prvním indukčním blku je vzácné a je spjen s velmi špatnu prgnózu, tit pacienti jsu vždy řazeni d nejvyššíh rizika a v řadě léčebných p rtkl ů jsu indikváni k algenní transplantaci kstní dřeně d příbuznéh i nepříbuznéh dárcé9, Krelace pčtu blastů v den 8 v periferní krvi p krtikidvé předfázi - prednisnvá dpvěď Dbře známé je hdncení tzv. prednisnvé dpvědi, které se pužívá v prtklech skupiny BFM. Tent parametr zavedl prfesr Riehm a spčívá v hdncení úbytku blastů v periferní krvi p týdnu léčby prednisnem a jedné dávky íntrathekálníh mettrexátu 65. Pacienti s více než 1000 blastůjl v periferní krvi v den 8 mají signifikantně hrší prgnózu a v prtklech BFM skupiny jsu řazeni d vyskéh rizika. Špatná prednisnvá dpvěď vzhledem k vyskému riziku relapsu těcht pacientů tak neukazuje jen farmakrezistenci na prednisn, ale i vlastně na další cytstatika pužitá následně v léčbě ALL. Špatná prednisnvá dpvěď predikuje hrší prgnózu i u nepříznivých pdskupin ALL, jaku je například kjenecká AU. 66 neb ALL s fúzním genem BCR! ABL 67. Studie Gajjara et al. prkázala hrší prgnózu pacientů s prkazatelnými blasty v periferní krvi p týdnu léčby kmbinací cytstatik a krtikidů 68.

19 E. Mejstříkvá, strana Hdncení pklesu blastů v kstní dřeni pře d dsažením remise Další parametry, které se buď pužívaly, neb pužívají v léčebných prtklech (např. prtkly Chjldren Cancer Grup), jsu dvzené d hdncení dpvědi v kstní dřeni před vlastním dsažením kmpletní remise 39, 69, Minimální reziduální nemc (MRN) Prblematice MRN je věnvána kapitla ve Výsledcích a diskusi (3.2 - Léčba leukémie, mnitrvání účinnsti léčby) Přístup k pa cien tů m s relapsem All a k p rimárně vysce rizikvé ALl Indikace transplantace kstní dř eně (SCT) u pacientů v první kmpletní remisi ALL V rámci ALL je algenní transplantace krvetvrných kmenvých buněk indikvána u pdskupiny pac ie ntů s velmi vyským rizikem selhání léčby s předpkládaným přežitím bez událsti nižším než 50%. Studie Balduzzivé et aj. prkázala lepší prgnózu dětí transplantvaných d příbuzných shdných dárců s velmi vyským rizikem na rzdíl d dětí léčený ch puze chemterapií 7/. Velmi vyské rizik byl v tét studii definván jak nedsažení remise p indukčním blku neb přítmnst fúzníh genu BCRI ABL neb MLL! AF4, špatná dp věď na prednisn spjená st imunfentypem a/neb s leukcytózu nad /L 7/. Jedinu na dějí pacienta s vysce rizikvu fnnu AL je někdy nepříbuzenská transplantace kstní dřeně s neúplnu shdu ( přílha 10). Autlgní transplantace není u ALL indikvána Přístup k pacien t ů m s fúzním genem BCRI ABL Prgnóza těcht pacientů je velmi nepříznivá a ve většině léčebných prtklů jsu řazeni d vyskéh rizika 67. V sučasné dbě lze těmt pacientů přidat ke standardní chemterapii specificku terapii inhibitrem BCRIABL kinázy imatinib mesylátem (imatinib). V sučasné dbě jsu dstupné na trhu i další inhibitry BCRIABL kinázy, které se testují pr pužití i u dětí s rezistencí či intlerancí imatinibu. V sučasné dbě existuje něklik přístupů, jak kmbinvat chemterapii s léčbu imatinibem 72. Časné pdání imatinibu d indukční léčby zvyšuje signifi k antně prcent dsažených kmpletních remisí p iniciální léčbě u dspělých pacientů, nicméně dpad na celkvé přežití je mezený 73. Přestže i samtný imatinib může navdit remisi nemcnění, tyt remise jsu jen dčasné a velmi rychle dchází k rzvji

20 E. Mejstříkvá, strana 19 resistence na tut léčbu 74. Mechanismus vzniku resistence není zcela bjasněn, ale klíčvu rli hrají bdvé mutace v tyrsinkinázvé dméně, resp. ve vazebné dméně pr inhibitr tyrsinkinázy. Tyt mutace jsu čast přítmny v subklnu leukémie a během léčby tyrsinkinázvým inhibitrem dchází kjej ich selektivní expanzi 75. Od září 2004 jsu děti s nvě diagnstikvanu ALL s prkázaným fúzním genem BCR! ABL d dne 33 přeřazeny d prtklu EsPhALL (Eurpean Intergrup Study n Pst Inductin Treatment f Philadelphia Psitive Acute Lymphblastic Leukaemia with Imatinib). Pacienti s vyským rizikem dstávají v prtklu EsPhALL ke standardní chemterapii ještě imatinib a SCT. Pacienti s lepší prgnózu jsu randmizváni d ramene s a bez imatinibu, a pdle hladin MRN a dstupnsti dárce rvněž SCT. I přes léčbu kmbinací imatinibem, chemterapií a SCT je prgnóza části pacientů s tímt fúzním genem velmi špatná. Příčin selhání léčby je řada, jednu z nejdůležitějších je již výše ppsaný dynamický vznik resistence BCR! ABL na pdávaný inhibitr na pdkladě mutace v ABL kinázvé dméně. Dále je u pkrčilých frem CML ppisvána kmpenzační hyperexprese BCRl ABL na úrvni mrna, přesný pdíl tht jevu na klinické resistenci na imatinib není znám 76, pravděpdbně hraje i rli v resistenci na imatinib u PhPzALL. Další typy resistence značujeme jak BCR! ABL nezávislé, jedná se zejména knstitutivní aktivaci kináz z rdiny SRC 76. Pstupně se dstávají na trh další inhibitry tyrsin kináz (např. dasatinib, niltinib) s větší terapeuticku schpnstí inhibvat BCRlABL tyrsinkinázu a překnávat část mutací, způsbujících resistenci na imatinib 77. U dasatinibu na rzdíl d imatinibu je navíc ppisvána i schpnst prnikat hematencefalicku bariéru d CNS při systémvém pdání 78 a schpnst inhibvat kinázy z rdiny SRC 76. Zatím není zcela bjasněn vliv půsbení, zdá se že inhibice SRC kináz může vést k pruše funkce zejména T lymfcytů a vést tak k sekundárnímu imundeficitu. výzvu pr výzkum nvých inhibitrů tyrsinkináz je mutace T3151, která vede k rezistenci na všechny dsud pužívané inhibitry (imatinib, dasatinib, niltinib) jak u CML tak i ALL Přístup k pacientům s vysce rizikvu T ALL Prgnózu části pacientů se špatnu dpvědí na prednisnvu předfázi a T imunfentypem zlepší SCT 21. vývj léčby T ALL dbře demnstruje nutnst stavět nvé prtkly na datech MRN. Pr relativní vzácnst T ALL srvnávala Schrauderva studie efekt SCT u pacientů s vysce rizikvu T ALL léčených pdle prtklů ALL BFM 90 a 95. Nutn zmínit, že prtkl ALL BFM 90 znamenal zhršení prgnózy u všech vysce rizikvých ALL prti předchzímu prtklu ALL BFM 86, pravděpdbně z důvdu snížení celkvé dávky

21 E. Mejstříkvá, strana 20 alkylačních cytstatik a z důvdu léčby krátkými r tačním i blky chemterapie p indukci 49 bez delšíh prtklu II s prlngvaným půsbe n ím cytstatik. Tt zhršení léčebných výsledk ů byl reflektván v prtklu ALL BFM 95, který přinesl signifikantní zlepšení prgnózy vysce rizikvé T ALL prti předchzímu prtklu. Ze studie Willemse et a1. je zřejmé, že pacienti st ALL becně dpvídají na léčbu pmaleji, nicméně pacienti st ALL, kteří jsu 3 měsíce d zahájení léčby v rámci BFM prtklu MRN negativní, prakticky nerelabují 79. Předběžné výsledky z ALL-BFM 2000 prtklu, které zatím nebyly publikvány pr krátku dbu sledvání celé khrty, ukazují, že negativita 3 měsíce d diagnózy znamená výbrnu prgnózu i u pacientů se špatnu dpvědí na prednisnvu předfázi. Na základě těcht výsledků v sučasné dbě u těcht pacientů není indikvána transplantace kstní dřeně v první remisi, shdně se pstupuje i u dětí v ČR. Napak pacienti s vysku hladinu MRN 3 měsíce d diagnózy jsu hrženi vyským rizikem časnéh relapsu a je u nich indikvána SCT i d nepříbuznéh dárce. Ještě před SCT tit pacienti dstanu vysce intenzivní léčbu s mnitrváním MRN. Při nedstatečném pklesu MRN během následných blků chemterapie, kdy už je zřejmé, že nemc je velmi chemrezistentní, jsu takví pacienti kandidáty pr změnu léčby včetně experimentální léčby. V sučasné dbě se na trh dstávaj í nvé léky namířené nejen na léčbu T ALL 80. Příklady tě ch t léku jsu nelarabin (ARA-G) a frdesin, inhibitr purin nuclesid fsfrylázy (PNP). Frdesin navdí situaci pdbnu vrzenému pškzení PNP. Mutace genu pr PNP veducí k jejímu vrzenému pškzení je příčinu varianty těžkéh kmbinvanéh imundeficitu. Absence funkční PNP vede ke zvýšené apptóze T Iymfcytů na pdkladě zvýšené kumulace metabli tů purinů. Zajímavá je myšlenka kmbinvat u refraktemí T ALLlLBL nelarabin s frdesinem, a prhlubit tak vzájemně jejich antileukemický účinek. Inhibitry gama-sekretáz nejen blkují zvýšenu aktivaci dráhy spuštěné aktivační mutací v prteinu NOTCH 1 (přitrnn asi u 50% T ALL), ale i zatím pdle in vitr dat dkáží zvýšit senzitivitu na dexamethasn u T ALL buněčných linií 81, Přístup k pacientům s relapsem ALL Prgnóza relapsu ALL je závislá na něklika faktrech a dluhdbě se daří vyléčit přibližně 30-40% pacientů 83. Prgnóza relapsů je mim jiné závislá na efektivitě frnt line prtklů. S vyšší efektivitu léčby klesá celkvý pčet relapsů a kumulují se rizikvější a resistentnější pacienti. Mění se i skladba pacientů v relapsvých prtklech (zpravidla je kritériem pr zařazení d prtklu 1. relaps ALL p chemterapii bez předchzí algenní SeT) suvisející s rzšiřující se indikací algenní transplantace v 1. kmpletní remisi (Ph POZ ALL, již zmíněná

22 E. Mejstříkvá, strana 21 vyská hladina MRN ( 10-3 ) 3 měsíce d diagnózy apd.). Nejdůležitější prgnstické faktry pr úspěch léčby relapsu jsu dba d diagnózy primárníh nemcnění (velmi časný méně než 18 měsíců d zahájení léčby, časný méně než 6 měsíců d knce léčby a více než 18 měsíců d diagnózy a pzdní více než 6 měsíců d knc léčby), imunfentyp (BIT) a míst relapsu nemcnění (v kstní dřeni neb mim kstní dřeň (extramedulární) neb kmbinvaný). Pdle těcht tří faktrů v rámci prtklu ALL REZ BFM 2002, pdle kteréh se léčí pacienti i v České Republice, se pacienti rz d ě lují d 4 skupin Sl až S4 (rzdělení tabulka 4). BCP ALL T ALL izlvaný mimdřeňvý kmbinvaný dřeňvý izlvaný dřeňvý izlvaný mimdřeňvý jakýkliv dřeňvý S2 S2 S1 Tabulka 4. Plehled prgnstických pdskupin relapsu ALL. S2 S2 S1 Sl skupina Pacienti v S 1 skupině splňují kritéria pzdníh izlvanéh extramedulárníh relapsu B neb T imunfentypu, mají nejlepší prgnózu a dsahuj í přežití bez událsti vyšší 75% bez pužití transplantace kstní dřeně. S2 skupina U tét skupiny ( zařazení v tabulce 4) je pravděpdbnst přežití v 5 letech d relapsu asi 45%. Indikace k transplantaci kstní dřeně se v tét skupině řídí hladinu reziduální nemci p dvu blcích chemterapie. Publikace Eckertvé et a!. prkázala u pacientů léčených pdle prtklů ALL REZ BFM 90, 95 a 96 signifikantně lepší prgnózu pacientů s hladinu MRN nižší než 10-3 p dvu blcích chemterapie (pravděpdbnst přežití v 6 letech d relapsu skupiny s nízku až negativní MRN byl 86%, pacienti s vysku MRN všichni zrelabvali) 84. Na základě studie Eckertvé et a!. byl designván prtkl ALL REZ BFM 2002, kde v pdskup ině S2 transplantace kstní dřeně je indikvána u pacientů s hladinu MRN 10-3 p dvu blcích chemterapie. S3/S4 skupina D tét skupiny JSu řazeni pacienti s nejvíce rizikvým typem relapsu ALL (zařazení v tabulce 4). Remise se daří dsáhnu u 80% pacientů ze skupiny S3 a asi jen u plviny pacientů z S4 pdskupiny, medián trvání remise je ale jen asi 8 měsíců (S3), případně puze 3 měsíce (S4). D S4 skupiny jsu řazeni pacienti s velmi časným relapsem B prekurzrvé leukémie a jakýmkli dřeňvým relapsem T leukémie. U těcht dětí se remise daří dsáhnut

23 E. Mejstříkvá, strana 22 jen asi v 50 až 60% případů. U těcht pacientů, pkud se p daří dsáhnut kmpletní remise, je jednznačně indikvána transplantace kstní dřeně Akutní myelidní leukémie (A ML) AML je především nemcněním starších dspělých. V dět ské ppulaci je incidence přibližně 8 x Analýza incidence AML pdle věku ukazuje kumulaci pacientů d 2 let (12 x 10-6 ), dále mírný pkles incidence d 9 let věku (3,8 x 10-6 ) a dále kntinuální vzestup incidence s každým rkem věku s určitu kumulací incidence klem 16. rku (9 x 10-6 ) 85. Vyšší incidence AML M3 je ppisvána např. v Itálii a v Latinské Americe Zajímavým zjištěním incidenci M3 pdtypu u českých dětí je její dluhdbě vyské (13%) zastupení mezi AML, sice nedsahující hdnt výskytu u dětí v Itálii, Španělsku či Latinské Americe, ale významně vyšší než v SRN, Skandinávii či Velké Británii (6%) (Starý et aj., publikace v přípravě). Významnu pdskupinu jsu pacienti se sekundární AML p léčbě nádrvéh nemcnění chemterapií neb raditerapií, prblematika se překrývá se sekundárním MOS Z cytstatik se na vzniku sekundárních AML pdílejí nejvíce inhibitry tpizmeráz a alkylační cytstatika. K sekundárním AML řadíme rvněž AML vzniklé jak kmplikace u pacientů s definvaným kngenitálním selháním kstní dřeně (např. Kstmannva agranulcytóza, Fancnih anémie, Diamnd Blackfanva anémie, Shwachman-Diamndův syndrm, amegakarycytární trmbcytpénie s radiulnární synstózu) 96. V České republice je každý rk nvě diagnstikván přibližně dětí mladších 18 let a dále je asi u 4 dě tí rčně diagnstikván relaps nemcnění. V sučasné dbě přežívá dluhdbě více než plvina dětí 97. Zlepšení prgnózy u dětí byl stejně jak u ALL dsažen pmcí randmizvaných studií. Za selhání léčby jsu zdpvědné jak relapsy, tak i agresivnější bilgické chvání nemci a txicita vlastní léčby, která je významně intenzivnější než u ALL 98, 99. Duležité pr prgnózu pacienta je rvněž správné zhdncení všech vstupních vyšetření, z j ména při hraničním pčtu blastů a negativitě fúzních genů AMLl!ETO a CBFWMYHl l, zda se nejedná pkrčilu frmu myeldysplastickéh syndrmu (RAEB), u kteréh je u dětí jednznačně indikvána algenní transplantace kstní dřeně a u kteréh intenzivní léčba není zcela jednznačně indikvána 100, 101. Algritmus pr dlišení těcht jedntek u sprných případů je uveden na brázku 7. Při pzitivitě již zmíněných rekurentních genetických abnrmit AMLl! TO a CBF!MYHll je pacient léčen jak AML při libvlném prcentu blastů v KD.

24 E. Mejstříkvá, strana 23 AML _ _... -_.. _ , , t(8;21) BM 1(15;17) Blasta R8t BM WBC.>1S-20 aftr Inv(16) >30% Organmgaly 2wk. 1(0;11) _ _ _.. _..... "'_..... _,.... _ _ ti..... _.... _ MOS Obrázek 7. (převzat z review Hasleh et al. /(2). Schéma diagnstickéh algritmu k rzlišení AML a MDS u pacientů s hraničním pčtem blastli v kstní dřeni. Schéma nepřím demnstruje blízkst bu nemcnění, zejména pn absencí typických cytgenetických změn Prgnstické faktry a klasifikace AML Mrflgická klasifikace Na rzdíl d ALL, kde mrflgie blastů krmě L3 pdtypu prakticky nekreluje s imunlgickým nálezem, u AML má mrflgické rzdělení stále své významné míst 103. Nejznámějším a dsud pužívaným rzdělením je tzv. F AB klasifikace (Prpsals fr the c\assificatin f the acute leukaemias. French-American-British (F AB) c-perative grup) 104, která hdntí mrfl gicku a cytchemicku zralst leukémie (MO - s minimální diferenciací, Ml - bez vyzrávání, M2 - s vyzráváním, M3 - prmyelcytární, M4 - myelmncytární, MS - mncytární, M6 - erytrleukémie, M7 - megakaryblastická). Pdtyp M2 kreluje s přítmnstí fúzníh genu AMLlIETO. Pdtyp M4e kreluje s fúzním genem C B F/MYH 11. Pdtyp M7 specificky v dětském věku nacházíme u malých dětí s m. Dwn. U dětí s AML M7 a bez Dwnva syndrmu nejčastější strukturální abnrmitu je t(l;22)(p13;q13), která je ascivána s velmi nízkým mediánem věku (4,2 měsíce) 105. M6 a M7 u starších dětí bez m. Dwn se částečně překrývá s prblematiku pkrčilých frem MDS 106. U pdtypu M4 a MS čast nacházíme přestavby MLL genu. Pzději FAB klasifikace zahrnula i hdncení imunfentypu 107, zejména pr definici pdtypu AML M7 a MO. Sučasná klasifikace W HO IOB hdntí nález pdle přítmnsti cytgenetických abnrmit (t(8;21)(q22;q22) (AMLlIETO), t(ls;17)(q22;qi2) (PMLIRARa), inv(l6) (CBF /MYHll), AML s abnrmitami 11q23 lkusu, kmplexní karytyp), pdle mrflgie (AML s multilineámí dysplázií, rvněž předchzí F AB kategrie jsu pnechány pr cytgeneticky

25 E. Mejstříkvá, strana 24 neklasifikvané AML) a pdle geneze vzniku (sekundární AML p léčbě pr jiné nádrvé nemcnění neb p předchzím myeldysplastickém syndrmu) Imunlgická klasifikace AML Dsud nejrzsáhlejší studie zabývající se hdncením krelace mrflgie s imunfentypem a prgnstickým významem exprese některých antigenů u dětské AML je práce prfesrky Creutzigvé z rku Tat práce nenašla prgnstický význam žádnéh z vyšetřených antigenů. Imunfentyp kreluje dbře se specifickými gentypvými pdskupinami AML, jakými jsu například AML 1 /ETO, CBF/MYH I I a PMLlRAR Gentypvá kjasifikace, epigenetické změny II AML a jejich význam pr terapii Gentypvá klasifikace v sbě dráží hetergenitu AML. V sučasné dbě čast zmiňvaná hyptéza definuje tzv. leukemicku kmenvu buňku jak buňku se schpnstí sebebnvy. V tét leukemické kmenvé buňce jsu nakumulvané genetické změny vlivňující jejich diferenciaci a prliferaci. Tyt genetické změny pdle sučasných znalstí dělíme d 3 skupin IIi: a) mutace typu I indukují prliferaci a vytvářejí růstvu výhdu prti buňkám bez mutace (např. FLT3/ITD resp. FLT3 mutace, c-kit, RAS, PTPNll, JAK2). b) mutace typu II blkují myelidní diferenciaci a dávají buňkám schpnst sebebnvy (např. AML l, CEBP., WTI, PML-RAR.) c) mutace v genech zapjených d kntrly buněčnéh cyklu a apptózy (např. NPMl (nuklefsmin), TP53) Mutace typu I a II čast nacházíme u pacientů s AML sučasně, cž částečně pdpruje hyptézu vzniku AML pmcí dvu zásahů d genmu 112. V sučasné dbě jsu pr léčbu pacientů důležité tzv. epigenetické změny. Epigenetické změny jsu změny, které nejsu důsledkem změny sekvence DNA, ale vlivňují regulaci exprese genů, typicky psttranslační mdifikace histnů, metylace cytsinvých bazí. Acetylace histnů zpravidla vede k expresi genů, deacetylace vede zpravidla k utlumení exprese gen ů A ML s fúzním genem AMLl/ETO, CBFplMYHll a PML/RARa Př ítmnst fúzních genů AMLlIETO a CBF /MYH Il je spjena s lepší prgnózu nemcnění a celkem tyt dvě translkace nacházíme asi u 7 až 8% dětí s AML 113.

26 E. Mejstříkvá, strana 25 Gen AMLl kóduje prtein CBFa2, který je sučástí CBF (cre binding factr) heterdimeru zdpvědnéh za regulaci velkéh pčtu genů. S učástí CBF kmplexu je rvněž CBF. Fúzní prtein způsbí špatnu funkci CBF a nepřím tak represi velkéh pčtu genů 114. Tyt leukémie jsu někdy značvány jak tzv. cre binding factr leukémie 115. Tyt leukémie jsu v řadě studií řazeny d lepšíh rizika a becně se u nich neindikuje transplantace kstní dřeně v první kmpletní remisi. U AML s fúzním genem AMLl/ETO nacházíme imunlgicky čast diferenciaci leukemických buněk, která kreluje s mrflgicku hetergenitu blastů, a typicky aberantní expresi CD 19, někdy nacházíme i pzitivitu intra TdT a intra-cd79a. Tyt pzitivity lymfidnich antigenů mhu někdy vést k diagnstickým rzpakům , ale pdle našich zkušenstí jsu čast přítmny jen v menší subppulaci blastů a zpravidla ani nevedu k překrčení AHL skóre pdle EGIL klasifikace. Imunhistchemicky je čast u tht pdtypu prkazatelný B lymfidní transkripční faktr PAX5 1/ AML s fúzním genem CB F /MYH ll typicky spadají d mrflgické pdskupiny AML M4e, imunlgicky je prkazatelná diferenciace blastů s častu pzitivitu aberantní CD2 a CD7, rvněž je zřetelná i pdle imunfentypu atypická esinfilie. Přítmnst fúzníh genu PMLlRARa velmi těsně kreluje s AML M3 pdtypem a tat leukémie je dnes léčena splu s klasicku chemterapií derivátem all- trans retinvé kyseliny (ATRA), která indukuje diferenciaci blastů J21. Imunfentypvě blasty dpvídají částečně prmyelcytům (pzitivita CDl 17, CD1 5, jasná CD33), časté jsu aberantní exprese CD2 (především u variantníh M3 pdtypu) a CD19. Typická je negativita HLA DR a CD34. Tent pdtyp AML je dnes nejlépe léčitelný AMLIMDS u pacientů s knstitutivní trizómií 21 (m. Dwn) Zvláštní kapitlu představuje AML u pacientů s knstitutivní trizómií 21. chrmzómu - s Dwnvým syndrmem. U těcht pacientů je známa vyšší incidence leukémií zejména AML a MDS 123. AMLlMDS u pacientů s Dwnvým syndrmem mladších 4 let má charakteristický fentyp (AML M7) 124. Pacienti s tut frmu leukémie mají výbrnu prgnózu, častěji jsu ale hrženi txicitu léčby, je tedy snaha u nich léčbu redukvat I přes redukci intenzity léčby je prgnóza těcht pacientů velmi dbrá. Tyt leukémie mají specifický imunfentyp s kmbinvanu diferenciací d megakarycytární a erytridní linie 127. Typicky prkazujeme aberantní expresi CD7 a CD56, typicky je dále pzitivní mlekula CD4 na CD33 pzitivních blastech. Sučástí diferenciace d megakarycytární linie je pzitivita trmbcytárních antigen ů CD41, CD42 a CD61. Pr diferenciaci d erytridní

27 E. Mejstříkvá, strana 26 linie svědčí pzitivita mlekuly CD36 a CD71 (zpravidla s vyšší intenzitu exprese CD71 než mají prliferující buňky becně). Nemaligní CD33 PZ myelidní buňky pacientů s m. Dwn v regenerující fázi kstní dřeně významně exprimují aberantní mlekulu CD56 (71 %±6% u pacientů s m. Dwn versus 4%±1 % u pacientů bez Dwnva syndrmu a léčených pr AML /28). Vyská exprese CD56 O\l"CAM) krelvala v tét studii s vysku expresí genu RUNXl 128, který je lkalizvaný na dluhém raménku 21. chrmzómu (21 q22.3). Tut dlišnst těcht pacientů v regeneraci kstní dřeně v pdmínkách stresvé hematpézy je nutné mít na paměti při hdncení MRN u pacientů s m. Dwn. Bilgie AML u pacientů s m.dwn starších 4 let se již pdbá více spradické frmě tht nemcnění AML s přestavbami genu MLL (l1q23) AML s pře s tavbami 11 q23 jsu časté spíše u menších dětí /3 0. Mrflgicky jsu zpravidla klasifikvány jak pdtypy M4 či M5 dle FAB klasifikace, čili mají naznačenu či úplnu mncytární diferenciaci. Tmu většinu dpvídá i imunfentyp. Navíc čast aberantně exprimují NG2 (mlekulu chndritin sulfátu krelující s přestavbami MLL genu). Vztah k prgnóze je v l i teratuře rzprný, sučasný názr je nestratifikvat tyt pacienty d hršíh rizika jen na pdkladě přestavby 11q23 131, V některých studiích dknce tat skupina měla I epsl prgnzu. v,,/ FLT3(D835) AML s FL T3 interní tandemvu duplikací (ITD) neb aktivační mutací AML s FLT3 mutacemi dpvídají hrší prgnóze a II dětí jsu přítmny asi v 15% případů, s hrší prgnózu jsu spjeny především mutace veducí ke knstitutivní aktivaci signalizace spuštěné přes FLT3 / 33. /34. V prtklu AML BFM 2004 jsu tit pacienti řazeni d vyššíh rizika Klinické a bilgické prjevy AML, primárně extramedulární leukémie Mezi prjevy nemci nacházíme příznaky zmíněné u ALL, vyplývající jak z útlaku nemaligní hematpézy, tak i prjevy způsbené zmnžením leukemických buněk. Obecně je AML velmi agresivní nemcnění vyžadující rychlé stanvení diagnózy a c nejčasnější zahájení intenzivní léčby. Mezi faktry vlivňující časnu prgnózu patří kagulpatie, zejména diseminvaná intravaskulární kagulpatie, která může být pměrně rychle fatální a leukstáza. Mezi faktry spjené s kagulpatií patří především M3, M4, M5 pdtyp,

28 E. Mejstříkvá, strana 27 hyperleukcytóza a infekce 98, 99. Při diagnóze nemcn ění někdy nacházíme extramedulární leukemické infiltráty (kůže, CNS apd.). Vzácně jsu di agnstikvány AML s primární extramedulární infiltrací bez infiltrace kstní dřeně - tzv. myelsarkm 135. Nejčastěji infiltrace pstihuje kůži, prakticky ale může být infil trván jakékli míst v těle (měkké tkáně, CNS, rbita atd.). Pacienti mhu být na rzdíl d pacientů s AML primárně infiltrující kstní dřeň zpravidla v lepším klinickém stavu a čast se primárně myslí na jiný půvd nádru. Interpretace bipsie může být někdy btížná, průtkvá cytmetrie v těcht situacích může vést rychle ke správné diagnóze. U dětí se čast se nachází myelmncytární diferenciace, ze studie prfesra Reinhardta a prfesrky Creutzigvé 73% pacientů byl pdle FAB klasifikván jak MS pdtyp 135, /36. Cytgeneticky, resp. mlekulárně geneticky nejčastější identifikvanu abnrmitu byl nález translkace t(9; 11) a (8 ;21), většina pacientů neměla ale zachycenu žádnu dchylku v gentypu / 35, /36. Pr vzácnst myelsarkmu je btížné dělat závěry prgnóze, z retrspektivních dat se ukazvala hrší prgnóza, která mhla být způsbena dkladem léčby neb nižší intenzitu léčby nejčastěji na pdkladě špatné diagnózy (např. za zám ěn u za NHL) /35. V suča s né dbě by měli pacienti s myelsarkmem být zcela léčeni v rámci AML prtklů Farmakgenetika AML Pdbně jak u ALL nacházíme individuální dchylky v citlivsti leukemických buněk a v txických účincích na nrmální tkáně u jedntlivých cytstatik. Pdkladem jsu plymrfismy nejrůznějších genů pdílejících se mim jiné na metablizmu těcht látek / 37. Studie CCG prkázaly hrší výsledky léčby u dětí hispánskéh a černšskéh půvdu, pravděpdbným pdkladem je rzdílná farmakgenmika. Dsud byly publikvány spíše jedntlivé plymrfismy a jejich vztah k prgnóze, např. byl publikván vztah ztráty funkce glutathin S-transferázy theta 1 (GSTT 1) a častějších txických kmplikací a hrším přežitím v prvnání s pacienty s alespň jednu funkční alelu / Princip léčby AML, perspektivní nvá léčiva Léčba AML je velmi intenzivní a je pstavena na limitvaném pčtu blků chemterapie s pužitím cytsin arabinsidu a antracyklinů (brázek 8). Většina skupin zabývajících se l éčbu AML v Evrpě neindikuje v iniciální léčbě algenní transplantaci kstní dřeně, jiné léčebné skupiny např. COG (Children's Onclgy Grup, USA) indikují algenní transplantaci v první remisi u všech pacientů krmě pacientů s nejlepší prgnózu s fúzním genem AMLlIETO a CBF/MYHl1. Velkým prblémem léčby AML je velký pčet smrtí

29 E. Mejstříkvá, strana 28 v suvislsti s léčbu (tzv. "treatment related deaths ') a nabízí se hledání specifické bilgické léčby s menším pčtem nežáducích účinků /37. Velký pčet nvých léků je v sučasné dbě vyvíjen a testván, ale jejich testvání prbíhá především ve studiích zahrnující dspělé pacienty. Rzšíření těcht léku d léčeb ných prtklů pr děti je btížné pr celkvě malý pčet pacientů. Pdbně jak u ALL hraje v l éčbě AML významnu rli léčba subklinickéh pstižení CNS chemterapií, část lé čeb ných studií u pacientů indikuje i raditerapii CNS (např. prtkly BFM s výjimku pacie ntů mladších 1 rku) 97, 141. Nicméně pdbně jak u ALL je zřetelný ústup d preventivníh zařvání CNS Léčba AML M3 s fúzním genem PMLIRARa Příkladem již pužívané léčby se specifi ckým účinkem na myelidní buňky je pužití ATRy (ah trans retinic acid) u pacientů s fúzním genem PMLlRARa, které vede k diferenciaci leukemických buněk. V sučasné dbě se u tht pdtypu AML začíná zatím především u dspělých pužívat xid arsenitý (As 2 0 }) v kmbinaci s ATRu /42, /43. Prbíhají studie s indukční léčbu pstavenu puze na A Tře a na AS20} 144. Otázka, zda je mžné u tht pdtypu v buducnu dsáhnut dluhdbéh vyléčení bez intenzivní chemterapie, se v sučasné dbě řeší v rámci randmizvaných studií. U dětí jsu zkušensti s As 2 0 } ještě více limitvané, v ČR zatím byl léčen puze jeden dětský pacient s relapsem AML M3, který na tét léčbě nedsáhl mlekulární remise a vyvinul další hematlgický relaps, který byl l éčen intenzivní chemterapií a algenní transplantací Imunterapie AML Mlekula CD33 je exprimvána prakticky na všech blastech u AML. Anti- CD33 léčba s knjugvaným cytstatikem calicheamicinem gemtuzumab zgamicin (GO) byla půvdně designvána pr léčbu starších pacientů s AML, netlerujících standardní chemterapii. Pstupně je tent lék pužíván již v iniciální léčbě v kmbinaci s statními cytstatiky, zatím především u dspělých pacientů 145. Jsu už publikvány i zkušensti s tímt lékem u dětí jak jedntlivě/ , tak i v kmbinaci s statními cytstatiky /48. U dětí J zatím 00 spíše využíván jak záchranná léčba při selhání standardních blků chemterapie. Nevýhdu tht léku je mžná kmplikace ve frmě venkluzivní nemci (VOD) /49, /50 a pžděné reknstituce pčtu trmbcytů /5/. Za VOD pravděpdbně stjí interakce 00 s Kupffervými buňkami jater, které jsu rvněž CD33 pz. Při pužití analgickéh knjugátu calicheamicinu s jinu prtilátku (anti-cd22) se sice pžďuje reknstituce trmbcytů, ale VOD zatím nebyla pzrvána. Pravděpdbné jsu i určité

30 E. Mejstříkvá, strana 29 imunpatlgické mechanismy, vzhledem k publikvané úspěšné léčbě trmbcytpénie p GO intravenózními imunglbuliny /52. U AML M3 je rv něž dkumentvána i excelentní dpvěď na imunterapii pmcí jiné anti-cd33 prtilátky i bez knjugvanéh cytstatika 153. Na AML blastech se dále nachází i řada dalších vhdných cílů pr imunterapii (např. anti-cd52, anti-cd45 apd.) /54-/56. Důležitu tázku, pkud lze akceptvat hyptézu leukemické kmenvé buňky, je přítmnst cílvé struktury právě na tét ppulaci buněk. Zdá se, že mlekula CD33 je přítmna i na ppulaci leukemických kmenvých buněk /57, /58. Jiným vhdným cílem na leukemických kmenvých buňkách se zdá být mlekula CD44 / Inhibitry kináz Zvýšená kinázvá aktivita hraje významnu rli v patgenezi AML (např. signalizace přes c kit či f1t3). Tut aktivitu lze například blkvat imatinibem neb tzv. duálním inhibitrem dasatinibem Oe prkázána i účinnst u pacientů s mutací C-KIT /60) (viz léčba BCRJABU Z ALL) /6/. Jak perspektivní se jeví rvněž inhibice fit3 pmcí např. PKC412 /62, 163. Snahu je tyt léky v sučasné dbě zapjvat d standardních léčebných prtklů, pdbně jak u Ph P z ALL je d ůl ežité i vyřešit vhdné načasvání tét léčby v kntextu statní chemterapie (např. jeden lék může fungvat jak senzitizátr pr lék druhý, v pačném případě kmbinace nemusí být vůbec účinná, někdy m ů že být vhdnější léky dávat sučasně). Na tmt místě je rvněž nutné zmínit blkátry farnesyl transferázy, které vedu k blkádě RAS signalizační dráhy Inhibitry /tistn deacetyláz, demetylující látky, terapeutické vlivnění epigenetických změn u leukemickýc/1 buněk Jak již byl zmíněn výše, jedna ze změn regulujících expresi genu Je acetylace resp. deacetylace histnů. Typicky u již zmíněných tzv."cre binding leukémií" (AML lieto neb C B F /MYH l 1 ) může léčba inhibitry histn deacetyláz (HDAC) pdbně jak A TRA u PMLlRARa pzitivní AML indukvat diferenciaci a apptózu /64. Nejznámějším inhibitrem je kyselina valprvá, pužívaná v humánní medicíně jak antiepileptikum, cž významně usnadňuje zařaz ní tht léku d léčby leukémií /65. Dalším známým inhibitrem HDAC je trichstatin neb depsipeptide/ 66, /67, pstupně jsu vyvíjeny i nvé inhibitry /68. Dalším mechanismem, kterým jsu regulvány exprese jedntlivých genů, je již zmíněná metylace, resp. demetylace cytzinvých bazí v prmtrvých CpG blastech. V sučasné dbě jsu dstupné léky, které jsu schpné demetylvat metylvé skupiny na cytzinech. Hypermetylace neb aberantní metylace jsu častu změnu u AMLlMDS / Tyt léky

31 E. Mejstříkvá, strana 30 jsu primárně určené pr léčbu MDS v dspělém veku a patří sem např. S-aza-2' dexycytidine (decitabine) Léčba vede k lepšímu vyzrávání jedntlivých linií v kstní dřeni, snižuje ptřebu transfúzí a redukuje pčet infek čních kmplikací Nvá cytstatika Rezistence na cytsin arabinsid je jedním z nejd ůl ežitějších faktrů selhání léčby AML, a prt je snaha vyvíjet nvé analgy nukletid ů nuklevých kyselin. 2-chlrdexyadensin (c1adribine) pdbně jak cytsin arabinsid je fsfrylván na trifsfát a je tak inkrprván d DNA během její syntézy, pstupně vede k zástavě buněčnéh dělení a k buněčné smrti. Dkáže indukvat apptózu u neprliferujících buněk a je rezistentní vůči inaktivaci deaminací. Je prkázána větší senzitivita pdtypu F AB MS 173. Y rámci prtklu AML BFM 2004 je cladribine zařazen pr léčbu AML vyskéh rizika, d kteréh jsu řazeni i pacienti s AML MS pdtypem. Clfarabine je pdbně jak cladribine analg nuklesidů a kmbinuje farmakkinetické vlastnsti t1udarabinu a cladribinu. U pacientů s relapsem/refrakterní AML byla prkázána jen částečná dpvěď na tt cytstatikum Odpvěď na léčbu A ML, terapeutické vlivnění leukemické kmenvé buňky Odpvěď na léčbu definvaná mrflgicky Na rzdíl d ALL jsu pacienti s AML léčeni pdstatně agresivnější chemterapií s vyšší txicitu až úmrtnstí v suvislsti s terapií. S agresivnější chemterapií suvisí i nemžnst sledvání bližší dynamiky pklesu leukémie, prtže naprstá většina pacientů rychle upadá d aplázie (schéma léčebných prtklů BFM98 a 2004 je na brázku 8). Léčebná stratifikace v jedntlivých prtklech zahrnuje hdncení blastů p jednm až dvu blcích chemterapie. Y prtklech BFM skupiny je pacient s četnstí blastů >5% p 1. blku zařazen d vyššíh rizika 175. Pdbně jak u ALL většina pacientů dsáhne kmpletní remise p 1. indukčním blku, výjimku jsu pacienti s AML M3, kteří remise v klasickém smyslu slva čast nedsáhnu, přest je prgnóza becně dbrá Mlekulárně genetické a cytgenetické cíle detekce MRN Detekce minimální reziduální nemci nemá na rzdíl d ALL becně přijímaný zlatý standard. Jen u malé části pacientů lze pužít mlekulárně genetický cíl (např. AML 1/ETO, CBF /MYH11, PMLlRARa, přestavby 11 q23 s identifikvaným fúzním partnerem) /76-/78

32 E. Mejstříkvá, strana 31 Krmě pacientů s fúzním genem PMLlRARa není pře sně definván význam mlekulární remise ve smyslu úpravy léčebné strategie. U pac ientů se znvubjevenu PMLlRARa pzitivitu je indikvána léčba pmcí A TRy, resp. AS203. Napak jsu publikvány případy pacientů s něklikaletu pzitivitu fúzních genů AMLlIETO neb CBF/ MYHl1 v kmpletní remisi 179. Nejen z našich zkušenstí spíše tat pzitivita vedla v různém časvém intervalu k relapsu nemcnění a dsažení mlekulární remise je zpravidla pdmínku vyléčení 180. Publikvané práce s perzistující pzitivitu AMLl /ETO ne vždy dstatečně dluh sledvaly pzitivní pacienty, jejichž MRN může přetrvávat i řadu let 179. Zprvu slibný marker AML, gen WT -1, lze pužít ke sledvání jen s btížemi - čast je pměrně slabě exprimván ve srvnání s nemaligním pzadím Mutace v transkripčním faktru GA T A-I jsu typické pr myelprliferace charakteristické pr Dwnův syndrm (TMO a AML-M7) a lze je využít jak případné cíle pr sledvání MRN Pr detekci MRN lze rvněž u některých pacientů s vhdnu geneticku změnu pužít metdy cytgenetické zejména flurescenční in si tu hybridizaci (FISH) Princip detekce MRN cytmetricky II AML v ývj fyzilgické myelidní řady j e pdstatně méně imunlgicky definvaný. Zajímají nás především antigeny asynchrnně exprimvané (antigeny ascivané s prgenitry a antigeny charakteristicky exprimvané na zralejších myelidních buňkách, např. exprese myelidníh antigenu C0 15 na CD34 PZ blastech), antigeny aberantně exprimvané (např. C019, C056, CD7, C02 neb NG2) neb hyperexprese či snížená exprese antigenů prti fyzilgickým buňkám. Pr AML je typická imunfentypvá hetergenita blastů a je zpravidla nutné MRN detekvat více kmbinacemi prtilátek 188, 189 ( přílha 4). Langebrake et al. rvněž prkázala srvnáním imunfentypu AML u dětí při diagnóze a při relapsu, že změnu v expresi alespň jednh antigenu má 88% sledvaných pacientů 190. Je tedy zřejmé, že v rámci detekce AML je ptřeba hledat univerzální dchylky leukemických buněk d nemaligní kstní dřeně bez hledu na iniciální imunfentyp pacienta. Průtkvá cytmetrie se na rzdíl d mlekulárně genetických metd nabízí jak metdika dstupná pr prakticky všechny pacienty. Jak u dspělých 191, tak u dětí v regenerující KO nacházíme nolmální prekurzrvé buňky splňující kritéria leukemickéh imunfentypu v některých časvých bdech až v řádu prcent /92. V rámci mezinárdní studie, kteru krdinvali klegvé z Německa, jsme prkázali prgnstický význam reziduální nemci u AML puze v univariantních analýzách, nikli v rámci multivariantní analýzy zahrnující všechna kritéria pužitá pr stratifikaci pacientů l89. Dsud publikvané studie se zabývaly sledváním MRN průtkvu cytmetrií u AML

33 E. Mejstříkvá, strana 32 především u dspělých pacientů /78. /9/. /93-/96. I přes vzácnst AML u dětí byly publikvány studie u dětí ukazující na hrší prgnózu dětí s prkazatelnu MRN pdle průtkvé cytmetrie /97-/99. Interpretaci MRN u AML kmplikují dvě klnstí: již zmíněná nestabilita imunfentypu leukemických buněk a "nestandardní chvání" regenerujících nemaligních prekurzrů, které mhu exprimvat i mlekuly pvažvané za asynchrnní či aberantní. Prt je vhdné definvat nrmy bud' v jedntliv)fch časvých bdech 192, neb nalézt vzrce k ' k'.,, h k h S d' exprese antigenu, tere nepr azujeme na regenerujlclc pre urzrec. tu le van Rhenen et a!. se zabývala především detekcí imunfentypvých dlišnstí CD34pzCD381leg leukemických buněk a CD34pzCD381leg prekurzrů. V rámci fyzilgické kstní dřeně jsu CD34pzCD381lcg Lin lleg prekurzry pvažvané za nejvíce kmenvé a s největším ptenciálem reppulace 203. Analgicky u AML je tat subppulace blastů pvažvána za nejvíce kmenvu Tat subppulace může z celé ppulace blastů tvřit variabilní část, častěji tent imunfentyp je přítmen u nediferencvan)fch AML (AML MO) 206.

34 E. Mejstříkvá, strana 33 Inducbn I HAM I EJ AMLBFM98 Inlen IDIl EJ B InduIdIn 1 AML-BFM 2004 ISR I 0 I ham1 1 B } I liril HAM I BB 12 GY' I 18.Jni1_ J Erhaltungstheraple 1 Jatlr Cytarabln I.th KlIP..... PJ. /I Tag MAD liro MRO liro MRO liro" MRl>"!)(mJ Dku Ddw Dku DIaJ Dku 1 for KIn:Ier mll ANI.. bel Dwn Syndn!mlAMI.. FAR M3 beachen! bel PaIIaúIn Dit malelu"an MIRer 21xJWche 4 WchBn IGArĎI1I der D RiIIDn'i Sratill2lerurv A:. ARA.c ; n HdOs1s CyQr.IbI EI Ox: DatIlln.tlldn; L.(JNR Stlndanfr1sltgn.pe t ksaiůiid n HcIrislkgl\ClP8 E: EIDpasId-Phspha Mlrímaf residua! diseas8 2.cOA: 2.QD.2-deaxy;iderD5ln KMP: KnchBrmar1q)1DIn HA: HcI'Id!IIs CytaIabjn DIur bigatlnscll! DIamer'Qtin M: Mlllcarůn des The!1Ipleelemenls ha: rabin -.._.,..--mltteihcl'd!lertes Obrázek 8. Léčebný prtkl AML BFM 98 a 2004 (AML BFM 98 schéma převzat z publikace 141, AML BFM 2004 převzat z prtklu). Je patrné, že léčba ANIL je již d začátku velmi intenzivní, takže většina pacientů velmi rychle upadá d aplázie. Časné hdncení dpvědi v den 15 služí jak přídatné kritérium pr stanvení rizika t:-5% vyské rizik) Přístup k pacientům s relapsem AML a k primárně vysce rizikvé AML Jak již byl zmíněn výše, různé pracvní skupiny zařazují algenní SCT pr rzdílnu část pacien tů. Obecně panuje shda neindikvat SCT v první kmpletní remisi u pacientů s příznivu cytgenetiku (AMLlIETOPz, CBF/MYHll POZ). Přístup BFM skupiny, pdle jejíchž prtklů se léčí i děti v Č R, je velmi rezervvaný k SCT v první kmpletní remisi u

35 E. Mejstříkvá, strana 34 de nv AML a becně není indikvána. V případ ě relapsu AML je SCT důležitu léčebnu mdalitu. Obecně prgnóza relapsu závisí na něk lika faktrech, jedním z nejdůležitějších je délka první remise «1 rk, > 1 rk). Další významnu pdskupinu pacientů indikvaných k SCT jsu pacienti se sekundární AML, jak na pd kl ad ě kngenitálníh selhání kstní dřeně, tak v suvislsti s léčbu pr jiné nádrvé nemcnění. Pacienti s AML vzniklu p léčbě pr jiné nádrvé nemcnění lze rzdělit na AML vznikl é p léčbě inhibitry tpizmeráz, které mají krátký dstup vzniku d tét léčby (1 až 3 rky) a typicky nesu přestavby MLL genu, a na AML p alkylujících cytstaticích, které vznikají pzději (4 až 6 let p primární léčbě), pr něž jsu typické změny na 7. a 5. chrmzómu, fáze sekundárníh MDS může předcházet sekundární AML. Nvá léčiva včetně mnklnálních prtilátek jsu u dětí v prvnání s dspělými becně hůře dstupná. Již zmíněná kmbinvaná imun (anti-cd33, knjugvaná s calicheamicinem) a chemterapie je u dětí indikvána v případě rezistentní nemci neb relapsu. V Č R byla tat léčba pužita dsud u 5 dětí s AML (2 pacienti s rezistentním relapsem, 3 pacienti s relapsem p SCT). Léčba byla úspěšná u 3 pacientů a umžnila SCT (ve 2 případech šl retransplantaci). 2. Cíl e 1) Je mezi myelidními antigeny exprimvanými u ALL suvislst? Dá se předpkládat becná příčina exprese myelidních antigenů u ALL? Má některý myelidní antigen prgnstický význam u ALL? Pkud an, je tat exprese d ů l ež itější než exprese jakéhkli myelidníh antigenu? Je exprese myelidních antigenů stabilní? 2) Jaký je prgnstický význam diferenciačníh antigenu CD10 u B prekurzrvé ALL? 3) Jaký je význam nvých kritérií definvaných pdle MRN? Význam průtkvé cytmetrie v mnitrvání časné léčebné dpvědi. 4) Význam MRN u transplantvaných dětí s ALL. Ovlivňuje reknstituce nemaligní B řady specificitu MRN pdle přestaveb imunglbulinvých genů? 5) Zj istit četnst, bilgický charakter a prgnózu sekundární ALL p léčbě ALL. 6) Prgnstický význam 4barevné cytmetrie v mnitrvání MRN u dětí s AML.

36 E. Mejstříkvá, strana Výsledky a Diskuse Imunlgická diagnstika ALL ALL z prekurz rů B I ym fcytů (BCP ALL) B prekurzrvé ALL imunlgicky členíme na prs, cmmn a praeb 23 pdle exprese antigenu CDI0 a intracelulárníh IgM. Funkce mlekuly CDI O na leukemických a na fyzilgických prekurzrech není známa. Prgnsticky nepříznivý význam má především pdtyp prb ALL (CDI0 negativní a intra-igm negativní), který kreluje s přestavbami genu MLL (llq23) a je častý u kjen c ů. Napak v pdstatě žádný prgnstický význam nemá klasifikace pdle pzitivity intracelulámíh IgM na pdskupinu praeb a call (Obrázek 9). Data jak z dspělých, tak i dětských ALL navíc ukazují, že ani pr krelaci s přestavbami genu MLL není intracelulámí expres IgM d ůleži tá 207, 208. CuIllUlaIIl.' e Pf t in SurvUII\9 (M ) C Ql1\plel u r c... t.'1:i 1.""r , : - call 0,00... J." - -:f.. f: O. l '-:..0- '---:':--:- ' -. -, - '---=7:--':---' --' R""v Obrázek 9. Obrázek ukazuje stejné plež ití u pacientů diagnstikvaných jak call neb praeb ALL. V ana(vze jsu zahrnuti všichni pacienti s námi určenu diagnsu call neb praeb ALL v letech 1999 až 2006, n=356, p =ns. Na brázku loje znázrněna analýza CP ALL klasifikvaných d dvu skupin pdle exprese antigenu na CD10 PZ (2:20%) a CDlOneg, ukazující signifikantní rzdíl v pravděpdbnsti v přež ití. Exprese antigenu CD I0 i u pacientů, které hdntíme jak pzitivní, se u jedntlivých pacientů mhu významně lišit (d pzitivity hraničníh pčtu blastů s většin u bla tll negativních až p typicku hyperexpresi všech buněk, brázek ll). Prt jsme se rzhdli testvat hyptézu, že i pacienti s calllpraeb ALL s významným pdílem CD loneg blastů mají hrší prgnózu.

37 n E. Mejstříkvá, strana 36 IatJ\l. A prtlon Swvtt.r rl'ij { "--Mtt r ) CanpIaI III + Cenat ed 0,5 CD1 0 ne g (n=41) p = Obrázek 10. Signtfikantně hrší přežití pacientů s negativitu CDi 0«20%)., l." prb ALL call l prs 8ubkln (60%) ' OOOO J=========;;====.. :":'.,.. '.( t : '" l!" ':.' f 21 > '00 10.J---,-----.,.; ' '. C020FlTC ' 0 '00 ' <f'\. I Lt. C02ll-FrlC Obrázek 11. Různá exprese antigenu CDiO při diagnóze BCP ALL, brázek uprstřed ukazuje typickéh pacienta s prb subklnem a vprav je pacientka s typicku hyperexpresí CDIO., 0.9 O,. "' :ti (11. O' 0.4. A"0P0!1 KJJ1 Sl.LJ"'JI\I'-'; (K.apWI. ). r CMl&Gred L '-4',.. 12\1".: l t ";--'- i'" I I i I I I 1 I,I I I 4 '0 R< - zcel. CD prs ni Cll,""B - MLUAF. 12 "'.e!.li C4..mAtu... s...vmťq fkliplan-""" Cc"llet. t em.urd p(3 skupiny)=o , 4 L I pt'q8 (neb LMtatrM!i prsl Obrázek 12. Vlev: Rzdělení pacientů pdle hladiny exprese CDiO (zcela CDiO+ jsu pacienti s méně než 20% CDi(fe R blasty, prb ALL exprimují CDi O na méně než 20% blasltt, (ástečně prb exprimují CDiO (?20%), ale sučasně bsahují významný pdí! (?20%) CDi0 17eg blastů, všichni MLL AF4 p = pacienti měli expresi CDiO nižší než 20% a nejsu zahrnuti d křivky prb. Vprav: Stejná analýza se spjenu skupinu prb a částečné prb. Signi fi kantně hrší prgnóza klasicky definvané prb ALL, ukazvaná na brázku 10, je d značné míry dána nepříz ni vu MLLlAF4 pz ALL; ddělíme-ii MLLlAF4 pz ALL, přestane být rzdíl mezi prb a statními ALL významný. Námi definvaná pdskupina "částečně prb"

38 E. Mejstříkvá, strana 37 má ale pdbnu prgnózu jak prb ALL (brázek 12) P pulační analýza tedy ukazuje, že významná přítmnst CDlOneg blastů určuje špatnu prgnózu - bez hledu na t, zda jsu přítmny i CD 1 Opz buňky Aberantní exprese antigenů Jak již byl zmíněn v Úvdu, leukémie napdbují svým imunfentypem své nemaligní prtějšky v kstní dřeni, resp. v thymu. Expresi antigenů z jiné linie,než z které vycházejí leukemické buňky, značujeme jak aberantní. Přesnu příčinu aberantní exprese u ALL a AML neznáme. V zásadě existuj í 2 základní hyptézy: a) aberantní exprese jsu důsledkem deregulvané exprese genů v důsledku leukemgeneze (např. mechanismus aberantní exprese CD2 u mikrgranulámí varianty AML) 209. b) aberantní exprese Je dllsledkem nezralsti leukemických buněk neb může dpvídat stádiu fyzilgických prekurzrů s ptenciálem diferencvat d různých linií 2/0. Exprese myelidních antigenů u ALL byla pvažvána na základě prvních studií za marker hrší prgnózy. Z árveň známu pdskupinu exprimující myelidní antigeny u dětí s ALL jsu pacienti s fúzním genem TEL/AMLl 2//. 2/2 ascivaným s dbru prgnózu. Prgnstický význam exprese těcht antigenů v jedntlivých studiích vedl v průběhu let k prti c hůdným závěrům 2/2-2/ 7. Slabé míst většiny těcht studií byl, že všechny myelidní antigeny byly brány jak sbě si rvné a zpravidla pzitivita kteréhkli antigenu pacienta klasifikvala jak tzv. MyAg pzitivníh. V situaci, kdy neznáme bilgický pdklad aberantní exprese antigenů, není správné je v analýzách hdntit splečně. Další slabinu některých studií byla analýza B a T ALL splečně neb krátká dba sledvání, která nezachytila pacienty s pzdním relapsem ALL. Suhrn charakteristik jedntlivých studií je uveden v tabulce, předlžené v rámci recenzníh řízení k přílze 1 (tabulka na straně 81). V rámci prtklu BFM 95 Jsme prkázali signifikantně hrší prgnózu BCP ALL s aberantní expresí mlekuly CD33 v přílze 1. Tut hrší prgnózu jsme ptvrdili i v multivariantní analýze v přílze 1. Hrší prgnózu jsme ptvrdili i u pacientů léčených v další studii (ALL IC BFM 2002) s kratší dbu sledvání (BCP ALL: medián 2,9 let, minimum 0,09, maximum 4,99 let) (brázek 13).

39 E. Mejstříkvá, strana > ' li Cl. '" 1,00 0,95 0,90 0,85 0,80 4i 0,75 et: 0,70 Cumulallve Prprtin Su",ving (Kaplan-Meier) Cmplete T Censred i '--ť " \. '--t, -:-"1: " +--,.tt-i(.,f:: li J-;.;f7t,1:::1:: I ::::1 :,;,:1: ' 1.,,,'>-:t, l--'t, 1----t-11+1 J I +: -+-:t-" -CD33>10% -, CD33<10% 0,65 0, rky Obrázek J 3. Zřetelně hrší přežití bez relapsu u pacientli s BCP ALL a expresí CD33 na více než 10% blastů léčených v rámci prtklu ALL JC BFM 2002 (Cx-Mantelův test, p=0,0204, prfs ve 4 letech pr D33 neg 90%±3,4%, pr CD33p 77%± 7,2%, pefs ve 4 letech pr CD33 neg 88%±3,5% pr CD 33p v přílze 1. 74%± 7,2%). Výsledek nezávisle ptvrzuje naše zjištění Akutní hybridn í leukémie Leukémie se signifikantním vzhledem blastů, jak z lymfidní, tak i myelidní linie, nazýváme hybridní. Pdle typu je lze členit na leukémie s primárně definvanu linií a významnu kexpresí antigenů zjiné linie, dále na leukémie s dvěma linivě různými ppulacemi definvané imunlgicky a/neb mrflgicky, a naknec na leukémie, které signifikantně změní svůj fentyp d jiné linie před dsažením kmpletní remise. BCP ALL je definvána pdle adaptvané EGrL klasifikace pzitivitu alespň dvu ze tří antigenů: CD19, (intra)cd79a a/neb, CD22, zárveň musí být negativní všechny tyt mlekuly: intra CD3, CD3, lehké řetězce imunglbulinu kapa a lambda. T ALL je definvána pzitivitu (intra)cd3 a pzitivitu CD7. AML je definvána splněním alespň dvu následujících kritérií: intrampo Pz, CD 13 Pz, CD33 P0 Z, CD6S PZ a/neb CDl17 PZ a sučasně úplnu (intracelulární, příp, i pvrchvu) negativitu CD3, CD79a a CD22, Imunlgicky jsu AHL s primárně definvatelnu linií a signifikantní kexpresí antigenů z jiné linie nejčastějším pdtypem AHL a pr její definici lze např. pužít již zmíněnu EGlL klasifikaci /6, ve které jedntliv)/m antigenům je přiřazen skóre pdle jejich příslušnsti

40 E. Mejstříkvá, strana 39 k lymfidní, resp. myelidní linii (tabulka 5, viz též příjba nad 2 je nález klasifikván jak AHL. 12). V případě překrčení skóre skóre Břada T řada myelidní linie (intra)cd79a, intra IgM, 2 CD22 (intra)cd3, TCRap, TCRy8 intrampo I CD19, COlO, CD20 CD2, CD5, CD8, CDI0 CDl3, CD33 CD65, CDl intratdt, CD24 intratdt, CD7, CD la CDl4, CD15, CD64 Tabulka 5. Skóre jedntlivých antigenů pr diagnstiku AHL. Splní-li blasty definici jedné z řad ALL a sučasně překrčí myelidní skóre 2 neb splní-li definici AML a překrčí-li skóre B neb T řady 2, je nález klasifikván jak AHL. Pr prvnání uvádím alternativní klasifikaci AL a AHL, která je pužívána v St. lude's Hspital v Memphisu (USA) a definuje jedntlivé pdtypy takt /0: B-lineage My+ALL splňují všechna následující kritéria: a) Blasty jsu CD19 pz a (CD22 poz neb intra-cd79a PO l. neb intra-igm (fl řetězec» b) Blasty jsu intra-cd3 neg c) Blasty jsu intra-mponeg d) Blasty exprimuj í jeden neb více myelidních antigenů (CDI3 CDI5, CD33 neb CD65) T-Iineage My+ALL splňují všechna následující kritéria: a) Blasty jsu CD7 PZ a intra-cd3 pz b) Blasty jsu CD22 neg c) Blasty jsu intra-mponeg d) Blasty exprimují jeden neb více myelidních antigenů (CDI3, CD15, CD33 neb CD65) LyPOZ AML splňují všechna následující kritéria: a) Blasty jsu intra-mpopz (neb je pzitivní nespecifická esteráza u AML M5) b) Blasty jsu intra-cd3 neg c) Blasty j su intra-igm(fl řetězect eg a neexprimují sučasně CD22 a intra-cd79a d) Blasty exprimuj í jeden a více z následujících antigenů: C02, CD5, CD7, CD19, CD22, CD56 neb intra-cd79a. Bifentypické leukémie splňuj í jedn z následuj ících kritérií a) Myelid/B - Eneage bifentypvé leukémie kexprimují intra-mpo a CD22 splu s CD 19 neb intra-cd79a. b) Myelid/T - lineage bifentypvé leukémie kexprimují intra-mpo a intra-cd3

41 E. Mejstříkvá, strana 40 c) Mixed BIT lineage bifentypvé leukémie kexprimují intra-cd3 a intra-igm(1l řetězec) neb intra-cd3 splu s intra-cd79a. V rámci diagnstiky pvažujeme za důležité, aby sba hdntící cytmetrický nález se vyjádřila k primární linii a které znaky hdntí jak aberantní. EGIL ani jiné klasifikace nejsu v sučasné dbě zcela vyhvující a v druhé plvině rku 2008 je čekávána nvá WHO klasifikace hematlgických malignit, kde bude část věnvána i hybridním leukémiím. Většina dpsud publikvaných studií hdntila bud' dspělé pacienty 218, neb khrty dětí dhrmady s dspělými Pměrně mál byl v těcht studiích zhledněn typ léčby a její výsledky na celkvu prgnózu. Z našich dat je zřejmé, že pkud striktně aplikujeme EGIL klasifikaci na čistě pediatricku khrtu, zdaleka nejčastější pdskupinu definvanu imun-gentypvě jsu pacienti s fúzním genem TEL!AMLl (viz tabulka 8) vzhledem k častému výskytu tht pdtypu, ale není rzdíl signifikantní prti skupině klasifikvané jak nn AHL. TEL! AML 1 gentyp je známý svji afinitu exprimvat myelidní antigeny a tat kexprese může vést až k překrčení AHL skóre, přestže z phledu diagnstiky a klinickéh průběhu se jinak jedná typické ALL (i když je jej ich prgnóza signifikantně hrší - brázek 14). Pdbně jak v předchzích studiích jsme ptvrdili vyšší incidenci u AHL gentypu BCRlABL a MLL! AF4 (tabulka 6) a s tím suvisející celkvu hrší prgnózu dětí klasifikvaných jak AHL. V analýze v rámci jedntlivých imunlgentypvých pdskupin (brázek 14) prkazujeme signifikantně hrší přežití u dětí klasifikvaných jak AHL v rámci TEL! AML 1 a MLL! AF4 pdskupiny. Jen pr úplnst retrspektivníh hdncení AHL u dětí, v uvedeném rzpětí (září srpen 2006): 4 další děti jsme klasifikvali jak AHL primárně AML s lymfidními znaky. Všechny 4 děti přesáhly AHL skóre expresí T lymfcytárních znaků, prgnóza tét pdskupiny byla extrémně špatná (v 1. rce d diagnózy žil a dsud žije puze 1 pacient p algenní transplantaci d HLA identickéh surzence), u žádnéh z těcht dětí jsme neprkázali klnální přestavby Ig/TCR.

42 E. Mejstříkvá, strana 41 AHL NnAHL p hdnta TALL 18% 14% n.s. TEL/AML1 32% 24% n.s. Hyperdiplidní 4% 21% p=o,026 BCRlA BL 9,4% 2,6% p=o,044 MLL/AF4 10,7% 1,3% p=ooo98 Ostatní BCP ALL 21% 35% n.s Tabulka 6. Cetnst jedntlivých imunlgických a mlekulárně genetických pdskupin u pacientů s AHL pdle skóre EGIL a u nehybridních ALL. Statistická významnst rzdilu v četnsti jedntlivých pdskupin je hdncena Fishervým exaktním testem. Červeně znázrněny signifikantní rzdily v zastupení AL klasifikvaných jak AHL.. 7 =1\ 0.6 1)= ;...;;;;.;:; p = ::= n=4 02 -nn AHL (AML) -NI.. (AMLJ\..y+) 0.1 P = n.s. OO :---"""----;;---;:-10---'!"2 rky " Ol Ol " " =71 t'i.,.;t;l n= - Iln AHL (T ALL) - AHL (T AI..1../t.\'+) p = n.s. 1 2 n=9 - nn AHL (TEUAML1' AlL) - AHl (1EJAM..1"'JMy+) p = nn AHL (hyr>erdlp'iold ALL) AtL (hypériiipiima) n=1 p = nt relevant nn AHL MLUAF' ALL) - AHL (MUIAF4"'"IMy+) n=j p=o.ooo8o 1 10,1 (J Nf I t:tod&. AH AR._._"",,) Obrázek 14. Nahře vlev: Křivky přežití ukazují signifikantní rzdí! (Cx-Manlelův test) mezi skupinu AHL 0=28 a nn AHL 0=557. Nahře vprav: V rámci AML nevidíme signifikantní rzdíl. Dle: Pkud hdntíme přežití v jedntlivých imun-gentypvých pdskupinách, signifikantní rzdí! v přežití nacházíme v pdskupinách MLLlAF4 a TELlAMLI. p=n.s

43 E. Mejstříkvá, strana leukémie s ná lezem blastů z rů zných linií a linivý přesmyk během časné fáze léč by před dsažením kmpletní remise. Přesmyk z jedné linie d druhé vyžaduj ící reklasifikaci leukémie neb nález dvu ddělených ppulací při diagnóze leukémie s nemžnstí nález jednznačně zařadit jak lymfidní, respektive myelidní leukémii, jsu becně v léčb ě leukémií velmi vzácnu situací. Literárně lze najít spíše jedntlivá kasuistická sdělení než epidemilgická data. Leukémie s nálezem více různých ppulací blastů například shrnul Weir et al 222. V jedntlivých kasuistikách je přesmyk zjedné linie d druhé ppisván např. u ALLlAML s přestavbu MLL genu , u akutních leukémií s mnzómii 7. chrmzómu neb u pacientů fúzním genem BCR/ABL 228. Bierings et al. ppsala případ pacientky s přesmykem 229 z BCP ALL během indukční léčby d myelmncytární leukémie a v relapsu zpět d BCP ALL se stále stejnými klnálními přestavbami 19-TCR bez prkázané přestavby MLL genu. Případná plasticita fentypu leukemických blastů na pčátku léčby by mhla zásadně vlivnit splehlivst diagnstiky, zejména imunlgické. Prt jsme si plžili tázku, zda k přesmyku nedchází častěj i než se předpkláda l. Velku rli v identifikaci přesmyku linie hraje častst a precisnst sledvání dynamiky nádrvé nálže před dsažením kmpletní remise. Je ttiž mžné, že část pacientů naknec dsáhne kmpletní remise, a fentypvý přesmyk leukémie prběhne během indukční léčby bez pvšimnutí. Leukemické buňky becně mění během léčby transkripci řady genů, cž lze identifikvat jak na základě expresníh prfilvání 230, tak i na úrvni imunfentypvých změn 23/. Část těcht změn pravděpdbně přím způsbují pdané léky 232. Typicky tyt změny u BCP ALL pstihují např. tyt antigeny: pkles intenzity až vymizení pzitivity CD10, TdT (lze pzrvat i u T ALL), vzestup exprese - CD20, CD45. Zm ěny v expresi těcht antigenů částečně kpírují vyzrávání během nemaligníh vývje B řady Tyt změny zpravidla nevedu ke změně klasifikace vlastní leukémie, jsu však velmi důležité především pr vlastní detekci a správnu interpretaci MRN. V rámci prtklu ALL IC BFM 2002 byl jedním z nejdůležitějších výzkumných chů zdpvědět tázku, zda časná dpvěď v den 8 a den 15 ukazuje prgnózu pacientů (přílhy 7 a 11). Sučástí prtklu tak byla i centrální evaluace dne 8 a dne 15 mrflgicky, imunlgicky i mlekulárně geneticky. Mrflgické vyšetření byl prváděn centrálně v Praze a v Olmuci. elkem u 4 dětí s BCP ALL (charakteristika pacientů je v tabulce 3) s BCP ALL (3x unifrmní infiltrace KD blasty, u pacienta DH signifikantní kexistence BCP ALL blastů (57%) a myelmncytárních blastů (15%) jsme identifikvali v den 8

44 E. Mejstříkvá, strana 43 signifikantní změnu fentypu (pacienti PM, LD a DK) směrem k myelidní linii (pkles B lymfcytárních antigenů, vzestup myelidních antigenů v č etně CD33, CD 14 a intracelulární myelperxidázy). V průběhu indukční léčby pstupně tyt buňky změnily svůj fentyp natlik, že v pdstatě imunlgicky a mrflgicky vypadaly jak nrmální mncyty. V těcht buňkách jsme ale srtváním prkázali identické klnální přestavby s půvdním Iymfidním klnem při diagnóze. Artefakt způsbený příměsí nechtěných buněk jsme vylučili jednak vysku četnstí leukemických přestaveb v "mncytech", jednak vnitřní kntrlu (nemaligní T lymfcyty), která byla negativní. Na pčátku léčby mhu tedy 1eukemické buňky dsud nebjasněným mechanismem změnit nejen imunfentyp, ale dknce i mikrskpický vzhled natlik, že připmínají nemaligní myelidní či mncytámí buňky. Tut skutečnst jsme pzrvali hlavně u dětí se špatnu dpvědí na prednisn. Incidence mezi pacienty se špatnu dpvědí na prednisn a BCP ALL na prtklu ALL Je BFM 2002 ( /2007) byla 19%. Ukázali jsme, že tent bilgický jev může být příčinu rzprných výsledků stanvení prcenta blastů mezi mlekulární genetiku, imunfentypizací a mrflgií. Všechny pacienty s pzdějším přesmykem spjvala již při diagnse BCP ALL signifikantní exprese mlekuly CD2, která jinak nepatří mezi časté aberantní antigeny. P řesmyk z lymfidní linie d myelidní linie u části pacientů ukazuje dsud nedceněnu plasticitu leukemických buněk a alespň u části těcht pacientů čekáváme shdné dsud nepznané genetické pzadí.

45 E. Mejstříkvá, strana 44 Iniciály rmun Identické Leukc Gentypvé Prednisn Změna léčby p Prgnóza Ivěk(r) fentypl kln. yty zm ěn y vá dpvěď standardním Mrflgie přestavby ( prtklu ALL 19-TCR ve /ll) léčby srvnání s leukemick ými blasty call (60%) myelmn: FLT3 IT O OH a an delece Relaps ALL 190 špatná lnterfant, SCT 12 myelmn ( s uča s ně i ll q23 p SCT (40%) FL T3ITO+) včetně MLL pr8 L I, PM aberantní 115 CO2 mn an 15 nenalezeny špatná Interfant, SCT CRI 2,5r call Ll LO aberantni 117 CO2 mn an 6,9 nenalezeny špatná lnterfant, SCT CR 1,2r ca LL L I OK aberantnl 15 CO2 mn an 45 nenalezeny dbrá O CRl8m IS /1 6 call LI "sek"aml sek AML 6m abcrantní an 138 nenalezeny špatná smrt v relapsu p dg, smrt CO2 v prgresi Tabulka 7. Přehled základních charakteristik pacientlí s přesmykem směrem k myelidní linii v rámci prtklu ALL Je BFM 2002, pr úplnst uvedena i pacientka JS z retrspektivní analýzy prtklu ALL BFM Imunlgická diagnstika terapeutických cíllj na leukemické b uň c e. Anti-CD33 léčb a, perspektiva využití dalších mnklnálních prtilátek v l éč bě d ětské ALL lmunfentypizace rvněž p ři n áší infrmace případných mlekulárních cílech pr eventuální specificku léčbu - zejména mnklnálními prtilátkami. Vzhledem k hrší prgnóze pacientů s aberantní expresí CD33, kteru jsme prkázali na khrtě pacientů léčených v rámci prtklu ALL BFM 95, se nabízí tázka, zda by se u tét pdskupiny nedala využít cílená anti-cd33 terapie (Přílha 1). Terapie humanizvanu mnklnální prtilátku anti-cd33 (kln hp67.6) knjugvanu s cytstatikem calicheamicinem (gemtuzumab zgamicin - 00) je pužívána především u dspělých pacientů s AML, kde naprstá většina leukemických buněk exprimuje mlekulu CD33. Půvdně byl léčiv testván v mnterapii u pacientů netlerujících knvenční indukční léčbu AML (zejména pacienti starší 65 let s významnými kmrbiditami znemžňujícími klasicku intenzivní chemterapii). V sučasné dbě již byly publikvány a prbíhají další studie kmbinující 00 s další chemterapií u dspělých pacientů s AML. U dětí byly publikvány zkušensti s 00 v terapii jak u AML /46, tak i u ALL Studie Zwaana et al. prkázala signifikantně nižší

46 E. Mejstříkvá, strana 45 hdntu LC s samtnéh calicheamicinu in vitr u pacientských v z rk ů s ALL prti AML, u kterých Oemansvá et a!. prkázala významnu jnter-individuální variabilitu v citlivsti na calicheamicin 239. Zdá se, že určitu rli v dpv ědi na tent lék u AML (u ALL nebyl dsud zkumán) hrají i plymrfismy mlekuly CD Širšímu pužití u ALL brání v sučasnsti mezení na CD33 pz ALL a literárně pčet publikvaných pacientů nepřesahuje maximálně něklik mál desítek pacientů, zpravidla s relapsem, resp. refrakterní nemcí. Naše zkušensti s léčbu mnklnálními prtilátkami u ALL jsu mezené na pacienty s refrakterním nemcněním, resp. relapsem p SCT. U všech pacientů před pdáním mnklnální prtilátky byla věřena pzitivita příslušné mlekuly (u všech byla pzitivita na hladině nejméně 40%). Celkem by la mnklnální prtilátka v léčbě ALL pdána u 6 pacientů s relapsem ALL. Pacient s 2. relapsem BCP ALL a s částečnu expresí CD33 byl léčen kmbinací anti-cd33 (00) s chemterapií bez efektu, pacient s refrakterním velmi časným 1. relapsem praet ALL byl léčen anti-cd33 (00) bez efektu, pacient s 1. relapsem sekundární AHL (prb/my+) p algenní transplantaci dsáhl kmpletní remise a kmpletní dárcvské krvetvrby p dvu dávkách samtné anti-cd33, dva pacienti s 1. relapsem BCP ALL byli léčeni kmbinací anti-cd52 (Campath) a chemterapií puze s částečným efektem bez dsažení mlekulární remise a pacient s 1. relapsem BCP ALL s vysku pzitivitu CD20 na reziduálních leukemických blastech byl léčen anti-cd20 (rituximab) splu s chemterapií a dsáhl mlekulární remise. I call lécba ca; néh relapsu I I call lécba pzdníh relapsu I lcof-j t ::::...;I.,. -'--- --L-... Obrázek 15. Ukázka mnitrvání léčebnéh efektu kmbinace chemterapie a anti-cd52 (Campath TM). MRN byla detekvána pmcí kvantitativníh sledvání klnálních přestaveb 19-TCR a pmcí 8-barevné průtkvé cytmetrie (CD58 FITC/CD66c PE/CDIO ECD/CD45PerCp/CD34 APC/CD20 PB/CD38 A 700). U pacienta s čas ným relapsem jsme při pzitivitě MRN pdle průtkvé cytmetrie před algenní transplantací prkázali selekci CD52 negativních blastů (věřen klnem s jiným cílvým epitpem než má anti-cd52 v Campathu). DH2-5, Db2, Vd2, Vbl- 19/TCRjsu cíle pr sledvání MRN

47 E. Mejstříkvá, strana 46 V sučasné dbě se již d klinické praxe dstává humanizvaná anti-cd22 prtilátka knjugvaná s calicheamicinem - intuzumab zgamicin. První perspektivní výsledky již byly ukázány u dspělých pacientů s Iymfmy a na zv í řecím mdelu ALL 24/,242. Perspektiva tht léku u ALL je veliká, prakticky všechny BCP ALL tut mlekulu exprimují. Pdbný je i mechanismus fungvání jak u gemtuzumab zgamicinu, p navázání prtilátky dchází k internalizaci kmplexu, v lyszymu djde k ddělení cytstatika, které pškzuje DNA cílvé buňky pdbným mechanismem jak inizující záření. Txicita jak gemtuzumab tak i intuzumab zgamicinu není zanedbatelná a nelze je přidat navíc ke standardní prtklární léčbě bez redukce a/neb změny statních léků a nelze tak čekávat v dhledné dbě zapjení d indukční léčby ALL, když prcent dsažených kmpletních remisí v uznávaných léčebných prtklech je vyšší než 95%. Mnklnální prtilátky fungující samstatně bez navázanéh cytstatika lze zpravidla d stávajících léčebných prtklů přidávat snadněji (např. anti-cd22 epratuzumab 243, anti-cd20 rituximab, anti-cd52 campath). V sučasné dbě prtkl COG pr relaps BCP ALL přidává anti-cd22 prtilátky (epratuzumab) přím d indukční léčby relapsu ALL 244. Pdbná strategie se v sučasné dbě zvažuje i v nvém léčebném prtklu pr recidivy dětské ALL v rámci BFM skupiny. Převažující zkušensti jsu tedy před evším z léčby refrakterní ALL, kde již zpravidla testujeme efekt na plyrezistentní leukemické buňky. Za zmínku stjí ještě bčasné pužití mnklnální prtilátky OKT-3 (anti-cd3) v léčbě refrakterníh relapsu T ALL Léčba leukémie, mnitrvání účinnsti léčby Hdncení minimální reziduální nemci Základními metdikami pr sledvání MRN je kvantitativní sledvání přestaveb genů Ig/TCR a průtkvá cytmetrie (detailní charakteristika metdik je rzvedena dále). Zlatým standardem pr mnitrvání ALL je v sučasnsti RQ PCR pr Ig/TCR. Reziduální nemc se pstupně zapjuje d léčebných prtklů nejen dětské ALL. Díky sledvání MRN pmcí PCR je tak definván nvý pjem - mlekulární remise. Obecně pacienti s BCP ALL, kteří dsáhnu v rámci prtklů BFM mlekulární remise p prvním indukčním blku, jsu pacienti s velmi dbru prgnózu 246. Pacienti st ALL mají jiný charakter dpvědi, becně dpvídají na léčbu pmaleji, platí ale, že pacienti negativní tři měsíce d diagnózy prakticky., 79 nere I a b UJI.

48 E. Mejstříkvá, strana 47 V sučasné dbě je sledvání MRN pmcí RQ PCR Ig/TCR pr řadu zejména eknmicky méně vyspělých zemí metdiku nedstupnu. Naprti tmu průtkvá cytmetrie je rzšířená v zemích s hrším eknmickým zázemím. Vzhledem k nedstatečné standardizaci cytmetrie, především její interpretace, jsu všechny dsavadní cytmetrické studie MRN mezené bud' na jednu instituci neb l ab ratř Imunfentypvá detekce MRN u ALL lmunfentyp ALL blastů dpvídá více či méně imunfentypu nrmálně se vyvíjejících prekurzrů. Nemaligní prtějšky prekurzrů T Iymfcytů se fyzilgicky vyskytují puze v thymu, pr sledvání reziduální nemci v periferní krvi a kstní dřeni u T ALL by tereticky měl stačit detekvat blasty pdle imunfentypu nezralých T prekurzrů (exprese intracelulárníh TdT, negativita pvrchvé C03 v rámci C07pzC05pZ T lymfcytů 250. Dále je známá typická hyperexprese mlekuly C099 u významné části T ALL 25/. Naprti tmu nemaligní B prekurzry jsu ve variabilním pčtu prakticky vždy v kstní dřeni zastupeny 13. Známý je tzv. rebund fenmén, kdy nacházíme v regenerující kstní dřeni B prekurzry např. p chemterapii až v desítkách prcent. Hledání rzdílů v imunfentypu blastů d nemaligních B prekurzrů je zásadní prblém reziduální nemci u BCP ALL 250. Pr dlišení leukemických B prekurzrů d nemaligních prtějšků využíváme něklik typických vlastnstí leukemických blastů: snížená neb napak zvýšená exprese některých mlekul (např. snížená exprese až negativita mlekuly C038, hyperexprese CO lo, 0 58) exprese aberantních mlekul zjiné linie než Iymfidní (např. exprese C066c, C033, C013, C015) exprese mlekul v rámci nolmální hematpézy se vůbec nevyskytující (NG2 - mlekula chndritin sulfátu, která se exprimuje typicky u ALL i AML s přestavbami MLL genu) asynchrnní exprese mlekul (např. intracelulární exprese TdT na C034 0eg blastech, pzitivita C02l na C034 PZ blastech) Je nutné zmínit i změny imunfentypu u dětské ALL během léčby. V rámci indukce ALL, kdy významnu část terapie tvří krtiksteridy, je časté ptlačení exprese některých mlekul, které při diagnóze hdntíme jak hyperexprimvané (např. COlO, C034) neb napak upregulace mlekul, které hdntíme při diagnóze jak sníženě exprimvané (např. C045) 23/ Mezi diagnózu a relapsem čast nacházíme nestabilitu exprese aberantních mlekul, jak je např. C0 33, C013 a CD , napak mlekula C066c ukazuje významnu stabilitu 253. Prkázali jsme ale stabilitu myelidníh antigenu C033 v časné fázi léčby 252.

49 E. Mejstříkvá, strana 48 V sučasné dbě se pstupně stává dstupná 9 a více-barevná cytmetrie (příklad na brázku 16), umžňující analýzu více než I I parametrů na jedntlivé buňce. Očekáváme s tímt přístupem zvýšení senzitivity a specificity průtkvé cytmetrie zejména v časvých bdech s regenerací v KD '... W c.. <'> '00 8 U 10 B Pt'rrrr...,""'" lrukem"k bb.. cr> DOO "f p- C?,. lť,.. '.'.,. " u 5;; " "... U,"', I.. ''''''''' 10,.. Ul'",r..x'O O> >- C? lť,.. U '" 'OOM HJO W OQ, OO\X) , , ' 000 g... <C,.. c M U t 10 I DO ' !0 C058 FITC CD20 PB C058 FITC C058 FITC Obrázek 16a. MRN pdle pr/'itkvé cytmetrie u pacienta s vysce rizikvu B prekurzrvu ALL 3 měsíce d zahájení léčby. Pacient s iniciální hyperleukcytózu až WBC/uL, dbru dpvědí na prednism a více než 25% blastů (M3) v KD v den i5, cž pacienta kval(fikval d vyskéh rizika. Anal)/za kmbinace CD58/CD66c/CDiO/CDi9/CD45/CD34/CD38/CD2G. Všechny brázky jsu z gatu CDiC/: buněk. V kstní dřeni jsu zřetelné jak nemaligní B prekurzry (CD66c l1eg CD58 p :(be: hyperexprese) CD38 p : ), Lak i leukemické buňky (aberantní exprese CD66c, hyperexprese CD58, nízká až negativní CD38, vyšší intenzita CDiO prti nemaligním B prekurzrům). Celkvá hladina MRN je i, 2% ze všech jaderných buněk a tat hdnta by pacienta pdle nejnvějších BFM kritérií kvalifikvala pr maximální terapii vče tně algenní SCT i d nepříbuznéh dárce (pacient žije v i. kmpletní remisi 22 měsíců d iniciální diagnózy na udržvací terapii dle prtklu ALL JC BFM 2002).

50 E. Mejstříkvá, strana 49 10', , pacient I Z CD19PS bun ěk I,', , lť ;;. u 10" 10'... C U 'r- "f '',r/',' 10' B 530f30-A: C020 FITC B-53013Q-A '', , 10' ul 10' 10 1 FL1-H: CD20 FITC III všechny CD19PS,',r/' 10' 10' B-530f30-A: CD20 rite B-530!JO A srtvané CD 19ps ne g, IgH/TCR=2,1 (zcela leukemlcké) CD20 Obrázek 16b. Vyská hladina MRN (mdře) na hladině 5,8% s kexistencí nemaligní B řady (červeně) u pacienta s Pfr= ALL 180 dní p SCT P neúspěšné indukční terapii byl remise dsažen až p přidání imatinibu. Pacient byl transplantván v mlekulární remisi pdle přestaveb 19/TCR (pacient 6 sl0 36 z přílhy 5), přest velmi časně narstla MRN a následně nemc zrelabvala úedná se jedinéh pacienta s negativní MRN před SCT, který zrelabval}. Pacient zemřel v léčbě relapsu na.\ystémvu mykticku infekci. Leukemický půvd blastlj znázrněných na tmt brázku jsme věřili přímým srtváním a následným věřením přítmnsti klnálních přestaveb 19/TCR, Cytmetrická reziduální nemc v mezinárdní studii Mini-Mini Jak již byl zmíněn, všechny dsud publikvané i aktuálně prbíhající studie využívající MRN průtkvu cytmetrií jsu zpravidla mezeny na jednu labratř, respektive jednu ? J v' - d k MRN d" h h' _ InStItUCI ',,-, -. e zrejme, ze ete ce ve stu II t t rzsa u je mzna jen multicentricky. Průtkvá cytmetrie je pvažvána za metdiku becně dstupnější i v zemích s hrším eknmickým zázemím. Asi u 5 až 10% pacientů se nepdaří zavést per systém, bud' z d ůvdu nenalezení vhdných dstatečně specifických a senzitivních klnálních přestaveb, neb z důvd ů lgistick - bilgických (nemžnst získat dstatečné mnžství materiálu př i diagnóze nemcnění, nezaslání rzhdujících vzrků d labratře). U těcht pacientů lgicky vzniká tázka pužitelnsti klasifikace MRN pdle průtkvé cytmetrie. Dsud ale nebyla publikvána jednznačná kritéria pr hdncení cytmetrické MRN.

51 E. Mejstříkvá, strana 50 V rámci studie Mini Mini Jsme navrhli jedntný panel mnklnálních prtilátek s pužitelnstí prakticky pr všechny pacienty s ALL. V rámci hdncení MRN jsme definvali širké spektrum subppulací rámci B řady i T řady s cílem pstihnut i případné imunfentypvé dchylky vzniklé jak v časné fázi léč b y 23/ V rámci B řady jsme definvali pdle pacientů z piltní fáze (děti s relapsem ALL a sledvanu MRN pdle RQ PCR a pacienti s regeneruj ící kstní dřeni v průběhu l éčby a p SCT) celkem 29 subppulací a v rámci T řady celkem 5 subppulací. D studie se zapjily labratře z Chrvatska, Izraele, Maďarska a Hng Kngu. Navrhli jsme jedntné templáty pr interpretaci dat v sftwaru Cellquest (BD San Jse) a lwj (TreeStar, Oregn). Léčba ALL představuje kmplexní situaci, kdy v kstní dřeni dchází pstupn ě k redukci nádrvéh klnu a znvubjevení nemaligní hematpézy. Oba tyt dynamické aspekty je průtkvá cytmetrie schpná bsáhnut. Vzhledem k tmu, že pdle prtklu ALL IC BFM-2002 se léčí d října 2002 a medián sledvání celé khrty stále není dstatečný pr krelaci s prgnózu, byl nutné najít v první fázi jiný způsb, jak věř i t tent způsb hdncení cytmetrických dat. Jak již byl zmíněn výše, zlatým standardem v sučasné dbě je detekce MRN pdle RQ PCR Ig/ TCR. Pdle náhdné plviny negativních vzrk ů v daný časvý bd a pdle tzv. "crss lineage" kntrl (pacienti s T ALL změření kmbinacemi prb řadu a napak) jsme definvali pzadí v kstní dřeni specifické pr každý časvý bd zvlášť. Hdnty subppulací, které přesáhli trjnásbek 98. percentilu subppulací "crss lineage" kntrl a RQ PCR negativních vzrků, jsme definvali jak MRN, pkud byl více hdnt subppulací hdncen jak MRN, jak MRN jsme značili nejvyšší z nich. dncení senzitivity a specificity MRN pdle průtkvé cytmetrie byl tedy vztažen k hladině MRN pdle RQ PCR ( přílha ll). Zjisti li jsme, že předem definvané subppulace mhu pskytnut relevantní infrmaci i v platfrmě 4barevné cytmetrie. Jak rzvádím v přílze 11, standardně definvané subppulace rzdělí v den 15 pacienty s BCP ALL (ale nikliv st ALL) pdle pravděp db nsti MRN pdle citlivé PCR v den 33 a v týden 12. Tyt závěry mají bezprstředn í význam pr plánvání dalších léčebných prtklů Mlekulárně genetická detekce MRN u ALL O becně u ALL je mžné nalézt mlekulárně genetické cíle u většiny pacientů (minimálně u 80%). Jednak využíváme jak přestavby genů Ig/TCR, u pacientů s přítmným fúzním genem (např. TEL/AMLl neb BCRlABL) lze pužít i sledvání jejich transkriptů. Většina

52 E. Mejstříkvá, strana 51 léčebných stratifikací v sučasné dbě vychází u ALL pře devším z kvantitativníh sledvání přestaveb Ig/TCR neb průtkvé cytmetrie 247, 249, (lg/tcr) Sledvání MRN u ALL pmcí p řestaveb imunreceptrvých genů Detekce MRN pmcí kvantifikace klnálních přestaveb genů pr imunglbuliny (lg) a T buněčné receptry (TCR) vychází z předpkladu, že buňky ALL jsu maligními prtějšky nezralých lymfidních buněk 2/0. Pkud maligní zásah pstihne lymfidní prekurzr, který již zahájil prces V -(D)-J rekmbinace, mají všechny jeh dceřiné buňky stejné sekvence přechdvých blastí pdjedntek antigenvých receptrů specifické pr leukemický kln danéh pacienta. Mezi nejčastěji detekvané klnální přestavby u leukémií z B řady patří přestavby těžkých řetězců imunglbu li nů, které lze detekvat u více než 95% dětských ALL z B řady. Většinu z nich tvří kmpletní přestavby V-D-J, v přibližně 20% lze nalézt nekmpletní O-J přestavby. U T-ALL lze sledvat přestavby T buněčnéh receptru gama (TCRG), delta (TCRD), a beta (TCRB), přestavby pdjedntky alfa se pr přílišnu slžitst tht vyšetření rutinně nevyšetřují. Zvláštním fenménem u leukémií je tzv. linivá prmiskuita, která způsbuje přestavvání genů pr receptry T Iymfcytů u B prekurzrvé ALL (TCRG, TCRB a nekmpletní přestavby TCRD) a napak výskyt nekmpletních přestaveb IgH u T ALL 260. Prvním krkem metdiky je určení klnality přestaveb pmcí screeningvéh panelu, který zahrnuje (pdle pstupu pužívanéh naší labratří) 27 PCR reakcí pr jedntlivé rdiny segmentů těžkých (lgh) a lehkých (lgk) řetězců imunglbulinů a pr nejčastěji přestavvané segmenty TCRB, TCRG a TCRD 26 /. Mnklnální prdukty PCR věřené pmcí analýzy heterduplexů 26/ jsu sekvenvány a na základě přechdvých V -(D)-J ekvencí jsu navrženy specifické primery. Pmcí těcht primerů a flurescenčně značených snd je pak zaveden pacient-specifické RQ-PCR 46, 262, 263. MRN je kvantifikvána s pužitím DNA z diagnstickéh vzrku kstní dřeně jak standardu. Takt je mžné v labratřích s dstatečnu zkušenstí zavést systém pr sledvání MRN až u 95% pacientů s ALL, ve skutečnsti je vždy celkvá úspěšnst naknec nižší, vstupuje d th čast faktr i lgistický (nedstatečné mnžství materiálu, neddání vzrku d labratře apd.). Tat univerzálnst je však vykupena velku finanční, časvu a metdicku nárčnstí tét metdy. Dalším negativem je mžnst nespecifickéh nasedání primerů na přestavěné sekvence Ig/TCR ve zdravých lymfcytech s nebezpečím falešné pzitivity vyšetření. Prt byla Evrpsku skupinu pr reziduální nemc u ALL (ESG-MRD-ALL) navržena pravidla

53 E. Mejstříkvá, strana 52 pr vyhdncvání MRN pmcí tét metdy, která zahrnují mim jiné pužití multiplikátu DNA z l ymfcytů zdravých dárců jak negativní kntrly 264. Prkázali jsme, že regenerace B řad y p transplantaci kstní dřeně je spjená s falešnu pzitivitu přestaveb imunreceptrvých genů v cílech zahrnující některé typy přestaveb těžkéh i lehkéh řetězce, přestže vzrky byly vyhdnceny jak pzitivní pdle kritérií ESO. Míra tét regenerace především závisí na suběžně pdávané imunsupresi: při pdání krtikidů nacházíme významnu redukci B prekurzrů až jejich absenci, s čímž je spjen významně nižší pčet ( přílha 6). falešných pzitivit v systémech pr detekci MRN pdle IglTCR přestaveb Sledvání MRN u ALL pmcífúzních genů U č ásti pacien tů s ALL jsme schpni identifikvat tzv. fúzní geny. Tyt fúzní geny lze sučasn ý mi metdikami detekvat v ně kterých případech jak na úrvni mrna, tak i na úrvni DNA ( například fúzní geny zahrnující gen MLL), některé fúzní geny se z technických d ů v d ů detekuj í puze na RNA úrvni (BCR/ABL). Prkázána je dbrá krelace hladiny transkriptu TEL! AMLl a pře s tave b Ig/TCR 265. TEL! AMLl se tedy nabízí jak vhdný cíl při nemžnsti sledvání specifických cí l ů pdle přestaveb Ig/TCR. Dsud není publikvána práce která by technicky a prgnsticky srvnala detekci MRN pdle přestaveb Ig/TCR a pmcí fúzníh genu BCR/ABL. U krelace fúzníh genu BCR/ABL s přestav bami Ig/TCR je třeba mít na pam ě ti, že fúzní gen BCR/ABL může být u ALL přítmen (pdbně jak u blastickéh zvratu CML) i v jiných liniích než v Iymfidní Nevýhdu sledvání MRN pmcí fúzních genů na RNA úrvni je mžnst kntaminace s rizikem falešné pzitivity a dále c e lk vě vyšší pžadavky na kvalitu a stáří vzrku Nepří mé sledvání M RN pmcí chimérismu p algenní SeT Pr úplnst je třeba ještě zmínit sledvání případných reziduálních leukemických buněk b ecně u hematlgických malignit, jak akutních, tak i chrnických, pmcí chimérismu s přibližnu citlivstí Zlatým standardem v sučasné dbě je sledvání pacienta a dárce pmcí specifických STR (shrt tandem repeats) sekvencí Samzřejmě signál příjemce nemusí vždy znamenat nutně relaps malignity. Ppulaci, ve které detekujeme gentyp příjemce, lze zřejm it srtváním 269.

54 E. Mejstříkvá, strana Léč ebný prtkl ALL IC-BFM 2002 pr primární léčbu de nv ALL Studie ALL IC-BFM 2002 je léčebný prtkl, který byl krdinván Če s ku republiku a jeh vznik byl mtivván snahu zlepšit léčebné výsledky v zemích s dstatečnu zkušenstí s prtkly BFM skupiny, ale nedstatečně zkušených v mnitrvání MRN. Jedním z cílů byl srvnat stratifikaci pacientů pdle klinických a bilgických vlastnstí se stratifikací prtklu ALL-BFM 2000, ve kterém byli pacienti stratifikváni předev š ím pdle hladin MRN. Základní schéma bu prtklů je na brázku 17. V ALL-BFM 2000 se zásadně změnila stratifikace, některá klasická kritéria, která se pužívala v předcházejících léčebných prtklech, jak věk a leukcytóza, nebyla zahrnuta d stratifikace pacientů 259, 273 ( přílha 7J Tat kritéria byla nahrazena parametrem MRN pdle přestaveb Ig/TCR ve dvu časvých bdech - v den 33 a týden 12 d diagnózy ALL. Tyt časvé bdy pr detekci MRN byly pdlženy retrspektivní analýzu MRN publikvanu v rce Pacienti s negativní reziduální nemcí v den 33 a v týdnu 12, s dbru dpvědí na prednisn a bez fúzníh genu BeRl ABL a MLLI AF4 jsu řaze n i d standardníh rizika. Pacienti se špatnu dpvědí na prednisn, s prkázaným fú zním genem BCRlABL neb MLLlAF4, nedsažením remise v den 33 neb MRN vyšší než 10-3 v týden 12 jsu řazeni d vyskéh rizika. Ostatní pacienti, v četně těch, u kterých není mžné zavést systém na sledvání přestaveb imunreceptrvých ge nů, jsu řazeni d stře dn í h rizika. Léčebný prtkl ALL IC-BFM 2002 zahrnuje země ze všech kntinentů a v sučasné dbě byl d tht prtklu d října 2002 zařazen více jak 4000 dětí s nvě diagnstikvanu ALL. Základní tázku tht prtklu je prvnání klasických stratifikačních kritérií s nvu stratifikací zhledňující MRN v rámci ALL-BFM Pacienti standardníh rizika v prtklu ALL IC-BFM 2002 splň uj í následující kritéria: jsu mladší 6 let, iniciální pčet bílých krvinek je nižší než 20000/flL, v den 33 je dsažen kmpletní remise, v den 15 v kstní dřeni je méně než 25% blastů, mají dbru dpvěď na prednisn a nemají prkázaný fúzní gen BCRlABL ani MLLlAF4. Paclc:nti vyskéh rizika splňují alespň jednu pdmínku z následujících: špatná dpvěď na prednisn, nedsažení kmpletní remise v den 33, prkázaný fúzní gen BCRlABL neb MLLlAF4, více než 25% blastů v den 15 u pacientů jinak nesplňujících standardní rizik. Ostatní pacienti jsu řazeni d středníh rizika. V rámci prtklu prbíhají dvě výzkumné studie srvnávající výslednu stratifikaci v bu prtklech: studie Mini Risk sleduje, zda pacienti standardníh rizika by splnili kritéria pr zařazení d nízkéh rizika i vprtklu ALL BFM 2000, studie Mini Mini (viz kapitlu , str. 4) řeší tázky

55 E. Mejstříkvá, strana 54 detekce MRN průtkvu cytmetrií. Prkázali jsme, že skupina standardníh rizika se liší v bu prtklech 273 (přílha 7). analllrrdy let d 15 d33 w12 dx! [fl' ** t ic ALL IC-BF12002 : TREATl\tIENT,., (" ".pl', "d I" A.lIl1u,,, hiiji'- 1 }=:::2 I 1fl>JI'1 SR - : t nb '!Ai. I 6-MP I WX I_I I L...I t i. 1U_. _t LJ m) r.;;í:::'i "[J III L..I_MP_: II D C _MIX--I 11 ';F';- Il.!::1 =IIII--I _ ú,_:\ip _. MT_X ---II f. IILI II 6 MP.M'!X I I''II----'' ),),. (j ' 2 lo '" "' nm 't rr m:,!'i_ I D!\1Ut1'...',z.11Il $<,," l( p;aiial wiůllll'-all 'lt 8CP-ALL. \ fix 1" ""'...ll..,. rol r : \ITX $;Im'1.Jln.J tj I':.r t, tr J!lC' rrtdaj Lm!.'bnDn ' <#Irntd,ndIi::l._ lb..,...'i( Tm au ""'" ", HR I _cf AlEOP,... /lfm bul Ú>OIC< br. ccrdm!; '" 1"""_ """,,""'".,I11_1IC"1II: h'u lkh -'... >IUJqIb IU O"" PI MRD TůnepinlS AIEOP LLA ALL-BFNI 2000 (3) (4) (5) l la 11] lb 2 strl fikace Pl entu --,l " I I KD Ptt«>ll. PII.J:..e,\.,., DE.'ú\ J... p Prun>cl l. PJw..,lh PRED Obrázek 1 7 Schéma léčebnéh prtklu ALL JC-BFM 2002 a AJEOP BFM Zdlrazněny jsu časvé bdy, v kterých byla mnitrvána MRN v prtklu ALL Je BFM 2002 a v kterých čas vých bdech se stratifikuje v léčebném prtklu ALL BFM 2000.

56 E. Mejstříkvá, strana Detekce MRN p relapsu ALL a u pacientů indikvaných k algenní SeT Pacienti, kteří jsu zahrnuti přílze 5 274, jsu vů b ec prvními, u kterých byla v České republice sledvána léčebná dpvěď pdle přestave b imunreceptrvých genů. Tit pacienti představvali první khrtu pacientů pr věřen í senzitivity a specificity MRN pdle průtkvé cytmetrie, která byla v piltní studii pužívána v naší labratři již d rku V rámci studie jsme prkázali, že negativita MRN pdle přestaveb imunreceptrvých genů před SCT (vzrek debraný těsně před zahájením přípravnéh režimu - tzv. "cnditiningu") je pdle našich dat významným prediktrem přežití bez událsti jak v univariantní, tak i multivariantní analýze. D studie byli zahrnuti pacienti jak s relapsem ALL, tak i pacienti s vysce rizikvu frmu ALL, u kterých byla indikvána SCT v I. kmpletní remisi. Dsud jedinu publikvanu studií prgnstickém významu MRN pdle průtkvé cytmetrie u relapsu ALL je práce Custan - Smith et al V tét studii byli hdnceni všichni pacienti, vč etně pacientů s extramedulárním relapsem, kteří měli vyšetřenu hladinu MRN p sknčení indukce a měli vhdný imunfentyp pr sledvání. Tat studie v rámci multivariantní analýzy ukázala jak negativní prgnstický faktr relaps vzniklý v průběhu lé čby a MRN 0,01 % na knci indukce. Tat publikace ptvrzuje zkušenst i jiných pracvních skupin na světě, že časný relaps v kstní dřeni na léčbě je puhu chemterapií prakticky nevyléčitelný 276. U pacientů zahrnutých v článku Šrámkvé et al. byla sledvána MRN rvněž průtkvu cytmetrií, v letech 1996 až 2002 det kce byla prváděna měřením jedné neb dvu kmbinací prtilátek, které reflektvaly nejvhdnější imunfentypvé aberace (tzv. LAIP - Leukemia Assciated Immunphentype) dlišující maligní d nemaligních buněk. Tat strategie je v detekci MRN velmi častá 254, 277, 278. Pr pkrytí eventuálních imunfentypvých shiftů se dpručuje pužít pr detekci MRN alespň dvě imunfentypvé aberace 279. Rzlišení leukemických buněk d případných regenerujících prekurzrů je pstaven na expertním hdncení cytmetristy. Tent přístup neumžňuje kmplexní přístup k reziduální nemci průtkvu cytmetrií, např. není mžné tímt přístupem definvat, jaké ppulace jsu v daný časvý bd nrmu a jaká hranice jejich prcentuálníh zastupení již svědčí pr MRN. Od září 2002 jsme zahájili detekci MRN v rámci studie Mini Mini v prtklu ALL IC-BFM 2002 pdle jedntnéh panelu čty řbarevných kmbinací zvlášť pr BCP ALL (SYTOI6/CDI9/CD45. CD20/CDIO/CD I9/CD34, CDIO/CD66c/CD19/CD45, CD58/CDlO/CD19/CD34) a pr T

57 E. Mejstříkvá, strana 56 ALL (SYTO 16/CD 19/CD45, CD99/CD7/CD5/CD3 a intra-t dt /CD7 /CD5/intra-CD3) ( přílha ll). Tyt kmbinace jsme ve stejné pdb ě začali pužívat pr detekci MRN i u pacientů sledvaných p relapsu či p transplantaci. V pd statě nám výše uvedené kmbinace u m ž ň ují definvat dstatečný pčet imunfentypvých aberací vhdných pr sledvání MRN Detekce MRN u pac ie ntů s AML Detekce MRN u AML byla první aplikace, kde jsme začali pužívat 4-barevnu průtkvu cytmetrii a v rámci tét studie jsme definvali řadu principů pužitelných i pr detekci MRJ\[ u ALL. Celá studie prbíhala v rámci prtklu AML BFM 98, který byl krdinvána klegy z Milnsteru. V naší studii jsme definvali jak základní 2 antigeny CD34 a CD33 ( " páteř (backbne)"), na nichž se detekvaly jedntlivé imunfentypvé aberace. Pr kvantifikaci MRN z jaderných buněk jsme zavedli měření flurescenční barvičky SYTO-16, které vlně prchází buněč n u membránu a značí nuklevé kyseliny a tím pmáhá k dlišení jaderných buněk d nejaderné drti. Medián vzniku relapsů u dětských AML je kl 1 rku /02, 280, cž umžňuje rychlé hdncení vlivu MRN na výsledky léčby. Detekce MRN prbíhala ve dvu ča svě ddě l ený ch peridách, přičemž na pacientech z první khrty (2000 až 2001 ) se stanvily prahvé hdnty ("cut ffy") jedntlivých subppulací v definvaných časvých bdech (den 15, 21 až 28, 42-56, 70 až 84) pr predikci relapsu nemcnění 192. Na splečných datech jsme prkázali, že pacienti s prkazatelnu imunlgicku přítmnstí blastů ve 3 a íce časvých bdech měli signifikantně hrší přežití bez událsti (přílha 4) /89. V rámci multivariantní analýzy jsme ale neprkázali přídatnu hdntu MRN pdle průtkvé cytmetrie ke kritériím, která se pužívala ve stratifikaci pdl e prtklu AML BFM 98 /4/, Závěr Mye/idní antigeny u ALL Objevili jsme nvé suvislsti mezi aberantními myelidními antigeny a jejich vztah k prgnóze a ke gentypu ( přílhy ], 3). Objevili jsme silný prgnstický význam exprese CD33 u ALL celkvě i u důležitých pdskupin pacientů (přílha I). Naše výsledky ukazují, že jedntlivé myelidní antigeny mhu být regulvány rzdílně a že tedy dsavadní praxe jejich směšvání byla nesprávná. Demnstrvali jsme nestabilitu exprese myelidních

58 E. Mejstříkvá, strana 57 antigenů zejména při primární léčbě ALL ( přílhy 1, 3), přičemž některé antigeny (CD66c) mají srvnatelnu expresi při relapsu ALL, jiné (např. CD33) nikliv Význam diferenciač níh antigenu CD10 Naše data ukazují, že exprese jednh z nej dů ležitěj š í ch anti genů u leukémií, CD 10, může být v rámci klasifikace B prekursrvé ALL pužita k lepšímu prgnstickému rzdělení ALL Minimální reziduální nemc P růtkvá cytmetrie při primární léčbě rzdělí pacienty s B prekurzrvu ALL pdle hladiny MRN. Splehlivé pužití 4 barevné cytmetrie s předdefinvanými gaty je limitván na prvních 15 dnů prtklu ALL-IC BFM2002, přičemž tat hdnta splehlivě určí zařazení d skupin MRN měřených PCR. Analgické využití časné dpvědi na léčbu T ALL není mžné pr jinu kinetiku léčebné dpvě di ( přílhy 7, ll). U nepřízni ých frem ALL lze cytmetricky detekvat MRN i v pzdějších fázích léčby ( přílha S), pravděpdbně díky menší fentypvé plasticitě maligních blastů. Reknstituce B řady je ptenciálním zdrjem falešných pzitivit i při detekci MRN pmcí přestaveb genů 19 ( přílha 6) Cytmetrie detekuje MRN u AML, ale není schpna prgnsticky rzdělit pacienty v rámci existujících rizikvých skupin ( přílha 4). 5. Seznam zkratek ABL AEIOP AF10 AHL ALL AML AMLM4e AML1 ara-c ARA-G ATRA BCP BCR BFM gen V -abl Abelsn murine leukemia viral ncgene hmlg, lkalizace 9q34.1 Assciaznie ltaliana Ematlgia Onclgia Pediatrica (pracvní skupina) gen ALL 1 fused gene frm chrmsme 10, lkalizace 1 Op 12 akutní hybridní leukémie akutní lymfblastická leukémie akutní myelidní leukémie akutní myelidní leukémie varianta M4 s esinfilii gen Acute myelid leukemia 1 (synnymum RUNX1 (runt-related transcriptin factr 1), CBF A2 (cre binding factr A2), lkalizace 21q22.3 cytsin arabinsid arabinsyl guanin all-trans retinvá kyselina (retinic acid) B prekurzrvá (B cell precursr) Breakpint cluster regin, lkalizace 22q11.2 (sučást fúzníh genu BCRlABL) Berlín-Frankfurt-Munster (pracvní skupina)

59 E. Mejstříkvá, strana 58 bhlhb I CALM CBF CBFp CCG CD CEBPa C-KIT CNS COG DAPI DNA EFS EGIL ESG-MRD-ALL EsPhALL ETO FAB FLT3 FLT3/1TD GMALL GO GSTTI HDAC HLA HOXII HOXllL2 19 ITD JMML L LAIP LMOI LM02 LYLI MDS MLL MRN MYC MYHll NCI NG2 gen Basic helix-ip-helix dmain cntaining, class B, 2, lkalizace 21q22.11 gen calmdulin I (phsphrylase kinase, delta), lkalizace 14q24-q31 cre binding factr gen pdjedntky CBF, lkalizace 16q22 Childhd Cancer Grup (pracvní skupina) cluster f differentiatin (nmenklaturní systém antigenů) gen pr CCAA T enhancer binding prtein alp ha, lkalizace 19q 13.1 gen receptru pr stem cell faktr, lkalizace 4q 12 centrální nervvý systém Childhd Onclgy Grup (pracvní skupina) 4",6 - diamidin phenylindle, di hydrchlride (flurescenční barviv značící stechimetricky DNA) dexyribnyklevá kyselina (dexyribnucleic acid) přežití bez událsti ("událstí" je smrt, relaps neb sekundární malignita, event free survival) Eurpean Grup fr the Immunlgical Characterizatin f Acute Leukemias Eurpean Study Grup n MRD detectin in ALL (pracvní skupina) Eurpean lntergrup Study n Pst Inductin Treatment fphiladelphia Psitive Acute Lymphblastic Leukaemia with lmatinib gen Eigth twenty ne (synnymum RUNX1 Tl (runt-related transcriptin factr 1; translcated t, 1 (cyclin D-related)), lkalizace 8q22 French-American-British (klasifikace leukémií) gen FMS-like tyrsine kinase 3, lkalizace 13q 12.2 interní tandemvá duplikace FLT3 German Multicenter study grup n Adult acute Lymphblastic Leukemia (pracvní skupina a prtkl) gemtuzumab zgamicin, Myltarg enzym glutathin S-transferáza theta 1 hi stn deacetyláza (histn deacetylase) human leuccyte antigen rdina genů Hmebxll (TLXl,2,3) gen Hmebx 11 L2, lkalizace 7p 15-7p 14.2 imunglbulin interní tandemvá duplikace juvenilní myelmncytární leukémie litr leukemia assciated immunphentype gen (LIM dmain nly 1 (rhmbtin-like 1)), lkalizace l1p15 gen (LIM dmain nly 2 (rhmbtin-like 2)), lkalizace 11 p13 gen Lymphblastic leukemia derived sequence 1, lkalizace 19p13.2 myeldysplastický syndrm gen Myelid/lymphid r mixed lineage leukemia, lkalizce l1q23 minimální reziduální nemc prtncgen MYC, lkalizace 8q24 gen Mysin heavy chain, lkal izace 16p 13 Natinal Cancer Institute mlekula chndritin sulfátu

60 E. Mejstříkvá, strana 59 NHL NOTCHl NPMl OKT-3 PAXS PCR pefs Ph PML PNP POG prfs RAEB RAEB-t RARa RC RFS RNA RQPCR SCT STR SYTO-16 TALl TAL2 TCR TdT TEL TLXl TLX3 TMD TPS3 VOD WTl Nn Hdginský Iymfm gen Ntch hmlg 1, translcatin-assciated (Drsphila), lkalizace 9q34.3 gen nuciephsmin, lkalizace 5q35 kln anti-cd3 prtilátky Paired bx gene 5, lkalizace 9p13 plymerázvá řetězvá reakc (plymerase chain reactin) pravděpdbnst přežití bez událsti ("událstí" je smrt, relaps neb sekundární malignita, event free survival) Filadelfský (Ph chrmzóm na pdkladě trans lkace BCRI ABL (9;22) gen prmyelcytární leukémie purine nucieside fsfryláza Pediatric Onclgy Grup (pracvní skupina) pravděpdbnst přež ití bez relapsu refrakterní anémie s excesem blastů (refractry anemia with excess f blasts) refrakterní anémie s excesem blastů v transfrmaci (refractry anemia with excess f blasts in transfrmatin) gen receptru pr retinvu kyselinu alfa (retinic acid receptr alpha) refrakterní cytpénie přežití bez relapsu nemcnění (relapse free survival) ribnuklevá kyselina (ribnucieic acid) kvantitativní plymerázvá řetězvá rekace transplantace krvetvrných buněk (stem cell transplantatin) shrt tandem repeats zelené flurescenční barviv značící nuklevé kyseliny a vlně prcházející buněčnu membránu gen T -cell acute leukemia 1, lkalizace 1 p32 gen T-cell acute Iymphblastic leukemia 2, lkalizace 9q31 T buněčný receptr (T cell receptr) terminální dexynukletidyl transferáza gen Translcatin ets leukemia, lkalizace 12p 13.1 gen T cellleukemia, gen z rdiny hmebx genů, lkalizace 10q24 gen T-cellleukemia, gen z rdiny hmebx genů, lkalizace 5q35.1 tranzitrní myelprliferativní nemc (transitry myelprliferative disease) gen prteinu p53 ( veliksti 53 kda), lkalizace 17p 13 venkluzivní nemc (venciusive disease) tumr supresrvý gen Wilmsva nádru, lkalizace 11 p 13

61 E. Mejstříkvá, strana Literatura Pužitá literatura 1. Yung NS, Scheinberg P, Calad RT. Aplastic anemia. Curr Opin Hematl 2008; 15(3): Hrusak O, Trka J, Zuna J, Pluckva A, Kalina T, Stary 1. Acute lymphblastic I ukemia incidence during sciecnmic transitin: selective increase in children frm l t 4 years. Leukemia 2002; 16(4): Pui CH, Rbisn LL, Lk A T. Acute Iymphblastic leukaemia. Lancet 2008;371 (9617): Strahm B, Malkin D. Hereditary cancer predispsitin in children: genetic basis and clinical implicatins. Int J Cancer 2006; 119(9): Zuna J, Cave H, Eckert C, Szczepanski T, Meyer C, Mejstrikva E, et al. Childhd secndary ALL after ALL treatment. Leukemia 2007;21 (7): Shivakumar R, Tan W, Wilding GE, Wang ES, Wetzler M. Bilgic features and treatment utcme f secndary acute Iymphblastic leukemia--a review f 101 cases. Ann Onc Jaffe ES, Diebld.1, Harris NL, Muller-Helmelink HK, Flandrin G, Vardiman JW. Burkitťs Iymphma: a single disease with multiple variants. The Wrld Health Organizatin c1assificatin f neplastic diseases f the hematpietic and Iymphid tissues. Bld 1999;93(3): Burrneister T, Schwartz S, Hrst HA, Rieder H, Gkbuget N, Helzer D, et al. Mlecular hetergeneity f spradic adult Burkitt-type leukemia/lymphma as revealed by PCR and cytgenetics: crrelatin with mrphlgy, immunlgy and clinical features. Leukemia 2005; 19(8): Attarbaschi A, Mann G, Schumich A, Knig M, Pickl WF, Haas OA, et al. CD44 deficiency is a cnsistent finding in childhd Burkitťs lymphma and leukemia. Leukemia 2007;21(5): Campana D, Behm FG. Immunphentyping f leukemia. J Immunl Methds 2000;243(1-2): ll. Kansal R, Deeb G Barcs M, Wetzler M, Brecher ML, Blck A W, et aj. Precursr B lymphblastic leukemia with surface light chain immunglbulin restrictin: a reprt f 15 patients. Am J Clin Pathl 2004; 121 (4): VasefMA, Brynes RK, Murata-Cllins JL, Arber DA, Medeirs Ll. Surface immunglbulin light chain-psitive acute Iymphblastic leukemia f F AB Ll r L2 type: a reprt f 6 cases in adults. Am.1 Clin Pathl 1998; 11 0(2): McKenna R W, Washingtn LT, Aquin DB, Picker Ll, Krft SH. Immunphentypic analysis fhematgnes (B-Iymphcyte precursrs) in 662 cnsecutive bne marrw specimens by 4-clr tlw cytmetry. Bld 2001 ;98(8): Krft SH, Asplund SL, McKenna RW, Karandikar N1. Haematgnes in the peripheral bld f adults: a fur-clur tlw cytmetry study f 102 patients. Br J Haematl 2004; 126(2): Sims GP, Ettinger R, Shirta Y, Yarbr CH, Illei GG, Lipsky PE. Identificatin and characterizatin f circulating human transitinal B cells. Bld 2005; 105(11): Bene MC, Castldi G, Knapp W, Ludwig WD, Matutes E, Orfa A, et aj. Prpsals fr the immunlgical classificatin f acute leukemias. Eurpean Grup fr the Immunlgical Characterizatin f Leukemias (EGIL). Leukemia 1995 ;9( 1 O):

62 E. Mejstříkvá, strana Bene MC, Bernier M, Casasnvas RO, Castldi G, Knapp W, Lanza F, et al. The reliability and specificity f c-kit fr the diagnsis f acute myelid leukemias and undifferentiated leukemias. The Eurpean Grup fr the Jmmunlgical Classificatin f Leukemias (EGIL). Bld 1998;92(2): Szczepanski T, van der Velden VH, van Dngen]J. Flw-cytmetric immunphentyping f nrmal and malignant lymphcyt s. Clin Chem Lab Med 2006;44(7): Attarbaschi A, Mann G, Dwrzak M, Wiesbauer P, Schrappe M, Gadner H. Mediastinal mas s in childhd T -cell acute lymphblastic leukemia: significance and therapy respnse. Med Pediatr Oncl 2002;39(6): Reiter A, Schrappe M, Ludwig WD, Tiemann M, Parwaresch R, Zimmermann M, et al. Intensive ALL-type therapy withut lcal raditherapy prvides a 90% event-free survival fr children with T-celllymphblastic lymphma: a BFM grup reprt. Bld 2000;95(2): Schrauder A, Reiter A, Gadner H, Niethammer D, Klingebiel T, Kremens B, et a1. Superirity f allgeneic hematpietic stem-cell transplantatin cmpared with ehemtherapy alne in high-risk ehildhd T-cell aeute lymphblastie leukemia: results frm ALL-BFM 90 and 95. J Clin Oncl 2006;24(36): Bene MC, Castldi G, Knapp W, Ludwig WD, Matutes E, Orfa A, et al. Classificatin f acute leukemias: reply frm EG ll t Dr van Dngen. Leukemia 1996; 1 0(8): Kalina T, Mejstrikva E, Vaskva M, Hrusak O. Imunfentypizace dětských leukémií. Transfúze a hematlgie dnes 2006; 12(1 ): Graux C, Cls J, Miehaux L, Vandenberghe P, Hagemeijer A. Cytgeneties and mleeular genetics ft-cell acute Iymphblastic leukemia: frm thymcyte t lymphblast. Leukemia 2006;20(9): O. 25. van Grtel M, Meijerink JP, Beverl HB, Langerak A W, Buys-Gladdines lg, Sclmeider P, et a!. The utcme f mlecular-cytgenetic subgrups in pediatrie T -cell acute lymphblastic leukemia: a retrspective study f patients treated acerding t DCOG r COALL prtcls. Haematlgica 2006;91(9): van Grtel M, Meijerink JP, van Wering ER, Langerak A W, Beverl HB, Buijs- Gladdines lg, et a!. Prgnstic signifieance f mlecular-cytgenetic abnrmalities in pediatrie T-ALL is nt explained by immunphentypic differences. Leukemia 2008;22(1): Niehues T, Kapaun P, Harms DO, Burdach S, Kramm C, Krhlz D, et a!. A c1assificatin based n T cell selectin-related phentypes identifies a subgrup f childhd T-ALL with favrable utcme in the COALL studies. Leukemia 1999;13(4): Baak U, Gkbuget N, Orawa H, Schwartz S, Helzer D, Thiel E, et a!. Thymic adult T-cell acute lymphblastie leukemia stratified in standard- and high-risk grup by aberrant HOX11 L2 expressin: experienee fthe German multicenter ALL study grup. Leukemia Crist WM, Shuster]J, Falletta l, Pullen DJ, Berard CW, Vietti TJ, et a!. Clinical features and utcme in childhd T -cellleukemia-lymphma accrding t stage f thymcyte differentiatin: a Pediatrie Onclgy Grup Study. Bld 1988;72(6): Raff T, Gkbuget N, Luschen S, Reutzel R, Ritgen M, Irrner S, et a!. Mlecular relapse in adult standard-risk ALL patients detected by prspective MRD mnitring during and after maintenanee treatment: data frm the GMALL 06/99 and 07/03 trials. Bld 2007;109(3): Asnafi V, Be1djrd K, Bulanger E, Cmba B, Le Tutur P, Estienne MH, et a!. Analysis f TCR, pt alpha, and RAG- l in T -acute lymphblastic leukemias imprves

63 E. Mejstříkvá, strana 62 understanding fearly human T-Iymphid lineage cmmitment. Bld 2003;101(7): Asnafi V, Beldjrd K, Oarand R, Millien C, Bahlul M, LeTutur P, et aj. IgH Dl rearrangements within T -ALL crrelate with cc079a expressin, an immatureltcrgammadelta phentype and absence f ll 7Ralpha/CO 127 expressin. Leukemia 2004; 18(12): Asnafi V, Beldjrd K, Libura M, Villarese P, Millien C, Ballerini P, et al. Age-related phentypic and ncgenic differences in T -cell acute Iymphblastic leukemias may reflect thymic atrphy. Bld 2004;104(13): Asnafi V, Buzyn A, Thmas X, Huguet F, Vey N, Birn 1M, et al. Impact ftcr status and gentype n utcme in adult T-cell acute Iymphblastic leukemia: a LALA-94 study. Bld 2005; 105(8): Pui CH, Relling MV, Owning lr. Acute Iymphblastic leukemia. N Engl J Med 2004;350(15): Truewrthy R, Shuster J, Lk T, Crist W, Brwitz M, Carrll A, et aj. Plidy f Iymphblasts is the strngest predictr ftreatment utcme in B-prgenitr cell acute Iymphblastic leukemia f childhd: a Pediatrie Onclgy Orup study. J Clin Oncl I 992; I 0(4): Zuna J, Hrusak O, Kalinva M, Muzikva K, Stary J, Trka J. Significantly lwer relapse rate fr TEL/ AML 1-psitive ALL. Leukemia 1999; 13( 1 O): Zuna J, Hrusak O, Kalinva M, Muzikva K, Stary J, Trka J. TEL/AMU psitivity in childhd ALL: average r better prgnsis? Czech Paediatric Haematlgy Wrking Orup. Leukemia 1999; 13(1 ): Schultz KR, Pullen OJ, Sather HN, Shuster JJ, Oevidas M, Brwitz MJ, et aj. Riskand respnse-based classificatin f childhd B-precursr acute Iymphblastic leukemia: a cmbined analysis f prgnstic markers frm the Pediatrie Onclgy Orup (PO O) and Children's Cancer Orup (CCO). Bld 2007; 109(3): Aric M, Valsecchi MO Rizzari C, Barisne E, Bindi A, Casa1e F, et aj. Lng-term results fthe AIEOP-ALL-95 Trial fr Childhd Acute Lymphblastic Leukemia: insight n the prgnstic value fdna index in the framewrk fberlin-frankfurt-muenster based chemtherapy. J Clin Oncl 2008;26(2): Nachman.lB, Heerema NA, Sather H, Camitta B, Frestier E, Harrisn CJ, et aj. Outcme ftreatment in children with hypdiplid acute lymphblastic leukemia. Bld 2007;110(4): Stark B, Jeisn M, Obuzv R, Krug H, Olaser-Oabay L, Luria O, et al. Near haplid childhd acute lymphblastic leukemia masked by hyperdiplid line: detectin by flurescence in situ hybridizatin. Cancer Oenet Cytgenet 2001; 128(2): Attarbaschi A, Mann O, Knig M, Steiner M, Owrzak MN, Oadner H, et aj. Neartetraplidy in childhd B-cell precursr acute lymphblastic leukemia is a highly specific feature f ETV6/RUNX I-psitive leukemie cases. Oenes Chrmsmes Cancer 2006;45(6): Frestier E, Andersen MK, Auti K, Blennw E, Brgstrm O, Olvleva I, et al. Cytgenetic pattems in ETV6/RUNXl-psitive pediatrie B-cell precursr acute lymphblastic leukemia: A Nrdic series f245 cases and review fthe literature. Oenes Chrmsmes Cancer 2007;46(5): Raimndi SC, Zhu Y, Shurtleff SA, Rubnitz JE, Pui CH, Behm FO. Near-triplidy and near-tetraplidy in childhd acute lymphblastic leukemia: assciatin with B-lineage blast cells carrying the ETV6-RUNX1 fusin, T-lineage immunphentype, and favrable utcme. Cancer Oenet Cytgenet 2006; 169(1 ):50-7.

64 E. Mejstříkvá, strana Pieters R, Schrappe M, De Lrenz P, Hann I, De Rssi G, Felice M, et a!. A treatment prtcl fr infants yunger than 1 year with acute lymphblastic leukaemia (lnterfant-99): an bservatinal study and a mul ti centre randmised tria!. Lancet 2007;370(9583): Mann G, Cazzaniga G, van der Velden VH, Flhr T, Csinady E, Paganin M, et a!. Acute lymphblastic leukemia with t( 4; ll) in children 1 year and l der: The 'big sister' f the infant disease? Leukemia Aric M, Valsecchi MG, Camitta B, Schrappe M, Chessells 1, Baruchel A, et a!. Outcme ftreatment in children with Philadelphia chrmsme-psitive acute lymphblastic leukemia. N Engl 1 Med 2000;342(14): Schrappe M, Reiter A, Ludwig WD, Harbtt 1, Zimmermann M, Hiddemann W, et a!. Imprved utcme in childhd acute lymphblastic leukemia despite reduced use f anthracyciines and cranial raditherapy: results ftrial ALL-BFM 90. German-Austrian Swiss ALL-BFM Study Grup. Bld 2000;95( 11 ): De Keersmaecker K, Marynen P, Cls 1. Genetic insights in the pathgenesis ftcell acute lymphblastic leukemia. Haematlgica 2005;90(8): Asnafi V, Radfrd-Weiss I, Dastugue N, Bayle C, LebeufD, Charrin C, et a!. CALM-AFI0 is a cmmn fusin transcript in T-ALL and is specific t the TCRgammadelta lineage. Bld 2003;102(3): Caudell D, Aplan PD. The rle f CALM-AF 10 gene fusin in acute leukemia. Leukemia 2008;22(4): Sulis ML, Williams O, Palmer T, Tsell V, Pallikuppam S, Real Pl, et a!. NOTCHl extracellular juxtamembrane expansi n mutatins in T-ALL. Bld Suwanjunee S, Wngchana W, Palaga T. Inhibitin f gamma-secretase affects prliferatin f leukemia and hepatma celllines thrugh Ntch signaling. Anticancer Drugs 2008; 19(5): Smith M, Arthur D, Camitta B, Carrll AJ, Crist W, Gaynn P, et a!. Unifrm apprach t risk classificatin and treatment assignment fr children with acute lymphblastic leukemia. 1 Clin Oncl 1996; 14(1): Mricke A, Zimmermann M, Reiter A, Gadner H, Odenwald E, Harbtt 1, et a!. Prgnstic impact f age in children and adlescents with acute lymphblastic leukemia: data frm the trials ALL-BFM 86, 90, and 95. Klin Padiatr 2005;217(6): Stanulla M, Schaeffeler E, Flhr T, Cari G, Schrauder A, Zimmermann M, et a!. Thipurine methyltransferase (TPMT) gentype and early treatment respnse t mercaptpurine in childhd acute lymphblastic leukemia. lama 2005;293(12): Bissel N, Auclerc MF, Lheritier V, Perel Y, Thmas X, Leblanc T, et a!. Shuld adlescents with acute lymphblastic leukemia be treated as ld children r yung adults? Cmparisn fthe French FRALLE-93 and LALA-94 trials. 1 Clin Oncl 2003 ;21 (5): Ramanujachar R, Richards S, Hann I, Gldstne A, Mitchell C, Vra A, et a!. Adlescents with acute lymphblastic leukaemia: utcme n UK natinal paediatric (ALL97) and adult (UKALLXIIIE2993) trials. Pediatr Bld Cancer 2007 ;48(3) : Ramanujachar R, Richards S, Hann I, Webb D. Adlescents with acute lymphblastic leukaemia: emerging frm the shadw f paediatric and adult treatment prtcls. Pediatr Bld Cancer 2006;47(6): Cnter V, Valsecchi MG, Silvestri D, Campbell M, Dibar E, Magyarsy E, et a1. Pulses f vincristine and dexamethasne in additin t intensive chemtherapy fr children with intermediate-risk acute lymphblastic leukaemia: a multicentre randmised tria!. Lancet 2007;369(9556): Mricke A, Reiter A, Zimmermann M, Gadner H, Stanulla M, Drdelmann M, et al. Risk-adjusted therapy f acute lymphblastic leukemia can decrease treatment burden and

65 E. Mejstříkvá, strana 64 imprve survival: treatment results f 2169 unselected pediatric and adlescent patients enrlled in the trial ALL-BFM 95. Bld Pui CH, Pei D, Sandlund JT, Campana D, Ribeir RC, Razzuk BI, et al. Risk f adverse events after cmpletin ftherapy fr childhd acute lymphblastic leukemia. J Clin Oncl 2005 ;23(31 ):7936-4l. 64. Schrappe M, Reiter A, Zimmermann M, Harbtt J, Ludwig WD, Henze G, et al. Lngterm results f fur cnsecutive trials in childhd ALL perfrmed by the ALL-BFM study grup frm 1981 t Berlin-Frankfurt-Munster. Leukemia 2000; 14(12): Riehm H, Reiter A, Schrappe M, Berthld F, Dpfer R, Gerein V, et al. [Crticsterid-dependent reductin f leukcyte cunt in bld as a prgnstic factr in acute Iymphblastic leukemia in childhd (therapy study ALL-BFM 83)]. Klin Padiatr 1987; 199(3): Drdelmann M, Reiter A, Brkhardt A, Ludwig WD, Gtz N, Viehmann S, et al. Prednisne respnse is the strngest predictr ftreatment utcme in infant acute lymphblastic leukemia. Bld 1999;94(4): Schrappe M, Aric M, Harbtt J, Bindi A, Zimmermann M, Cnter V, et aj. Philadelphia chrmsme-psitive (Ph+) childhd acute lymphblastic leukemia: gd initial sterid respnse allws early predictin f a favrable treatment utcme. Bld 1998;92(8): Gajjar A, Ribeir R, Hancck ML, Rivera GK, Mahmud H, Sandlund JT, et aj. Persistence f circulating blasts after 1 week f mul ti agent chemtherapy cnfers a pr prgnsis in childhd acute lymphblastic leukemia. Bld 1995;86(4): Brwitz MJ, Pullen DJ, Shuster]J, Viswanatha D, Mntgmery K, Willman CL, et al. Minimal residual disease detectin in childhd precursr-b-cell acute lymphblastic leukemia: relatin t ther risk factrs. A Children's Onclgy Grup study. Leukemia 2003 ; 17(8): Steinherz PG, Gaynn PS, Breneman JC, Cherlw JM, Grssman NJ, Kersey m, et al. Cytreductin and prgnsis in acute Iymphblastic leukemia--the imprtance f early manw respnse: reprt frm the Childrens Cancer Grup. J Clin Oncl 1996; 14(2): Balduzzi A, Valsecchi MG, Uderz C, De Lrenz P, Klingebiel T, Peters C, et aj. Chemtherapy versus allgeneic transplantatin fr very-high-risk childhd acute Iymphblastic leukaemia in first cmplete remissin: cmparisn by genetic randmisatin in an internatinal prspective study. Lancet 2005;366(9486): Wassmann B, Pfeifer H, Gekbuget N, Beelen DW, Beck J, Stelljes M, et aj. Alternating versus cncunent schedules fimatinib and chemtherapy as frnt-line therapy fr Philadelphia-psitive acute lymphblastic leukemia (Ph+ ALL). Bld 2006; 1 08(5): Ottmann OG, Wassmann B, Pfeifer H, Giagunidis A, Stelljes M, Duhrsen U, et aj. Imatinib cmpared with chemtherapy as frnt-line treatment f elderly patients with Philadelphia chrmsme-psitive acute lymphblastic leukemia (Ph+ALL). Cancer 2007; 1 09( 10): Ottmann OG, Wassmann B. Treatment fphiladelphia chrmsme-psitive acute Iymphblastic leukemia. Hematlgy Am Sc Hematl Educ Prgram 2005: Pfeifer H, Wassmann B, Pavlva A, Wunderle L, Oldenburg J, Binckebanck A, et aj. Kinase dmain mutatins f BCR-ABL frequently precede imatinib-based therapy and give rise t relapse in patients with de nv Philadelphia-psitive acute lymphblastic leukemia (Ph+ ALL). Bld 2007;110(2): Ramirez P, Dipersi JF. Therapy ptins in imatinib failures. Onclgist 2008; 13(4):

66 E. Mejstříkvá, strana Quintas-Cardama A, Crtes 1. Management f patients with resistant r refractry chrnic myelgenus leukemia. Onclgy (Willistn Park) 2008;22(4):430-7; discussin 437, 442, 446 passim. 78. Prkka K, Kskenvesa P, Lundan T, Rimpilainen J, Mustjki S, Smykla R, et a!. Dasatinib crsses the bld-brain barrier and is an effic ient therapy fr central nervus system Philadelphia chrmsme-psitive leukemia. Bld Willemse MJ, Seriu, Hettinger K, ďanie ll E, Hp WC, Panzer-Grumayer ER, et a!. Detectin f minimal residual disease identifies differences in treatment respnse between T ALL and precursr B-ALL. Bld 2002;99(12): Chesn BD. Clinical management ft-cell malignancies: current perspectives, key issues, and emerging therapies. Semin Oncl 2007;34(6 Suppl5):S Hlwiecki J. NOTCH 1 pathway: a mlecular target in T -cell cancers? Lancet 2005;365(9455): De Keersmaecker K, Lahrtiga I, Mentens N, Flens C, Van Neste L, Bekaert S, et a!. ln vitr validatin f gamma-secretase inhibitrs alne r in cmbinatin with ther anticancer drugs fr the treatment ft-cell acute lymphblastic leukemia. Haematlgica 2008;93(4): Einsiedel HG, vn Stackelberg A, Hartmann R, Fengler R, Schrappe M, Janka-Schaub G, et a!. Lng-term utcme in children with relapsed ALL by risk-stratified salvage therapy: results f trial acute lymphblastic leukemia-relapse study f the Berlin-Frankfurt-Munster Grup 87. J Clin Oncl 2005;23(31 ): Eckert C, Bindi A, Seeger K, Cazzaniga G, Hartmann R, Beyermann B, et a!. Prgnstic value f minimal residual disease in relapsed childhd acute lymphblastic leukaemia. Lancet 2001 ;358(9289): Langmuir PB, Aplenc R, Lange Bl. Acute myelid leukaemia in children. Best Pract Res Clin HaematI2001;14(l): Bindi A, Rvelli A, Cantu-Rajnldi A, Fenu S, Bass G, Lucian A, et a!. Acute prmyelcytic leukemia in children: experience f the Italian Pediatric Hematlgy and Onclgy Grup (AIEOP). Leukemia 1994;8(8): Maule MM, Dama E, Mss ML, Magnani C, Pastre G, Merletti F. High incidence f acute prmyelcytic leukemia in children in nrthwest Italy, : a reprt frm the Childhd Cancer Registry fpiedmnt. Leukemia 2008;22(2): Niemeyer CM, Baumann I. Myeldysplastic syndrme in children and adlescents. Semin Hematl 2008;45(1 ): Yeasmin S, Nakayama K, Ishibashi M, Oride A, Katagiri A, Purwana IN, et a!. Therapy-related myeldysplasia and acute myelid leukemia fllwing paclitaxel- and carbplatin-based chemtherapy in an varian cancer patient: a case reprt and literature review. lnt J Gynecl Cancer Schaapveld M, Visser O, Luwman MJ, de Vries EG, Willemse PH, Otter R, et a!. Risk f new primary nnbreast cancers after breast cancer treatment: a Dutch ppulatinbased study. J Clin Oncl 2008;26(8): Flaig TW, Tangen CM, Hussain MH, Stadler WM, Raghavan D, Crawfrd ED, et a!. Randmizatin reveals unexpected acute leukemias in Suthwest Onclgy Grup prstate cancer tria!. J Clin Oncl 2008;26(9): Navid F, Billups C, Liu T, Krasin MJ, Rdriguez-Galind C. Secnd cancers in patients with the Ewing sarcma family ftumurs. Eur J Cancer 2008;44(7): Hward R, Gilbert Lynch CF, Hall P, Strm H, Hlwaty E, et a!. Risk f leukemia amng survivrs f testicular cancer: a ppulatin-based study f 42,722 patients. Ann Epidemil2008;18(5):

67 E. Mejstříkvá, strana Bamard DR, Lange B, Alnz TA, Buekley J, Kbrinsky JN, Gld S, et al. Aeute myelid leukemia and myeldysplastic syndrme in children treated fr cancer: cmparisn with primary presentatin. Bld 2002; 1 00(2): Bamard DR, Wds WG. Treatment-related myeldysplastic syndrme/acute myelid leukemia in survivrs f childhd cancer--an update. Leuk Lymphma 2005;46(5): Alter BP. Diagnsis, genetics, and management f inherited bne marrw failure syndrmes. Hematlgy Am Sc Hematl Educ Prgram 2007;2007: Creutzig U, Zimmermann M, Ritter J, Reinhardt D, Hermann J, Henze G, et al. Treatment strategies and lng-term results in paediatrie patients treated in fur cnseeutive AML-BFM trials. Leukemia 2005;19(12): Creutzig U, Zimmermann M, Reinhardt D, Dwrzak M, Stary J, Lehmbecher T. Early deaths and treatment-related mrtality in children underging therapy fr aeute myelid leukemia: analysis fthe multicenter ciinical trials AML-BFM 93 and AML-BFM 98. J Clin OncI2004;22(21): Lehrnbeeher T, Varwig D, Kaiser J, Reinhardt D, Klingebiel T, Creutzig U. Infectius emplicatins in pediatrie acute myelid leukemia: analysis fthe prspective multiinstitutinal ciinical trial AML-BFM 93. Leukemia 2004; 18(1): Creutzig U, Bender-Gtze C, Ritter J, Zimmermann M, Stllmarm-Gibbels B, Krhlz D, et al. The rle f intensive AML-specific therapy in treatment f children with RAEB and RAEB-t. Leukemia 1998; 12(5): Hasle H. Myeldysplastic and myelprliferative disrders in children. Curr Opin Pediatr 2007; 19(1): Abrahamssn J, Clausen N, Gustafssn G, Hvi L, Jnmundssn G, Zeller B, et al. Imprved utcme after relapse in chi1dren with acute myelid leukaemia. Br J Haematl 2007; 136(2): Bacher U, Kem W, Schnittger S, Hiddemann W, Schch C, Haferlach T. Further errelatins f mrphlgy accrding t F AB and WHO ciassificatin t cytgenetics in de nv acute myelid leukemia: a study n 2,235 patients. Arm Hemat12005;84(12): Bermett JM, Catvsky D, Daniel MT, Flandrin G, Galtn DA, Gralnick HR, et al. Prpsals fr the ciassifieatin fthe acute leukaemias. French-American-British (FAB) cperative grup. Br J HaematI1976;33(4): Reinhardt D, Diekamp S, Langebrake C, Ritter J, Stary J, Dwrzak M, et al. Acute megakaryblastic leukemia in ehildren and adlescents, exciuding Dwn's syndrme: imprved utcme with intensified inductin treatment. Leukemia 2005; 19(8): Bamard DR, Alnz TA, Gerbing RB, Lange B, Wds WG. Cmparisn f childhd myeldysplastic syndrme, AML F AB M6 r M7, CCG 2891: reprt frm the Children's Onclgy Grup. Pediatr Bld Cancer 2007;49(1): Bennett JM, Catvsky D, Daniel MT, Flandrin G, Galtn DA, Gralnick HR, et al. Prpsed revised criteria fr the ciassificatin f acute myelid leukemia. A reprt fthe French-Ameriean-British Cperative Grup. Ann ltem Med 1985; 103(4): Harris NL, Jaffe ES, Diebld J, Flandrin G, Muller-Hermelink HK, Vardiman J, et al. Wrld HeaIth Organizatin ciassificatin f neplastic diseases f the hematpietic and lymphid tissues: reprt fthe Clinieal Advisry Cmmittee meeting-airlie Huse, Virginia, Nvember J Cl in Oncl 1999; 17(12): Creutzig U, Harbtt J, Sperling C, Ritter J, Zimmermann M, Lmer H, et al. Clinical significance f surfaee antigen expressin in ehildren with acute myelid leukemia: results f study AML-BFM-87. Bld 1995;86(8): Hrusak O, Prwit-MacDnald A. Antigen expressin patterns reflecting gentype f acute leukemias. Leukemia 2002;16(7):

68 E. Mejstříkvá, strana Renneville A, Rumier C, Biggi V, Niburel 0, Bissel N, Fenaux P, et a1. Cperating gene mutatins in acute myelid leukemia: a review f the literature. Leukemia 2008;22(5): Gemans BF, Zwaan CM, Miller M, Zimmennann M Harlw A, Meshinchi S, et a1. Mutatins in KIT and RAS are frequent events in pediatric cre-binding factr acute myelid leukemia. Leukemia 2005; 19(9): Rubnitz JE, Raimndi SC, Halbert AR, Tng X, Sri vastava DK, Razzuk BI, et al. Characteristics and utcme f t(8;21 )-psitive childhd acute myelid leukemia: a single institutin's experience. Leukemia 2002; 16(1 0): Yamagata T, Maki K, Mitani K. RunxllAMLl in nnnal and abnnnal hematpiesis. IntJ Hematl 2005;82(1): Mrzek K, Blmfield CD. Chrmsme aberratins, gene mutatins and expressin changes, and prgnsis in adult acute myelid leukemia. Hematlgy Am Sc Hematl Educ Prgram 2006: He G, Wu D, Sun A, Xue Y, Jin Z, Qiu H, et a1. B-Lymphid and myelid lineages biphentypic acute leukemia with t(8;21)(q22;q22). Int J HematI2008;87(2): He G, Wu D, Sun A, Xue Y, Jin Z, Qiu H, et a1. CytCD79a expressin in acute leukemia with t(8;21): biphentypic r myelid leukemia? Cancer Genet Cytgenet 2007; 174(1 ): Gibsn SE, Dng HY, Advani AS, Hsi ED. Expressin fthe B cell-assciated transcriptin factrs PAX5, OCT-2, and BOR 1 in acute myelid leukemia: assciatins with B-cell antigen expressin and myelmncytic maturatin. Am J Cl in Pathl 2006; 126(6): Valbuena JR, Medeirs U, Rassidakis GZ, Ha S, Wu CD, Chen L, et a1. Expressin f B cell-specific activatr prtein/pax5 in acute myelid leukemia with t(8;21)( q22;q22). Am J Clin Pathl 2006; 126(2): Tiacci E, Pileri S, Orleth A, Pacini R, Tabarrini A, Frenguelli F, et a1. PAX5 expressin in acute leukemias: higher B-lineage specificity than CD79a and selective assciatin with t(8;21)-acute myelgenus leukemia. Cancer Res 2004;64(20): Fenaux P, Wang ZZ, Degs L. Treatment facute prmyelcytic leukemia by retinids. Curr Tp Micrbil Tmmunl 2007;313: L-Cc F, Ammatuna E. The bilgy f acute prmyelcytic leukemia and its impact n diagnsis and treatment. Hematlgy Am Sc Hematl Educ Prgram 2006:156-61, Hasle H, Clemmensen IH, Mikkelsen M. Risks f leukaemia and slid tumurs in individuals with Dwn's syndrme. Lancet 2000;355(9199): Burquin JP, Subramanian A, Langebrake C, Reinhardt D, Bernard O, Ballerini P, et al. Identificatin f distinct mlecular phentypes in acute megakaryblastic leukemia by gene expressin prfiling. Prc Natl Acad Sci U S A 2006; 1 03(9): Abildgaard L, Ellebaek E, Gustafssn G, Abrahamssn J, Hvi L, Jnmundssn G, et al. Optimal treatment intensity in children with Dwn syndrme and myelid leukaemia: data frm 56 children treated n NOPHO-AML prtcls and a review fthe literature. Arm Hematl 2006;85(5): Creutzig U, Reinhardt D, Diekamp S, Dwrzak M, Stary J, Zimmermann M. AML patients with Dwn syndrme have a high cure rate with AML-BFM therapy with reduced dse intensity. Leukemia 2005; 19(8): Langebrake C, Creutzig U, Reinhardt D. Immunphentype f Dwn syndrme acute myelid leukemia and transient myelprliferative disease differs significantly frm ther diseases with mrphlgically identical r similar blasts. Klin Padiatr 2005;217(3):

69 E. Mejstříkvá, strana Langebrake C, Klusmann JH, Wrtmann K, Klar M, Puhlmann U, Reinhardt D. Cnemitant aberrant verexpressin f RUNXl and NCAM in regenerating bne marrw f myelid leukemia fdwn's syndrme. Haematlgiea 2006;91(11): Hasle H, Abrahamssn J, Arla M, Karw A, O'Marcaigh A, Reinhardt D, et al. Myelid leukemia in ehildren 4 years r lder with Dwn syndrme ften laeks GA TAl mutatin and eytgeneties and risk f relapse are mre akin t spradie AML. Leukemia 2008;22(7): Raimndi SC, Chang MN, Ravindranath Y, Behm FG, Gresik MV, Steuber CP, et al. Chrmsmal abnrmalities in 478 ehildren with aeute myelid leukemia: clinieal eharaeteristies and treatment utcme in a eperative pediatrie nelgy grup study-pog Bld 1999;94(11 ): Betts DR, Ammann RA, Hirt A, Hengartner H, Beek-Ppvie M, Kuhne T, et al. The prgnstie signifieanee f eytgenetie aberratins in ehildhd aeute myelid leukaemia. A study fthe Swiss Paediatrie Onelgy Grup (SPOG). Eur J HaematI2007;78(6): Lie SO, Abrahamssn J, Clausen N, Frestier E, Hasle H, Hvi L, et al. Treatment stratifieatin based n initial in viv respnse in aeute myelid leukaemia in ehildren withut Dwn's syndrme: results fnopho-aml trials. Br J Haematl 2003; 122(2): Small D. FLT3 mutatins: bilgy and treatment. Hematlgy Am Se Hematl Edue Prgram 2006: Meshinehi S, Alnz TA, Stirewalt DL, Zwaan M, Zimmerman M, Reinhardt O, et al. Clinieal implieatins f FL T3 mutatins in pediatrie AML. Bld 2006; 1 08(12): Reinhardt O, Pekrun A, Lakmek M, Zimmermann M, Ritter J, Creutzig U. Primary myelsaremas are asseiated with a high rate f relapse: reprt n 34 ehildren frm the aeute myelid leukaemia-berlin-frankfurt-munster studies. Br J Haematl 2000; 11 0(4): Reinhardt D, Creutzig U. Islated myelsarema in ehildren--update and review. Leuk Lymphma 2002;43(3): Kaspers GJ, Zwaan CM. Pediatrie aeute myejid leukemia: twards high-quajity eure f all patients. Haematlgiea 2007;92(11): Weiss JR, Kpeeky KJ, Gdwin J, Andersn J, Willman CL, Mysieh KB, et aj. Glutathine S-transferase (GSTMl, GSTT l and GSTAl) plymrphisms and utemes after treatment fr aeute myelid leukemia: pharrnaegeneties in Suthwest Onelgy Grup (SWOG) clinieal trials. Leukemia 2006;20(12): Blufer P, Barragan E, Cllad M, Cervera J, Lpez JA, Sanz MA. Inf1uenee f genetic plymrphisms n the risk f develping leukemia and n disease prgressin. Leuk Res 2006;30(12): Eyada TK, El Ghnemy EG, EI Ghrury EA, EI Bassyuni SO, El Masry MK. Study f genetie plymrphism f xenbitie enzymes in aeute leukemia. Bld Cagul Fibrinlysis 2007; 18(5): Creutzig U, Zimmermann M, Lehmbeeher T, GrafN, Hem1ann J, Niemeyer CM, et al. Less txicity by ptimizing ehemtherapy, but nt by additin f granulcyte elnystimulating faetr in ehildren and adleseents with aeute myelid leukemia: results f AML BFM 98. J Clin Onel 2006;24(27): Bnati A, Rizzli V, Lunghi P. Arsenie trixide in hematlgieal malignaneies: the new disevery f an aneient drug. Curr Pham1 Biteehnl 2006;7(6): Wetzler M, Brady MT, Traey E, Li ZR, Dnhue KA, O'Lughlin KL, et al. Arsenie trixide affeets signal transdueer and aetivatr f transeriptin prteins thrugh alteratin f prtein tyrsine kinase phsphrylatin. Clín Caneer Res 2006; 12(22): Quezada G, Kpp L, Estey E, Wells Rl. AI1-trans-retinie aeid and arsenie trixide as initial therapy fr aeute prmyeleytie leukemia. Pediatr Bld Caneer 2008;51 (1):

70 E. Mejstříkvá, strana Oleissner B, Sehlenk R, Brnhauser M, Berdel W. Oemtuzumab zgamiein (myltarg) fr the treatment f aeute myelid leukemia--ngi ng trials. Onklgie 2007;30( 12): Reinhardt D, Diekamp S, Fleisehhaek G, Crbaeiglu C, Jurgens H, Dwrzak M, et a!. Oemtuzumab zgamiein (Myltarg) in ehildren with refraetry r relapsed aeute myelid leukemia. Onklgie 2004;27(3): Zwaan CM, Reinhardt D, Crbaeiglu S, van Wering ER, Bkkerink JP, Tissing WJ, et a!. Oemtuzumab zgamiein: first clinical experienees in ehildren with relapsed/refraetry aeute myelid leukemia treated n empassinate-use basis. Bld 2003;101(1O):3868-7l Aplene R, Alnz TA, Oerbing RB, Lange BJ, Hurwitz CA, Wells RJ, et a!. Safety and effieaey f gemtuzumab zgamiein in embinatin with ehemtherapy fr pediatrie aeute myelid leukemia: a reprt frm the Children's Onelgy Orup. J Clin Onel 2008;26( 14): MeKy JM, Angeltta C, Bennett CL, Tallman MS, Wadleigh M, Evens AM, et a!. Gemtuzumab zgamiein-assciated sinusidal bstruetive syndrme (SOS): an verview frm the researeh n adverse drug events and reprts (RADAR) prjeet. Leuk Res 2007;31 (5): Nabhan C, Rundhaugen L, Jati M, Riley MB, Behlke L, Petersn LC, et a!. Oemtuzumab zgamiein (MyltargTM) is infrequently asseiated with sinusidal bstruetive syndrme/ven-ec1usive disease. Ann Onel 2004; 15(8): Larsn RA, Sievers EL, Stadtmauer EA, Lwenberg B, Estey EH, Dmbret H, et a!. Final reprt f the effieaey and safety f gemtuzumab zgamiein (Myltarg) in patients with CD33-psitive aeute myelid leukemia in first reeurrenee. Caneer 2005; 1 04(7): Leung A Y, Liang R. Thrmbeytpenia after gemtuzumab is reversible by intravenus immunglbulin. Leukemia 2005; 19(6): Sievers EL. Native antibdy and antibdy-targeted ehemtherapy fr aeute myelid leukemia. Adv Pharmael 2004;51: Mulfrd D. Antibdy therapy fr aeute myelid leukemia. Semin Hematl 2008;45(2): Maslak PG, Jureie JO, Seheinberg DA. Mnc1nal antibdy therapy f APL. Curr Tp Mierbil Immunl 2007;313 : Lin Y, Pagel JM, Axwrthy D, Pantelias A, Hedin N, Press OW. A genetieally engineered anti-cd45 single-ehain antibdy-streptavidin fusin prtein fr pretargeted radiimmuntherapy f hematlgie malignaneies. Caneer Res 2006;66(7): Krause DS, Van Etten RA. Right n target: eradieating leukemie stem eells. Trends Ml Med 2007;13(11):470-8l Hauswirth AW, Flrian S, Printz D, Stlar K, Krauth MT, Fritseh O, et al. Expressin fthe target reeeptr CD33 in CD34+/CD38-/CDI23+ AML stem eells. Eur J Clin Invest 2007;37(1 ): Jin L, Hpe KJ, Zhai Q, Smadja-Jffe F, Diek JE. Targeting fcd44 eradieates human aeute myelid leukemie stem eells. Nat Med 2006; 12( 10): Sehittenhelm MM, Shiraga S, Sehreder A, Crbin AS, Oriffith D, Lee FY, et al. Dasatinib (BMS ), a dual SRC/ ABL kinase inhibitr, inhibits the kinase aetivity f wild-type, juxtamembrane, and aetivatin lp mutant KIT isfrn1s asseiated with human malignaneies. Caneer Res 2006;66( 1 ): Cairli R, Beghini A, Mrell E, Orill O, Mntill M, Larizza L, et a!. Imatinib mesylate in the treatment f Cre Binding Faetr leukemias with KIT mutatins. A reprt f three eases. Leuk Res 2005;29(4): Pratz K, Levis M. Inerprating FL T3 inhibitrs int aeute myelid leukemia treatment regimens. Leuk Lymphma 2008;49(5):

71 E. Mejstříkvá, strana Knapper S, Mills Kl, Oilkes AF, Austin Sl, Walsh V, Bumett AK. The effects f lestaurtinib (CEP70 1) and PKC412 n primary AML blasts: the inductin f cyttxicity varies with dependence n FLT3 signaling in bth FLT3-mutated and wild-type cases. Bld 2006; 1 08(10): Serran E, Camicer Ml, Lasa A, Orantes V, Pena J, Brunet S, et a!. Epigenetic-based treatments emphasize the bilgic differences f cre-binding factr acute myelid leukemias. Leuk Res 2008;32(6): Kuendgen A, Schmid M, Schlenk R, Knipp S, Hildebrandt B, Steidl C, et al. The histne deacetylase (HDAC) inhibitr valpric acid as mntherapy r in cmbinatin with all-trans retinic acid in patients with acute myelid leukemia. Cancer 2006; 1 06(1): Yu WP, Sctt SA, Dng WF. lnductin fldl expressin and apptsis by the hi stne deacetylase inhibitr (trichstatin A) in human acute myelid leukaemic cells. Cell Prlif2008;41 (1 ): Klisvic MI, Maghraby EA, Parthun MR, Ouimnd M, Sklenar AR, Whitman SP, et al. Depsipeptide (FR ) prmtes histne acetylatin, gene transcriptin, apptsis and its activity is enhanced by DNA methyl transferase inhibitrs in AMLl/ETO-psitive leukemic cells. Leukemia 2003 ;17(2): Oarcia-Maner O, Assuline S, Crtes J, Estrv Z, Kantarjian H, Yang H, et a!. Phase I study f the ral istype specific histne deacetylase inhibitr MOCDO 103 in leukemia. Bld Kschmieder S, Agrawal S, Radmska HS, Huettner CS, Tenen DO, Ottmann 00, et a!. Oecitabine and vitamin D3 differentially affect hematpietic transcriptin factrs t induce mncytic differentiatin. lnt J Oncl 2007;30(2): Muller CI, Ruter B, Kemer HP Lubbert M. DNA hypermethylatin fmyelid cells, a nvel therapeutic target in MDS and AML. Curr Pharm Bitechnl 2006;7(5): Oalm O, Wilp S, Luders C, Jst E, Oehbauer O, Herman JO, et al. Clinical implicatins f aberrant DNA methylatin pattems in acute myelgenus leukemia. Ann Hemat12005;84 Suppl 1 : Sctt SA, Dng WF, Ichinhasama R, Hirsch C, Sheridan D, Sanche SE, et al. 5-Aza- 2'-dexycytidine (decitabine) can relieve p21 W AF I repressin in human acute myelid leukemia by a mechanism invlving release f histne deacetylase 1 (HDAC 1) withut requiring p21 WAFl prmter demethylatin. Leuk Res 2006;30(1): Hubeek I, Peters OJ, Brekhuizen R, Zwaan CM, Kaaijk P, van Wering ES, et al. In vitr sensitivity and crss-resistance t dexynucleside analgs in childhd acute leukemia. Haematlgica 2006;91(1): Kantarjian H, Oandhi V, Crtes J, Verstvsek S, Du M, Oarcia-Maner O, et a!. Phase 2 clinical and pharmaclgic study f c10farabine in patients with refractry r relapsed acute leukemia. Bld 2003; 1 02(7): Creutzig U, Reinhardt D, Zimmermann M. Prgnstic relevance frisk grups in the pediatrie AML-BFM trials 93 and 98. Ann Hematl 2004;83 Suppl I :S SchU C, Breitinger H, Schlenk RF, Dhner H, Frhling S, Dhner K. Develpment f a real-time RT -PCR assay fr the quantificatin f the mst frequent MLL! AF9 fusin types resulting frm translcatin t(9;11)(p22;q23) in acute myelid leukemia. Oenes Chrmsmes Cancer 2003 ;38(3): SchU C, Schlenk RF, Eiwen K, Dhner H, Frhling S, Dhner K. The prgnstic value f MLL-AF9 detectin in patients with t(9; II )(p22;q23)-psitive acute myelid leukemia. Haematlgica 2005 ;90( 12): Kem W, Schch C, Haferlach T, Schnittger S. Mnitring fminimal residual disease in acute myelid leukemia. Crit Rev Oncl Hematl 2005;56(2):

72 E. Mejstříkvá, strana Kusec R, Laczika K, Knbl P, Friedl J, Oreinix H, Kahls P, et al. AMLlIETO fusin mrna can be detected in remissin bld samples ť au patients with t(8;21) acute myelid leukemia after chemtherapy r autlgus bne marrw transplantatin. Leukemia 1994;8(5): Mitterbauer M, Mitterbauer-Hhendanner O, Sperr WR, Kalhs P, Oreinix HT, Fnatsch C, et al. Mlecular disease eradicatin is a prerequisite ťr lng-term remissin in patients with t(8;21) psitive acute myelid leukemia: a single center study. Leuk Lymphma 2004;45(5): Trka J, Kalinva M, Hrusak O, Zuna J, Krejci O, Madz J, et al. Real-time quantitative PCR detectin ť WT1 gene expressin in children with AML: prgnstic significance, crrelatin with disease status and residual disease detectin by flw cytmetry. Leukemia 2002; 16(7): Ostergaard M, Olesen LH, Hasle H, Kj eldsen E, Hkland P. WT1 gene expressin: an excellent tl fr mnitring minimal residual disease in 70% ť acute myelid leukaemia patients - results ťrm a single-centre study. Br J Haematl 2004; 125(5): Hsen N, Snda Y, Oji Y, Kimura T Minamiguchi H, Tamaki H, et al. Very lw ťrequencies ť human nrmal CD34+ haematpietic prgenitr cells express the Wilms' tumur gene WT1 at levels similar t thse in leukaemia cells. Br J Haematl 2002;116(2): Pine SR, Ou Q, Yin C, Jayabse S, Levendglu-Tugal O, Ozkaynak MF, et al. OA TA 1 as a new target t detect minimal residual disease in bth transient leukemia and megakaryblastic leukemia fdwn syndrme. Leuk Res 2005;29(11): Hitzler J, Zipursky A. OATA 1 mutatins as clnal markers ťminimal residual disease in acute megakaryblastic leukemia f Dwn syndrme--a new tl with significant ptential applicatins. Leuk Res 2005;29(11): Hasle H, Lund B, Nyvld CO, Hkland P, Ostergaard M. WTl gene expressin in children with Dwn syndrme and transient myelprliťerative disrder. Leuk Res 2006;30(5): Bacher U, Kem W, Schch C, Schnittger S, Hiddemann W, Haferlach T. Evaluatin ť cmplete disease remissin in acute myelid leukemia: a prspective study based n cytmrphlgy, interphase flurescence in situ hybridizatin, and immunphentyping during ťllw-up in patients with acute myelid leukemia. Cancer 2006; 106(4): Kem W, Danhauser-Riedl S, Ratei R, Schnittger S, Schch C, Klb HJ, et al. Detectin ť minimal residual disease in unselected patients with acute myelid leukemia using multiparameter flw cytmetry fr definitin f leukemia-assciated immunphentypes and determinatin f their frequencies in nrmal bne marrw. Haematlgica 2003;88(6): Langebrake C, Creutzig U, Dwrzak M, Hrusak O, Mejstrikva E, Oriesinger F, et al. Residual disease mnitring in childhd acute myelid leukemia by multiparameter flw cytmetry: the MRD-AML-BFM Study Orup. J Clin Oncl 2006;24(22): Langebrake C, Brinkmann I, Teigler-Schlegel A, Creutzig U, Oriesinger F, Puhlmann U, et al. Immunphentypic difťerences between diagnsis and relapse in childhd AML: Implicatins fr MRD mnitring. Cytmetry B Clin Cytm 2005;63(1): Kem W, Vskva D, Schch C, Hiddemann W, Schnittger S, Haferlach T. Determinatin f relapse risk based n assessment f minimal residual disease during cmplete remissin by multiparameter flw cytmetry in unselected patients with acute myelid leukemia. Bld 2004; 104(1 0): Reinhardt D, Langebrake C, Creutzig U, Vrmr J, Brune C, Thrwesten M, et al. [Minimal residual disease in acute myelid leukemia in children--standardizatin and

73 E. Mejstříkvá, strana 72 evaluatin f immunphentyping in the AML-BFM-98 study]. Klin Padiatr 2002;214(4): Kern W, Vskva O, Sehnittger S, Seheh C, Hiddemann W, Haferlaeh T. Fur-fld staining including C045 gating imprves the sensitivity f multiparameter f10w eytmetrie assessment f minimal residual disease in patients with acute myelid leukemia. Hematl J 2004;5(5): Kern W, Haferlach C, Haferlach T, Sehnittger S. Mnitring f minimal residual disease in aeute myelid leukemia. Cancer 2008; 112(1 ): San-Miguel JF, Vidriales MB, Orfa A. lmmunlgical evaluatin f minimal residual disease (MRO) in acute myelid leukaemia (AML). Best Pract Res CI in Haematl 2002;15(1): Vidriales MB, San-Miguel JF, Orfa A Custan-Smith E, Campana O. Minimal residual disease mnitring by f10w cytmetry. Best Pract Res Clin Haematl 2003; 16(4): Sievers EL, Lken MR. Oetectin f minimal residual disease in acute myelgenus leukemia. J Pediatr Hematl Oncl 1995; 17(2): Sievers EL, Lange BJ, Alnz TA, Gerbing RB, Bernstein ID, Smith FO, et al. lmmunphentypic evidence f leukemia after inductin therapy prediets relapse: results frm a prspective Children's Cancer Grup study f252 patients with acute myelid leukemia. Bld 2003; 10 I (9): Custan-Smith E, Ribeir RC, Rubnitz JE, Razzuk BI, Pui CH, Punds S, et al. Clinieal significanee f residual disease during treatment in childhd acute myelid leukaemia. Br J Haematl 2003; 123(2): van Rhenen A, Feller N, Kelder A, Westra AH, Rmbuts E, Zweegman S, et al. High stem cell frequency in acute myelid leukemia at diagnsis predicts high minimal residual disease and pr survival. Clin Cancer Res 2005;11(18): van Rhenen A, Mshaver B, Kelder A, Feller N, Nieuwint A W, Zweegman S, et al. Aberrant marker expressin patterns n the C034+C038- stem cell cmpartment in acute myelid leukemia allws t distinguish the malignant frm the nrmal stem cell empartment bth at diagnsis and in remissin. Leukemia 2007;21(8): van Rhenen A, van Ongen GA, Kelder A, Rmbuts EJ, Feller N, Mshaver B, et al. The nvel AML stem cell asseiated antigen CLL-1 aids in discriminatin between nrmal and leukemie stem cells. Bld 2007; 110(7): Wd BL. Myelid malignancies: myeldysplastic syndrmes, myelprliferative disrders, and aeute myelid leukemia. Clin Lab Med 2007;27(3):551-75, vii Rubnitz JE. Childhd acute myelid leukemia. Curr Treat Optins Oncl 2008;9(1): Flrian S, Snneek K, Hauswirth A W, Krauth MT, Sehernthaner GH, Sperr WR, et al. Oetectin f mleeular targets n the surface f C034+/C038-- stem cells in varius myelid malignancies. Leuk Lymphma 2006;47(2): Cstell R, Mallet F, Chambst H, Sainty O, Amulet C, Gastaut JA, et al. The immunphentype f mini maily differentiated aeute myelid leukemia (AML-MO): reduced immungenieity and high frequeney fc034+/c038- leukemie prgenitrs. Leukemia 1999; 13(10): Attarbaschi A, Mann G, Knig M, Steiner M, Strehl S, Sehreiberhuber A, et at Mixed lineage leukemia-rearranged ehildhd pr-b and COl O-negative pre-b acute lymphblastic leukemia enstitute a distinet clinical entity. Cl in Cancer Res 2006; 12( 10): Gleissner B, Gekbuget N, Rieder H, Arnld R, Sehwartz S, Oiedrieh H, et al. CD 10- pre-b acute Iymphblastic leukemia (ALL) is a distinet high-risk subgrup f adult ALL

74 E. Mejstříkvá, strana 73 asseiated with a high frequeney f MLL aberratins: results f the Oerman Multieenter Trials fr Adult ALL (OMALL). Bld 2005; 1 06(13): Orimwade D, Outram SV, Flra R, Ings SJ, Pizzey AR, Mrilla R, et a!. The T lineage-affiliated CD2 gene lies within an pen ehrmatin envirnment in aeute prmyeleytie leukemia eells. Caneer Res 2002;62(16): Oreaves MF. Differentiatin-linked leukemgenesis in lympheytes. Science 1986;234( 4777): Baruehel A, Cayuela JM, Ballerini P, Landman-Parker J, Cezard V, Firat H, et al. The majrity f myelid-antigen-psitive (My+) ehildhd B-eell preeursr aeute lymphblastie leukaemias expres s TEL-AMLl fusin transeripts. Br 1 HaematI1997;99(1): Pui CH, Rubnitz le, Haneek ML, Dwning lr, Raimndi SC, Rivera OK, et al. Reappraisal f the elinieal and bilgie signifieanee f myelid-asseiated antigen expressin in ehildhd aeute lymphblastie leukemia. 1 Clin OneI1998;16(12): Wiersma SR, Ortega 1, Sbel E, Weinberg Kl. Clinieal imprtanee fmyelid-antigen expressin in aeute lymphblastie leukemia f ehildhd. N Engl 1 Med 1991 ;324( 12): Fink FM, Kller U, Mayer H, Haas OA, Orumayer-Panzer ER, Urban C, et al. Prgnstie signifieanee f myelid-asseiated antigen expressin n blast eells in ehildren with aeute lymphblastie leukemia. The Austrian Pediatrie Onelgy Orup. Med Pediatr OneI1993;21(5): Sbl RE, Miek R, Rystn I, Davey FR, ElIisn RR, Newman R, et al. Clinieal imprtanee f myelid antigen expressin in adult aeute lymphblastie leukemia. N Engl 1 Med 1987;316(18): Putti MC, RndeLli R, Ceit MO, Arie M, Sainati L, Cnter V, et a!. Expressin f myelid markers laeks prgnstie impaet in ehildren treated fr aeute lymphblastie leukemia: Italian experienee in AIEOP-ALL studies. Bld 1998;92(3): Uekun FM, Sather HN, Oaynn PS, Arthur DC, Trigg ME, Tubergen DO, et al. Clinieal features and treatment uteme f ehildren with myelid antigen psitive aeute lymphblastie leukemia: a repl1 frm the Children's Caneer Orup. Bld 1997;90(1 ): Legrand 0, Perrt ly, Simnin 0, Baudard M, Cadiu M, Blanc C, et al. Adult biphentypie aeute leukaemia: an entity with pr prgnsis whieh is related t uníavurable eytgeneties and P-glyeprtein ver-expressin. Br 1 Haematl 1998; 100(1): Matutes E, Mrilla R, Farahat N, Carbnell F, Swansbury 1, Dyer M, et al. Definitin f aeute biphentypie leukcmia. Haematlgiea 1997;82(1 ): Owaidah TM, AI Beihany A, Iqbal MA, Elkum N, Rberts OT. Cytgeneties, mleeular and ultrastruetural eharaeteristies f biphentypie aeute leukemia identified by the EOIL sering system. Leukemia 2006;20(4): l. Killiek S, Matutes E, Pwles RL, Hamblin M, Swansbury 1, Treleaven 10, et al. Outeme fbiphentypie aeute leukemia. Haematlgiea 1999;84(8): Weir EO, Ali Ansari-Lari M, Batista DA, Oriffin CA, Fuller S, Smith BD, et al. Aeute bilinealleukemia: a rare disease with pr uteme. Leukemia 2007;21(11): Krawezuk-Rybak M, Zak 1, Jawrwska B. A lineage switeh frm AML t ALL with persistent transleatin t(4;11) in engenitalleukemia. Med Pediatr Onel 2003;41(1): Luniei A, Cny-Makhul P, Dubus P, Laembe F, Merli lp, Reiffers 1. Lineage switeh frm aeute myelid leukemia t aeute lymphblastie leukemia: reprt f an adult ease and review f the literature. Am 1 Hematl 2000;65(4):319-2l Stasik C, Oanguly S, Cunningham MT, Hagemeister S, Persns DL. Infant aeute lymphblastie leukemia with t(11;16)(q23;pi3.3) and lineage switeh int aeute mnblastie leukemia. Caneer Oenet Cytgenet 2006; 168(2):

75 E. Mejstříkvá, strana Fujisaki H, Hara J, Takai K, Nakanishi K, Matsuda Y, Ohta H, et a!. Lineage switch in childhd leukemia with mnsmy 7 and reverse f lineage switch in severe cmbined immundeficient mice. Exp Hematl 1999;27(5): Cutting R, Taj M, Vra A. Childhd precursr B-cell acute lymphblastic leukaemia and mnsmy 7 with phentypic shift at relapse; evidence fr the stem cell rigins f mnsmy 7. Br J Haematl 2008; 140(5): Reardn DA, Hansn CA, Rth MS, Castle VP. Lineage switch in Philadelphia chrmsme-psitive acute lymphblastic leukemia. Cancer 1994;73(5): Bierings M, Szczepanski T, van Wering ER, Willemse MJ, Langerak A W, Revesz T, et aj. Tw cnsecutive immunphentypic switches in a child with immungentypically stable acute leukaemia. Br J HaematI (3): Rhein P, Scheid S, Ratei R, Hagemeier C, Seeger K, Kirschner-Schwabe R, et al. Gene expressin shift twards nmlal B cells, decreased prliferative capacity and distinct surface receptrs characterize leukemic blasts persisting during inductin therapy in childhd acute lymphblastic leukemia. Leukemia 2007;21(5): Gaipa G, Bass G, Maglia O, Leni V, Faini A, Cazzaniga G, et a!. Drug-induced immunphentypic mdulatin in childhd ALL: implicatins fr minimal residual disease detectin. Leukemia 2005 ; 19( 1 ): Gaipa G, Bass G, Aliprandi S, Migliavacca M, Vallint C, Maglia O, et a!. Prednisne induces immunphentypic mdulatin f CD 1 O and CD34 in nnappttic B cell precursr acute lymphblastic leukemia cells. Cytmetry B Clin Cytm Lken MR, Shah va, Dattili KL, Civin CI. Flw cytmetric analysis f human bne marrw. II. Nrmal B lymphcyte develpment. Bld 1987;70(5): Lken MR, Shah va, Hllander Z, Civin CI. Flw cytmetric analysis f nrmal B Iymphid develpment. Pathl Immunpathl Res 1988;7(5): Shah va, Civin CI, Lken MR. Flw cytmetric analysis f human bne marrw. IV. Differential quantitative expressin ft-200 cmmn leukcyte antigen during nrmal hempiesis. J ImmunI1988;140(6): Balduzzi A, Rssi V, Crral L, Bnanmi S, Lngni D, Rvelli A, et a!. Mlecular remissin induced by gemtuzumab zgamicin assciated with dnr lymphcyte infusins in t( 4; ll) acute lymphblastic leukemia relapsed after transplantatin. Leukemia 2003;17(11): Ctter M, Rney S, O'Marcaigh A, Smith OP. Successful use f gemtuzumab zgamicin in a child with relapsed CD33-psitive acute lymphblastic leukaemia. Br J HaematI2003;122(4): Zwaan CM, Reinhardt D Jurgens H, Huismans DR, Hahlen K, Smith OP, et a!. Gemtuzumab zgamicin in pediatric CD33-psitive acute lymphblastic leukemia: first clinical experiences and relatin with cellular sensitivity t single agent calicheamicin. Leukemia 2003; 17(2): Gemans BF, Zwaan CM, Vijverberg SJ, Lnen AH, Creutzig U, Hahlen K, et a!. Large interindividual differenees in eellular sensitivity t ealicheamicin may intluence gemtuzumab zgamiein respnse in aeute myelid leukemia. Leukemia Lamba JK, Punds S, Ca X, Dwning JR, Campana D, Ribeir RC, et al. Cding plymrphisms in CD33 and respnse t gemtuzumab zgamiein in pediatrie patients with AML: a pilt study. Leukemia Bghaert ER, Khandke KM, Sridharan L, Dugher M, Dijseph JF, Kunz A, et a!. Determinatin f pharmaekinetic values f calicheamiein-antibdy enjugates in mice by plasmn resnance analysis f small (5 mul) bld samples. Caneer Chemther Pharmael 2008;61 (6):

76 E. Mejstříkvá, strana DiJseph JF, Armellin DC, Bghaert ER, Khandke K, Dugher MM, Sridharan L, et a1. Antibdy-targeted chemtherapy with CMC-544: a CD22-targeted immuncnjugate f calicheamicin fr the treatment f B-Iymphid malignancies. Bld 2004; 103(5): Carnahan J, Wang P, Kendall R, Chen C, Hu S, Bne T, et a1. Epratuzumab, a humanized mnclnal antibdy targeting CD22: characterizatin f in vitr prperties. Clin Cancer Res 2003;9(10 Pt 2):3982S-90S Raetz EA, Cair MS, Brwitz MJ, Blaney SM, Krail MD, Leil TA, et a1. Chemimmuntherapy reinductin with epratuzumab in children with acute lymphblastic leukemia in marrw relapse: a Children's Onclgy Orup Pilt Study. J Clin Oncl 2008;26(22): Oramatzki M, Burger R, Strbel 0, Trautmann U, Bartram CR, Helm 0, et a1. Therapy with OKT3 mnclnal antibdy in refractry T cell acute Iymphblastic leukemia induces interleukin-2 respnsiveness. Leukemia 1995;9(3): van Dngen JJ, Seriu T, Panzer-Orumayer ER, Bindi A, Pngers-Willemse MJ, Crral L, et a1. Prgnstic value f minimal residual disease in acute Iymphblastic leukaemia in childhd. Lancet 1998;352(9142): Pui CH, Sandlund JT, Pei D, Campana D, Rivera OK, Ribeir RC, et a1. Jmprved utcme fr children with acute Iymphblastic leukemia: results fttal Therapy Study XmB at St Jude Children's Research Hspita1. Bld 2004; 1 04(9): Custan-Smith E, Ribeir RC, Stw P, Zhu Y, Pui CH, Rivera OK, et a1. A simplified flw cytmetric assay identifies children with acute lymphblastic leukemia wh have a superir c1inical utcme. Bld 2006; 1 08(1 ): Brwitz MJ, Devidas M, Hunger SP, Bwman WP, Carrll AJ, Carrll WL, et al. Clinical significance f minimal residual disease in childhd acute Iymphblastic leukemia and its relatinship t ther prgnstic factrs: A Children's Onclgy Orup study. Bld Campana D, Custan-Smith E. Advances in the immunlgical mnitring f childhd acute Iymphblastic leukaemia. Best PractRes CI in HaematI2002;15(1): Dwrzak MN, Frschl 0, Printz D, Zen LD, Oaipa 0, Ratei R, et a1. CD99 expressin in T -lineage ALL: implicatins fr flw cytmetric detectin f minimal residual disease. Leukemia 2004; 18(4): Mejstrikva E, Kalina T, Trka J, Stary J, Hrusak O. Crrelatin f CD33 with prer prgnsis in childhd ALL implicates a ptential f anti-cd33 frntline therapy. Leukemia 2005; 19(6): Kalina T, Vaskva M, Mejstrikva E, Madz J, Trka J, Stary J, et al. Myelid antigens in childhd Iymphblastic leukemia: ciinical data pint t regulatin f CD66c distinct frm ther myelid antigens. BMC Cancer 2005;5(1): Custan-Smith E, Behm FO, Sanchez J, Byett JM, Hancck ML, Raimndi SC, et al. Immunlgical detectin f minimal residual disease in children with acute lymphblastic leukaemia. Lancet (9102): Custan-Smith E, Sanch J, Hancck ML, Byett JM, Behm FO, Raimndi Se, et al. Clinical imprtance f minimal residual disease in childhd acute lymphblastic leukemia. Bld 2000;96(8): Oaipa 0, Bass 0, Ratei R, Bindi A, Dwrzak M. Reply t van der Sluijs-Oelling et al. Leukemia 2005; 19(12): van der Sluijs-Oelling AJ, van der Velden VH, Reffen ET, Veerman AJ, van Wering ER. lmmunphentypic mdulatin in childhd precursr-b-all can be mimicked in vitr and is related t the inductin f cell death. Leukemia 2005; 19(10): van der Sluijs-Oelling AJ, van der Vel den VH, Reffen ET, Veerrnan AJ, van Wering ER. Reply t Oaipa et AI. Leukemia 2005;1 9(10):1858.

77 E. Mejstříkvá, strana Flhr T, Schrauder A, Cazzaniga G, Panzer-Grumayer R, van der Velden V, Fischer S, et a!. Minimal residual disease-directed risk stratificatin using real-time quantitative PCR analysis f immunglbulin and T -cell receptr gene rearrangements in the internatinal multicenter trial AIEOP-BFM ALL 2000 fr childhd acute lymphblastic leukemia. Leukemia Szczepanski T, Pngers-Willemse MJ, Langerak A W, Harts W A, Wijkhuijs AJ, van Wering ER, et a!. 19 heavy chain gene rearrangements in T-cell acute lymphblastic leukemia exhibit predminant DH6-19 and DH7-27 gene usage, can result in cmplete V-D-J rearrangements, and are rare in T -cell receptr alpha beta lineage. Bld 1999;93(12): van Dngen Jl, Langerak AW, Bruggemann M, Evans PA, Hummel M, Lavender FL, et al. Design and standardizatin f PCR primers and prtcls fr detectin f clnal immunglbulin and T -cell receptr gene recmbinatins in suspect lymphprliferatins: reprt fthe BlOMED-2 Cncerted Actin BMH4-CT Leukemia 2003; 17(12): Szczepanski T, Flhr T, van der Velden VH, Bartram CR, van Dngen Jl. Mlecular mnitring f residual disease using antigen receptr genes in childhd acute lymphblastic leukaemia. Best Pract Res Clin Haematl 2002; 15(1 ): Beillard E, Pallisgaard N, Van Der Velden VH, Bi W, Dee R, Van Der Scht E, et a!. Evaluatin f candidate cntrl genes fr diagnsis and residual disease detectin in leukemic patients using 'real-time' quantitative reverse-transcriptase plymerase chain reactin (RQ PCR) - a EUl pe against cancer prgram. Leukemia van der Velden VH, Cazzaniga G, Schrauder A, Hancck J, Bader P, Panzer Grumayer ER, et a!. Analysis f minimal residual disease by Ig/TCR gene rearrangements: guidelines fr interpretatin freal-time quantitative PCR data. Leukemia Frnkva E, Madz J, Zuna J, Reznickva L, Muzikva K, Hrusak O, et a!. TELlAML 1 real-time quantitative reverse transcriptase PCR can cmplement minimal residual disease assessment in childhd ALL. Leukemia 2005; 19(7): Prim D, Sanchez ML, Espinsa AB, Tabemer MD, Rasill A, Sayagues JM, et a!. Lineage invlvement in chrnic myelid leukaemia: cmparisn between MBCRI ABL and mbcrlabl cases. Br J HaematI2006;132(6): Raanani P, Trakhtenbrt L, Rechavi G, Rsenthal E, Avigdr A, Brk-Simni F, et a!. Philadelphia-chrmsme-psitive T-lyrnphblastic leukemia: acute leukemia r chrnic myelgenus leukemia blastic crisis. Acta Haematl 2005; 113(3): Anastasi J, Feng J, Dickstein JI, Le Beau MM, Rubin CM, Larsn RA, et a!. Lineage invlvement by BCRI ABL in Ph+ lymphblastic leukemias: chrnic myelgenus leukemia presenting in lymphid blast vs Ph+ acute lymphblastic leukemia. Leukemia 1996; 10(5): Lin T. Detectin f impending graft rejectin and relapse by lineage-specific chimerism analysis. Methds Ml Med 2007; 134: Kristt D, Israeli M, Narinski R, Or H, Yaniv T, Stein J, et a!. Hematpietic chimerism mnitring based n STRs: quantitative platfrm perfrmance n sequential samples. J Biml Tech 2005J6(4): Kristt D, Klein T. Reliability f quantitative chimerism results: assessment f sample perfrmance using nvel parameters. Leukemia 2006;20(6): Kristt D, Stein J, Yaniv I, Klein T. Assessing quantitative chimerism lngitudinally: technical cnsideratins, clinical applicatins and rutine feasibility. Bne Marrw Transplant 2007;39(5):

78 E. Mejstříkvá, strana Frnkva E, Mejstrikva E, Avigad S, Chi k KW, Castill L, Manr S, et al. Minimal residual disease (MRD) analysis in the nn-mrd-based ALL IC-BFM 2002 prt cl fr childhd ALL: is it pssible t avid MRD testing? Leukemia Sramkva L, Muzikva K, Frnkva E, Krejci 0, Sedlacek P, Frmankva R, et al. Detectable minimal residual disease befre all geneic hematpietic stem cell transplantatin predicts extremely pr prgnsis in children with acute lymphblastic leukemia. Pediatr Bld Cancer Custan-Smith E, Gajjar A, Hijiya N, Razzuk BI, Ribeir RC, Rivera GK, et al. Clinical significance f minimal residual disease in chi!dhd acute lymphblastic leukemia after first relapse. Leukemia 2004; 18(3 ): vn Stackelberg A, Seeger K, Henze G, Eckert C. Clinica! significance f minima! residual disease in childhd acute lymphblastic leukemia after first relapse. Leukemia 2004;18(10): ; authr reply Kerst G, Kreyenberg H, Rth C, Well C, Dietz K, Custan-Smith E, et al. CnculTent detectin f minimal residual disease (MRD) in childhd acute lymphblastic leukaemia by f10w cytmetry and real-time P R. Br J HaematI2005;128(6): Malec M, van der Velden VH, Bjrklund E, Wijkhuijs 1M, Sderhall S, Mazur 1, et al. Analysis f minimal residual disease in childhd acute lymphblastic leukemia: cmparisn between RQ-PCR analysis fig/tcr gene rearrangements and multiclr flw cytmetric immunphentyping. Leukemia 2004; 18(1 O): Szczepanski T. Why and hw t quantify minimal residual disease in acute Iymphblastic leukemia? Leukemia 2007;21 (4 ): Rubnitz le, Razzuk BI, Lensing S, Punds S, Pui CH, Ribeir RC. Prgnstic factrs and utcme f recurrence in childhd acute myelid leukemia. Cancer 2007; 1 09(1): Přilžen é publikace s impact faktrem Příl ha 1 Crrelatin f CD33 with prer prgnsis in childhd ALL implicates a ptential f anti-cd33 frntline therapy E Mejstříkvá, T Kalina, 1 Trka, 1 Starý, O Hrušák Leukemia 2005 (ff 6, 924)

79 E. Mejstříkv á, strana 78 Crrespndence Crrelatin f C033 with prer prgnsis m childhd ALL implicates a ptential f anti-c033 frntline therapy Leukemla (2005) 19, di: /sj.leu Published nline 14 April 2005 TO TH E EDITOR There has been a cntrversy abut the prgnsti c impact f myelid antigens (MyAgs) in All. The issue has nw regained sigllificallce since an anti-cd33 mnclnal antibdy (mab) is avai lable fr clinica l treatment, w hich is cnsidered fr AMl as well as fr CD33 P, All. ' - J We evaluated the prgnstic impact f MyAgs in unifrmly treated palient s. Frm 9/1996 t 10/2002, 343 children with All were enrll d in a Czec h natinwide sludy All-BFM95. In 327 paticnts (96 0 /.,) immunphentyping and mlecular gelletics were perfrmed centrally in ur reference labs. Predn isne g respnders (PCR) with WBC at diagnsis < 20000/pl and age 1-5 ycars were assigned inl standard risk grup (SRC ). High RC (HRC) crrespnded t prednisne pr respnse (PPR) Ol' n remissin at dav 33 r BC R/ABl r MLUAF4 fusins. The remaining patients were in the intermediate RC (IRC). Full stjt istics delails are in the Supplementary Infrmatin. Immunphentyping was perírmed n bne marrw (B MI samples at diagnsis n flw cytmetry (FO using FACSCalihur (BD San Jse, CA, USA). Infrmed cnse nt was btained frm the patients and/r their guardians. A standard panel f mabs was used fr FC immundiagnstics, including: CD13 (Sll Dl Immulltech, nly in B-cell precursr (Bep) All ), CD 15 (MMA BDI, CD33 (D3Hl Immuntech) and CD65 (88 H 7 Immuntech), unvaryingly thrughut the study. ln a mu ltivariate analysis f BCP All patients (Table 1 I, CD33 was the nly MyAg with an independent prgnstic im pact. A simi lar analysis n T AlL (n - 45) did nt shw, l prgnstic impact f li sted M yags, therefre, we excluded I All cases frm further analyscs. Three cases (0.92%) were excl uded due t the absence f a representative leukemic ppulatin by FC and ne case was excluded si nce CD33 was nt assessed. RFS was signiflcantly wrse in BCP ALl (tla l = 278) pati ents with higher CD33 rs perce'ntage (patients with higher and lwer CD33 percentage: 5-yea r RFS 57 ± 6 vs 87 ± 3%, med ian f llw-up 3.3 and 4.0 years, n = 98 and n = 180, respectively; culff level: 10%; Figure 1). A similar analysis with a cutff level f 20% wuld reveal significant differcncc (P = , nt shwn). When analyzed separately by RC, this difference remai ns apparent and remains significanl fr SRC and IRC (5-year RFS in cases with lwer and higher CD33 percentage, cutff 10%: SRC, 88 ± 5 vs 59± 11 %, n = 70 and n = 36, P- O.Ol ; IRC, 92±3 v 60 ± 9 ;'" n = 88 <:Ind 1l - 49, P= ; HRC, 58±13 vs 38 ± 16%, n=22 and n=13, P=0.076). The difference in IRC was significant at any cutff level frm lot 70% (always P<0.02, data nt shwn). Thu s, CD33 is prgnstically imprtant especially in IRC, which is the mst Crrespndence: Dr O Hrusak, ClIP - DepartmL'nt r Immunlgy, V uvalu 84, Praha 5, Cz ch Republic; Fax: ; Received 1 Nvcmber 2004; accepted 1 March 2005; Published nline 14 April 2005 abundant RC amng relapsed cases but paticnts al risk are therwise difficult t discern The BCP All ca ses with an intermediate percentage f C033 PS blasts (10- S0'!!) had a prer utcme (5-)'ear RFS: 61 ± 7.9%) than the CD33,w g cases (P= , but nt different than the c"ses with high C033 PS percentage (;;. 50,{, blasts; P= 0.32). Thc diffcrence in the EFS f cases with higher CD33 P '" cell frequenc)' was less prfund (BCP All: P= and P> 0.05, fr cutff 10,md 20%, respectively; dala nl shwn) c mpjren t RFS (P= and P= , Fi gure 1 a) A signifi("ant differencp was nted in sepmate ana lyses fr PCR (ttal = 25 21, TEU AML 1 pas (ttal = 82) and hyperdiplid (ttal = 62) (P < , P= and P= 0.019, respectively; Table 2). In PPR, we failed t prve prgnstic significance f C0 33 expressin (P > 0.05, data nt shwn). The striki ng prgnstic imprtance f C033 cntrasts with several studies frm the 19905,4-6 which failed t find J diffcrcllt prgnsis f M yagpos All. These papers fllwed a perid f cntrversy between studies shwing significantly wrse prg nsis f MyAgPOS A l L 7- r n difference. 10 Hwever, reccnt in vitr data shwed a higher resistan ce fr AlL blasts with MyAgs. '1 Allhugh the aberrant MyAg express in has hccn knwn fr al least 40 years, little is knwn abut its regu latin and cell bilgical re levance. The mechanisms that lead t th l' cexpressin f several MyAgs in sme cases are bscllre; it is als nt prven whether the mechanisms causing MyAg expre ss in are cmparable in T-All and in BCP All. Therefre, it is inapprpriate t cmbine several MyAgs int cmps ite criteria r t ana lyze the sign ificance f M yags in Bcr All tgether with T-All cases. A shrter fllw-up is amng pssible reasn s fr a nnsignificant utcme; analysi s f Dur data by the criteria used by Uckun et ať (CD3 3 and/r CD13 at a 30% cutff value) des reveal a significant diffe rence in utcme (5-yea r EFS 52 ±9.2 and 77 ± 3.4%, 1' = , cmpared t 4-year EFS 77 ± 4 and 76 ± 1.8%, n.s. 4 in MyAgP'" and MyAgneg BCP All, respe ctively). The median f ll w-up was 3.6 and 2.7 years in this and the previus 4 study, respectivel)'. Since txic deaths are less likely t crrelate significantly with the immunphent)'pe, impact n RFS shuld alwa)'s be analyzed. The difference in EFS may becme insignificanl when smaller chrts f patients are analyzed. Anther bscuring Table 1 Cx multivariate analysis in B-cell precursr All: crrelatin f variables with RFS Varlab/es CD65% CD33% CD13% CD15% WBC at diagnsis Respnse t prednisne Age at diagnsis bcr/abl r mll/af4 P The independent prgnstic significance f myelid antigens (MyAgs) tgether with the prtcl-defined risk crilena is assessed by the Cx's prprtinal hazard regressin mdel. AII patients in whm all listed MyAgs were investigated, n = 255, are included.

80 a b E. Mejstříkvá, strana p= years lrg 0.9 SRG O.A (f) C l:l VI 80 c :O'" 70 0 = ;; f '" 60 Q. III 'Jt. CI,t.= 50,., 40 a. 30 '" U 20 t 10 u'" HRG IRG HRG years diagnsis day 15 day33 figure 1 OUlcme significance f CDJJ in B-cell precursr (BCP) L l. (al Cases with high 'r perccntage f CD3J P S cclls (bld black nesl are cmpared t thse with lwer C033 1 '" percentag (thin gray nes). Cutff 10% is represented in th ese plts, analyses n ther IJlues are described in text; all BCP ALL cases (n = 278); (b) RFS in Bep ALL split by risk grups (P-values are 0.011, and řv r SRC, IRC and HRG, respectively). The cutff value and the line,lrl are identical t the panel (a). (e) Percentage f leukemie cell s ť prc ss ing CD33 during the inductin therapy. C ses with cytme Irically detectable minimill residual di sea e were evaluated fr CD33 expressin. Cells were gjted accrding t ptical scatter prperties Jnd by the expressin f COlO Jnd CD19 in three-clr flw l)'tmelric measur ments.,ariable is thc difference in mab c10nes used in the study - w ius mab c10nes differ in the sensitivity twards the respective MyAgs. 12 This may have influenced especially multicentric analyses (Baruchel, persnal cmmunicatin) Therefre, it is apprpriate t analyze RF5 f BCP and T-ALL stparately, the MyAgs shuld be assessed by identical mab dnes preferably in a single labratry and the chrt shuld be Crrespndence treated by a single chemtherapy prtcl. The presenled ppulatin-base analysis cntains all these features. Antigen shift represents ne f the pssibl e reasns f the immuntherapy failure. 5ince the anti-cd33 immuntherapy is a ptential extensin f the presented analysis, we checked fr the stability f CD33 expressin at relapse. In 39 f 51 relapsed patients, we culd cmpare the levels f CD33 expressin at diagnsis and at relapse. In line with previus studies,1 3 the expressin amng relapsed patients was ralher unstable (17 f 39 switched between psitivity and negativily, cutff 20'Y, data nt shwn), and included als cases whse blasts cmpletely lst CD33 expressin at relapse. The expressin af CD13 and CD15 was als unstable, cntrasting with the stability f cl MyAg CD66c. 14 We next asked whether a substantial shift in CD3 3 expressin culd be bserved already during the inductin treatment. lne selected patients whse BM specimens cntainecl at least 50'10 CD33 PS blasts at cliagnsls. Of these, specimens were selected with a clear minimal re sidua I disease at days 15 and/r 33 by Fe. CD33 expressin was ascertained with a thrce-clr cmbinatin f CD10 (ALB2), CD33 (D3HL60.251) and CD19 U4.119, all frm Immuntech). Percentage f CD33 1 " " cells was assesse in gated cells accrding t ptical scatler an CD10 and CD19 expressin. The data shw that despite flu ctuatins (Figure 1 cl, mst patients retain the high CD33 percentage cluring the inductin treatment (9/ 12 at day 15 and 7/8 at clay 33). Lss f CD33 expressin thus usually des nt ccur at an early phase f trealment. 50 far, anti-cd33 treatment in ALL has been cnsidered nly fr patients with high percentage f CD33'"'' blasts and n ther realistic hpe fr cure. I - 3 The minimum percentage f CDDfl"" blasts suitable fr anti-cd33 immuntherapy is unknwn. In the presented chrt, there are 18 patients (5.5%) wh meet the arbitrary criteria f having BCP ALL with CD33 detectable n malrity (greater th an 50%) f blasts and being in IRG r HRG. The 5-year RFS f these patients was 40 ± 1 SOf,. (thc 5-year RF5 f the remaining patients frm the same subset was 80±4%, p= ). In ttal, eight f these patients relapsed and ne develped a secndary AML. Three f them underwent allgeneic BM transplantatin in secnd r thircl cmplete remissin. Ecnmic reckning f anti-cd33 immuntherapy shuld cnsider that a prprtin f the patients might be rescued frm an intensive relapse treatment including BM transplantatin. 5etting the anti-cd33 immuntherapy t the inductin phase f treatment seems t vercme the issue f Jntigen shift (Figure 1 cl. In additin, peri pheral nnmal igllant CD33!'S cells are reduced by the intensive initial chemtherapy. This limits the risk f therapy failure due t peripheral cnsumptin f th e anti-cd33 mab 15 and the effective dse may be lwer. Clinical experience is cumulating with single anti-cd33 immuntherapy as well as in cmbinatin with chemtherapy. If the presented results are t be taken int c1inical trials, a dse escalatin study early during treatment is preferable t select a safe dse that des nt cause a significant delay in chemtherapy but significantly reduces the leukemic c1ne. Thc fact that CD33 is nt expressed n all blasts in sme cases Inay appear Cl prblem fr the immuntherapy since CD33 neg cells may remain unaffected. Hwever, this is nt different frm the cntemprary treatment philsphy; mst single agenls can kill just a prtin f the leukemic cells by themselves and the final success is achieved by cmbining them. INhereas standard chemtherapy targets mstly dividing cells, the suggested immuntherapy wuld aim at cells based n partly diffcrent characteristics Leukemia

81 E. Mejstříkvá, strana 80 Crrespndence Table 2 subset) Incidence r C033", cases in ALL subtype S usi ng tw cutff va lues fr psitivity (percent C033 P " number f CD3J P, cases/tut, I per C033 at 10% P value C033 at 20% P-value BCPALL T ALL PGR (BCP ALL) PPR (BCP ALL) TEUAML1 + hyperdiplid BCRlABL+ Nnhyperdiplid, BCRlABL, MLUAF4, TEUAML1 negative (BCP ALL) 35% (98/278) % (65/278) % (6/45) 8.9% (4/45) 35% (89/252) NS 23% (57/252) NS 35% (9/26) 31% (8/26) 59% (48/82) % (33/82) % (16/62) 9.7% (6/62) 50% (4/8) 38% (3/8) 27% (28/105) 22% (23/105) Statistics shw differences in respective subgrups (chi-square). Acknwledgements We thank J Ridskva, K Pspisilva, L Cndrcinva, P Hanusva and N Hlsva fr technical assistanee. Cllabrati n f Czech Pediat rie Hematlgy (CPH) centers (data manager A Vrzalva, leaders: B BIJZC'k (Ostrava), Z CC'rna (Plzenl, Y Jabali (Ceske Budej viee), V MihJI (Olmuc), f) Prehazkva (Usti nad Labem), J Sterba (Brnl, J H<1k Jnd K Tusvska (Hradec Kralve)) and statisti ca l help f P. MJrtinkva is Jppreciated. The wrk was supprted by gra nt s: CA UK 80 and 65 (2004), MZ CR and MSM E Mejstř ík vá 1,2 T Ka li na 1,2 J Trka' " J Starý) O Hrušá kl Supplementary Infrmatin 'CLlP (Childhd Leukemia Investigatin Prague), 2nd M edica l 5chl, Charles University, 2 Prague, Czeeh Republic; Department af Immunlgy, 2nd MedKal 5ehl, Charles University, Prague, Czeeh Republie; and JDepartment af Pediatrie Hematlgy and Onelgy, 2nd Medical 5chl, Charles University, Prague, Czech Republic Supplementary Infrmatin acempanies the paper n the Leukemia website ( References Zwaan CM, Re inhardt O, Jurgens H, Huismans DR, Hahlen K, Smith OP et al. Gemtuzumab zgamicin in pediatric C033-psitive acute Iymphblasti c leukemia: first cl inical experi ences and relatin w ith cellular sensitivity t single a g( nt ca li cheam icin. Leukemia 2003; 17: Balduzzí A, Rssi V, Crral L, Bnanmi S, Lngni D, Rvelli A et al. Mleeular remissin induced by gemtuzumab logamicin assciated with dnr Iymphcyte infusins in t(4; 11) acute Iymphblasti c leukem ia relapsed after transplantatin. Leukemia 2003; 17: Crter M, Rney S, O'Marcdlgh A, Smith OP. Successfu l use f gemtuzumab zgam iein in,i child w ith relapsed C033-psitive acute Iymphblasti c leukaemia. Br } Haematl 2003; 122: Uckun FM, Sather HN, Gaynn PS, Arthur O,Trigg ME, Tubergen DG et al. Clinical features and treatment utcme f ehi ldren with myelid antigen psitive acute Iymphblastic leukem ia: a reprt frm the Ch ildren's Cancer Grup. Bld 1997; 90: Putti MC, Rnde"i R, Ceit MG, Aric M, Sainati L, Cnter V er al. Expressin f myelid markers lacks prgnstic imp, Cl in children treated fr acute Iymphblastic leukemia: Italian experience in AIEOP A LL studies. Blad 1998; 92: Czuczman MS, Ddge RK, Stewart ce, Fra nkel SR, Oavey FR, Pwell BL et al. Value f immunphentype in intensively treated adult acute Iymphblastic leukemi a: ca ncer and leukemi a Grup B study Bld 1999; 93: Wiersma SR, Ortega j, Sbel E, Weinherg Kl. Clinical imprtance f myelid-an ti gen expressin in acute Iymphblasti c leukemia f childhd. N EnglJ Med 199 1; 324: Fink FM, K ll er U, Mayer H, Haas OA, Grumilyer-Panzer ER, Urban C el al. Prgnsti c significa nce l' myelid-assciated antigen expressin n bl ast ce lls in children with acute Iymphhlastic leukemia. The Austri an Pediatri e O nclgy Grup. Med Pediatr OncJ 1993; 21 : Sbl RE, Mick R, Rystn I, Davey FR, Ellisn RR, Newman R et al. Clinica l imprtjnce f myelid anti gen expressl n in adult acute Iymphblastic leukemia. N Eng l J Med 1987; 316: Pui CH, Behm FG, Singh B, Rivera GK, Sche/l Mj, Rberts WM et al. Myeli d-assciated antigen expressin laeks prgnstie value in childhd acute Iymphhlastic leukemia treated with intensive multiagent chemtherapy. Bld 1990; 75: Den Ber M L, Kapaun P, Pieters R, Kazemier KM, Janka-Schaub GE, Veerman AJ. M yelid antigen c-expressin in childhd acute Iymphhlasti e leu kaemia: relatinship with in vitr drug resistance. Br J Haemar/1999; 105: Fi rat H, Favier R, Adam M, Leverger G, Landman Parker j, Cayre Y et al. Oeterrni natin f myelid antigen exp ressin n childhd acute Iymphblastic leukaemia cells: discrepancies using di ffe rent mnclnal antibdy clnes. Leuk I. ymphma 2001; 42: van Weri ng ER, Beishuizen A, Reffen ET, va n der Linden-Schrever BE, Verheven MA, Hahl en K el al. Immunphentypic ch;,mges between diagnsis and relapse in childhd acute Iymphblasti c Icukemi a. Leukemiil1995; 9: Ka linil T, Vaskva M, Mejstrikva E, MadlO j, Trka j, Stary J et al. Myelid anti gens in ch ildhd Iymphblastic leukemia: clinical data pint t regulatin f C066 distinct frm ther myelid antigens. BMC Cancer 2005 (in press). 15 van der Vel den VH, Beckx N, Jedema I, te Marvelde JG, HgevE:-en PG, Bgaerts rvi et al. High CD33 -antigen lads in peripheral bld limit the díicacy f gemtuzumab zgamiein (Myltarg) treatment in acute myelid leukemia patients. Leuke mia 2004; 18:

82 E. Mej s tříkvá, strana 82 Přílha 2 Transfer f genmics infrmatin t flw cytmetry: expressin f CD27 ad CD44 discriminates subtypes f acute lymphblastic leukemia M Váškvá, E Mejstříkvá, T Kalina, P Martínkvá, M Omelka, J Trka, ] Starý, O Hrušák Leukemia 2005 (ff 6,924)

83 J % MyAg+ MyAg- MyAg- Med I CD33 % Trealmenl Irealmenl Irealmenl MyAg+ Irealme ian %01 abve CD33 resulls resulls resulls Ireatmen ni Cutff psilive %01 cutff abve (EFS l (EFSl (EFS l Treatmenl t results results w lab lr N l patients psitive (BCP cutff entire entire entire results (EFSl (EFS f up age diagn Reference Definitin f psitivity patien (B and BCP and (BCP multivariate univariate CD33 chrt) chrt) chrt) (EFS f BCP) BCP) [yea jlrup sis number MyAg 11%1 ts T) ALL T) ALL) analysis analysis clne methd I prtcls 11%1 11%1 1[%1 BCP) 1%1 1%1 11%1 rsl CD11b, 13, 33, 36,14,15, w12. micrscpy Graph Graph Childh single Gruped as: 0,1 16 (ut r St. Jude nt apprx.: apprx.. d lab 1(1) and >1 MvAgs f 372) nd 3.2 nd nd n. s. My9 1FC/2FC I prtcl shwn nd nd I nd Childh single CD13 r CD33 d lab 1(2) rcd significant significant My9 1FC/2 FC CCG nd nd nd nd nd Childh single CD65,CD13,CD ALL-A-84 and nt d lab (3) 15 CD significant significant My9 micrscpy ALL-BFM-86 shwn nd nd nd Childh single nt d lab (4) CD33 r CD nd 14 nd nd d n.s. shwn FC CCG nd nd nd nd One f: CD33, Childh single CD11b, 13, 14, nt AIEOPALL d lab (5) 15 and ns n.s. shwn Fe 88 AND nd nd nd 4 I nt multi- CD33 and/r shwn, usually by - centric (6) CD nd n.s. varied FC LALA87 nd nd nd 20 nd nd 28 CALBG Graph Graph single CD33 and/r nt (8811,9111,9 apprx.. apprx.: Adult lab (7) CD nd n.s. shwn FC 311,9511) nd nd nd Childh d Childh d single lab this analysis, Cx's multivariate CD33, CD13, CD15, CD65 N/A 255 N/A CD single this analysis, CD lab univariate CD CD33 r CD Abbreviatin sa.'5 lisled in thc pap\:r, nd :: nl dene (not prvi ded). n s = noi sagrllficanl. (1 _1.3)Ff' ''' t 1.2,3)-clr nw cy1metry, Thl.!' data demnsrrate the pin ls mmtln ln Ihl! paper, includin g Cnlcna rr MyAg pslu \lj ty di fter, malang cmparisns cumbcr$ome. Vari ab le percenle f MyAg- r fcdj3... d nes frequently unspcc:lfil.'d. ;\ nc\.. i)' added t th e paper. shn fll\y up ps.5ibl y callscs sme fthe dl fference's (cmpare ref 4 :U1d the lasl line) Impnlnl pjl1s f SU... '1vaJ Jnalyses are ften missmg References (numbered separately just fr this Table) CD33 signilicant N/A N/A D3HL FC/3FC ALL BFM N/A N/A significant significant D3HL FC/3FC ALL BFM significanl significant EFS at [years] I I. Pui CH. Dchm f O, Smsh 8. R.m.!TB GK. Sché'l l M J. Rberts WM ('rist \.VM, Mirr J. Jr Myclid-assclatc<i antl g.en cxpressin lacks prgnsuc \'aj u in childhd acul ' I)'mphblastic leukeml3 trt!'3ted w1th intensive mulllagcnl c; hemthef3py Bld 1990;75( 1) \Vtcrsma SR. One,ga J, Sbel E. Wemberg K. I. Cl lfil Cal lmpnance fmyelclld-anrigen expressln in ď cu te j' mp h b lasll-': leukern l3 fchildhd. N Eng' J Med 1t)9 I,J 24( 12) FlIlk FM. Kller U. \1ayer I I, Haas OA. Grumayer- Panzer ER. Urban C. Dengg K Mutz J. Tuchler H G3ttCrer-:vtenz I, e1 aj. Prgl'lsltc 51gnificancc f mye1ld-a.sscimed antigen e- p rc'ssln n blasl cells ln chlldrcn with acule Iymphblastic IC llkcl1li t. Thi! A uslrian Pediatrie OnclSJ' Grup Med Pediatr Oncl 1993,2 1(5) lkkun FM, S3ther HN. Gaynn PS. Anhur DC. Trigg, ME.. T ubersen DG. Nachman J. Slcmhen. PG. Sen scl MG. Reaman GH. Cl!O leal fealul'e's and treatmenl Qutcme f chl ldren "\\'Ith myclid antigen pslti"e acu[e Iympnblastic leukenlla a repn ťrm thc Chtldrcn's Cancer Grup Bld I { I) PUU I Me. Rndc:\1I R. Ccit MG. ;\nc M. Samati L. Cnter V. Gugltelmi C. Cantu-Rajnldi A. Cnsl ini R. Pessin A. Zantsc L. j\hser8 G. Bindi A. Bass G Expressin af myelld markers lacks prgn311c Impacl in chtldren treated fr <ICUle I)'mphblasllc leukcmia: Ita"'n <xpeflcnce 111 AIEOP-ALL stud"" Bld 1998:92(3) 795-& Buchclx C, David B. Sebban C. Racadt E. Bene M. Bernard"'\, Camps L. Juau\t H. Slgaux F..Lepag.c E Imrnun phenl)'pe fadu!t ac-utc Iymphblastlc Icukeml8. cltnlcal parameters. and butcmt an <t1l1llys1s ra prspecti vc lnal tncludmg 562 tcstcd pátllmls (lala87). Fr.nch Grup n Therapy fr."dult Acute Lymphblastlc Leukemla. Rl d (5) Czuczman MS. Ddgc- R.K, Stcwan ce. frankc'l SR. Davcy FR. Pwell BL. Szau wskl TP, SchttTer CA. Larsn RA. Blmfídd CD Val ue ť Immunpht::ntypc to tnten Slvely treated aduh aculc l y mphbll1c Icuketma ca"cer and leukemla Grup B study Bld ( 11 )

84 E. Mejstříkvá, strana 82 P říl h a 2 Transfer f genmics infrmatin t flw cytmetry: expressin f CD27 and CD44 discriminates subtypes f acute lymphblastic leukemia M Váškvá, E M ejstříkvá, T Kalina, P Martínkvá, M Omelka, J Trka, J Starý, O Hrušák Leukemia 2005 (ff 6,146)

85 E. Mejstříkvá, strana 83 Leukemia (2005) :: Nat re Publishing Grup AI! rights reserved /05 $ CORRESPON DENCE Transfer f genmics infrmatin t flw cytmetry: expressin f CD27 and CD44 discriminates subtypes f acute Iymphblastic leukemia Leukemia advance nline publicatin. 10 March 2005; lo: /sj.leu Tf IE EDITOR \ pressin prfiling studies have prvided data n an unprece.lťn ted number f genes that are expressed in malignant cells The critical number f genes which can predict a particular,éntype is a matter f discussin. Dwning pi nted ut that as ;e..y as 20 genes may be necessary fr an acc urate predictin f Jbsets and prgns is; thes genes shuld be spec ifically "udied, perhaps by methds like reverse transcriptin ply 'llerase chain reactin (RT-PCR) r flw cytmetry (FO (Dwn 'lg in Carrll cl ;J / ). Fe. which shws the expressin f -lolecules in mutual cntext n individual cells, appears utimal fr such analysis. The present study (Micrarray-guided FO is designed t Itematically screen fr genes within the existing expressin ljrfilill studies n childhd acute Iymphblast ic leukemia L LJ. I. The genes, which are identified as best c rrelating with :Iic pediatric ALL subgrups (E2NPBXl, MLL, TEL!AML 1, BCRI B L, 'nvel' and hyperdiplid gentypes; pati ents wh later rclarscd and thse wh develped therapy- induced acute elblaslic leukernia), are selected. Afler reca lculalin just kjr the B precursr AL cases, we select the gen e in which the diiíerence in expressin is likc'l y t be bserved at thc prtein Il!\'el. Next, we select mlecules with suitable cellular lcaliza 'in (nnsecreted prteins) and with an available mab. Reaclivity and specificity f mabs are tested in healthy peripheral bld ell s and/r in cell lines. The respective mlecules are investigated by fur-clr FC in diagnstic bne 'IIlrrw (BMI samp les. Five mlecules have prceeded int this ep (CD44, CD2 7, D49f, CD247 and CDI03). We present nefe thc resu lts f CD44 and CD27 expressin, which are.nvestigated in the largest chrt. A ttal f 66 patients w ith B-cell precursr ALL and 14 atients with T lineage ALL were cnsidered t enter CD44 and CD2? investigatin. These patients repre sent all Czech children age lwer than 18 yea rs) diagnsed with ALL between 03/ 2003 lnd 02/2004. Five patients (fur B-cell precursr and ne T neage ALl) were excluded due t lw sample vlume. CD44 xpressin was investigated in 62 B-cell precursr ALL ratients 11 TEUAMLI P " 18 hyperdiplid, fur SCRlABLP", tw IL LR'"'' and 17 with n ne f the abve-mentined gentype) jnd (D27 express in in 56 S-cell precursr ALL patients (2 1 ieuaml 1 rs, 15 hyperdiplid, fur BCRlASL P" n. MLLRP, md 15 with nne f thc' abve-mentined gentype). Infrmed nsent was bta ined frm patients and/r their guardians. Patients were trcated accrding t ALLlC SFM 2002 r Interfant i rrespndence: Dr O Hrusak. Childhd Lcukaemia Investigatin t'rijgue, Department f Immunlgy, Charles University 2nd Medical hl, V uvalu 84, Praha 5, Pragu e, Czech Republic; Fax : ; Ondrej.Hrusak Ifmtl.cuni.cz. eceived 25 Augusl 2004; accepted 12 January prtcls. The presence f TEl!AML 1, BCRlABL fu sin genes and MLL gene rearrangement (MLLR) was detected by twrund nested PCR; hyperdiplidy was assessed using DNA index flw-cytmetric measurement. CD44 and CD27 antigens were stained with an anti-cd44 FITC and ant i-cd27 FITC (BD, San Jse, CA, USA) in fur-clr cmbinatins with antigen s f1'om a standard panel (a nti -CDI0 PE, anti-c019 PCS r PC7, anti CD34 APe, Immuntech, Marseille, France). Data were acquired using a FACS Ca libur flw cytmeter (BD). Antigen psitivity was ana lyzed n gated malignant cells accrding t the is type cntrl. T eva luate differences i express in between th e subgrups, a nnparametric Mann- Whitney test was perfrmed using StatView sftware (SAS Institute, Cary, NC, USA) Expressin prfiling fund the gene fr CD44 (Hermes, Pgp-l) t be ne f the best crrelating with the MLL gentype and with the subg1'oup f T-ALL patients wh later develped hematlgical relapse. u Althugh MLLRPuS blasts in u r chrt did shw CD44 psitivity, 50 f,jr we have nt bserved a higher CD44 expressin cmpared t ther C044 1 " " B-cell precursr ALL cases (Figures 1 a, 2a). In additin, D44 express in significantly crrelated with higher risk T-ALL (P= 0.032) (Figure 2b). This als indicates that the current risk stratificatin f the T-ALI_ patients w ithin the ALL-IC BFM2002 prtcl (based n age, leukcyte cunt at presentatin, ea rly treatment respnse and unfavrable mlecular genetics, as in ther majr frntline therapy prtcls) crrespnds t the true bilgical risk. Furthermre, C044 expressin was significantly lwer in TEU AML 11' ' ALL (P< ). which is in line with thc bservatin f ne f the tw express in prfiling studies. 1 Thc assc iatin with TEUAML 1 gentype was als fund in CD27 (TN FRSF7) gene expressill,' but anther expressin prfiling study] shwecl nly a crrelatill with BCRlABL gentype. We fund a strng crrelatill f CD27 with TEl! AML 1 psitivity. CD2 7 P '" blasts abve 30'Y were detectcd in 20/21 and 2/35 patients with TEUAMLl I JOS and TElIAML 1" 0 1: ALL, respectively (P < O.OOO1) (Figure 1 a). Since the ppsitc crrelatins with TEUAML 1 were bserved fr CD27 and CD44, we ana lyzed the cmpsite picture f the expressin f th ese tw mlecules simultanellsly (Figure 1 a, b). Mst CJses in bth expressin prfiling studi es and in ur cytmetric study can be c nsidered either CD44 P S r C027 P,. Dual C027psCD44PS blasts are typi ca lly seen in BCR/ABLI"" ALL and a subset f TEL! AML 1 p, patients exists with CD44p'CD271l0S bl asts. ln ur chrt, th e TEl!AML 1 ps case with Sl 0(., CD44"'" cells prese ntecl with an unusually high blast cunt (peripheral leukcytsis 109 x 10 6 per ml) and higher percentage CD66 ps blasts (25%) cmpared t thc typical TEUAML 1 p, patients G - ther presentatin parameters crrespncled well with the gentype. (D27 has heen cnsidered t be a general marker fr memr)' S-cells in humans and s far its expressin in human B-cell precursrs has nt been reprted. Here we shw th at this antigen is indeed expressed in malignant S precursrs at a prtein leve!. Mrever, an experiment with seven-clr FC n nnmalignant BM (FACS Aria, BD, data nt shwn) did cnfirm

86 E. Mejstříkvá, strana 84 Crrespndence a Q) 100 cr> jg 60 c Q) t' Q) "- 80 r-- 40 N U O 20 O O O 20 Flw cytmelry CD44 % O b- O b TEUAML1 a Hyperdiplid 6BCRlABL xmll OOther b Expressin prfiling TEUAML1 a Hyperdiplid ABCR/ABL 6. O c.q -MLL t Ul Ul OOther 6. "-. x tj.0 c Q) 6. cr> 6. r--.;t '0.&. N u O -1QOOO Ul CD44 gene expressin x C 100 Q) : 80 "" S u Q) > -g80 Ul Q) Ul Ol U '" m -' 40 ::< UJ f- t' Q) 20 t' Q) Cl Percent TEUAML 1 ps cases abve cutff value Figure 1 Clu stering f ALL gcntyp ic subgrups accrding t C044 and C027 expressin. (a) FC data. (bl Expressin prfil ing data frm Yeh er a/.' Prbe set number 404<J3_<l t (C044) and _at (CTl27 ). (c) The TEUAML 1 predictive value f C044 and C0 27, clelectecl by FC ar in tw expressin prfiling sludies. Cmpari sn t the lher prbe sets analyzed in Ye h er a/.' Nncrrelating genes are near the halched diagnal. An ptimal cu tri va lue W 3 S fund fr each prbe set based n the best discriminatin f TEUAML 1,l<» frm ther B-precursr ALL C,lses (Iargcst distance frm the nncrrelating diagnall. Circles rcpresent individua l prbe sets (va lues crrespnding t lhe best C044 and CD27 prabe sets are enlarged). Squares repr senl C044 and C02? fram Rss el ať (prbc set numbers _at fr C044 and 20615_31 fr (027), triangles shw 0 44 and C027 by Fe. thi s chrt. In expressin prfiling studies, the best crrelating prbe sets were used in bth inslances. C027 POS cells in all fur specimens (12 ±2.2% amng [)APlneg D 19 P '''C010 l ''''C020,,,,g cells, amng these C027 PS cells 45 ± 13% were C034 pn ' l. The dynamics f C044 expressin n develping B-cells during hematpiesis was already reprted. We are ging t analyze the recmbinatin status f 19 genes in subppu lalins f precursr B-ce lls with C044 and C027 expressin crrespnding t Iymphblasts. T cmpare the value f C044 and CD27 with the ther expressin prfiling data fr the predictin f TEUAML 1 status, we used th e sam e plt as described previusly in the FC metaanalyses" (Figure 1 cl. This frmat clepicts graphically lhe predictive value f eac h prbe set r mlecule fr the TEUAML 1 status. Each prbe se t r mlecule is separately cmpared t its ptimal cutff value in all BCP ALL patients l' thc respectivc chrt. lhe prbe-set-speciric ptimal cutff value was determined using a statistical sftware R ( The ptimal cutff value is thc ne that leads t th e besl re sl utin between TEUAML 1 ps and TEUAMLl "eg subsets, judging by the distance frm a nnc:rrel ating diagnal. The percentage f TEUAML 1 neg patients abve the cutff value is cmpared t the respecti ve value in TEUAML 1 pa< patients. The verall predictive values fr C044 and CD27 are 93 and 95% in Fe. 82 and 91% in Yeh,l an d 90 and 90% in RSS,l respectively. Th e difference in predictive valucs is in cmpli- kemia

87 E. Mejstříkvá, strana 85 Crrespndence 3 b a <fl Ul 4000 x Ol 2000 Ol Dl.,. či.2000 Expressin prfiling P=0.11 g : 50 - O; 40 a. 30 BQ Flw cytmetry P=0.032 c _._ _... _----_._-_._------_.-._ _._ _._ _._ ' ' CD44 CCR Relapsed IR HR ligure 2 Significance f CD44 expressin in specific subsets. (a) Intensity f CD44 expressin ln B-cell precursr ALL. Histgrams represent ILLR''''' (thick lines), tgether with typi cal hyperdiplid (thin lines) and TEL/AML 11' ' (dashed line) cases. Y-axi s shws frequency. (b) CD44 'pressin in T-ALL patienls. Exprcss in prfiling data f patienls in clinical cmplete remissin (CCR) and relapsed patients. 1 Prube set number 126_3t is shwn (Ieft panel). FC data f patients in the intermediate (IR) and high-risk (HR ) grups (right pane\). ce with the fact that FC can investigate the expressin f Ied mlecules n pure ALL cells. We studied the ther "Illecules (C049f, C0247 and CD103) in spec imens f fewer lients and thus it wuld be t early t establish their edictive va I ues. The princi pie that class-defining genes may be selected within 'Icrarray data has been suggested previusly (Dwning in Carrll et a1 5 ). The results ( the presented screening strategy nlove this principle. Lack ( in(rmatin n prtein expressin ared t be the mst limiting factr reducing the number f. ndidate genes in the final FC testing. Imprbability ( the cell- 1und (rm als excluded mlecules during the screening (r C - these secreted mlecules may be studied by prtein chemistry. Althugh cytmetric studies n mlecules that "me frm a systematic screening strategy in micrarrays have '1 )1 been presented yet, ne new mlecule (C058) has been Ilrduced int FC testing based n expressin pr(iling? The mented data nt nly shw that in(rmatin (rm micrarrays an betransferred t cell-based investigatin by Fe, but als that lile cmpsite micrarray in(rmatin can be suceessfully,tplced by strng predi ctrs likc CD44 and C027. The ging prjeet Micrarray-guid('d Fe tests whether ther mlecules ean be fund with cmparable r better predictive alues fr ALL gentype and prgnsis. clmwledgements,'ie thank the cytmetric technicians Jana Ridskva, Klara pisilva and Lucie Cndrcinva, and the mlecular genetic h nicians Katka Muzikva and Lena Rpznickva and Marketa '.ahnva. MV highly appreciates the practieal and theretical perience in the labratry f Z Trajanski (Institute f Jimedical Engineering and Christian Oppler Labratry (r L>l'nmics and Biinfrmatics, Craz University ( Technlgy, IJJslria), as well as the (rienclly atmsphere. The cllabratin ( \I Czech Pediatrie Hematlgy (CPH) centers (Ieaders: B Blazek Ostrava), Z Cerna (Pl zen), J Hak (Hradec Kralve), Y Jabali (Ceske ;udejvice), V Mihal (Olmuc), O Prehazkva (Usti nad :.b ml, J Stary (Praha) and J Sterba (Brn)) is appreeiated. The wrk was supprted by Crants Ns. CA UK , MSM , ICA MZ CR and M Vaskva l.2 E Mejstrikva' 2 T Kalina 1. 2 P Martinkva] M Omelka:l JTrka la J Stary4 O Hrusak 1.2 References 'CLlP - Childhd Leukemia Investigatin Prague, 2nd Medical Schl, Charles University, Prague. Czech Republic; 10epartment f Immunlugy, 2nd ME'dical Schl, Charles University, Prague, Czech Republic; JOeparlment f Prbabilily ancl Mathcmatical Stalistics, Faculty f Malhemalics and Physics, Charles University, Prague, Czech Rcpublic; anrl 'Pedialric Hematlgy and Onclgy, 2nd MedicalSchl, Charles Univcrsity, Prague, Czech Republic Ych E), Rss ME, Shurtleff SA, Williams WK, Patel D, M hfuz R CI JI. Classificatin, subtype discvery, and prcdictin f uutcume in pediatrie acute Iymphblastic leukemia by gene expressin prfiling. Cancer Ce1/2002; 1: Armstrng SA, Stauntn JE, Silverman LB, Pieters R, den Ber ML, Mi nden MD el al. MLL translcatins specify a distinct gene expressin prfile that distinguishes a unique leukemia. Nal Genel 2002; 30: Rss ME, Zhu X, Sng G, Shurtleff SA, Girtman K, Willi;lms WK el al. Classifjeatin f pediatrie acute Iymphblastic leukemia by genc expressin prfiling. 810ad 2003; 102: Fine BM, Stanulla M, Schrappe M, H M, Viehmann 5, HarbulI J el al. Gene expressin patterns assciated with reeurrent chrmsmal transleatins in acute Iymphblastic leukemia. 8I(xI2004; 103: Carrll WL, Bhjwani D, Min DJ, Raetz E, Relling M, Davies S Cl.11. Pediatrie acute Iymphblastic leukemia. Hematlgy lam Sc Hemall Educ Prgram) 2003, Hrusak 0, Prwit-MaeDnald A. Antigen exprcssin palterns reflecting gentype f acute leukemias. Leukemia 2002; 16: Chen JS, Custan-Smith E, Suzuki T, Neale GA, Mihara K, Pui CH el al. Identificatin f nvel markers fr mnitring minimal residual di sease in acute Iymphblastic leukemia. B/cl 2001 ; 97: Leukemia

88 E. Mejstříkvá, strana 86 Přílha 3 Myelid antigens in childhd Iymphblastic leukemia:clinical data pint t regulatin f CD66c distinct frm ther myelid antigens Tmas Kalina, Martina Vaskva, Ester Mejstrikva, JzefMadz, Jan Trka, Jan Stary and Ondrej Hrusak BMC Cancer (ff 2, 709)

89 E. Mejstříkv á, strana 87 BMC Cancer () BiMed Centra l Research article Open Access Myelid antigen s in childhd Iymphblastic leukemia:clinical data pint t regulatin f CD66c distinct frm ther myelid antigens Tmas Kalina1,3, Martina Vaskval.3, Ester Mejstrikva1,3, Jzef Madz2,3, Jan Trka2,3, Jan Stary2 and Ondrej Hrusak* l.3 Address: 'DepanlllC lll f Im mun lgy, Charl es Universily 2nd Medical Sc hl, Pragu e, Czech Re publ ic. 2Depanment f Pediatri e Hemallgy and Onclgy, Cha rles Univers il y 2 nd Med ical S,hl. Prague, Czech Republic and 3CLl P - Ch ildhd Leu kem ia lnvesligalin Prague Czech Republi c Emai l: Tmas Kalina l mas.kali na@ lfmlo l. cuni.cz; Ma n inavaskva fmll.cuni.cz; ESler Mejslrikva ESler.Mejsl rikva@ lfrn l l.cuni.cz; lzef Mad z ju f. madz@ lfmll.cuni.cz; Jan Trka. jan.lrka@ lfml l. cun i.cz; Jan Slary ian.s lary(ajlfm ll. cuni.cz; Ondrej l-lrllsak' ndrej.hrusak@ lfm lo l.cun i. cz C rrespnding au lh r Publ ished: 12 April 2005 BM C Cncer 2005, 5:38 di: I / This areicle is available fr m: bimedceneral.cm/ /5/38 Received: 16 Nvember 2004 Accepeed: 12 Apr íl Kalina e e al; licensec Bi Med Centra I Ltd. This is an Open Access articl e distribu ted under the terms f the Creative Cmm ns Attribu tin Li ce nse (http /Icreatjyecmms Q r li ic e se$! byl2 O), w hich permi ts unrestricted use, dis tributin. and reprdu ctin in any medium, prvided the riginal w rk is prperly cited. Abstract Backgrund: Aberrant expressin f myelid antigens (MyAgs) n acute Iymphblastic leukemia (ALL) cells is a well-dcumented phenmenn, althugh its regulating mechanisms are unclear. MyAgs in ALL are interpreted e.g. as hallmarks f early diffe rentiatin stage and/r lineage indecisiveness. Granulcytic marker CD66c - Carcinembrynic antigen-related cell adhesin mlecule 6 (CEACAM6) is aberrantly expressed n ALL with strng crrelati n t gentype (negative in TEUAMLI and MLUAF4, psitive in BCRlABL and hyperdiplid cases). Methds: ln a chrt f 365 cnsecutively diagnsed Czech B-precursr ALL patie nts, we analyze distributin f MyAg+ cases and mutual relatinship amng CD 13, CD 15, CD33, CD6S and CD66c. The mst frequent MyAg (CD66c) is studied further regarding its stability frm diagnsis t relapse, prgnstic significance and regulatin f surface expressin, Fr the latter, flw cytmetry. Western bit and quantitative RT-PCR n srted cells is used. Results: We shw CD66c is expressed in 43% patients, which is mre frequent than ther MyAgs studied. In additin. CD66c expressin negatively crrelates with CD 13 (p < 0,000 I). CD33 (p = 0.002) and/r CD6S (p = 0.029). Our data shw that different myelid antigens ften differ in bilgical imprtance. which may be bscured by cmbining them int "MyAg psitive ALL". We shw that unlike ther MyAgs, CD66c expressin is nt shifted frm the nset f ALL t relapse (n = 39, time t relapse years). Althugh ppsite has previllsly been suggested. we shw that CEACAM6 transcriptin is invariably fllwed by surface expressin (by quantitative RT-PCR n srted cells) and that malignant cells cntaining CD66c in cytplasm withut sllrface expressin are nt fund by flw cytmetry nr by Western bit in viv. We reprt n prgnstic significance f CD66c. glbally r separately in gentype subsets f B-precursr ALL. nr an assciatin with knwn risk factrs (n = 254). Cnclusin: ln cntrast t general ntin we shw that different MyAgs in Iymphblastic leukemia represent different bilgical circumstances. We chse the mst frequent and tightly gentype-assciated MyAg CD66c t shw its stabile expressin in patients frm diagnsis t relapse. which differs frm what is knwn n the ther MyAgs. Surface expressin f CD66c is regulated at the gene transcriptin level. in cntrast t previus reprts. Page 1 f 11 (page number n/ fr ci/a/in purpses)

90 E. Mejstříkvá, strana 88 BMC Cancer 2005, 5:38 http :// /5/38 Backgrund Althugh expressin f surface markers in acute lymphblastic leukemia (ALL) parallels that f nrmal hematpietic precursrs, several markers f myelid lineage are fund n ALL lymphblasts. This phenmenn is referred t as "aberrant expressin". The issue f the regulatry mechanisms that allw it has been addressed repeatedly thrughut the recenl 40 years [L2]. Althugh several hyptheses stressing either pssible lineage indecisiveness r genetic misprgramming have been rjised, the phenmenn is slili nt fully understd. We and thers have shwn thal the myelid antigen CDGGe is very frequently aberrantly expressed in B-precursr ALL, hwever, a large sludy shwing its frequency in the light f ther myelid antigens has been missing. CDGGc expressin was fund n cases f childhd and adult ALL in strng crrelatin with nnrandm genetic changes (BCR! ABL psitivity [3 J, hyperdiplidy and TEL/AMU negativity [4J, reviewed in [5]). CDGGc (CEACAMG, previusly cajled Nnspecific crssreacting antigen, NCA 90/50 and KOR-SA3s44 antigen) is a member f the carcinembrynic antigen family. This heavily glycsylated mlecule cnsists ftw cnstant Ig Iike dmains and ne variable Ig-like dmain and it is anchred t the membrane via its glycsylphsphatidylinsitl (CPI). Within the hematpietic system, CDGGc expressin is limited lo granulcytes and its precursrs [3,GJ, where it serves hmtypic and hetertypic adhesin [7J, Ca2+ mediated signaling [8J and is markedly upregulated frm intracellular stres after activatin {9J. It is als fund in epithelia fvarius rgans 17J. Upregulatin fcdggc is an early mlecular evenl in lransfrmatin leading t clrectal tumrs [lol. II was als cnfirmed t inhibit anikis (appttic respnse induced in nrmal cells by inadequate ar inapprpriate ad hes in t substrate) in the in vitr mdel f carcinma f cln [ll] and specific silencing f this gene led t decreased metastatic ptential in pancreatic adencarcinma [12]. Surprisingly, Sugita et al [13J reprted intracellular presence fcdg6c in allleukemic celllines examined, regardless f surface presence r absence, with a different antigen distributin in cytplasm that determined surface expressin. They speculated that presence f an undisc10sed transprter wuld target this mlecule t granules and fr surface expressin, whereas surface CDGGc"eg cell lines lack this transprter. This intriguing hypthesis prmpted us t test whether transcriptin f CEACAMG gene and/r intracellular CDGGc expressin is always fllwed by surface expressin. llniqueness f aberrant expressin f CDGGc n malignant lymphblast is explited fr diagnsis f ALL and fllw-up f a minimal residua I disease (MRD) using f10w cytmetry [14,15]. T use a marker fr a MRD assessment a critical questin must be addressed, whether the aberrant expressin is a stable prperty f the malignant clne r whether it can be subject t immunphentype shift. ln the present study we set ut t address the frequency f CDGGc mlecule expressin in childhd ALL, the regulatin fcdggc expressin frm gene transcriptin t cytplasmic and surface expressin, and we fllw immunphentype stability frm diagnsis t relapse. We als discuss relevance f CDGGc fr prgnsis predictin. Methds Ptients The chrt f all Czech children (<18 years) diagnsed with B-precursr ALL investigated in ur reference labratry frm t was used fr current study (n = 381). lnfrmed cnsent was btained frm patients and/r their guardians. The presence f TEL/ AMU, BCR/ ABL and MLL/ AF4 fusin genes was detected by tw-rund nested PCR, hyperdiplidy was assessed using DNA index f10w cytmetric measurement as described previusly [4]. Patients' gentype and crrespnding surface CDGGc expressin is shwn in Figure 1 (gentype available in 98% f patients). Fr intracellular staining and FACS srting, nly samples with enugh material were selected. Celllines Surface CDGGc negative cell lines with typical translcatin fund in childhd ALL: TEL/AMUps (REH) was kindly prvided by R. Pieters (University Hspital Rtterdam), MLL/AF4 ps (RS4;1l) translcatin and with n fusin (NALM-G) were btained frm Cerman Cell Line cllectin (DSMZ, Braunschweig, Cermany) Flw Cytmetry Flw cytmetry immunphentyping f bne marrw (BM) aspirates was perfrmed in at diagnsis and at relapse. Rutine immunphentypic c1assificatin using panel f mnclnal antibdies (mabs) was perfrmed as described previusly [4]. Brief1y, BM samples were stained with 2-, 3- and 4-clr cmbinatins f mabs fr 15 min in darkness, erythrcytes were Iysed with NII 4 CIcntaining Iysing slutin fr 15 min, washed and data were acquired using single FACS Calibur instrument thrughut the study (BD Bisciences, San Jse, CA, USA) f10w cytmeter. Anti-CDGGc (CEACAMG) mab used in all diagnstic and relapse measurements in this study was clne KOR-SA3s44 directly labeled t FITC (lmmuntech, Marseille, France). Intracellular staining was perfrmed using Fix & Perm kit (Caltag, Burlingame, CA, Page 2 f 11 (page number n/ fr ci/a/in purpses)

91 E. Mejstříkvá, strana 89 BMC Cancer2005, 538 hltp// CD66c% I 60 8 = BO tg' 40 <9 ", '*' 0O@O dp cep fl I * TEUAML1 BCRJABL Other Hyperdiplid MLUAF4 I Man Figure I Crrelatin f ALL gentype categries and percentage f CD66c psitivity. Median percentage f CD66cPS blasts is listed belw each gentype grup. Data f cnsecutive unselected patients with BCP ALL (n = 373) are shwn. USA) accrding t manufacturer's prtcl. Acquired data was analyzed with Cell Qucst (BO Bisciences) r Flw J (Tree Star, Ashland, OR, USA) sftware, Iymphblast gate was drawn based n ptical scatter and C019PS blast ppulatin was selected fr further analysis. Value f 20% was chsen as a threshld f psitivity as recmmended by ECII Fr rbust prgnstic significance testing, ther threshld values were als tested as indicated in results. Crss-blcking f CD66c mabs Bne marrw samples f C066c pslllve blasts were stained with anti-c066c mab clne 9A6 (Cenvac, Freiburg, Germany) mab fr 15 min, erythrcytes were Iysed with NHCI-cntaining Iysing slutin fr 15 min, washed and sample was incubated with anti-c066c mab KOR-SA3544 PE mab cnjugate. Western bit Samples cntaining 5 x log cells were Iysed fr 30 min at 4 Cin Iysis buffer cntaining 20 mm Tris-HCI (ph 8.2), 100 mm NaCI, 50 mm NaF, 10 mm EOTA, 10 mm pyrphsphate (Na 4 P ) and Cmplete Mini EOTA-Free (prtease inhibitr ccktail tablets, Rche Oiagnstics, Mannheim, Cermany). Oebris was sedimented by centrifugatin fr 3 min at rpm, O c. Supernatants were mixed with 100!ll 2x Laemmli's SOS-plyacrylamide gel electrphresis (PACE) sample lading buffer, and heated fr 5 min at C. Prteins were fractinated by SOS-PACE n 12.5% gels and electrphretically transferred t PVOF membranes (Bi-Rad, Hercules, CA, USA). Membranes were blcked fr 1 h in ['BS (ph 7.4) cntaining 0.5% Tween-20 and 5% nnfat dried milk. Blts were then incubated fr 1 h at rm temperature with anti KOR-SA3544 (Immuntech, Marseille, France) r antibeta-actin (Sigma-Aldrich, Saint Luis, MO, USA) mabs and then develped using gat anti-muse IgC (H+L) HRP cnjugate (Bi-Rad). Immunreactive material was then revealed by enhanced chemiluminescence (ECL, Amersham, Little ChaJfnt Buckinghamshire, UK) accrd ing t the manufacturer's instructins. Islatin f RNA and Real-Time Quantitative PCR analysis (RQ-PCR) Fr RQ- PCR analysis, leukemic blasts were FACS sned using srting ptin n FACS Calibur r n FACS Aria instrument (1.1 x x los cells frm ne patient). Islatin f RNA frm FACS-srted cells was perfrmed using Trizl-reagent (Cibc BRL, Carlsbad, CA, USA) accrding t manufacturer's instructins Cmplementary DNA was prepared using M-MLV Reverse Transcriptase (Cibc) accrding t manufacturer instructins. Clycgen (Cibc) 250!lg /ml was added when initial cell number was lwerthan 10 5 Quality f cona was verified by PCR n beta-2-micrglbulin (B2M) husekeeping gene. RQ-PCR was perfrmed in the LightCyclerT>' rapid thermal cycler system (Rche Oiagnstic CmbH, Mannheim, Cermany), accrding t manufacturer's instructins, using SYBR green intercalating dye. CEACAM6 specific primers 3'-CCCCITICTACCACCTCTAA and 5'-CCATCTCCCCT CCAACCA designed by Baranv [181 were used fr CEACAM6 amplificatin and B2M specific primers 3' CATCCTCCITACATCTCTCC 5'-CCACCAGACAAT CCAAACTC [19Jwere used fr ttal cona quantificatin. PCR amplificatin was carried ut in 1 x reactin buffer (20 mmljl Tris-HCI, ph 8.4; 50 mml/l KCI); and 2.0 mml MgC1 2 cntaining 200!lmljL f each dntp, 0.2!lml/ L f each primer, 5!lg bvine serum albumin per reactin, and 1 U f Platinum Taq DNA plymerase (all frm Cibc) in a final reactin vlume f 20!lL. Fr each PCR reactin, 2!lL f cona template and 2!ll f SYBR Creen 5 x (FMC BiPrducts, Rckland, MA, USA) flurescent dye was included. The cyding cnditins were 2.0 minutes at 95 C fllwed by 45 cycles f Page 3 f 11 (page number nt fr citafin purpses)

92 E. Mejstříkvá, strana 90 BMC Cancer 2005, /5/38 Table I: Frequency f CD66c and myelid antigen expressin. Cases with >20% blasts are regarded psitive, cexpressin f CD66c and ther MyAg is tested by Fisher's exact test. Mlecule N f ca ses (ttal = 365) Prprtin [%] Cexpressin with CD66c CD66c CD CDI CDI CD CD66c and CD CD66c and CD CD66c and CD CD66c and CD mutuallyexclusive randm mutually exclusive mutually exclusive p = NS P < p = denaturatin at 94 C fr 5 secnds, anneal ing at 59 C fr 30 secnds, and extensin at n c fr 15 secnds. CEACAM6 and B2M gene were amplified separately frm the same cdna, and al! experiments were perfrmed in duplicale. Melting curve analysis was perfrmed after each run; in case f peak melting lemperature shift, PCR prd UCLS were verified n agarse gel electrphresis. Nrmalized CEACAM6 Expressin (CEACAM6n) Amplificatin and calibralin curves were generaled by using affi liated sftware (LightCycler 3 data-analysis sftware; versin ; Idah Technlgy Inc., Sall Lake City, UT, USA). A calibratin curve fr the B2M and CEACAM6 husekeeping gene was generated using the series f lox diluted cdna frm peripheral bld granulcytes as a standard fr bth reactins. Crssing pint (Cp) value was calculated with LightCycler 3 sftware using secnd derivative maximum methd. CEACAM6n value is relative and represents a rati f CEACAM6 t B2M (CEACAM6n = CEACAM6/ B2M). Standard cdna frm granulcytes was assigned CEACAt\16n value f 1, lhe same aliqut f granulcytes cdna was used thrughut f study. Statistics Statistical evaluatin was d ne with Statview sftware, (SAS Institute Inc, Ne. USA). We used Fisher's exact test, regressin cefficient, Mann-Whitney test and Lgrank (Mantel-Cx) test as described in text. Results Frequency f CD66c and mye/id antigen (MyAg) expressin We selected 365 patienťs samples btained at diagnsis f B-precursr ALL with available infrmatin n the ex:pressin f MyAg CDl3, CDI5, CD33, CD6S and CD66c. This subchrt represents 96% f al! B-precursr ALL diagnsed in the study perid. The CD66c mlecule was expressed n 43% cases (Table 1, cases with >20% psitive blasts were cnsidered psitive). Fr the fractin f psitive cells and crrelatin with gentype see [S], f nte, 29% f patients expressed CD66c n mre then 50% blasts. Cmparisn with ther MyAg shwed thal CD66c is mre frequently expressed. Cexpressin f CD66c with ther MyAg was nt a usual finding (Table 1, Figure 2). Expressin fcd13, CD33 and CD6S tended t be nn-randm (mutualiy exclusive) with CD66c (Table 1). Cexpressin f CD66c with any 2 f the ther MyAg was fund in fewer than 4 cases in each cmbinatin. Interestingly, mutual relatinship f ther MyAg was randm, with the exceptin f CD 13 and CD33 cexpressin (p < ) and CDlS and CD6S cexpressin (p = ). The analysis was perfrmed als at different culffvalues (10, 30 and 50 %; data nt shwn). The same r less significant crrelatins were als bserved at different cutffvalues. Crss-blcking f KOR-SA3544 c/ne with 9A6 c/ne The mab clne KOR-SA3S44 was nt included in Human Leukcyte Differentiatin Antigens wrkshp, but was characterized by Sugita et al [13]. T prevent ambiguus interpretatin f ur data we extended characterizatin f KOR-SA3S44 clne f CD66c mab by blcking experiments n CD66c PS blasts. Pretreatment f cells with wrkshp-typed clne 9A6 mab cmpletely blcked binding f KOR-SA3S 44 clne in all 9 leukemie specimens and in granulcytes (data nt shwn). Cytplasmic presence f CD66c in ALL blasts We have studied surface and cytplasmic expressin f CD66c in 20 ALL diagnstic samples by flw cylometry. In cntrast t findings f Sugita et al 113], we have detected CD66c exclusively in all 8 surface psitive cases. Nne f the 12 surface negative cases stained in cytplasm Page 4 f 11 (page number nt fr citatin purpses)

93 E. Mejstříkvá, strana 91 BMC Cancer 2005,538 httpl/ 100 Vl a. u 80 <!) <!) t:l U 60 u. 40 Cll a. S 20 >. u 'O?1- O...,... r-- O O % f surface CD66c PS Figure 2 Graphical iiiustratin f myelid antigen psitivity in childhd B-precursr ALL. Fr each antigen, psitive cases are represented by a clred frm The areas f the frms rughly crrespnd t the frequency f psitive cases (bserved numbers f patients are marked in red) while the shapes are cnstructed t illustrate the respective cexpressins. An arbitrary cutff value f 20% is used fr all antigens. The CD66c psitivity crrelates with negativity f any f the fllwing: CD33 (p = 0.002), CD 13 (p < ) and CD65 (p = 0.029). There was a signifícant crrelatin between CD33 and CD 13 psitivity (p < I) and between CD 15 and CD65 psitivity (p = ) whereas the psitivity f n ther tw antigens f the nes shwn crrelated signifícantly with each ther. Ttal number f B-precursr cases illustrated is 365. (Figure 3). The prbable cause f the ppsite finding in several cases (lwer percentage after permeabilizatin than n surface) is a higher backgrund after permeabilizatin (istypic cntrl mean flurescence intensity was 4.3 ± 2.0 and 9.7 ± 3.7 fr surface and permeabilized staining, respectively), which cvers brderline events. Transcriptin f CEACAM6 gene T extend the abve findings, we used Real-Time Quantitative Reverse Transcriptin-PCR (RQ-RT-PCR) t quantitatively assess presence f specific CEACAM6 mrna. We FACS-srted CD 19psCD66c'leg r CD 19psCD66cPS blast cells fr RQ-RT-PCR analysis. We didn't find significant amunt f CEACAM6 transcript in surface CD66c"eslymphblasts, whereas CD66cPOS cells cntained CEACAM6. When CD66c''''S and psitive fractin was 'Figure 3 'Relatinship f surface and cytplasmic expressin f CD66c. Percentage f surface expressin f CD66c in ALL blasts is pltted against cytplasmic expressin (after cell membrane permeabilizatin). Samples f 20 patients at ALL diagnsis are shwn, 12 CD66c negative and 8 CD66c psitive. Regressin ceffjcient R2 = FACS-srted f hetergeneus specimens (lymphblasts partly psitive fr CD66c) the level f CEACAA16 was bserved higher in CD66c" e g cells and lwer in CD66cPs cells as cmpared t unifrm ppulatins (Figure 4). In ne specimen (ALL patient with Dwn syndrme), CEACAM6 wasn't increased in CD66c PS fractin. Western bit We further questin the intracellular CD66c psitivity in surface CD66c negative cell lines. We perfrmed Western bit as described by Sugita et a!. [13 J n REH (TEL/ AMUPs ) and RS4;11 (MLL/ AF4ps) celllines and fund n CD66c prteín (Fígure 5). Furthermre we fund NALM-6 (surface CD66c neg, n translcatín) cell line negative. Tw BCR/ ABL and fur hyperdiplid (ah surface CD66cPs ) diagnstic samples used as psitive cntrls were psitive, with the similar1y narrw band cntrasting t brad band detected in granulcytes (Fígure 5), suggesting different glycsylatin in keeping with reprt by Sugita. Stability f surface expressin frm diagnsis t relapse All relapsed patients up tij1 12/ 2003 with available infrmatin n CD66c expressin at diagnsis and at relapse were used t assess stability f CD66c expressin. Cmparisn f CD66c expressin in 39 cases f relapsed childhd ALL cases t theír ímmunphentype at díagnsis Page 5 f 11 (page number nt fr citatin purpses)

94 E. Mejstříkvá, strana 92 BMC Cancer 2005, lo- lo- 10- CD66c-neg CDe-g CD6Se-ps CD86C-pOS ' ' 10' CD66c neg CD66cneg frm hetergenus :: 100 U a.. c 1<.0 J :: «IDU.E «1 J-W mu ID :: 0,1 p P Figure 4 Transcriptin f CEACAM6 versus surlace CD66c expressin n srted cells. FACSsrted CD66c surface negative (CD66c neg ) r psitive (CD66c Ps ) ALL Iymphblasts, five patients with hetergeneus CD66c expressin were srted int bth CD66c negative and CD66c psitive fractin (lines cnnect srted fractins frm the same specimen). Mann-Whitney test was used t cmpare grups (n = 32). CEACAM6n value is nrmalized t beta-2-micrglbulin (see Methds). Page 6 f 11 (page number nt fr citatin purpses)

95 E. Mejstříkv á, strana 93 BMC Cancer 2005, 5:38 httpl/ 127 ko - fl) (/J Q) Q) "O "O "O "O '0 : '0 '0...J...J aj aj Ci Cl. Ci Ci '9 'E i5 :..- "5 " 'E..- :E c c! 8. ::I: -:r...j CD66c c... U O >. >. >. >. Cl Ol aj c UJ a::: Cf) a::: <: z (3-actin Figure 5 Western bit f granulcytes, ALL samples f CD66c psitive cases and surface CD66c ne g cell lines with TEUAMLI ps (REH), MLUAF4ps (RS4; 11) translcatin and with n fusin (NALM-6), Q) (/J 100 O 00 O O 80 O g.60 O Q) :: Ví O O 00 O O Diagnsis Figure 6 Stability ( CD66c (rm diagnsis t relapse. Each circle represents ne patient (n = 39). Percentage f CD66cPS blasts at diagnsis is pltted against percentage f CD66cPS blasts at relapse. Regressin line with 95% cnfidence R2 = O revea led that bth negativity and psitivity f this antigen was retained frm diagnsis t relapse (Figure 6; median time t relapse 2.5y min 0.3y, max 5.3y). Althugh the quantitative levels f CD66c expressin differed in sme patients (median difference 0.0%, standard deviatin 21 %), n case f CD66c cmplete lss r gain was fund in ur chrt. Prgnstic significance f CD66c expressin Only B-p recu rsr ALL patients treated n the same ALL BFM 95 treatment prtcl [20] (n = 254) were evaluated fr prgnstic impact. The prgnsis did nt differ fr cases with either CD66cPOS blasts exceeding either 20% (Figure 7) r any ther cutff value tested (5%, 10% and 50%, d ata nt shwn). Next, we asked whether CD66c expressin crrelated with the risk factrs used in ALL BFM-95 prtcl fr stratiflcatin int risk grups 12l J. N difference in relapse free survival (RFS) was nted when analyzed separately fr each risk grup r higher and lwer initial leukcytsis (cutffvalue: 2 x 10 4 cells per ml), age grup r respnse t prednisne (grups as in Table 2). When analyzed with respect t a gentype, we fund n prgnstic va lue f CD66c in any defined grup (BeRl ABlYs, TEL/ AMLlPs, hyperdiplid ALL and n ne f the abve-mentined genetic changes, Figure 7 and Table 2). Page 7 f 11 (p age number n/ fr ci/a/in purpses)

96 E. Mejstříkvá, strana 94 BMC Cancer 2005, /5/38 1,0 0,8 0,6 '. 1,0 0,8 0, ,4 0,2 0,0 Relapse fr.. survlval OVERAll p=o,77 C068c psltive n=109 CD66c negatíve n=145 0,4 0,2 0,0 Relapse free survival TEUAML1 p=0.95 CD66c psitive n=2 CD66c negative n= Time (years) 7 O Time (years) ,0 + + ' 0,8 0,6, ". "'.. '_'fl 1,0 0,8 0,6 0,4 Relapse free survival 0,2 0,0 Hyperdiplid p=0.35 CD66c psitive n=55 CD66c negative n= Time (years) Figure 7 Relapse free survival f cases with CD66c ps (blue line) r CD66c neg (red line) B-precursr ALL. Unselected cnsecutive patients treated n ALL BFM95 prtcl (median fllw up 3.64 years). Since surface CD66c assciates with gentype, separate analyses fr distinct gentype subgrups are shwn. 0,4 0,2 0,0 Relapse free survival n (TEL/AML1. BCRlABL. MLUAF4 r hyperdiplidy) p=o.15 CD66c psitive n=45 CD66c negative n= Time (years) ln cntrast t the study by I-Ianenberg et al [221, there was n crrelatin between initial leukcytsis and CD66c in ur chrt (Table 2). Discussin aur data n childhd B-precursr ALL shw that CD66c is mre frequently expressed than the myelid antigens included in the standard immunphentyping panels fr ALL. T ur knwledge, CD66c is the mst frequent myelid marker in childhd ALt. This, tgether with the tight crrelatins between CD66c and gentype [5], makes CD66c a perlinent bject f research n aberrant expressin regulatin. ln line with the data frm Sugita, we cnfirm the specificity fkor-sa3s44 clne mab fr CD66c by CEACAM6 mrna detectin and by crss-blcking f KOR-SA3S44 binding by representative 9A6 clne, that suggests a spatial prximity f the tw epitpes recgnized. Furthermre we shw that all CD66c PS ALL specimens shw a similar extent f glycsylatin as cell lines analyzed by Sugita, which differs frm the extent f glycsylatin in granulcytes. Since there is a strng crrelatin f ALL gentype and CD66c expressin, we hypthesized lhat surface CD66c expressin wuld be cntrlled by gene transcriptin rather than by targeting t surface frm intracellular stres as prpsed by Sugita [13J. In accrdance with this, bth intracellular staining and Western hlt failed t identify cytplasmic CD66c prtein in any surface CD66c,1ťg cells. Dwn the same line, n CEACM16 transcript was page 8 f 11 (page number n/ fr ci/a/in purpses)

97 E. Mejstříkvá, strana 95 BMC Cancer 2005, 5:38 Table 2: Crrelatin between risk factrs and CD66c expressin. The distributin f CD66cPS and CD66c ne g cases (cutff 20%) is shwn. In additin, n difference was bserved in the RFS f the risk-defined subsets based n the CD66c expressin (Ig-nnk test p value> 0.05 in all analyses). Only patients treated by a single ALL BFM-95 prtcl are shwn here (n = 254). CD66cPS cases CD66c ne g cases p.value (chi square) AII patients N/A Prednisne pr respnder Prednisne gd respnder n.s. Initial leukcytsis = > 20 x 109/L Initialleukcytsis < 20 x 109/L n,s. TEUAMLI BCRlABL MLUAF4 Hyperdiplid Other gentype (nt TEUAMLI, BCRlABL, MLUAF4 r hyperdiplidy) 2 7 O P < Age I-S Age > n,s. Standard risk grup Intermediate risk grup High risk grup n.s. detected in surface CD66c ne g lymphblasts. Overall ur data suggest that transcriptin is the checkpint that leads t surface expressin, rather then the frmer mdel, which prpsed that all malignant lymphblasts generate the CD66c mlecule but nly sme f them target it fr the ce ll membrane. lnterestingly, imprtance f this mlecule was shwn in a mdel f clrectal carcinma where transfectin with CEACAM6 inhibited anikis (l0), high CEACAM6 predicted high risk patients with resectable clrectal cancer (9) and CEACAM6 gene silencing decreased resistance t anikis in vitr leading t inhibitin f metas tatic ability in muse mdel (ll). Althugh the functin f CEACAM6 in ALL blasts is stili unknwn, this mlecule's functin has been recently assciated with pathgenesis f ther types f cancer in man [10-12,23,24]. Study f anti-ceacam6 immuntxin-based therapy in muse mdel f pancreatic carcinma was published (ecently [25]. 50 far, prgnstic significance f expressin f myelid antigens CDl3, CDI4. CD33, CD65w, COl lb and CD15 has been studied with cnflicting results (summarized in [26]). As determined in ur large chrt f patients treated n ALL BFM 95 prtc!, n prgnstic significance f CD66c culd be revealed in genera!, nr when we analyzed separate risk grups r TEL/ AMLl pos, BCRj ABL- ps, hyperdiplid and ther B-precursr ALL cases separately. Furthermre, instability f aberrant expressin was reprted fr mst myel id markers (CDl3, CD14, CD15, CD33 and CD65). Stabil ity f expressin is a majr cncem f flw cytmetric studies f MRD. In present, use f multiple CD markers is widely recmmended t prevent MRD underestimatin due t the immunphentype shift (discussed in [15,27J). In current study we shw fr the first time that CD66c expressin stays quajitatively stable frm diagnsis t relapse in all relapsed cases studied. This finding, tgether with high frequency f CD66cPS cases, supprts inclusin f CD66c int a mabs panels fr MRD detectin in patients psitive fr this CD marker at diagnsis. Hwever, anecdtal dwnregulatin fcd66c expressin during chemtherapy has been bserved [15 J, but has nt been methdically studied yel Any temprary dwnregulatin might lead t falsely lwer values f MRD measurement - thus, it wuld be wrthwhile t disclse whether this phenmenn ccurs (egularly at certain pint.s f chemtherapy. Mutual excl usiveness f MyAg expressin as wel! as differmt stability f CD66c cmpared t ther MyAgs [28J challenges the general practice f prgnstic evaluatin f MyAgps ALL cases as a grup [26] and favrs individual Page 9 f 11 (page number nt fr citatin purpses)

98 E. Mejstříkvá, strana 96 BMC Cancer2005, 538 http// evaluatin f cntributinjregulatin f each MyAg fr blast cell. Cnclusin CDGGc presents sme f the tightest assciatins wilh ALL gentype. Althugh ur findings indicate that CDGGc is unlikely t gain a practical imprtance as a prgnsis predictr, there are several reasns t fcus n it in diagnstic and MRD studies. CDGGc, apparently the mst frequently expressed aberrant antigen in childhd ALL, is very useful in discriminating leukemic blasts frm nnmalignant cells. Aberrant ex:pressin remains a puzzling phenmenn that warrants further investigatin. If it is cnfirmed by techniques sensitive enugh that the s called "aberrant markers" are truly nt expressed n any subtle ppulatin f lymphid precursrs, there will be an pprtunity t find new targets fr specific ALL therapy (e.g. mnclnal antibdics against differently glycsylated frm f CD66c) thal will spare the nnleukemic precursrs, lhus reducing the treatment txicity. Cmpeting interests The authr(s) declare that they have n cmpeting interesls. Auth rs' c ntributins TK perfrmed flw cytmetry, cell srting, RQ-RT-PCR study and drafted the manuscript, MV carried ut the Western bit study, EM acquired and analyzed patients flw cytmetry data and perfrmed the statistical analysis, JM designed and assisted t the RQ-RT-PCR study, JT designed RT-PCR, did the gentype detectin and critically discussed the manuscript, JS cntributed t the study design and rganizatin and OH cnceived f the study, analyzed data and drafted the manuscript. All authrs read and apprved the final manuscript. Acknwledgements This wrk was supprted by the Grant Agency f Charles University #44/ 2001 and #65/2004, IGA # and MSM Superb technical assistance f j. Ridskva, K. Pspisilva, L. Gndrcinva, P. Hanusva, K. Muzikva and M. Kalinva as well as the cllabratin f all Czech Pediatrie Hematlgy (CPH) centers (data manager A. Vrulva, leaders: B. Blazek (Ostrava), Z. Cerna (Plzen), Y. jabali (Ceske Budejvice), V. Mihal (Olmuc), D. Prchazkva (Usti nad Labem), j. Scary (Praha), j. Sterba (Brn), j. Hak and K. Tusvska (Hradec Kralve)) is highly appreciated. V. Hrejsi is acknwledged fr cnsulting in mlecular immunlgy. We th.nk t F. Grunert fr prviding us with a sample f 9A6 clne f CD66c. References Markert CL: Neplasia: a disease f cell differentiatin, Cncer Res 1968, 28: Greaves MF: Differentiatin-linked leukemgenesis in Iymphcytes, Science 1986, 234: Mri T, Sugita K, Suzuki T, Okazaki T, Manabe A, Hsya R, Mizut.ni S, Kinshica A, Nakazawa S: A nvel mnclnal antibdy, KOR SA3544 which reacts t Philadelphia chrmsme-psitive acute Iymphblastic leukemia cell s with high sensitivity, Leukemi 1995,9: Hrusak O, Trkaj, Zunaj, Huskvaj, Bartunkvaj, Stary j: Aberrant expressin f KOR-SA3544 antigen in childhd acute Iymphblastic leukemia predicts TEL-AMLt negativity. The Pediatrie Hematlgy Wrking Grup in the Czech Republic. Leukemi 1998, t 2: Hrusak O, Prwit-MacDnald A: Antigen expressin patterns rellecting gentype f acute leukemias. Leukemi 2002, 16: Bccuni p, Di Nt R, L Pard C, Villa MR, Ferrara F, Rtli B, Dei Vecchi L: CD66c antigen expressin is myelid restricted in nrmal bne marrw but is a cmmn feature f CD'IO+ early-b-cell malignancies. Tissue Antigens 1998, 52: Kishimt T, Kikucani H, vn dem Brne AEGK, Gyert SM, Masn OY, Miyasaka M, Mretca L, Okumura K, Shaw S, Springer TA, Sugamura K, Zla H: Leukcyte Typing VI. New Yrk, Lndn, Garland Publishing Inc: 1997: Klein ML, McGhee SA, Baranian j, Stevens L, Herca SA: Rle f nnspecific crss-reacting antigen, a CD66 cluster antigen, in activatin f human granulcytes. In(eC[ Immun 1996, 64: Skubitz KM, Campbell KD, Skubitz AP: CD66a, CD66b, CD66c, and CD66d each independently stimulate neutrphils. ) Leuke Bil 1996, 60: I janescheff P, Terraccian L, Lwy A. Glatz-Krieger K, Grunert F, Micheel B, Brummer j, Laffer U, Metzger U, Herrmann R, Rchlin C: Expressin f CEACAM6 in resectable clrectal cancer: a factr f independent prgnstic significance.) Clin Onc/2003, 21 : II. Ordnez C, Screatn RA, liamzis C, Stanners CP: Human carcinembrynic antigen functins as a general inhibitr f anikis. Cancer Res 2000, 60: Ouxbury MS, lt H, Zinner MJ, Ashley SW, Whang EE: CEACAM6 gene silencing impairs anikis resistance and in viv meta static ability f pancreatic adencarcinma cells. Onegene 2004,23: Sugita K, Mri T, Ykta S, Kurki M, Kyama TO, Inukai T, lijima K, Gi K, Tezuka T, Kjika S, Shiraishi K, Nakamura M, Miyamt N, Karakida N, Kagami K, Nakazawa S: The :KOR SA3S44 antigen predminantly expressed n the surlace f Philadelphia chrmsme psitive acute Iymphblastic leukemia cells is nnspecific crss-reacting antigen.50/90 (CD66c) and invariably expressed in cytplasm f human leukemia cells. Leukem;a 1999, 13: Campana O, Cuscan-Smith E: Detectin f minima' residua' dis ease in acute leukemia by Ilw cytmetry, Cytmetry 1999, 38: Cam pana O, Custan-Smith E: Advances in the immunlgical mnitring f childhd acute Iymphblastic leukaemia. Sest Pract Res Clin Hemtl 002, 15: Bene MC, Castldi G, Knapp W, Ludwig WO, Matutes E, Orb A van't Veer MB: Prpsals fr the immunlgical classificatin f acute leukemias. Eurpean Grup fr the 'mmunlgical Characterizatin f Leukemias (EG ll). Leukemi 1995, 9: Chmczynski p, Sacchi N: Single.step methd f RNA islatin by acid guanidinium thicyanate-phenl-chlrfrm extractin, Anal Biehem 1987, 1.62: Baranv V, Yeung MM, Hammarstrm S: Expressin f carci nembrynic antigen and nnspecific crss.reacting 50-kDa antigen in human nrmal and cancerou5 cln mucsa..: cmparative ultrastructural study with mnclnal antibdies. Cncer Res 19'14, 54: Madz j, Zuna j, Muzikva K, Kalinva M, Krejci O, Hrusak O, Otva B, Stary j, T rka j: Slwer mlecular respnse t treatment predicts pr utcme in patients with TEUAMLI psitive acute Iymphblastic leukemia: prspective real time quantitative reverse transcriptase.plymerase chain reactin study. Cncer 2003, 97: I J. 20. Muller Hj, Beier R, t ning L, :Bluners-Sawanki R, Orffel W, Maass E, Muller Weihrich S, Scheel-Walter HG, Scherer F, St.hnke K, Schrappe M, Hrn A Lumkemann K, Bs j: Pharmackinetics f native Escherichia cli asparaginase (Asparaginase medac) and hypersensitivity reactins in ALL-BFM 95 reinductin treatment. Br) Hemtl 200 I, 114: Owrzak MN, Frschl G, Primz D, Mann G, Peschger U, Muhlegger N, Friesch G, Gadner H: Prgnstlc significance and mdalities Page 10 f 11 (page number nt fr cilahn purpses)

99 E. Mejstříkvá, strana 97 BMC Cancer 2005, 5:38 http{/ f flw cytmetric minimal residual disease detectin in childhd acute Iymphblastic leukemia. Bld 2002, 99: Hanenberg H, Baumann M, Quentin I. Nagel G. Grsse-Wilde H, vn Kleist S, Gbel U. Burdach S. Grunert F: Expressin f the CEA gene family members NCA-50/90 and NCA-160 (CD66) in childhd acute Iymphblastic le u kemias (ALLs) and ln cell lines f B-cell rigin. Leukemi 1994, 8: Schlzel S. Zimmermann W, Schwarzkpf G. Grunert F, Rgaczewski B, Th mpsn j: Carcinembrynic Antigen Family Members CEACAM6 and CEACAM7 Are Differentially Expressed in N rmal Tissues and Oppsitely Deregulated in Hyperplastic Clrectal P ly ps and Early Adenmas. Am j Pthl 2000, 156: Duxbury MS, It H, Benit E. Zinner Mj, Ashley SW. Whang EE: Overexpressin f CEACAM6 prmtes insulin-like grwth factr I-induced pancreatic adencarcinma cellular invasiveness. Oncgene 2004, 23: Duxbury MS. It H. Ashley SW, Whang EE: CEACAM6 as a nvel target fr indirect type I immuntxin-based therapy in pancreatic adencarcinma. Bichem Biphys Res (mmun : Putti MC. Rndelli R. Ccit MG. Aric M. Sainati L. Cnter V, Guglielmi C, Cantu-Rajnldi A, Cnslini R, Pessin A, Zanesc L. Masera G, Bindi A, Bass G: Expressin f Myelid Markers Lacks Prgnstic Impact in Children Treated fr Acute Lymphblastic Leukemia: Italian Experience in AIEOP-ALL Studies. Bld : I. 27. San Miguel jf, Ciudad j. Vidriales MB, Orfa A. Luci P. Prwit-Mac Dnald A. Gaipa G, van Wering E. van Dngen]J: Immunphentypical detectin f minimal residual disease in acute leukemia. (rit Rev Oncl Hem!Ol 1999, 32: Mejstrikva E, Kalina T, Trka j, Stary j, Hrusak O : Crrelatin f CD]] w ith prer prgnsis in childhd ALL implicates a ptent ial f anti-cd]] frntline thera py. Leukemi in press:. Pre-publicatín histry The pre- publicatin hislry fr lhis paper can be accessed here: bttp-l!www bjqmedce!ra! cm/ q7/5138/prepllb Publishwith BiMedCentral andevery scientist can read yur wrk free f charge "BiMed Central will be the mst significant develpment fr disseminating the results f bimedical research in ur lifetime. " Sir Paul Nurse, Cancer Research UK Yur research papers will be: available free f charge t the entire bimedical cmmunity peer reviewed and publishedimmediately upn acceptance cited in PubMed and archived n PubMed Centra I yurs - yu keep the cpyright I Submil yur manuscrlpl here: O BiMedcentra! adv.asp Page 11 af 11 (page number nt fr citatin purpses)

100 E. Mejstříkvá, strana 98 Př ílha 4 Residual disease mnitring in childhd acute myelid leukemia by multiparameter tlw cytmetry: the MRD-AML-BFM study grup Claudia Langebrake, Ursula Creutzig, Michael Dwrzak, Ondrej Hrusak, Ester Mejstrikva, Frank Griesinger, Martin Zimmermann, and Dirk Reinhardt Jurnal fclinical Onclgy (ff 13,598)

101 E. Mejstříkvá, strana 99 VO L U M E 24 NUM B E R 22 A UGUST JOURNAL OF CLINICAL ONCOLOGY ORIGINAL REPORT Residual Disease Mnitring in Childhd Acute Myelid Leukemia by Multiparameter Flw Cytmetry: The MRD-AML-BFM Study Grup CIc/lidi" La/lKťbrake, UrSIII.l Creutzig, Michael DW/lTza'" Ondrej Hrusak, Ester Mejstrikra. Frn/lk Griť5Í11ger, MlllTill Ziml11enllllllll, tlnd Dirk Rcinhllrdt A B STR A C T -rs' dcsdsurs f plenlldl cn ess lepflnt HK1UftSIS t Cudra ake, PIlD. Dep,rtl11en1 l Padlf'rn3,nlgv dnd Onc;lgy, g-str3ss6 1. [) Hann..,er, lny, &-m3d. filnt!b",kf' _ cialjd Purpse M nitri ng f residual disease (RD) by flw cytmetry in childhd acute myelid leukemia (AMU may predict utcme Hwever, the ptimal time pi nts fr investigatin, the best antibdy cmbinat ins. and mst imprtantly, the clinica l impact f RD analysis remain unclear. Patients and Methds Five hundred frty-tw specimens l 150 chi ldren enrlled in the AML-Berlin-Frankfurt-Muenster (8FM) 98 study w ere analyzed by l ur-clr im munphentyping at up t lur predefined tlme pmts durmg treatmem, Fr each f the 12 leukemia-assciated immunphentypes and tlme pints, a threshld level based n a previus retrspectlve analysis f anther chrt f ch il dren w ith AML an d n cntrl bne marrws was determined. Results Rega rding all fur tlme pints, there is a statistically significant difference in the 3-year event-free survival (EF S) in thse children presenting with immunlgically detectable blasts at 3 r mre time pin ts. The levels at bne marrw puncture (B M P) 1 and BMP2 turned aut t have the mst signiflcant predictive value fr 3-year-EFS: 71 % ::':: 6% versus 48% ::':: 9%, P LOg.Rank and 70 % ::': 6 % versu s 50% ::': 7%, P LOQ Ran k =.033), resulting in a mre than tw-fld risk f relapse, ln a m ultiva nate ana lysis, using a cmbined risk classificatin based n mrphlgically determ ined blasts at BM P1 and BMP2, French-American-British classificatin, and cytgenetics, the influence f immunlgically determined RD w as n lnger statistically significant. Cnclusin RD mnitring befre secnd inductin has the same predictive value as examining levels at fur diherent time pints durlng intensive chemtherapy. Crnpared with cmmnly defined nsk factrs in the AML-BFM stules, flw cytmetry des nt prvide additinal infrmatin fr utcme predictin, but may be helpful t evaluate the remissin status at dav 28. J Clin Oncl 24: by American Sciety f Clinical Onclgy OOOgy,J.IIl3X1OOI S /JCO INTRODUCTION Minima! residua! disease (MRD) mnitring In childhd ;Ind adull acute myelid 1e1lkemiJ (AML) using flw cytmetry is still ullder discussin in terms f the prglltic impacr, tbe ptímal time pillťs fr,rn,j1ysis, and the best antibdy cmbina rins. AML blast cell s d nt express specific antigens lhal' culd snvť as single and unambiguus murkers fr RD in regeneratillg bne martow, Ir is thcrdim: necessary t carefully charjcterize cmbinatiulls f anrigells Ihat are "ble r sensitively (letecr residu;ú blasr cdls amng llrmal hematpietic ccus during treat.ment. Ant!Je\" bstacle fr MRD mnitring in AML is the insrability frhe b!ast cell antigen cxpressin partern. As previusly sbwn by us' and thers,2.'1 thl' vast majrity f AML cases underg J shift f antigen expressin pattem between diagnsis and eventual relapse, II is therefre indispensjble fr MRD evalualin t mnitr a wide range f leukemia-assciated imll1unphcn types (li\ip). Until nw. there are nly a few rcp0rls abut thc prgnstic relevancc f RD mnitring in pcdiatric S,6 and aduit 7 - III /\M L Thcseinvesligatills wen: based n different therapy reg-imens and hav.: emplyed divergent rechnical 'Ippraches in terms ť utilized latp, rime pinrs f Jn;llysis during thcrap)', and rhe psirivity thresh!js lised fr OutCOIllC predkt.in, The bjectivc f lhis st udl' was t determine t he fllwing assessment criterí;i ll' the i\ml-berlin Frankfult-l'v!uenstcr (I3FM ) tteatment strjtegy: lhe Infrmatin dwnladed frm and prvided by BIBLlOTHEK DER n July 31,2006 frm. Cpyright 2006 by the American Sciety f Clinical Onclgy. AII rights reserved.

102 E, Mejstříkvá, strana 100 Residual Disease Mnitring in Childhd AML (!1sitivity f specitic Li\IP b'i Sed lln '1 [et[spective :1l1alysis f chilťn wirh AML; thé' apprpriatcness f Rl) a: 'essment by lnultidiensinal Hw cytmetry fr utcme prcdictin in ch ildren with \M L; the mst predictive time pint cluring rher:1py; Jne! the ditinal valu t: f tlw ytmetric assays fr ut cme preclictin 1cumparisn t knwn risk ťactrs. Study Design Thc AML-BFM MIU)stlldyisclllp,ed irw phdses. Pha,c A includes eslablishment <Ind s[3nclmlizalin l a cnsel1sus panel fr fur-c lr nn llln()p hn typing, The fctls wa;; 10 dclinc thr ;;CI iťivity an I,peóficity f ťrťllt laip in nrma!,nd reg nc ra tin g bne marrw specimcns' l <Ind t &:lititi' dinically relevanl threshld-icvels fr <':leh LAIl' at dd ined time,inls lu'ing trejlmnl in d ľt' tm s p ctive apprch. Ph'lSC fl W;1.1 designcd w,'spcctively dpply thsc thr",hlds 10 cv'llll<llť thl' impacl íru mnitring tlutcllle prejietin, PlrSl' A. RctľO s p cc tiwl '. 65 chi ldľcn wilh dt' 110VO A.t'vIL (c ntijluoll' jupletl' rl,ntissi,)n: n = <Hl; relapse: n = 25) Jld cnrllcd in tl ll' AM I.-BFM 98 Jl' (Tahle I) dt a mcchan ťllw-uj' f 1.5 )'cars have b n studice! fr the " urrcn c f LAJ I' lil rl'gcncr.\ting bne rnarrw. PilI/St' H. Chi1dn'n enrucd in Ih AML-BFM 9R study and ciiagnsed >r Jc nvll A ll bctwccn J llu a r)' I. 2()(L and Iuly 31,21104 wcrc "Iigiblc fr prspcctivc cvaluiltiun. clujcd WlTé ehildrcll with acu le prmydcytie :ukcmia (AML French-AJIIl'riean Rrirish [fab ] MJ). witll t( 15;17)/P LL- Tabl. 1. Pal lem CharaClenstlcs al Diagnsis fr Bth Pal'1s l Ihs Study CharaclerlsllC al dl gn s s, year, Melan Rang eukcytes, IIp.L Medlan Range 'Mti marrw blasls, % Medlan an ge e< imalelfemalel M7 Other/nOl classifiable a'vlype Nrmal Invll6i liq23 -, grup (SR/HRI Phase A IretrspectIVel N. % (31 52/ 8 6 <I B /49 33/67 65 II PIKlse B (prspec Ivel N. 0/ , , Sn5 50/50 G / /68 AllrevlStins: FAB, French-Amencan-S"llsh; SR. stan ad nsk; HR. hlgh ns. 1hree chlldren presenterj w lh "" 20% tllasls al dlagn :s: ' chlldren 11 7% I1i 18%1 with M2 and 118:2 11 and ne chlld wlth M7 115% ln me smear. n marrw punch bpsy avrllablej ar. d m yelflbrsls 150.RARa and childrell,vítl\ Iris Oly 21 hec3usl' they cxhibit billlgically diffcrcnt ICtLkclllias Jml reccivc slightly ditfercnt chclllthcml'y. Altugcthcr. 542 samplcs frm 150 children (Tahle II \'\Iere "vailablc. This (hrl is rcprl's nf;ltive '''' cmprcd wil h the verajj stujy cucctive III terllls nf 3gC. sex, WBC, f'ab cla. sifica tin. and risk-gr0l1p allcatin. Frm these 150 childrcn. five childrcn "ilh cktectablc hlasl cclls hy tlw cytll\clry, hut an dntigen ea-pressin patrcm that IVas nt cclvcrcd by the LA]P.' used f r RD mnitring (CD33 / 7 /117 / 6. ed3j/56. CO?/3.' ) \'\Icre cxdllded. Thc standard risk gmup (SR) defulitin thal' is gcllcrall uscd fr slrati hcatin in the AML-BFM studic, colllpriscs FAB subtype' (MIIM2 + ucr rd.>. M3. M4c). favrahlc cytgcnelics, alld lllrphlgic li y dctcnnincd hne lll'litnw hlast.> ťless than 5'Y at day 15 (nt rl'quird lór FAB M3). Fr this a.ll<1lysis. the mrphlgic cvaluatin at cby 2 "flrcatmcnt «5% hlasl in bne lnilrrw) \VilS induded as dn additinal par'llnctcr fr tlll' SR grul' (herdn rcil:rrcd t as cxtcnded AML-RFM ri_,k). Thc datl' uf Ci!ch bne ln<ljhiw punclure WilS coľľdte'j t thc COlll'SCS ui intellsivc chellltherapy f the AML-BFM 98 sludy (Hg 1). Only SPCCilTll'llS that wrre 0hwined 3t lle fthe first tóur schcdukj timc pints (hne lll'lltow pu.lleturc IBMPjJ: day 15; BMP2: bdr" sccnd inductin; BMP3: beti>rc third thcmpy curse; BMP4: bcfre folllth tllcrapy (ursc) wcre indudcd in Ihc study ( Tbk 2). Bne marrw specimclls were brai nťd aťter inrnrmcd mnscnl ťmm each patient r eadl pal1 c nťs guardian. 1\11 chiljrcn wc r Irciltcd acwrding t thc GC riildll AlVIL-BFM YH study (S t tll.. Ireatlllcnt schcdubscc C rul2 ig ct ai Ll ). Al! illvl'stigatius pcrfrlllťd had bccll :tppnlved hy Ihc 10(,11 cthic.s cmmittccs und were in 'lccrd'lllce ",ith n,lssumncc hlcd \\ th Jnd apprvcd hy thl' Depdltmcnt f Health dnd HUITlJ.l\ Serviccs. Diagnsis Diagnsis anj cbssincatin werc stablishcd accrjing 10 tlll' critcl13 f thl' FAB IH " grup by thc refcrcn.:e IabratlY ni th AivlL-llFrvl studic's in Muenster a nd w,'re rl"\cwej by all ce'cpclt grup f indcpc'ndcnl' hcmat]gists. In addilin 10 thc Pappcn.heim stainru bne lililrr"w anj blud Slllcars th e f 1J0wilig cytehelllical stainillgs 'VlTC pcrf()ľlllcd: pcrid.ic "cid Schiťf. rtlydperxidasc. a1pha-iljphtyl-acetatc cstcrasc. "Ild aei" phsph"tasc. Tht' diagn(,ses llfmo and M7 sllbtypcs \Vcrc always colllíľl ncd by illlmunulgical mcthds. C}'1gcnetic and llllcculdrgellctic data IVcrenhtainl'd lnlllllhc rcfi.'ltllce labratry flhe AML-13FM stlld y (J. Harbrt, Gic.,scn. GmnaIlY) Multiparameter Flw Cytmetry Fm-clr Ilw cytmťti)'-a ccrdin g t thc COIlSCllSlIS p,lllcl nf Ihc AML-BFM MRD study gmup s prc\()ll s l y dcsnibcd in dtaiľ Wd' perfnncd at!hli immunlgy labmtrics at the University ChilJrcn's Hspil,lI. MUCllstcr, Grmany. the St Anna Childrl'lú Hspit',,1. ViCllll". AuslrÍ;l. tlte Inlens\tlCatln Mal ntenance t ycar Ar. e lh ± I'G-CSF T=-----T=T--T--O------T---=TH' Day BMP l BMP2 BMP3 BMP4 Fig 1. Acufe M elld Leu emla Berlin Franklun-Mu Alste, study 98 Ireatmcm schedule wllh bne ll) rrw punclure <BMP) tll ne Dmts. AlE. Ara-C (cyla,ab lne), darubcln, Bnd etpsde: HAM, hlgll-dse Ara C an mltxamrne: AI. Ara-C and idarubicin: ham. medlum-hgh-dsa Ara-C and nlllox8 01lrne: HAE. hlgh-<lse Ara-C and etpside. Ara-C i.lh.. imralhekal Ara-C : G-CSf. granulcyte clny stllnulatlng faclr; Rand. ra l1dmizanl1 Inlrmatin dwnladed lrm and prvided by BIBLlOTHEK DER n July lrm. Cpyright 2006 by the American Sciety l Clinical Onclgy. AII rights reserved. 3687

103 E. Mejstříkvá, strana 101 langebrake et al Table 2, Olstflbu lloi1 f Eliglble Specimens 811d Tlfl 1e POlnlS Days Frm Stan f Chemtherapy N,f lime POInt Speclfllens Medlďn Range PrOlcl SMP l BMP BMP BMP l a punnure, l"r1l'" Uni\'.:r, ity, " r<lgue, Ll.c h Republic, anj at thl.' University Hspital, ( rile lti n t"n, GCl'Lllan}', "t initiji Jignmis J.ne! during intensi ve chemth,'rapy,,\nticagulatcj bne rnarrw "ajlll'les were sent t une f the Iabratrics by n:migh t mail. wide antibdy pand bascd Oll a CD33/CD3 j backhne, indepcn dent nf thl' illitial illlln unphenl't)'p" íllcluding tluur,'scwce clljug,lted myduid nl,lrk,'rs OU-PE (Sf! Dl; Iml111InLltech, Krddd, Cermany), COl J-HT'C (MM A; [ketun Diduns(ln, Hcidelherg, Cermany), CD3J P( (mhlc,o.25i ; lltllllullotcch). CD33-APC (D3HLC,O,25 l; Immun Icch), and HLA DR-FlTC ([.143, BeCI II DidullSn), l)'mphij 1l1Jrker Cm PE (8H8.1 ; Imrnunlcch ), CD 10 FI'J'C (Al.B2; lmlllulltech), U)19 FITC (/4. 119; lrn(llllllot '.:h), CD56-PE (",CAM ItU; Hect ll DiL'krsn), tlll' act ivatill "ne! prnliteratin marker CD38 PE (!-I137; Bedn Dickin50n) s wcll S th pmgenitr assci'ltcd rnrkers CD34-APC 18{;12; Bectn Dickins ll ), CD34- P '7 (58 J; Imlllunt<.'ch) <lud C DI!7- fltc (950: Immunrccb) \v"s appl icd (Table 3). Syt 16 (Mlceular Prbcs, Eugcnt', ORl IVa, used li,, stinin.g nudc<1ted cclls t cxdudc debris,llld nt cmpktdy Iysed "l')1hrcyres frm anal)'5is, After in cllbatin thc bne 1I1,lITOW sampb with molldnal an libdies fur 15 minutes, erythrl"ytcs \"crc lyse I f r 7 minutes USillg FAC.'i l.ysing Slutill (!3ectn DickirWln) Ol' Vnsa Lyse (Bcckman Cultw, KrefelJ, Ger \n,uly),. ftcrwarcls, Úl.' spccimcns wcre washed twicť with 2 ml pbsphate buftáej s<llinc (PBS) buffcr (ph 7.4) <I nd ccntrifuged (S minut"s, 20 C, 600 g) Itl n:1llovc exces, anti b lclícs and lysed RB C. SPl' imclls \Vcre m e,ls Uľed using Ihť f'a C. CaJibur ( Bčctn Dickinsn) Ol' EPICS (Bcckman Culrer ).,ulalyzllig t ICO,130,001l CVL'nts. [xll'miw inlťrii1,tnu ll c'n rl cmpj t'isolls \Vcrc per ln llcd t cnsurc rhal cither site culj dc tcl1 simiijr pcl'ecntages ťpsitivity. Data Ana/ysis/Gating Strategy Thc spccimclts \wre "naj)'lcd using tlrc Paint' J-ga tc PRO Sftware Be Dickinsnl ar Cytrnic, RXP, (lftw<lre (Becknlan Cu ll r ), AU dat erc rcl'iewed cťlltrally in the íll1l111u10lgy IabratlY fthc UnivCI'Sl ty Chil Jrcn's Hspital Muenster, in rdcr t warmnt hmgcneus datl m aj.ysis and mlcrpl'etarill, Rc, idual ll1a1igua.llt cdb aolllng nrmal h"ltlatpictic cdb 11m idcntiticc\ hy clu,rer nalysl' lising six paramcter (tórward nd sidc Table 3, Cnsensus Ant.bdy P ll el Used fr RO MnitOring Withln lha AML BFM MRD Stuy Grup Anubdy Tube N FtTC PE PC5 r APC APC r PC7 SyTO 16 CD7 CD45 C034 2 HLA-OR CD38 CD33 CD34 3 CD15 C01 3 C033 CD34 4 CD2 C07 CD33 CD34 CD 15 C01 17 CD33 CD34 C0 19 C056 C033 CD34 Abbrev,atlOns, RO, res,du, I d.se8se; AML BFM, Acute Myelld l eukem ta Berl,n-Frankl urj Muen ter; MAO. nllolmal restdual dlsease, FITC, flurescern tso!h'cyanate: PE. phycrythru; APC, allpljyccy nlo, pe5. phyc.ryti1t111 cyanne 5: PC7, pl1ycerythnn-cvanlne 7, scaltcr prpcrties as well s tur antigcns simull<me usly), An tigm psitivity was inferrcd if thc flurcscenc'c intemity culd he ckarl)' sep<lratccl fi'01l1 I1cgative clltrb (ist)'pic cntrj. Ol' ncg,ltivc cell ppubtinns fr lhc' exn m ined illltigen l. III threc-stcp J.ll<ll)'sí, tllt' residua! blas! cclis \Vere dctennincd rughl)' by thei r f('rward se<llter/side sctter prpcnics fllc)lvcd by a prccis,' gating accrding t thl:' [.AlP t be investigmed (fr (ktaib St'C LJngdmllzc' ct :rl '). T vid bias, au samplt's wťrc evaluated by t Icast {\,VO inl'cstigatrs, Statistics Fwnl!'rec survival (EFS) was cajculated frll1 Jatc f diagnsis t last ťllw - up ar hrsl evcnt (tililure t achieve rcmissin, rcsistant kukeuhj, rl" bpse, scc nd Illaligllanc)', ar dc th f any causc), F<lilure fm' suf\'ival (rr:s) II'aS calculared frm dte ať dij.n s is t last (ljw-up Ol' failurc (rc\ap,e, nnrespnse). Patients wh did nt atw.in a cmplcle rclllissin (Jccrding t the Cancer and Lcukcmia Grup B critwia '7) were cnsidered t:lilurcs in time zem, Surviva! W,ll calcubted frm date nf diagnsi, t de,lth nf an)' cause Ol' t last tóllnw-up, Univariare anal ysi, was cndllcred hy Ihc Wilcxn tesl fr quiultitative variables and Fisher, rxnct test fr ljualitative variablcs. When tí'equellcics were sufficicntly large, i statistic lvas llscci. Prbabilirics nf, ur vival were estimred using tl,c Kapbn-tv1eicr Il1cthd, \\th S s accrjing t t;rccnwd, "nd \Verc eojllpared witll tll(' lg-rank test. Culrtulatiw incidence functíns f relapse "Ild dc<lth in (OntinlluS wll1pletc rcmissil'l werc cnslructej by Úle metllod f Ka!bf1eisch mld Prcntice. COlnputatinns Wt'rc pcrfnned lising SAS versill 6,12 (S AS Institute Inc, Car)', Ne). RESULTS Definitin f Cut Off Levels by Retrspective Analysis The dclcrrninatin f latp specificity has ueen Jescribc'd in detail previusly, I I Tn brief, bne marrw specimt'm f 39 chijdrcn with,kule lymphbhlstic leukemia, Ewing sarcma, nn-hdgkin's lymphma, Ol' withut a malign<1nt Jisease werc evalumed ICH the presence,mj amunt fdifferent LAIP, Three grups f specificity culd be defined accrding t thc' median percentage f LAIP in regenerating bne marrw: lw spcóficiť)' ",ith 1.0 ;', Ol' mre, medium specificity frm 0, I tu 1,0%, and high specificit)' with Iess than 0.1%. B,lscd n these results, cjini.:auy prgnstic relevant threshlds fr each specificity grup and time pints wcre defined by retrspectively analyzing 25 children with relapse and 40 children withut relap,e at,1 met!ian fllw-up f 1.5 years, L\\' specilicily L!\lP are ni)' infl'lmtive at BMP I, whije high and ver)' high specificity LAIP can be utilized fr discriminatill at.,11 fur rime pints. Accrding t these data, the threshlds given ill Figure 2 werec,llclllated thar are able t un<lmbígllusly discriminate between thse childrcll wh relapsej and thse children in cnt.illulls cm plete remissin, Serial Assessment f RD at Three r Mre Time Pints Identifies Chi/dren With Pr Prgnsis Children with at le'lst three pec imens unti! BMP4 (n = Y5) havť been eva luated t investigate the impact l' serial inmuii1010gic mnitring fr utcme prejiclin, ln :,4 chiljren, ;1 11 mt\lsurej LAIP levéi, were belw the threshld al e:lch time pint rhiljren, the measured LA IPs Úl at least three specimens were abvť the Jťlerm i ne,l threshld, ln 48 children, Dne r mre LATPs were abve thc lhreshld at ne r tw tjme pints (Table 4), Using thi.s appr:lch, it wa5 pssible t idejltify,1 pr-risk grup, chdracterized by psitive flw c:ytmdric assays at three r mre cnsecutive time pillts dltring chemtherapy, with all EFS ť3l'yt, :!: II % (Fig :\), Hwever, EFS wa s Ilt significantly diftt:rent berweell children wh were ncgutive by f10w cytmetl')' at alj analyzťd time Infrmatin dwnladed frm www,je,rg and prvided by BIBLlOTHEK DER n Jufy 31,2006 frm, Cpyright 2006 by the Ameriean Sciety f Clinieal Onelgy, AII rights reserved,.j! IlTltN.\L 1))-' r U N I, ')\!. O NCl I[)J(;'t'

104 E. Mejstříkvá, strana 102 Residual Disease Mnitring in Childhd AML A Es '" '" CCR (n = 161,.. Relapse (n = 121 > 40 l,j.g i J (/) 3.0 E I :3 10 I I a. I 3 10 i BMP Tlmeplnl f I " CCR (n : 19) Relapse (n = 14) i 2. 3 BMP TimeplOl f i CCR (n = 21) t 2.5 t Relapse (n = 12)?:-?: Ul i 2 0 Ul 1.5 '" :I' '" 1,5 r 1 0 c:- a. 1.0 D !! :5 0.5 f BMP Timeplnl f CCR (n = 18) Relapse (n = 13) t 3 BMP Timepint.. Fig 2. lal M edl8n percenlag l leukem taassctated IIl11l1unpl1enOlvpes (LAIP' SEl i" bne marrw accrdlng 10 speclhclty alld!in,., P(llnL Dala are OOlall18C by a relrspectm! analvsls l m!dren Wllh acutc:> myelld ukemla suf ering ITm relapse v DI Su S cnl nuus cmplete r I11ISSIOO tbi Cutlf leve l tas perce ta e f nucleated calls) accrci"' O 10 LAJP 5peClf,crty <Ind ume pll1t uljltzed fr ra Idual dlsease Class,ficalln. CCR. cnlinuus cm plete rel ;$$100, BMP. bne martow Ptlncture Sl>OClhcily Immunphenlype SMPl BMP2 Lw CD I 31331:J4 B CD34138IHUI DA C033l34 2".. C0 33l SMP3 BMP4 Wedlum COl COI51331:J4 COI 5I117/33/ C0 7!.l3134 Hlgh CD2I33134 CD 19!.l3134 CD ' % 0.2",. t Very hlgh CD 19/56rJ " 0.1% 01 % 0.1% pints Jnd thse with n <:: r tw ['s itive time pints (73% ::+:: 8% v 61% ± 7%, P -.43). Cmbining the gd nd Che intennediate gruup, the diffen:,nce in cntrrtsl t thc pr gruup was statisticauy,igniticant: P"FS 65% ::+:: S')!u v 31 'i-h ::+:: 13')/0; P -,02. Shifting the cut ff k'vels, which wcre used fr grup ajjcatin, did nllt result in ct berter distinctin in terms f FS (dnta nt shwn ). Single Tirne Pint RD Assessrnent Befre Secnd Inductin Is Mst Infrrnative fr Outcrne Predictin "Vhen investi l:(aring thc fur difterent timl' pints sep.tralcly, we fund th,tt nly at BMPl and BMP2, there is a statistiwlly signiticjnt difference between RD -psitive and RD-negative children in the 3-yectr EFS (Fig 4; 7l % :!: 6% II 48'Yr, ::+:: 9%; P",. 'l ", k =.029; 70% ::t: Table 4. Risk Grups and O utcrne Accrdlng t Residual Disease Detarmined in Chlldren W it i1 Three r Mre EIIglble T"ne Pin ts N. Secndarv R,s Grup 'Gme POlnts Pauants CCR Relase NR Deilth ln CCR Lpukenlia Gd AII negauve O O ln erl11ed,ata 1 2 abv" Illresi10ld [) I pr ". 3 abva,hreshld ,e 1 O Abrevlill.ns CCA. COnllnUOIJ cmplete remlssln. NR, nnrespnse WIw.J(l).nrg 3689 Infrmatin dwnladed frm and prvided by BIBLlOTHEK DER n July 31, 2006 frm. Cpyright 2006 by the American Sciety f Clinical Onclgy. AII rights reserved.

105 E. Mejstříkvá, strana 103 Langebrake et al I. IO lc-. --, -\ 0 8 '_, L-,-,ll'-=(L -.-!073, SE = '. 07 \...,., I ' ""1_._'-._.. _ SE=007 ' Ol l 1 -I L_, l L _ O. 31,SE0' 3 -- Gd ln evenl5). _- Inrermedl8te (n = events) P: 1-2 =.43 ' 3 =.OOS 2-3 =.007 pr (n = 13.9 events) 2 Years fig 3. Evenl tree survlvlli 13 ye8rs) f children wilh 81 leasi three specimens ullli1.,!p4 (9ct ah tiin8 plnts negatjve. Inlermed le: 1-2 lime polnls p itive, pr. 311me polnts OSltlv,SE, slandard rrr pr blhly f ev nt-iree survlvall.,ji' I' 50% :!: 7%: P'. g I,n k =.0 3). This is als tnte, ir nly high and cr)' high specificity LAlPs are rt!grdcd (70 /r, :!: 6% \' 37 '!, :!: II ')10; O"'g l<.iflk =.031; 66% :!: 6%, 1/ 45%, :!: 891,: Pu -, - R. nk = Similarily, ni)' r BMPl and BMP2 the RD- psirive ch ildren differed signiticm rl)' frm lhc RD-negative chi1dren rcg'lrding tbeircumulative 110nrrspnse and relapse inciden ť: 48%, ± 10% \' 25% -'-- 6%; P r ; "", =.0_: 1.1% ± 7 0 /r, v 25% :!: 6%; p(;'jy =.01.. Regarding 3-year veral1 Irvival, ni)' Blv!P2 tmned ut t be.l statistically siglliticantdislrimnatr (P =.(36). MRD Mnitring Has N Additinal Prgnstic Impact Cmpared With Knwn Risk Factrs Usi.ng the 1111ivari"tc COX regressin mdel fr FFS risk assess "Ient, bth BlPl and BMP2 had slatistiglily signiticanl impuct: RR, :J5 (95% CI, 1. J3 t 4.89; P =.021) and risk rati, 2,21 (95% CI,!.l ; P -.013), respt'ctively. Regarding n ly thsť children, wh resplldell t treatment as kt cťtnincd by mrphlgy at day 15, there is Cl statisticauy 'ignificant li ftltťtk C in 3-year EFS betwecn MRD-negative "nd MRD-psítive.hildren: 6\'% :!: 6% I' 40% ± 15% (P <.05), A multivariate analysis ntrlling fr AML-BFM risk cbssificaun, induding FAB su btype, cytgene tics, dnd mrphlgicuuydeterliint'd bhst atday 15, was perfl'rmed. At BMP I, hth Owcytmetry a.nd AMI.-BFM risk shw almst the same rl k r'lti fr FFS with sil11ibr 95% 1$ (2.09; 1.00 t 4.39: 2.06: 0.87 t 4.88). Thl' influenc(' f BM P2 n tlw risk f failure is lťs thall thc il11pact l' the "1\-1 L- BF,'v! risk, hwever, the differencť s are nt signifie'1i1l. Using '111 cxtended risk gruup dassiticatin including l11rphlgic.dly determined blasl'.' al da )' 28 as '1 cvari'ht', this rurned ut t have mre impacl n FF. with a RR f2.8 fr bth time pints (Table 5). We f1l1ther,mal)'zed, whether the inclusin fflw c)'tmdry in the risk grup as-,esslllent culd hdp t detine mre prccisely risk gr lup:; fr ajditin1 treatment stratificalin. Therťlre, the 3-year EFS uccrding t illllllunlgicall)' deterlllined RD W.15 caklllated sep'lrately fr tht' SR and high -risk grllp. Tht're IVa, HO dilfaenet' in bth grups.lt m."ip 1 r BIvlP2 (Table 6). DISCUSSION Dlle t the fjct that the antigcn t'xpressill pattcm f AtvlL bbsts ditfers sígnineantly belween diagnsi:; and relapse I 1 and thal n pťcine antigens exist which clearly can identify leukemic blasts, we h.we devdped an antibd}' panci that a110w5 lis t delcct residua1 blasl' cells independently f thl' inilial immunphentype. Based n a.d33/ D34 basís, thc LA[Ps uti1i7.ed fr MRD.1ssessmenl cmprisc the cmmnly accepted antigen expressin patlerns in i\ml. ' " ' 11l We art' the tirsl' grllp appl}'ing tillle-depelhknt prgnstically rekvant ClIt ff leveb that have been determined by the retrspective 'lnalysb nf children treakd within the AML-flFM studies fr thc ccurrenceť 12 different Lt\lPs at detined time pints, instead felllpirie,illy defining cut fťlevel. [n ur intematina1 prspcctivt' stud}', \W wťre able t shw th,lt tbe detectin f residuul blasl cells by flw cytmetry at early time pints f fllw-lip (ul1til da)' 84) is a significant predictr uf treatment utcme regarding 3-yea r EFS, Espt!cially in the very early curse f therapy-befre thc start f lbe secntl induclill, al day 2H froill Ji<lgnsis-multidimel1sinal Hw cylmt'tr}' can hclp t difkrenliate between children with gd <lnd pollr prgnsis. Similar l'ťsults were btained by thc cxclusive :Illalysis fla[ps witb high Dr ver}' high speciticity, indicaling tht antigene Cllmbin'ltins with lw r medium specificity are nl relevant fr RD mnituring. FurthťrnHlre, flw cytmetry is ajs able t detect "minimal" RD in thse children with mrphlgicul1y undetectable blasts attn first illductill. A 1.0 Og '-\.., , u.\ SE = 0.06 't.., "-:---'._.. _.. _u_.. u 48, SE = MPl neg (n = 64, 18evenIS) BMP 1 ps (n = 29, 15 evenls) O. l j,--_. LOg-rnk P Ye"," 1.0 B a T l,_ \ ' SE = 0.06 Lg-rank P =.033 '1.,-{.. _,-._--_.. _ SE = BMP2 neg. In = 72, 21 even!s).. _.. BMP2 pes. (n event., 2 3 Yea,s t (AI bn" l11arrw puncture IBMPI I and {B) BMP2 (SE, standard errr prbabili ty l event-t ree survlval) Infrmatin dwnladed frm and prvided by BIBLlOTHEK DER n July 31,2006 frm Cpyright 2006 by the American Sciety f Clinical Onclgy. AII rights reserved.

106 E. Mejstříkvá, strana 104 Residual Oisease Mnilring in Childhd AMl Table 5. U,wa"ate and Multlva"ate Cx Mdels fr Failure-Free Survlval Unlvanale Tlll e P,nt BMPI BMP 2 Cx Mdel RR 95% CI P RR 95% Ci P Flw evlomelry t t Mu!u r,ate flw ev melry O AML BFM nsk t Mulllvanale Flw cylomelrv 1 98 O I t Extended AMl-BFM tis" 2 80 I 05 t I 15 t I AbbrOVJahOJlS: BM P. DOne rtl<urw punclur, RR. " rallo. MRO. mlnlmal resldual d,seasa, AML 8FM, Acule Mye ld Leu emra Serl lll FrankfulT Muens!er Our reslilts are cunsistenr with reprts n pediatrie und adult \M L regard ing the prgnstic impuct,)ť immllnlgical blasl detec Ilun after hrst indll(tin.. 7.Y Thc series fcllstan-$mith et ar; cmrrist's the analysis f residual blasb at the md f remissin indudin Iherapy b)' defined marker cmbin.nins dependcnt n the initi<11 immunphentypc. [n the RD-negative grllp, their reslilts shw less IhJn O.J %, residu'll AML cells: six children (2 1 %) rebpsed, and three,hildren 00%) died in CR, whereas in thc RD-psilive gr up the p rpľlin fchildren wh rdap ed and fthe in CR is equal (bth relapse and CCR. n = 5: 38%; Jeath in C R. n = 3). The prb<jbil.ity IIf 2-ye<Jr ver,lll survival is stali. tkally di fferent. but the assimihl 'in f the tw (Ur'ves ;tfter th<1t time injicatl's that a stable situalin h.is nt yet bťt'n 'K hi evť d. Othťr invcstigatr grups tund that ni)' the mnitring at later :ime p in t' l (after wnslidatill therapy) is signi fi c<l nt fr ut- Table 6. 3-Year EFS Ac rdlng t R,sy Grup Srrallf,catrn and Flw Gy meme Oetenn lned Resldual Olsease Level a TII119 POI I1 IS SMPI and BMP2 NO. f ' f 3-Year 's. GrLlp Patlents Events- EFS SE SMPI SR HR Ne a!lve PsitIVe Nega!lve O. O 0.08 POSI!IV(' MP2 SR HR Negatlve Psltrve 8 0.7G 01 5 NegatlVe Pslllve lbreviatrns EFS. evenl frse survlvai; BMP, I)ne nlarrw puneture: SR. :andald risk: HR. hlgh "sk. An event is lha fallure achreve remlss n. reslstanl leukemlb. relapse. acnd Illalignancv. r death f any cause. P cmť predictin, which m,iy linut the c1inieal usefulness f these data fr risk-adapted therapy taijring. Thc mst re(ent reprl by Kern et al 21 ťven revcaled tnut nnly time pints lnger than I year after diag nsis were indepcndently related t EFS and verull surviv;tl. During this perid f therapy ťllw-up, RD psitiviry may rather have repre e nrcd resurgent leukemia (cclllt relapse) than a surrgale marker f initial therupy respnse lisable fr treatment stratificatin. The individu,ll diffťrcn (c s in the kinetics f leukemie recurrences mj)' tnerefre impede u prspedive applicatin ť Ihis apprach fr thc carly diugnsis f relapse. Althllgh we culd shw thut tlw eytmťtry is a reliable and bjť e live methd t delect residu;tl bj<jst eell s in regeuerating bne m'lhow speeimens, md that it is therdre upprp riate fr utwme predictin, we further wanted t knw whethcr these reslilts bear additive va lllť s fr treatment str<jtiticatill us cmp'lred with cnven!ínal risk fjctrs. tably, thc AML-BFM risk gwup cl'lssiticatin ll is based n initi al c ytgeneťics, FAB classificatin, and mrphlgicj II)' detectabie blast c('hs f mre r less rhan 5% at du)' 15. Appl)'ing Ihis binar)' risk grup clussiticatin t the children anulyzed, J highly signilicant differenct: in terms f3-year EFS is <1chieved withut using inul1unlgical inlrmatin: 78% ::!:: 6% ve rsus 49% :!: 6% (P =.0025). When inclllding illtrmatin n mrphlgical blast cllnts fr0111 day 2R (BMP2) in udditill t the cnventinal risk classiti(atin (extended AM L-BFM risk clussifi(utin), the difťercnce in 3-)'ear EFS betw ťen th e tw risk grups even in c rc asťd 10 85% :: SUlc, wrsus 48% = 5'110 (P =.0002 ). Thc impact f flw c}'tmetry results n FFS at either lime pint W;tS fund equiv'llent t that f the AML-llFM risk in tertm f risk rati and 95% Cls. \A/hen induding the extťnded AML-BFM risk classiticati n in thecox-mdel, it turned utthat immllnlgi(al Rl) as a.:variate des Ilt cntribute t a better risk grup separatin. It has t he mentined that nne f the recently puhlished stlldies f ther grups included infrmatin f RD mnitring us wmpared with mr)hlgically derermined blast cdb ut the an'llyzed time pints JS part fthe risk dassificjtin s)'stem. Cnsiclering ur resulrs, this cmparisn has t be recmmended in rder t interprer ptential additinal va lues f tlw cytmelric invesligatins cltclťly. Applying the cvuriul es l1sed by the[ grups (age al diagnsis, leukc)'te cunt at diagnsis. kať}'ty p e) t ur dura, we btain similar significant results fr the inflllellce fbmp I and BMP2 n uteme. Hwever, in ur study the mre sphisticntt'd i\ml-bfm risk gr up classificatin hus been laken us the bjsis t delt:rmllle the true additinal value f MRD mnitring. fn cnclusin, fr the AML-BFM stud ies, risk grup strati!i.catin based Oll FAB sublype. cytgem:lics, Jnd mrphlgicully determined bne marrw bbsts heťr e secnd inductin do ťs nt bcndit frm inclusin frd data, <ls asst'ssed by multidimensinal floiv cytmetry. Further investig<1tins will foclls n an imprvej risk grllp stralíhcatin including bhlsl percentage at d.ly 21l. ln a prspeetive study, \Ve will evaluale whether the discriminatin fblasl ce lls and regenerating holle marrw (eus (a!l be imprved in terms nf ;]((Uracy <Ind bicctivity by flw (yt mťtr y JS cmpared with mrphlgical interprt'!::ttin alne. Infrmalin dwnladed frm and prvided by BIBLlOTHEK DER n July 31, 2006 frm. Cpyright 2006 by the American Sciety f Clinical Onclgy. AI! rights reserved. 3691

107 E. Mejsrříkvá, strana 105 Langebrake et al REFERENCES - -, ' I. Langebrake C. Bnnhnann I. Telgler-Sclllegel 81 al: Immunphentyplc differences betwes,,.gn0515 and relapse ln childhd AML' Imphcas lr MAD mnltnng CylOmeti'y S C'IO Cytm Sil r Mana R. Srewart Carletn C. Ddg",,,,hard K. BI al: Hlgh IreQuency Immunpl1911 'VIle changes ln scute myelld lau emla at relapse: fl'phc3tlns tr residua I dlsease deteclin (Cancer leukem a Grup S Study Bld ) Maeed A. San M lguel JF. Vidnales MB. st al 'I1entYPlc cl1anges,n acule nlyelld IElukaemla. pllcatlns ln 11'0 d leelln l mlnlmal resldual.'sease J Clln Pari10l Oelschlagel U. Nw"k R. Se"a ba. el al Stli!l aberran l antigen expressln <ll relapse r at 31ment talure ln acui'" leuken "a Cytmetry 42' 47, Cuslan $llllttl E. A Ibe" RC. Rubllltz JE. e CIIOIcal Slgnll,eanee t r sldual d:seas8 OUflng 'eatmenl ln ehlldhd acule nlyelld lellkaemlb. '" J H<le11atl Sl8vers EL. ng8 BJ. Aln70 TA. SI al Im muphenlyplc avld nga f leukanlla aher,nducun rapy pi' dlcis relapse : Results fr 111 a prspe tive :hl!dran s Canear Grup sludy f 252 patrem wnh Ta myelld Isuicemla Bld : Faller N. van dm Pl MA. van Stiln A, et al. 'RD parameters uslnu II'lmunphenOlYplC delecn methds are l1'ghly rellab e ln predlctlng surviva1 11 acule IllYelid Isukaemla. Leukemie Kern W. Vskve D. Scl10eh C. 81 al: DeIE" mlnaun f relapse fls based n assessmem f m lnlmal resldual dlsease during c0111ple e ren1lssin by multil:>arameter flw cytmstry ln unselectsd pa llents w lth acule mysl,d leukemie. BlOd 104: San Mlguel JF. Vldria 'es MB. Lpez Berges C. et al : Early wnmunphenrypleal svalujnn l mimmal residua I dlsease ln acule myslld leu emla ldentilles dih erenl pstient risk grups and may cntnbute t psllnuclln treatmam strati rca rln. Bld Vend1ll1 A Tamburini A. Buecisan F. al al Chnrcal relevance f minima I reslual dlseasa delec Iln i adull acute mye id leuksmla J HemalOther Stem Cell Aas II ,. Relnhardt D. Langebra e C. Creurz,g U. st al Mlnlmal resldual dissase 10 acute rnye id leukemla,n chlldren: S nda rdlz3110n and evaluatln l immuphenlyplng "' Ihe AML BFM 98 srudy. Klln Padlal r CrsutZlg U. ZIInmem,ann M, Ritter J. st al. DelMln l a s ana rd ns grup ln chldren w lth AML Br J Haematl 104 : CrsumQ U. Zlmmer Biln M. Relnhardl D. et al: Esrly dealhs and lreatmant rslated mrlallty ln children underging therapy fr cu te m yalid leljeml Analysls t lha rnullicenter d iieel tnals AMl BFM 93 and AML BFM 98. J CIIIl Ol1el 22; Bennen JM. Catvs y D. Daniel MT, er al. Prpsals lr the classlllc3t, f lha acuts leukaa- Acknwledgment rnias' Frencll-All1erican-8ririsl1 (FABI c-peratlve grup. Br J Hitem 10133: Bennen JM, Catvs,",y D. Demel M r, al al: Prpsed revised cri ler fr the classiflcalln f acule myelld leukeml A,eprt l Ihe French Amarican-Bnll 11 Cperatlve Grup. Ann Inrern Mad I03: Bennett JM. Catv ky D. D(iI1lel MT. 9t al: Crilena lr lha dl8gn IS f aeule ISlJkemr f m egakarycyle lineage (M71: A rspn f tl1 e French Am encan Bntlsh Cperatlve Gru. Ann hllern Med Cll esn BD. Cassilerh PA Head DR. st al: Reprt l lha Natlnal Cancer Insttuls-spnsre wrkshp 0 11 delll11110ns l diagi10sls and respnse ln acule ",yelld leu'emlll. J Clin OncI Maeed A. Or ld A, Vldriales MB. el al' Charactefl zalio n f aberr an t phenrypes '" Je ute r yelblas le "ll emla. AI1 i1 HemalOl 70: Reading CL. Esrey EH. Huh YO. SI al: Expres Sln f unusual imlllunphen!ype cmblnatlns ln acule myelg9nus leu emla. Bld 8 1 : Terstappen LW. Sa Hrd M. Knemann S. Sl al: Fl w C meme ch ractenza In f a u le myslid leukem ia Part II. Phentypic hetergsnelty al dlagnsls lcrrecte and repubhs hed n 'ele ngl!lally pfl nted ln Leukenlla 5: I I. Le'Jkemla Kam W, Vskva D. Schch C. el al: Prglls IIC IInact f minimal resldual dlsease as de emllned by mulllparameler Hw cytmetry '" pa tiant wlth "ClIte m yelld leukem la. Onklgie 28: We thank Carlin Augsburg., Juna Mdtzer, Elisabeth Kurzknabe. Gertralld Frlischl, and i\ngcla Schumich fr their excellent tťchni ca l isi,tncť. Weah th<1nk all thr hspital persl1ncl Jnd clinicians particíputillg ill the AClIlť Myelid Leukemia-Bedin-Frmkfurt-Muenster,tud)' up fr prviding bne m,iitow ampl e s and clillictl data. Thi.s,utide i, cledicated t D r GlIenther Schellllg in hnr fhis 80th birthda)'. Appendix The Appelldix is induded in thc full-t ext vers in f this article, availjble nlinr at [I is nt included in thr PDF vcr,in (via Adbei!l> Re'lder<»). Authrs' Disclsures f Ptential Cnflicts f Interest ll,e aulhrs Ind,eated n ptel 118. cnfllcts f nterest. Authr Cntributins Cnceptin and design: Claudla Lange l1rake. M ichael Dwrzak. Ondrel Hrusak. Ursula Creutz g. D,rk Rei nhardt Administrative supprt: Ursula CreutZlg, Martil' Zimmermann Prvisin l study materials Or patients: Ctaudla Langsbra.e. Ichael DWO«8k. Ondrsj Hrusak. Ester Mejstn,v'. Frank Gneslnger Dirk Asml1ardl Clfectin and 8ssem bly l data: Claudla La l1gebrake. Michael Dwrza. Ondrej H rll sa. Ester MSjstriKva. F, ank Grieslnger. Dirk Reinhardt Data analysis and interpretatin: Claudla Lar1ge brake, Mart,n ZilnmeflTlMI'. Dlr Relnhardt Manuscript writlng: Claudla Langebrake Final apprval l manuscript: Ulsula Creu\Zl9. M ichael Dw«a. Dlfk Reln hardl Infrmatin dwnladed frm and prvided by BIBLlOTHEK DER n July 31, 2006 frm. Cpyright 2006 by the American Sciety f Clinical Onclgy. AI! rights reserved. J Ol TlH\ AL ll ' C I. L I (. \ l. O :-:CI II.OC)

108 E. Mejstříkvá, strana 106 Přílh a 5 Detectable minima) residua I disease befre ahgeneic hematpietic stem cell transplantatin predicts extremely pr prgnsis in children with acute Iymphblastic leukemia Lucie Šrámkvá, Kateřina Mužíkvá, Eva F rňkvá, O ndřej Krejčí, Petr Sedláček, Renata Frmánkvá, Ester Mejstřík v á, Jan Starý, Jan Trka Pediatrie Bld and Caneer (ff 2, J 64)

109 E. Mejstříkvá, strana 107 Pediatr Bld Cancer Detectable Minimal Residual Disease Befre Allgeneic Hematpietic Stem Cell Transplantatin Predicts Extremely Pr Prgnsis in Children With Acute l ymphblastic leukemia Lucie Sramkva, MO,1,2 Katerina Muzikva, Bc,1,2 Eva Frnkva, MO,1,2 Ondrej Krejci, MO, PhO,1,2 Petr Sedla ce k, MO, PhO/ Renata Frmankva, MO, PhO/ Ester Mejstrikva, MO,1,3 Jan Stary, MO, PhO/ and Jan Trka, MO, Ph0 1,2*, fr the Czech Pediatrie Hematlgy Grup (CPH) Backgrund. Thc level f minimal residua I disease (MRD) prir t allgeneic hematpietic stem cell transplantatin (HSCT) has been shwn 10 be an inde'penden t prgnstie faetr fr uteme f pediatrie patients with high-risk Jeute Iymphblélstic leukemia (ALU. Retrspeetive studies whieh uspd (,emi-) quantitatin f clne >peeific immunglbulinft-ccll receptr Og!TCR) rearrangements have dcumented the feasibility and practi cality f this teehnique. This apprach has als been disputcd due t the ccurrence f clnal evlutin and gencrall y high MRD leve ls prir t HSCT. Prcedure. ln ur prspeetive study, MRD befre and after HSCT was mnitred using quantitative real-time PCR in a ehrt f 36 children with ALL en secutively tran,planted in ur center between VII 1/2000 and VII/ Results. tn 25 f 36 patients, MRD level prir HSCT was assessed. Seventeen patients were classified as MRD-negati ve and eight were MRD-psitive up t 9 x In MRD-psitive subgrup, seven eve nts (six re lapses) ccurrcd pst -transplant in striking entrast t nly n e relapse in MRD-negative subgrup (event-free survival (EFS) lg-rank P < ). MRD prved t be the n ly significant prgnstic factr in a multiva ri ate analysis (P < ). Adptive immuntherapy including dnr Iymphcyte infusins in patients with adverse dynamics f MRO after HSCT had nly limited and/r temprary effect. Clnal evlutin did nt present a prblelll precluding MRD mnitring in any f pati ents suffering a psttransplant relapse. Cnclusins. We shw that MRD quantitati n using elnal IglTCR rearrangements successfully assesses th e ri sk in pediatrie ALL patients underging allgpneic HSCT. I\s ur ahility t treat deteetable MRD levels after HSCT is very lirnitcd, alternati ve strategies fr MRD-psitive patients prir HSCT are necessary. Pediatr Bld Cancer 2006 Wi ley-li", tnc. Key wrds: acute Iymphblastic leukemia; childhd; hematpietic stem cell transplantatin; immunglbulin and T-cell receptr gene rearrangements; minimal residua I disease INTRODUCTlON Despite the verall imprvement in the chemtherapybased frnt-line treatment f the childhd acute Iymphblastic Ieukemia (ALL), the hematpietic stem cell transplantatin (HSCT) remains an imprtant treatment ptin fr the patients with resistant, very high-risk, and/r relapsed di sease. Hwever, the curative eťťect f allgeneic HSCT is hampered by a relapse ccurrence that represents a majr cause f the HSCT failure. Already in 1998, Knechtli et al. shwed that the level f minima! residual disease (MRD) prir HSCT represents an imprtant prgnstic factr [I]. They used a semi-quantitative apprach fr the detectin f immunreceptr gene-immunglbulin and T-cell receptr genes (lgltcr) rearrangements. In their chrt, all children entering the pre-transplant cnditining with a high-level MRD suffered a pst-transplant event and children with Iw-Ievel MRD had significantly prer utcme cmpared t MRD-negative subgrup. Similar data were btained in the subsequent studies, partly using the new technique f real-time quantitative PCR (RQ-PCR) [2,3]. When this quantitative technique fr MRD detectin was cmpletely intrduced and prgressively standardized, the internatinal Pre-BMT M RD Study Grup (part f the Eurpean Study Grup n Minimal Residual Disease in ALL-ESG-MRD-ALL) [4] retrspectively analyzed the pre-transplant MRD levels and thc pst-transplant utcme in a chrt f 140 ped iatric ALL patients [5]. MRD prved t 2006 Wiley-Liss, Inc /pbc,20794 be a highly significant (P < 0.00 I) independent factr t influence event-free survival (EFS) f this grup. High MRD burden, tgether with a shrter duratin f the fiťst cmplete remissin (CR). MLL gene rearrangements, and pr-b immunphentype prved t be the n ly negative risk factrs. This large multicenter, retrspective study was recently di sputed by lmas huku et a!. [6]. Their analysis, based n a grup f95 transplanted patients (age < 20 years), shwed n crrelatin between the pre-transplant MRD burden and the pst-transplant relapse. lmashuku and clleagues made a cuple f rather surprising bservatins: first, they fund 96% f their patients t be MRD-psitive prir HSCT. lcllp----z:hildhd Leukemia Investigatin Prague. Prague. Czcch Republic; 20epartment f Pediatric Hemt(Jlgy and Onclgy, Charles University, 2nd MedicJl Sch'! Jnd University Hspital Mtl, Prague, Czech Republic; Departmcnt l' Imll1unlgy. Charles University, 2nd Medieal Schl and University Hspital Mt\, Prague, Czech Republic Grant spnsr: FNM; Grant number: 9735; Grant spnsr: MZ; Grant number: ; Grant spnsr: GAUK; Grant number: : Grant spnsr: MZ; Grant number: ; Grant spnsr: MSM: Grant number: *Crrespndence t: Jan Trka, Department l' Pediatrie Hematlgy and Onclgy, Charles Univers ity, 2nd Medical Sch\' V uvalu Prague 5, Czech Republic. lťmtj. c uni.cz Received 30 August 2005; Accepted II Janumy 2006 '/lwtley Inte rsci ence

110 E. Mejstříkvá, strana Sramkva et al. Secnd, their ability t predict the relapse after HSCT was hampered by the c lnal evlutin f IgrrCR rearrangements. Eleven f 16 patients having relapse after HSCT shwed a ttall y different rearrangement pattern at relapse when cmpared t the initial screening. This is in striking cntrast t previusly published data that shw mre than 95% f relapsed patients have preserved rearrangements allwing the MRD fllw-up [7]. On the basis f their results, Imashuku et a!. dispute the practicality ť the Ig/TCR-based apprach. Here, we present a series f36 pediatrie ALL patients wh cnsecutively underwent allgeneic HSCT using unmanipulated grafts at ur institutin. In 25 f them, we were able t assess MRD leve! prir and after the transplant using RQ PCR-based detectin ť Ig/TCR rearrangements. We shw that detectable MRD beťre HSCT is a very strng negative prgnstic factr and that the clnal evlutin f the Ig/TCR reanangements des nt ham per the relapse predictin. Therefre, ur study clearly demnstrates fr ne thing the feasibi lity f the methd and fr anther a very strng cjinical value f this apprach fr the identificatin ť patients ar rhe risk f relapse after allgeneic HSCT. MA TERIAlS AND METHODS Patients and Treatment Between August 2000 and September 2004, 36 cnsecutive pediatrie patients (age years) with ALL indicated t HSCT were enrlled t ur study (Table I). This chrt cmprised all such pediatrie patients frm the Czech Republic in the given perid ť time and all transplants were TAHLE I. Transplanted Patients With ALL Dnr GVHD Fllw-up N. Agc/sex Immunphentype Fusin gene Remissin Cnditining (HLA march) grade (mnths) I 111m T-ALL Nt detected CRI TBI 12Gy, VPl6 MSD IIl. cgvhd m pr-b ETV6/RUNXI PR3 TBI 12 Gy, VPI6 MSD II 15* 3 101m call ETV6/RUNXI CR3 TBI 14.4 Gy,VPJ6 UD ( 10/10) II /m T-ALL Nt detccted CRI TBI 12 Gy, VPI6 MSD II /m T-ALL Nt,.!clccted CR2 TBI 14.4, Cy UCB (5/6) II 4* 6 151m pr-b MLLlAF4 CRI TBI 12 Gy, VPI6 MSD I, cgvhd m call ETV6/RUNX I CR2 TBI 12 Gy, VPI6 MSD 1/ m AHLlcALL BCR/ABL CRI TBI 12 Gy, VPI6 UD (10110) 1/ 21 * 9 111m call BCRJABL CR2 TBI 12 Gy, VPI6 UD (10/10) 24* 10 15/f pracb/call BCRJABL CR2 TBI J2 Gy, VPI6 UD (9/10) 6* II 121m pracb/call BCRlABL CRI TBI 14.4 G y, Cy UD (9/10) 4* m praeb/call Nt detected CR3 TBI 12 Gy, VPI6 UD (10/10) II 31i m call Nt detected CR2 TBI 12 Gy, VPI6 UD (10/10) II 2* m call ETV6/RUNXI CR2 TBI 12 Gy, VPI6 UD (7/[0) II 9* 15 8/f call ETV6/RUNXI CR2 TBI 12 Gy, VPI6 MSD /f call Nt dctectcd CR2 TBI 12 Gy, VPI6 MSD II m T-ALL Nt detccted CRI TBI12 Gy, VPI6 MSD 1/ lf call BCRlABL CR2 TBI 12 Gy, VPI6 UD ( 10/10) m pr-b MLL rcarrangement CR2 BuCy, VPI6 UD ( 10/10) O' 20 8/m AHLlpr-B BCR/Al:lL CR2 TBI 12 Gy, VPI 6 UD (9/l0) 1/ /m call Nt detccted CR2 TBI 12 Gy, VPI6 UD (9/10) II Ilf T-ALL Nt delecled CRI BuCy, VPI6 UD (10/10) II 12* 23 S/m T-ALL SIL/fAL I CRI TBI 12 Gy, VPI6 MFD (10/10) II lf calupr-b ETV6/RUNXI CR2 TBI 12 Gy, VPI6 UD (9/10) II /m call Nt dckcted PR3 TBI 12Gy, VPI6 UD (10/10) II m pr-b MLLlAFt.» CR2 BuCy, Mel MSD II m call BCRlABL CRI TBI 12 Gy, VPI6 UD (8/10) II lli 28 9/m pracb Nt dctected CR2 TBI 12 Gy, VPI6 UD (9/10) IV 1* 29 51m ca LL BCR/ABL CRI TBI 12 Gy, VPI6 UD (10/10) II /m call ETV6/RUNXI CR2 TBI12Gy, VPI6 UD (10/10) II m pr-b/cai.l Nt detected PR3 TBI l2 Gy, VPI6 UD (10/10) II m praeb Nt detected PR3 TBI 12 Gy, VP.16 UD ( 10/10) 1* 33 9/m call Nt dctecteu CR2 TBI 12 Gy, VPI6 MSD II /f AHL BC'R/A BL CRI TBI 12 Gy. VPI6 UD (7/ 10) II /m ealllpraeb I TV6/RUNXI CR3 TBI 12 G y, VPl6 UD (9/10) II m call BCR/ABL CRI TBI 12Gy, VPl6 UD (lo/lo) 10* Bu, busulphan; Cy, cyclphsphamide; Mel, mclphalan; VP 16, vepesid; CR, cmplete remissin; PR, partial remissin; TBI, ttal bdy irradiatin; MSD, matched sibli ng dnr; UD, unrel ated dnr; UCB, unrelated erd bld; MFD, matched family dnr; GVHD, graft-versus-hsl disease; cgvhd, chrnic graft-vcrslis-hsl disease. ' - time t event. Pedilr Bld COl1cer DOl IO.1002/pbc

111 E. Mejstříkvá, strana 109 MRD in Children With ALL Underging "SCT 3 perfrmed at ur institutin. The grup f patients cnsisted f 30 children with B-cell precursr (BCP) ALL and 6 children with T-cell ALL. Twelve children were transplanted in the first CR. all f them due t high-risk ALL (T-ALL and prednisne pr respnse (4), BCR-ABL-psitive (7), MLL rearranged (I»; 20 children were transplanted in the secnd r higher remissin; and 4 children in partial remissin (withut increased number f blast cells in the bne marrw but withut recvery f hematpiesis). Dnrs f hematpietic stem cells were HLA-identical siblings in 10 cases, unrelated dnr frm BMT registries with variable rate f HLA match (frm 7 t 10/1 O antigen match n high reslutin PCR level) in 24 cases; ne patient was transplanted using unrelated crd bld and ne patient frum phentypically identical mt her. In the majrity 01' transplants (n = 32), we used a similar pre-transplant cnditining regimen based n the ttal bdy irradiatin (TBl) in the dse 12 r 14.4 Gy and etpside 60 mg/m 2, in the crd bld transplantatin TBl plus cyclphsphamide 2 x 60 mg/kg. In three children under 2 years f age a busulphan-based cnditining (2x busulphan, cyclphsphamide, and melphalan, I x busulphan, cyc\phsphamide, and etpside) was used. In the majrity f unrelated dnr transplants (n = 19) we used rabbit antithymcytic glbulin (ATG, Fresenius) at 10 mg/kg fr 4 days. Graft-versus-hst disease (GVHD) prphylaxis cnsisted f intravenus (i.v.) cyclsprin A (CsA) in the dse 3 mg/kg/ day in HLA-identical sibling dnrs and using the cmbinatin f CsA 5 mg/kg/day and methtrexate (MTX) administered days +1, +3, and +6 in unrelated dnr transplants, always with transitin t ral CsA in the adequate dsage. Since February 2003, we sturted reduced GVHD prphylaxis accrding t ALL SCT-BFM 2002 prtcl where nly targeted dse f CsA with required serum levels between 80 and 130 g/l (Flurescence Plarizatin Immunassay methd) was given. Only in ne ca se (the crd bld transplant) the cmbinatin f CsA and methylprednislne was used. Incidence f acute GVHD was lw in ur grup with I chi\d develping acute GVHD Grade I, 24 children experiencing acute GVHD grade II, and 7 children having n acute GVHD. We have registered nly tw cases f acute GVHD grade III-lY. Fllw-up f the whle grup ranges frm 12 t 61 mnths with median 26 mnths after HSCT. MRD Assessment Fr the MRD assessment we examined BM samples frm bth diagnsis and relapse, I week befre the start f the pretransplant cnditining and then after HSCT, n a regular basis: days +28, +60, +100, +180, and later 9,12,18, and 24 mnths after HSCT (r mre frequently in MRD-psitive patients when adptive immuntherapy was cnsidered). In children with a very high-risk f relapse, additinal peripheral bld (PB) samples were taken every mnth during first 6 mnths after HSCTand every 3 mnths later n. Mnnuclear cells frm the diagnstic Oľ relapse BM samples were islated by Ficll- Paque (density g/ml, Pharmacia, Uppsala, Sweden) density centľifugatin. Fllw-up BM r PB samples weľe prces sed by erythrcyte Iysis. Genmic DNA was islated by QIAamp'" DNA Bld Mini Kit (QIAGEN GmbH, Hilden, Germany), DNA was stred at -20 D C befre prcessing. Primers and prtcls fr immunglbulin heavy chain (IGH), immunglbulin Iight chain kappa (IGK), T-cell receptr gamma (TCRG), T-cell receptr delta (TCRD) gene rearrangements, and TAL I deletins detectin were described previusly [8,9). Clnality f PCR prducts was cnfirmed by the heterduplex analysis [10). Mnclnal PCR prducts were cut frm the gel, reamplified with the same set f primers, and puritied by QIAquick PCR Purificatin Kit (QIAGEN). Sequencing was perfrmed in the ABI PRISM" 310 Genetic Analyzer with BigDye Primer v3.0 Sequencing Kit (Applied Bisystems, Fster City, CA). Variable (V), diversity (D), and jining (1) regins f the immunreceptr gene were identified by cmparisn with sequences in GenBank using the lm Mun Gene Tics (IMGT) Database ( imgt.cines.fr, IMGT, Eurpean Biinfrmatics Institute, Mntepellier, France) and the IGBlast search ( Natinal Center fr Bitechnlgy Infrmatin, Bethesda, MD). Patient-specific frward primers fr RQ-PCR were designed using the VECTOR NTI 8 Suite Sftware (Infrmax, Bethesda, MD). Family-specific reverse primeľs and prbes fr IGH, IGK, TCRD, and TCRG were described previusly [11-14). Ig/TCR RQ-PCR was perfrmed in the icycler IQTM Real-Time PCR Detectin System (B1O RAD, Hercules, CA) and in the ABI PRISM 1l Real Time PCR System (Applied Bisystems). Standard CUl'ves were prepared by diluting the diagnstic (HSCT in CR I) Ol' relapse DNA samples in plyclnal DNA fmm healthy dnrs. The albumin gene was used t nrmalize the DNA cncentratin and quality [15). The ESG-MRD-ALL criteria fr RQ-PCR sensitivity and quantitative range (QR) interpretatin were used [4). In six patients wh suffered frm relapse after HSCT, BM samples were re-analyzed fr the presence f clnal Ig/TCR rearrangements t evaluate the extent f clna I evlutin. RESUlTS Feasibility f the Apprach We were able t evaluate MRD level prir HSCT using 19/ TCR rearrangements in 25 f 36 patients. ln tw cases, the pre-transplant sample was nt available due t severe bne marrw aplasia, and in nine cases we did nt find a target with adequate sensitivity and specificity. AII 25 patients were regularly mnitred using IglTCR rearrangements (tw Pediarr B/ad Cancer DOll O.lO02/pbc

112 E. Mejstříkvá, strana Sramkva et al. targets in 14 patients, ne target in 9). At least ne target with sensitivity 10-4 was available fr all but ne patient (N. 12), where nly ne target with sensitivity 10-3 was fund. Clnal Evlutin f Ig/TCR Rearrangements ln ur chrt, clnal evlutin did nt preclude MRD mnitring in any f the patients. Al! pst-transplant relapse samples when cmpared t the diagnsis/first relapse spec i men shwed at least ne stable Ig/TCR rearrangement. MRD Level Prir HSCT Predicts Pst-transplant Outcme Accrding t MRD level in BM prir the cnditining regimen we divided ur patients int tw grups (Table II). The first grup (MRD-psitive) cnsisted f patients with MRD detectable within the QR f the methd. The secnd grup (MRD-negative) included patients with undetectable r very lw MRD psitivity (belw the QR; n = 2) prir t the transplant. The MRD-psitive subgrup cnsisted f eight patients (Ns. 2, 8, 9, 10, II, 13,22, and 35). One f them died due t pst-transplant cmplicatins (day + 66-multirgan faijure after gram-negative sepsis), six children experienced a hematlgical relapse, althugh all f them achieved transient pst-transplant MRD negativity, and ne is alive in cntinuus hematlgical remissin. Hwever, the latter patient (N. 35) suffered frm mlecu lar genetic re lapse and was treated with the ad p ti ve immuntherapy with a fllwup f 12 mnths. The grup f MRD-negative patients included 17 children (Ns. 1,4,12,15, 16,17,18,20,2 1,23,24,26,27,29,30,31, and 36), all f whm are alive except ne and in cmplete hematlgical remissin with a fllw-up f mnths (median 26 mnths). One patient f this grup (N. 36) suffered a relapse 10 mnths after HSCT. Interestingly, althugh MRD-negative by Ig/TCR apprach, BCR/ABL fusin gene reverse-transcriptase PCR analysis prir HSCT shwed brderline psitivity (data nt shwn). EFS analysis clearly supprts the hypthesis that MRD psitivity prir transplant is a significant adverse prgnstic factr (Ig-rank P < I; Fig. I). Further divisin int the subgrups with high MRD psitivity (2 10-\ n = 4) and lw MRD psitivity ( > 10-4 and < 10-'; n =4) did nt shw any effect, evidently due t a lw number f patients and a high frequency f events (data nt shwn). Multivariate analysis (i ncluding als sex, age at diagnsis, first CR duratin, type f dnr, and fusin gene-bcr/abl, MLLlAF4, and ETV6/RUNXI - presence) identified pre-transplant MRD as the nly significant risk factr (P < I). TABLE II. MRD Levels in the Bne Marrw Befre Cnditining and Survival f the Patients Numhcr f Relapse Patient n. ALL subtype Igrl'CR trgcl:; MRO level after HSCT Cmments 2 ETV6/RUNX I 1.47 x 10-4 Ves Oied in remissin (systemic fungal infectin, severe induced GVHO after OLl) 8 BCRlABL x 10-2, 9.2 x 10-2 Ves Oied in remissin (systemic fungal infectin) 9 BCRlABL 2 Negative, l.3 x 10-4 Ves Oied in prgressin f disease (n treatment f relapse) 10 BCRlA BL 1.2 x 10-3 Ves Oied in prgressin f disease II BCRlABL x 10-4,6.2 X 10-4 Ves Oied in remissin (systemic fungal infectin, severe induced GVHO after OLl) 13 BCP 2.8 x 10-2 N Oied due t multirgan failure in gram-negative sepsis day T-ALL I 6.4 x 10-3 Ves Alive in CR2; after 2nd HSCT., 35 ETV6/RUNXI x x 10 N Alive in CCR T 2 Negative, negative N Alive in CCR 4 T Psitive (belw QR) N Alive in CCR 12 BCP I Negative N Alive in CCR 15 ETV6/RlJNX I 2 Negative, ncgative N Alive in CCR 16 BCP Negativc N Alive in CCR 17 T-ALL 2 Negtive, negative N Alive in CCR 18 BCRlA BL 2 Ncgative, negative N Alive in CCR 20 BCRlABL I Ncgative N Alive in CCR 21 BCP 2 Psitive (bclw QR) N Alive in CCR 23 T-ALL 2 Negative, negative N Alive in CCR 24 ETV6/R NX I Ncgálive N Alive in CCR 26 MLLlAF9 2 Negative, negative N AJive in CCR 27 BCRlABL 2 NegiJtive. ncgative N Alive in CCR 29 BCR/ABL 2 Negative, negative N Alivc in CCR 30 ETV6/RUNXl 2 Negat.ive, negative N Alive in CCR 3 1 BCP 2 Negalive, negative N Alivc in CCR 36 BCR-ABL Negative Ves Oied, systemic fungal infcctin Pediatr Bld Cancer 001 IO.IOO2lpbc

113 E. Mejstříkvá, strana 111 Iii >. _8 ::> <ll.6 ":- C.4 '" > w.2 O MRD-negative (n=17; 1 event) MRD-psitive (n=8; 7 events) L -rank p< O Fllw-up [mnths) MRD in Children With ALL Underging HSCT 5 MRD Mnitring and Treatment Strategies After HSCT Pst-transplant MRD dynamics was mnitred in all patients with detectable targets. In the grup f pre-transplant MRD-psitive patients, five displayed minimally ne MRDpsitive sample befre the emergence f relapse. In three patients, there was a time-frame fr an attempt t avert the relapse manifestatin, but despite ur effrt all three patients subsequently relapsed (Fig. 2). Perid frm the first MRD psitivity after transplantatin t the diagnsis f hematlgieal relapse was days (0, 30, 36, 330, 365, and 486 days). Treatment f pst-transplant hematlgical relapse was hetergeneus and it is summarized in Table III. Fig. 1_ EFS in MRD-psitive and MRD-nega ťive patiems. Meuian fllw in MRD-negative gru p = 25 mnths. a 1 a: b li 1 a: U,I O,i)() ' t--\-- 0,0000 ' O' 0.0' OJII)I = =_---, \ c., II j,, -f Fig. 2_ Disease curse nnd MRD fllw-up in Patients 8 and 22. a: Disease prgressin after HSCT in BCR/AI:lL-psiti ve patient (N. 8) was nly temprari ly retarded by ima tini b trcatmem and Dll. Squarcs = 19 rearrangcmem targct N. I; lriangles = 19 rea rrangement target N. 2 (rull symbls = BM samples; pen symbls = PB samples); black arrws = Dll; 1M = imatinib mesylate; R = relapse ; T. = allgeneic HSCT. b: Pre-transplant MRD status detemlines psttransplam curse fthe discasc in T-ALL int'anl paticnl. Squares = TCR delta incmplete rearrangemem target (full symb ls = BM samples; pen symbls = PB samples). Pediatr 8100d Cw,,'ť( 001 IO.IOO2/pbc DISCUSSION Detee tin f MRD levels has already beeme an integral part f treatment f childhd ALL patients including thse underging HSCT. Onging frnt-line treatment trials, based n previus retrspective studies [16, I 7 J, aim t demnstrate the benefit f MRD-based stratifkatin in the prspective setting. Retrspective single- and multicenter analyses f MRD in transplanted pediatrie ALL ehildren shwed ciearly the significant impact l' pre-transplant MRD n utcme [1-3,5]. Imashuku et al. questined these data, shwing II surprisingly high prprtin f MRD-psitive patients at the start f a cnditining regimen (96% ) :rnd strikingly high frequency f the c10nal evlutin hampering MRD detectin itself [6]. Althugh they did nt use an up-t-date methdlgy (specifi c prbe hybridizatin was emplyed instead f RQ-PCR) and a full spectrlll11 f [gitcr rearrangements, their results cast dubt upn the practicality f the whle apprach. In this study, we cncentrated n IglTCR quantitatin nly, despite the fact that significant prprtin f patients bear the fusin genes (BCR/ABL, ETV6/RUNXl, MLL! AF4, MLLlAF9) as ptential targets fr MRD deteetin as well. As already mentined, the clna I IglTCR quantitatin methdlgy has been inereasingly standardized thrughut the last years within the ESG-MRD-ALL. This standardizatin prcess and als newly develped interpretatin criteria imprved significantly its clinical value_ When prperly applied, this met hd prvides a reliable, clinically liseful tl, as it was prved by numerus intematinal quality cntrls [4]. Hwever, this is noi the case fr the quantitative analysis f the fusin genes expressin in pediatrie ALL. We have recently shwn a very gd crrelatin between ETV6/RUNX I transcript leve ls and Ig/ TCR quantitatin but in the chrt that cnsisted dminantly frm the frnt-line treated patients [18]. In the current study, we bserved a minr but significant discrepaney between BCR/ABL and IglTCR MRD levejs in Patient 36_ He di splayed brderline psitivity in nested qualitative PCR fr BCR/ ABL prir t the transplant and he was the n ly patient

114 E. Mejstříkvá, strana Sramkva et al. - i:<: "?: '" u:.2 r u '" c " - " 0>0 '" -z 00 "" Z 00 + Z Z $.. M I I I I I I M + 00 Z.. Z I" M + c;, + ln the Ig/TCR MRD-negative subgrup wh develped relapse after HSCT. Our prspective single-center study clearly dcuments the feasibility and applicability f the IgrrCR quantitatin technique f MRD detectin in the transplant setting. The efficacy f thi s apprach, in terms f the identificatin f at least ne target with adequate specificity and sensitivity per patient, increased steadily thrughut the study: it was 61 % in the first half f the chrt and 80% in the latter. Our results are in agreement with the previusly published data [1-3,5.19] and in striking cntrast t the study by lmashuku et aj. [6]. Bth survival and multivariate analyses demnstrate the significance f MRD level befre HSCT. Patients wh enter the transplant cnditining phase f treatment with MRD level higher than 10-4 are at high-risk f pst-transplant relapse. Treatment fthese relapses has been very di sappinting s far. Three different appraches may lead t a ptential slutin f this prblem: ( I) reductin f the mal ignant clne prir t the transplant using intensified r additinal treatment, (2) mdificatin f the HSCT prcedure, and (3) pst-transplant treatment mdificatins ba sed n the clse fllw-up f MRD levels. Pre-transplant treatment intensificatin is cmplicated by the fact that vast majrity f patients have been heavily pre-treated. The idea f emplyment f sme drugs that are nt nrmally used in the frntline treatment failed t shw a significant effect. Ptentially, intrductin f new agents (e.g., kinase inhibitrs, mnclnal antibdies, new antimetablites, such as clfarabine) might be an ptin [20]. Hwever, n cnvincing data are available thus fa r. Mdificatin f transplant prcedure based n MRD psitivity prir t HSCT aims fr the reductin f GVHD prphylaxis, thus bsting the graft-versus-ieukemia effect. Remving ATG, targeted dse f CsA and rapid immunsuppressin tapering may lead t this effect. Althugh partly e ncuraging. results f an nging Dutch study have thus far been incnclusive [19]. In sme patients in ur chrt, we used targeted dse f CsA. In patients yunger than 16 years f age transplanted frm matched sibling, we did nt use MTX in GVHD prphylaxis and in sme patients transplanted frm well-matched unrelated dnr even ATG was mitted. Due t the srna II numbers and hetergeneity f patients with ALL, it is difficult t prve any nticeable effect f thi s strategy in terms f relapse preventin. We shuld e cautius as thi s strategy may significantly increase the risk f transpl ant-related mrbidity and mrtality withut c lear evidence f efficacy. Adptive immuntherapy after the transplantatin was generally nt successful in ur chrt. ln ur hands, interventins, such as early and rapid discntinllatin uf immunsuppressin, infusin f DU in 4-6 weeks interval, and/r use f imatinib mesylate in BCR/ABL-pusitive ALL were nt suffic ient enllgh t prevent nset ť relapse. Applicatin f these appraches in patients with imminenr Pediatr 8/DOd C{//lCer DOr IO.IO02/pbc

115 E. Mejstříkvá, strana 113 MRD in Chndren With ALL Underging HSCT 7 relapse have led t extended remissin but ften at a priee f severe, unentrlled GVHD, and Jife-threatening invasive fungal infeetins, Mrever, n permanent effeet was seen in ur grup f patients, Heavily pre-treated patients bearing a chemresistant leukemia have an extreme mrbidity and mrtality, Therefre, an early initiatin f adptive therapy might at least pstpne, ifnt prevent, relapse, and faeilitate ťurther effieaeius ehemtherapy; if subsequent remissin is reaehed, these patients shuld be indieated fr re-transplantatin, A secnd HSCT may be curative in such settings, Our results demnstrate that the pssibilities f treatment f the pst-transplant relapse are extremely limited, Intrductin f new treatment mdalities is desirable fr the patients with mlecular genetic relapse after HSCT. These shuld include nt nly thse mentined abve (kinase inhibitrs, mnclnal antibdies, new antimetablítes) but als the inhibitrs f enzymes cntrlling epigenetic mdificatins, specimcally DNA methyltransferases and histne deacetylases [21.), We demnstrate feasibility f MRD quantitatin using clna I IglTCR reaitangements as an apprach fr the pretransplant risk assessment in pediatrie ALL patients underging allgeneic HSCT. We shw that, althugh, we are able t identify the patients in an almst certain risk f relapse, ur ability t respnd and t avert an impending relapse is very limited, ln spíte f the use uf currently available set f treatment appraches after HSCT, we failed t permanently avert a predicted relapse, The change f the apprach t MRD-psitive patients prir t HSCT is necessary because f very questinable benefit f HSCT in these children, We are cnfident that all effrts shuld be ai med t better cntrl pretransplant MRD levels, Nte added in prf Patient N, 35 suffered frm hematlgieai relapse 14 mnths after HSCT and died due t disease prgressin, ACKNOWLEDGMENT AH pediatlie hematlgy eenters in the Czech Republie are acknwledged fr their cperatin and reprting the patients t the transplantatin center: Brn, Olmuc, Ostrava, Hradec Kralve, Ceske Budejviee, Plzen, Usti nad Labem, We wuld like t thank Jzef Madz, Ph,D, fr the help with the data analysis, REFERENCES I, Knechtli CJ, Guldcn NJ. Hancck JP. et al. Minimal residua I disease status befre allgencic bne marrw transplantatin is an imprtant delcnminant f succcssful OUlCOme frchildren and adlescents wilh acute Iymphblastic leukemia, Bld 1998;92: , 2, Bader P, Hancck J, Kreyenberg H, el al. Minimal residual diseasc (MRD) Slalus rnr lo allgene ic stem cell transplantatin is a pwerful predictr fr psl-transplant utcme in children Wilh ALL. Leukemia 2002; , van der Velden VH, Jslen SA, Willemse MJ, et al. Real-l.ime quantitative PCR fr deteclin f minimal residual disease hcfrc allgencic stem cell transplantatin predicis ulcml! in children with acute Iymphblastic leukemi.!. Lcukemia 2001: I 5: , 4, van der Velden VH, Hchhaus A, Cazzaniga G, ct al. Detcclin ť minima! residual disease in hematlgie malignancics by rcal-time quantitalive PCR: Plinciples. appraches, and labratry aspects. Leukem.ia 2003;17: , Krejei O, Van der Velden V, Bader P, el al. Level ť minimal residual disease pnr t haemalpietic transplantatin predicls rrgnsis in paedialrie patients with acule Iymphblastic leukaemia: A reprl f the pre-bmt-mrd sludy grup. Letter. Bne Marrw Transplant 2003;32: , 6, Imashuku S, Terui K, Matsuyama T, el al. Lack nf clinical utilily l' minimal residual disease delectin in allgeneic Slem cell recipient. Wilh ehildhd acute Iymphblastic leukemia: Muhi-instilulinal cllabrative study in Japan, Bne Marrw Transrlant 2003;31: , 7, Szczepanski T, Willemse MJ, Bnnkhf B, ct 31. Cmparalive analysis f 19 and TCR gene rearrangemenls at diagnsis and at relapse f childhd preeursr-b-all pruvides imprved stralegies fr seiectin f stable PCR largets fr mnitring f minimal residual disease, Bld 2002;99:23 I , 8, Pngers-Willemse MJ, Seriu T, Stlz F, et al. Primers and prtcls fr standardized detectin f minimal residual disease in aeute lymphblastic leukem.ia using immunglbulin and T-ccll receptr gene rearrangements and TAL I dclctins as PCR targels: Reprt f the BIOMED-I cncerted aelin: Invcstigatin l' minimal residual disease in acute leukemia, Leukemia 1999: 13: , 9, Szczepanski T, Pngers Willemse MJ, Langerak AW, Cl al. 19 heavy chain gene rearrangements in T-celJ acute lymrhbjastic lcukemia exhibit predminant DH6- I 9 and DH7-27 gene usage, can result in cmplete V-D-J rearrangements, and are rare in T-ccll receplr alpha beta 1 ineage, B ld 1999;93 : , van Dngen JJ, Langerak AW, Bruggcmann M, ct al. Design and standardizatin f PCR primers and prtels ťr deteclin fc1nal immunglbulin and T-cell receplor gene recmbinatins in suspect Iymphprliferatins: Reprt f lhe BIOMED-2 col1certed actin BMH4-et , Leukemia 2003; 17: I 7, II. van der Velden VB, Wijkhuijs JM, Jaebs DC. el ul. T-cell recertr gamma gene rearrangements as target fr delcelin 01' minimal residual disease in acute Iymphblastic leukemia by real-timc quanlil3live PCR analysis, Leukemia 2002; I 6: , 12, van der Velden VH, Willemse MJ, van der Scht CE, ct aj. Immunglbulin kappa deleling element rcan'wlgements in precursr-b aeute Iymphblastie leukcmia are stahlc targets fr delectin f minimal residual disease by real-time quantilalive PCR, Leukemia 2002; 16: , 13, Langerak AW, Wlvers-Tetter ll, van Gastel-Ml EJ, ct aj. Basic helix-lp-hejix prteins E2A and HEB inducc immaturc T-cell receplr rearrangements in nnlymphid eejls, Bld 2001;98: , 14. Verhagen OJ, Willemse MJ, Breunis WB, ct ul. Applicatin f germline IGH prbes in real-time quantitative PCR fr the delcclin f minima! residual disease in acute lymphblastic leukcmia, Leukemia 2000; 14: , 15, Pngers Willemse MJ, Verhagen OJ, Tibbe GJ, ct aj. Real-timc quantitative PCR fr lhe deteclin f minimal residua I disease in acute Iymphbla,tic leukemia using junclinal regin specinc TAQMAN prbes, Leukemia 1998;12: , 16. van Dngen JJ, Seriu T, Panzer-Grumayer ER, ct aj. Prgnstie value f minimaj residual disease in acute Iymphblaslic leukacmia in childhd, Lancet 1998;352: , Pr-dil/! r Bld COllcer DOl 10, 1002lpbc

116 E. Mejstříkvá, strana Sramkva et al. 17. Cuslan Smilh E, Bchm FG, Sanchez J, et al. Immunlgical detectin f minimal residual disease in c hildren WiLh acule lymphblaslic leukaemia. Lancel 1998;35 1 : Frnkva E, Madz J, Zuna J, el aj. TELlAML 1 real-lime quantitative reverse lranscriplase PCR can cmplement minimal residual disease assessment in childhd ALL. Leukemía 2005; 19: Schilham MW, Balduzzi A. Bader P, et al. Is there a rle fr minimal residual disease levels in the Lreatment f ALL patie nts wh rcccive allgeneic stem cells? Bne Marrw Transplant 2005;35:S49-S Pui CH, Jeha S, Kirkpatrick p, et al. Clfarabine. Na! Rev Drug Discv 2005;4: Eggcr G, Liang G, Aparici A, el al. Epigenetics in human disease and prspects fr epigenetic therapy. Nature 2004;429: Pediarr Bld Cancer DOl IO. I002/pbc

117 E. Mejstříkvá, strana 115 Přílha 6 B-cell recnstitutin after allgeneic stem cell h"ansplantatin impairs minimal residual disease (MRD) mnitring in children with ALL Frankva va, Muzikva Katerina, Mejstrikva Ester, Kvac Martin, Frmankva Renata, Sedlacek Petr,Hrusak Ondrej, Stary Jan, Trka Jan Bne Marrw Transplantatin (ff 3, O)

118 Bne Marrw Transplantatin (2008), 1-1 0,, 2008 Nalure Publlshing Grup A" rights reserved /08 $ ORIGINAL ARTICLE 8-cell recnstitutin after allgeneic SeT impairs minimal residual disease mnitring in children with ALL EFrnkva l, K Muzikva l, E Mejstrikva, M Kvac, R Frmankva, P Sedlacek, Hrusak, J Stary "nd J Trka Drpar/men/ j Paediatrie Haema/%gyIOnc%gy, 2nd Medica/ Schl, Charles Universi/y {Ind Ulliversi/y HO.l'piwl M%l. Prague, C:ť ch Republie \linimal residual disease (MRD) detectin using quantiatin f clne-specific Igr T CR rearrangements befre and after transplantatin in chjldren with high-risk \LL is an imprtant predietr f utcme. The methd ld guidelines fr its interpretatin are very precise t amid bth false-negative ad -psitive results. 11 a grup r 21 patients fdwing transplantatill, we bserved detectable MRD psitivities in IgjTCR-based real-time quantitative PCR (RQ-PCR) leading t n further prgressi f the disease (ll f 100 (11 %) ttal samples). We hypthesized that these psitivities were mstly the result l' nnspecific amplificatin despite the Ipplicatin f striet internatina/ly agreed-upll meaes. We applied tw nn-self-specific 19 heavy chain ays and received a simijar number f psitivities (20 ld 15%). Nnspccific prducts amplified in these RQpeR systems differed frm specific prducts in length and lequence. Statistkal analysis prved that there was an t ccllent crrelatin f this phenmenn with B-cell regelleratin in BM as measured by ftw cytmetry and 19 light chain-k excisin circle quantificatin. We nc\ude that althugh IgjTCR quantificatin is a reliable methd fr pst transplant MRD detectin, islated psitivities in Ig-based RQ-PCR systems at the time f itense B-cell regeneratin must be viewed with cautin t lvid the wrng indicatin f treatment. BOlle Martu' Tramplanlalin advance nline publicatin, 19 May 2008; di: 1O.1038jbmt Ke,'wrds: ALL; SCT; minimal residual disease; KREC; R.el1 recnstitutin; dnr Iymphcyte infusin COlTcspndence: Dr E Fra nkva, Departmenl f Paediatric liaematlgyfonclgy, 2nd Medic"1 Schl. Charles University, V C valu 84, Praguc 5, Czcch Rcpublic. eva.frnkva(a lf.ml Lc uni.cz These aulh rs cntribulcd equally t Ihi, wrk. Recci\'ed 21 December 2007; revised 13 March 200; accc plc-d 20 March :lxlr lntrductin uring lhe pasl decade, minimal residual disease (M R) mnilring using palienl-specific anligen receplr gene rearrangements has been incrpraled inl majr frnlline and relapse lrealment prlcls fr ehildhd ALL. ' " Severa I grups, inc1uding urs, reprled lhe unfavrable prgnstic signifieance l' high MR levels befrc transplant in children with high-risk ALL. " Sludies explring the significance f pst tl'ansplanl MR were based n lhe detectin f mixed chimerisl11," II' f10w cylmelry (FC)," the fusin gene PCR in ca se f Ph + ALL,' 2 per lising c1ne-specifie Tg r TCR V- (D)-J seq uences' :' ", and, mst recently, real-time quantilalive per (RQ-PCR) deleclin f c10nal 19/TCR rearrangemenls.' 7 Cnsislcnlly, all studies shwed that delectable M R at any lime after set represenls a substantial risk f pst lransplant relapse, bth in children and in adults. Several measures exisl 10 avert hematlgieal relapse after SCT when mlecular relapse is delected. The f'irst plin is thr reinfrcement l' lhe GVL effeel by immunsuppressin reduclin r dnr lymphcyte infusin (DLl); lhe secnd is the applicalin l' further cytreductive therapy, including MAh Ol' specific tyrsine kinase inhibitl's, in the case ar BCR/ABL-psilive ALL The benefit frm such lherapy has becn described in a small prprtin f ALL palients. T date, lhcre is n genel'al cnsenl regal'ding the chice and liming f lherapy in case f pst lransplant MR posili vi ty. The ESG-MR-ALL (Eurpean Study Grup n Minima! Resid ual Disease in ALL) sel guidelines fr thc inlerpreta li n f quantitative IgjTCR-based MRD lhal inc1ude the use f plyclnal DNA frl11 the peripheral bld (PB) f healthy dnrs in mllltiplicate as a ncgative cntrl and a strict definitin f MRD psitivily.27 This definitin is even stricter when aimed at lhcrapy intensificatin (fr examp1e, DLl) 10 prevent false-psitive reslills. S far, this methd ha s prvcd t be rcliable, leaving the ptential nnspecific amplificatin in regenerating nnrnalignant Iyrnphcytes nly a theretical pssibilily. Startin g 140 days and later after SCT, we bserved M RD psitivities in acerdance with al1 ESG-MRD-ALL criteria in patients wh subsequently turned MRD-negative withut any antileukemic treatment and had been in cmplete rernissin fr several years after SeT. We hypthesizcd that

119 D,.wb.cks f pst t,.nsplant MRD in child hd ALL E Frankva el al the B-cell regeneratin after SCT caused an unspecific binding f clne-specific primers, which bypassed the therwise strict ESG-MRD-ALL criteria fr MRD psitivity. MRD detectin using nn-self patient-specific assays revealcd false MRO psitivity in a substantial prtin f pst-sct BM specimens. This false psitivity was limited t thc samples cntaining high numbers f B-cell prgenitrs as measured by immunphentyping and by recen tl y described B-cell recmbinatin (r;: deleting) excisin circles (KREC) detectin. Mrever, using high-reslutin capillary electrphresis and seq uencing, we bserved that the size f such nnspecific RQ-PCR prducts differed frm the specific prducts. We therefre cnclude that MRD results pst-sct shuld be apprached with extreme cautin, and ffer recmmendatins fr aviding MRO misinterpretatin. Patients and methds Patiel1lS A ttal f 38 children with ALL (aged 1-18 years) underwent allgeneic SCT in the Czech Republic frm January 2003 t Octber Of them 21 patients with B-precursr ALL were selected fr the study based n fllwing criteria: leukemia-free surviva l with a fllw-up f at least 12 mnths after tra nsplant (median fllw-up 46 mnths, range mnths) and the availability f M RD results and residua I O A samples frm at least three (3-7) f the fllwing time pints after S T: days + 30, 1 60, 100, -I 140, + 180, I year, 2 years and 3 years. In ttal, 100 BM DNA samples (Ieftver material a fter MRD detectin) were investigated. Washed leftver material frm tubings and the transfusin bag fllwing the cmpletc administratin f the BM graft was used as a cntrl fr KRE dctcctin. lnfrrned cnsent fr the use f rcsidual mate rial after prtcl-based examinatin fr research purpses was btained frm patients r their guardians. Transplanls The patients were transplanted due t relapsed r high-risk ALL in their first (7), secnd (ll) Ol' third (3) rem issin. Onrs f hematpietic stem cells were HLA-identical siblings in 5 cases, a si bling with 9/ 10 HLA antigen match in I case, and unrelated dnrs frm BMT rcgistries in 15 cases. BM was transplanted in ten cases, PBSC in nine cases, umbilical crd bld (UCB) in ne case and bth BM and UCB (sibling) in ne case. ln the majrity f transplants (n = 19), we used a similar pre-transplant cnditining regimen based n TBl at a dse f 12Gy and etpside 60 mg/kg, and in tw children, a BU-based cnditining (I x B,CY a nd melphalan, I x BU, C Y and etpside) was used. ln the majrity f unrelated dnr transpla nts (n = 13), we used the rabbit antithymcytic glbulin (Fresenius, Bad Hmburg, Germany) at a dse f 10 mg/ kg fr 4 days. GVHD prphylaxis cnsisted f CsA in HLA-identical sibling transplants a nd a cmbinatin f CsA and MTX administered n days + I, + 3 and + 6 in unrelated dnr transpla nts, respectively. ln ne patient ( C B transplantl, a cmbinatin f CsA and methylpred- nislne was used. N patient reccived any a ntileukemic trea tment (including adptive immun therapy) during the pst transplant perid. Deteelin [ residual disease M nnuclear cells frm the diagnstic r relapse BM sampies were islated by Ficll-Paquc (Pharmacia, Uppsala, Sweden) density centrifugatin and stred in Iiquid nitrgen. Fllw-up BM samplcs were prcessed by erythrcyte Iysis a nd stred at -80 ce. Genmic DNA was islated using a QlAamp DNA Bld Mini Kit (Qiagen GmbH, Hilden, Germany). Primers and prtcls fr the detectin f 19 heavy chain (lgh) rearrangements, 19 li ght chain-r;: deletins (KDE), TCR-y (TCRG), TCR- ů (TCRO) gene rearrangements and TAL! deletins havc been described previusly2u 9 C10nality f PCR prducts was cnfirmcd by the heterduplex analysis. 2 ') Sequencing was perfrmed in the ABI Prisl Genetic Analyzer with BigOye Primer v3.0 Sequencing Kit (Applied Bisystems, Fster City, CA, USA). Variable (V), diversity (O) and jining (1) regi ns f the iml11unreceptr gene were identified by cmparisn wi th sequcnces in Gen Bank using thc ImMunGeneTics databasc ( Eurpean Biinfrmatics Institute, Mntepcllier, France) and the IGBlast search ( / Natinal Center fr Bitcchnlgy lnrrmatin, Bethesda, MO, USA). Patient-specific frward primers fr RQ-PCR were designed using the Vectr NTI 8 Suitc Sftware (InfrMax, Bethesda, MO, USA). Family-specific reverse primers and prbes fr IGH, IGK, TCRO and TCRG have been described previusly3u- -" Ig/TCR RQ-PCR was perfrmed in the icycler IQ Real-Time PCR Detectin System (Bi-Rad, Hercules, CA, USA). Standard curves were prepared by diluting the diagnstic samples in pled plyclnal DNA frm the PB f five healthy dnrs, which was als used as negative cntrls. MRD using patientspecific as well as nn-se lf-specific sys tems was measured in triplicate, with 2.5 l f DNA per reactill. The albumin gene was used t nrmalize the DNA cncentratin and qualityj4 The ESG-M RO-ALL criteria fr RQ-PC R sensitivity, quantitative range and MRD interpretatin were used. 27 DNA analysls by n-chip eleclrphresis RQ-PCR prduct (I I) was analyzed in Agilc nt Bianalyzer (Agilent Technlgies, Santa Clara, CA, USA) lising a DNA Series II Kit (DNA 1000 Assay) and Agilent 2100 Expert sftware accrding t thc manuťacturer 's instructins. FllI' cylomelry K3 EDTA BM aspirate specimens were stained within 12h frm sample cllectin lising a whle-bld Iysi s technique with ammnium chlride. Abllt pl f sa mple (accrding t cellularity) was incllbated with MAb at dark fr 15 min, and then sampie was incubated with Iysing slutin fr 15min a t dark and centrifuged (400.1:). Aftcr supernatant remva l, the sample was resuspcnded in 200 I f PBS and analyzed n flw cytmeter (FACSCalibur; RO Bisciences, San Jse, CA, USA ar CyAn; Oak, Glstrup, Marrw Transplantatin

120 Denmark). Fr B- and T-cell regeneralinjfc MRO after SeT, the fllwing MAb cmbinatins were used: C 020; CDIOjCOl9/CD34, SYTOl6jCOl9jC045 and CD3/ CD16-56jC045j The fllwing anlibdy clnes wcre used: C020 FITC (clnel27; BO Bisciences), CO 10 PE klne SS2/36; Dak), COl9 PC7jPC5 (clne J4.119; Immuntech, Marseilles, France), C034 APC (clnc L1Q; Immuntech), CDI 9 PE (clne S125CI ; [mmllntech), CD45 PerC P (clne 20 I; BO Bisciences), C03 FITC (clne Sk7; BD Bisciences), CO 16 PE (c1nc B73.I; BO Bisciences), C D 56 PE (clne B73.1; BO Bisciences) anll CDI9 AP (clne SJ25CI; BD Bisciences). SYTO-16 tgreen tlurescent nucleic acid stain) wa purchased frm Invitrgen-Mlecular Prhes (Carlsbad, CA, USA). SYTO-16 green flurescenl nucleic acid stain exhibits bright green flurescence upn binding t DNA and RNA. SYTO-16 was used fr reprting the percentage f O 19 P, ;ells ut f all nuclea ted cells (SYTO 16'''''). The fllwing lubppul a tins were reprted: C D 191' ', CD 19'''''C045 dim, COlO " 019 P "" CD IOP <>scd19 P ''', C D34psC Dl9p, and CD3'x". T he B cells with a lwer expressin f C 045 (dim) crrespnd t immature cells,15 Detrc/in 0/ S-cell receptr excisin circles We used the methd f KR. C delectin,36 slightly mdified as fllws. We did nt emply the símllltaneus etectin f Íntrn-Kde rearrangements as sllggesled. Instead, we used a c. me thd with a calibratr 'ample- the dnr D NA extracted frm the residuum,fter BM transplantatin. We cnsidered the differences in DNA cncentratin f lhe samples and used RQ-PCR fr [he albumin gene as dcscribed previusly.-'4 The final 1IT10unt f KREC relative t the calibratr was expressed :1S: 2 C,calibralr- C.s:.J l11plc+klg2(dnacnc.cjlibralr fdnacnc.$a l11ple). SWlistical analyses rhe distributin f freqllencies between grups wilh psilive md negalive MRD was assessed using Fisher's exact tesl. fhe Mann-Whitney tesl was llsed t estimale the significance., 1' differences cncerning cntinuus M RD va lues. The,tatistical analyscs were pcrfrmed using StalView versin l.o (SlatView Sflware, Cary, NC, USA). Trend analysis in fígurc 4 was calculated using GraphPad Prism Sftware i rsin 5 (GraphPad Sftware, San Dieg, CA, USA). First, l!1eans f individual variables in individual lime pints were mrnpared using ne-way analysis f variancc (ANOVA), Ilten psl-hc linear lrend analysis was used t lest decrease r increase in nalurally rdered grups. Simullanellsly, Kruskal-Wallis lesl was used fr cmparisn f means.unng individual lime pints. Results Freifuency j' h)'[!olhelica/l)' Iltls[!ecific amplificalin using paticl/ts' c!ne-specijic syslems in lhe curse j' prspective sl-sct mnitring \ patient-specific RQ-PCR system with minimal sensitivity JI' /0-4 was designed fr all patienls, and 17 ut f 21 patients were mnitred using lw independent 19/TCR Drawbacks f pcst transplant MRD in childhd ALL E FlOnkva el a/ largets. Figure I shws lhe results f pst transplanl MR D mnitri ng. l n ttal, 16 f 15l (11%) samples frm ni ne patients were M R D psitive accrding t ESG-MRO-ALL criteria in a t least ne larget (the C value f at lcasl ne f lhe rhrce rcplicates was within 4.0 frm the highest CI valllc ť the sensitivily and lhe CI value f at least nc ť thc three replica tes was 1.0 lwer lhan the lwcsl CI f the backgrund)27 Eighl samples ťulfilled ESG-MRO-ALL criteria fr psitivity that (lim at therapy intensi!icatin (the C. valuc f at least ne f the three rcplicates was 3.0 lwer than the lwest C. f the backgrund). AII samples were cvalualcd as ' psitive, nol quantifiable'. Fifteen ť sixteen psitive samples were examinej by tw{) largets; ne sample was psitive in bolh f them. The RQ-PCR targets with psitivc samples llsed IGH (7 x ), KDE (5 x ), TCRD (4 x) and TCRG (1 x ) rearrangemenls fr MRD dcteclin. Nine f sixteen psitivc samples turned negative in thc fllwing BM examinarins; threc palients were stili psitive al the end f fllw-llp. Only I l' 16 psilive samples was taken during crlicslerid lreatmenl f G H D, cmpared l 51 f 135 negalive samples (P = 0.0 I). On the basis ť ťllwing, we hypthesized lhal msl ar the psitive results wcre false psitives and were mst likely caused by unspecific hind ing f patienl-specific primers l similar V- (O)-J sequcnces f nnmalignant Iymphcytes in BM. First, all patients with at least ne psitive sample remained free f leukemia with a median fllw-up ť 31 mnths (range ; nl significantly different fmm patienls with n psilive samplc, P = 0.17, Mann-Whitney). Als, a" patienls wh entered lhe sludy were MRD nega tive (n = 16) r lw psitive ( < 5 X 10-4, 1/ = 5) hefre the transplant. Finally, simultaneus RQ-RT-PCR detectin f the respective fu sin gene (BCR/ABL and TELj AMLl) in 10 relevant samples les led gaye a negative MRD result. Frequency ( amplificalin us ing nn-.\'(:i( clne-.i'pecific syslems Because f lhe suspicin f false psitivity, we lised different RQ-PCR systems specifk ťr unique V- (D)-J sequences f tw lher patients (nl specific fr thc leukemie cells f the given patients) t test whether rhe V- (D)-J sequences wuld evcn be amplified in such circumstances. A ltal f 100 pst-sct samplcs with sufficienl leftver DNA were tesled. The frequcncy f MRO-psilive samples in the selected chrt dill nt diffcr frm the whle chrt (ll % ). We used lw patie nt-specific systems bascd n lhe VH3- J H4 rea rrangement. Bth the VH3 family and JH4 represent the mst freq uently rearranged segments in physilgical B-cell develpment J7.3" T maintain the reprducibility f the data, we used assays with n backgrund amplificatin f plyclnal DNA ťrm PB ar healthy dnrs ('buffy cat' cells). The assays \vere riginally designed fr tw patients wilh ALL (nt included in the investigated chrt) using patienl-specific primers situated with their 5' end in the VH3 segment and lhe last seven nucletides spanning N segments. In t()la l, 20 ut ť 100 (20% ) and 15 ut f 100 (15 % ) samples werc psilive accrding t the ESG-M RD-ALL criteria using thse Bne Marrw Transplantatin

121 D,awbacks l pst t,ansplant MRD in childhd ALL E Frnkva l af UPNe d+30 d+60 d+90 d+140 d yr +2yrs +3yrs +4yrs +5yrs IglTCR assay: FG: #4 Ij VH2ND2 BCR/ABL #82-1/ VH5Nkl TEL/AML1 #287 Ij Vgl #321 Ij Vklll #374 Ij VH1NgI #375 Ij VH3Nkll BCR/ABL #415 Ij VH3Nkll TEL/AML 1 #429 Ij VH1 BCR/ABL #432-1/ VH1Nklll TEL/AML1 #450 Ij Vd2NgI #497 Ij VH3NgII #639 Ij Vd2NgI #658 VH3Nd2 BCR/ABL #710 -jj VH3NgII BCR/ABL #718 Ij VH3NH4 BCR/ABL #719 O Ij VH3NH4 TEL/AML 1 #861 Ij VgI/Db2 #906 Ij Vklll/Dd2 #914 Ij VH4Nd2 #919 Ij DH1 #923 DH3 Figure I POSL Lrrtnsplanl minil111 rsidual di sease (M RD) resulls (lgitcr) [rm 21 palients included in the sludy AII psilive sumples wcrt cvaluated as 'rsiti"e, nol quanlifiahle. O, MRD negatiw ;., MRD psitive: UPN, unique ralienl number; FG. fusin gene. Psitive samples: Assay1: 1/18 1/21 3/20 4 /11 6/15 4/15 Assay 2: 2/18 2/21 2/20 1/11 5/15 1/15 ú f...i.....j O {) _ d30 d60 d90 d140 d yrs pst-sct Figure 2 C. valuc r ralsc minimal residual di sť"'c (MRD) psitivc sumrle, usin g tw nn sclr-srecilic 19 CR assa)'s. hlled and emrl)' diamnds rcpresent thc tw dirfcrenl."ays. In lhé Ca se thal mre members f thc cxamincd triplicatc wcrc psitivc. thc hi gh('sl C, value was uscd assays. Of lhe eleven samples psitive in their wn patientspecific systems, five and fur werc als psitive in the tw nn-self clne-specific assays, respectively. Figure 2 shws C, values f false-psitive samples in bth assays. As the nset f psitive signal was diffcrcnt belween the tw assays, their Cl values are nt mutually cmpaľable. Given the fact that n backgrund amplificatin was present, au samples wuld ful fill the criteria fr therapy intensificatin. 27 Nnspeciflc RQ-PCR prducls di/jer /rm Ih l:' spccific prducrs in lenglh and sequence As we bserved n difference in the length f mst nnspecific RQ-PCR prducts n 8% plyacrylam.ide gel (data nt shwn), we emplyed a mrc ensitive Agilent DNA analysis by n-chip electrphľesis. Figurc 3 silw an electľphretgram f the díagnstic sample (I: dilutin in buffy cat) f the patient whse assay was uscd fr amplificatin cmpared t thľee diffcrcnt false-psitive samples frm different patients thal differ in size and/r pattern. Sequencing f 10 false-psitive RQ-PCR prdllcts revealed the use f different N nuc1etides dwnstream frm the matching sequence f the patient-specific primer. Assessmenl f B-cell recnslilulin in lhl! BM lis ing KREC delecrin [n the curse f V- (0)-1 recmbinatin, [g (TCR) gene segments are assembled, leaving nnreplicable circular DNA fragments as 'by-prducts'. T-cell recmbinalin circles deteclin has been cmmnly lised as a quantilative marker f thymic utput J9 Detcctin f B-cell recmbinatin circles has nt been widely emplycd dlle t the cmplicated structure f [g genes. Recently, detectin r excisin circles riginating in the deletins f [g light chain ]( (KREC) was described J (, As IGK delctin ccurs in all B ne Marrw Transplantatin

122 Drawbacks f pst transplant MRD in childhd ALL E FrkGva et a/ " O c 20 ::J O Ol u c Ol u (f) ll:' Ol > '';::; cu 60 Ol cr: , Ó i j!, I 20 i O 1,! 15 10Q 100 i 80...! I i, I i I 20 t O j, I SpO Size (bp) a b c d Figurc 3 Agilenl DNA chip electrphrelgram f speific and unspeci nc real-time q uantilalive PCR (RQ-PCR) prduels. Rth 15 and 1500hp praks represe nl lwer "nd upper D NA markers, "nd... "xi, va lues are cxprcsscd as relalive Auresccnce units. (a) The prduct ar patient-spceific RQ-PCR. Thc diagnslie ALL samplc liscd fr arnrlilicalin was 1' diluled in plyclnal DNA rrm heaithy dnrs. (b-d) Nnspecil1c RQ-PC R prducl' ampli ljed fmm lhree differcnl palienls' fttw-up,amples Ilsing lhe nn-setf-spccific assay f lhe pa lienl frm (a). Iymphcytes lhat fail t rearrange IGK prductively n ne r bolh a lleles, the number f K R ECs in the BM refleets the number f Jcvelping B Iymphcytes. Figure 4a shws the number f KRECs relative t the DNA frm the BM dnr sample during t:ne pst transplant perid in 100 BM samples. With few exceptins, Ihe KREC leve ls rse cntinuusly, remaining lwer than thse f the cntrl until day 90 and having a median value higher than the cntrl 1-3 years pst-sct. This result was in cnerdance wlth the lwer intensity f immunsuppressin in later time pints. Figure 5a shws the impact f immunsuppressin taken at the time f sample cllectin n the nllmber f KRECs fr all time pints tgether. Supplementary Figure I shws the same a nalysis fr individual time pints. KREC number crrelated well with the ťalse psitivities bserved in nn-self-specific 19/TCR assays. Figure 6a shws the difference in the number f K R ECs between the samples with negative and false-psitive MRD. False MRD psitivity was mre frequent in samples with higher KREC number than in the negative nes (P<O.OOOI, Mann Whitney). This trend was als significa nt fr a ll but lle (day 140) pst-sct time pints tested individually (Sllpplementary Figure 2a). Bne Marrw Transplantatin

123 Orawbacks l pst transplant MRO in childhd ALL E Frnkva e/ a/ Assessmenl uf'lvmphucyle recullslilulin in Ihe BM' samples by immunphentl'jjing Evaluatin f B-cell subsets and T cells was available in 77 ut f 100 <Ind 69 u t f 100 samples, respectively. Cnsistent with the results f KREC detectin, immunphentyping shwed a trend tward higher ttal B-cell (CD 19 P <") numbers (P = 0.06, Kruskal- Wallis) a nd an a 8 7 <ll 6 Ci c 5 TI 8 4 ID > 3 m 2 (J w cr: O b 25 c u L() " " cn 5 (J O C *' " cn 10 (J 5 O d " M 10 (J 5 O e eg e +ll$ n=18 n=21 n=20 n=11 n=15 n=15 - ée1q n=16 n=16 n=17 n=5 n=12 n=11 g eé Ó 6óO. n=16 n=16 n=17 n=5 n=12 n=11 +$ n=14 n=15 d30 d60 n=16 n=5 n=11 n=8 d90 d140 d yrs pst-set - - incrcasc in T-cell numbers during the pst transplant perid (P = 0.02, ne-way ANOVA; Figures 4c and d). The diffcrence in B-cell prgenitr (CD 19 P <"CD45""") numbers was nt significant (Figure 4b). The impact f immunsuppressin n the number f B-cell prgenitrs, Band T cells is shwn in Figures 5b, c and d (fr all time pints tgcthcr) and in Supplementary Figures lb, c a nd d (fr individual time pints). Figure 6b and c shws that samples with false-psitive MRO had higher numbers f immature B cells (CD 19 1 "-"C045 dim ) and ttal B cells than negative nes (P < I, Mann-Whitney). Als, the numbers f COIO + 'COI9 p " COlO p 'COI9 p 'and C034 ps COI 9 PS cells were significantly higher in samples with false-psitive MR O (P < I, P = and I, respectively, data nt shwn). The number f T cells (C03 p O') was nt differcnt between the tw grllps (Figure 6d). Supplementary Figures 2b, c and d shw the same a nalysis fr individual time pints. Discussin MRD mnitring using antigen receptr gene rearrangements ffers a highly sensitive tl fr pst transplant management l' high-risk ALL. On the basis f MRD psitivity, Illethds ať preemptive imlllunthera py (DLI, immunsllppressin withdrawal) ar chemtherapy ca n be emplyed earlicr than when using thc lcss sensitive mixcd chime rism Ol' Ilw cytllletric detectin. Hwever, ur study demnstrated that even when all the criteria fr MRD interprelatin dcvelped during the past decade are met, there is a cnsiderable risk f false-psitivc MRD results a fter SCT. Even thugh a ll such rcsults wuld be classified nly as 'psitive, nt qllantiflable', thcy wollld mean at best the necessity ať rcpeated examinatin tgether with putting mre stress n the patient and their parcnts, and at wrst the applicatin f preemptive treatment. ln ur chrt, 9 f 21 patients were MRD-psitive a t 1east nce during the flrst 3 years pst-sct lising clnespecific 19jTCR RQ-PCR assays. N patient has relapsed s far, with a median fllw-up ť 31 mnths. This number des nt rellect the exact number f psitive reslilts in all transplanted patients, as ur chrt was selected based n Figure 4 LymphcYlc rccnslilutin during Ihc psl-sct perid wa s described by Ihe fllwing: (a) K-delelin exc isin circle, (KRE ) numhers expressed relalive (O the dnr BM snmpl. (KREC numh"r I).One-way analysis f variancc (A NOVA), nl significant diltcrcnce: Kruskal Wallis, P=O.OOl I (significa ntly differenl level bctwcen lime pinls I and 5, I nnd 6,2 and 5). (b) Pcrcentage l' B-cell precursrs (CU 19''''CD45'''''') ut l' Ihe lolal BM cell number during lhe psl-ser perid. One-way ANOV A, n l significanl difference: Krllskal Wallis, nl significanl diťkrcn cc. (c) Percentage f B cells (CD I 9 1 "") aul f Ihe 10Ial flm cell nurnbcr Juring lhc posi-sct perid. One-way ANOV A, nl significanl di /Terentc: Kruskal Wallis, noi significanl difterence (P = 0.06). (d) Percťntagc ť T cells (CD3"''') OUI f Ihe 10lal BM ce ll number during Ihe psl-sct peri d. One-way ANOV A, signiftcanl diffcrcncc (P = 0.(020): linear Ircnd, significa.nt increase amng time pints (slpe II. 8, I' d l.oooi): Kruskal Wallis, P = (si gniflca nlly differenl level bclween lim" pints I and 5. I and 6). Marrw Transplantatin

124 a 8 7 tll 6 Ci c 5 "O B 4 Ol ;; > 3. <II 2 u w II: l<: b 'j. E 15 č 1!1 V 10 ;; " Cl 5 u c " - Cll 15 Ci u 5 d 35 r P=O.11 "' P< O.OOO1 P< r 'I r -. =-=.... n=37 n=44 n=18 P=0.075 "'\ Ťr P<O.OO01 P< 'I r "I. S I I I I 1... n=29 n=34 n=13, P= r " 25 P<O.OO0 1 P <0.OO01 r 'I " - 15 M u 10 5 d:j + Ó n=29 n=34 n=13 P=0.12 P=O.054 "',-c- r r P=0.57.r 'I t I -. n=24 n=32 n=12 CsA CsA, MP nl5 Figure 5 The irn paci f immullsuppr, ive Ireulrne l11 laken <ll Ihc time ar '.. rnple cllecli n n Iymphcyle sunsels (ull time pinls lgelher). [ ' pre,sed as K-dd cli n excisi n circles (KREC) numbers relalive t lhe dnr BM sample (a), and as a pcrcentage f B-cell p recursrs ICDI9'>O'C D45 d ;"" bl, B cells (COI9""" cl and '1' cells (CD 3"''', d) ul f Ihe 101al BM cell numncr. T he Mann Whitney lesl was used f r slalis!ical anal ysis. MP, melhylprcdnisl ne; 1$, immun,uppressi n, Cs, cyd sprin A. On pa licnt rcceivcd myc p hcnlalc 111 0telil pl us mclh ylprcdnislne I yca r posl-ser (nl shwn). Ordwbdcks f pst trdnsplant MRO in childhd ALL E Frnkva el al the leukemia-free survival and n the availability f pst tra nspla nt material. Kneehtli el a l.' bserved pst transplant M R D psitivity in 8 f 36 pa ticnts wh remained in cntinuing emplete remissin. AII M RDpsitive samples in their study had been fllwcd by negative nes, cmpared t 9 f J6 psitive samples in this study. O n the basis f the interim results, we already ensidered the last three psitive samples in ur study t be false psitive a nd did nt invite patients t underg repeated examinatin ut f sched ule, s we have nt received the M RD results s fa r. One ean speculate that Lhse psitivities were real and retlected GVL effeet preven ting a hematlgical relapse. AII f the patients se lected fr this study were MRD negative r lw psitive befre the transplant, which has been shwn t dente a lw risk f pst transplant relapse in several sludies. s H. 17 Mrever, II f 16 psitive samples cming frm palíents with fusin genes were negative in simultaneus rusin transeript detectin. We emplyed tw nn-sclf-specific RQ-PC R assays a nd bserved a substantial percentage l' false-psi tive amplificalins in ur chrt f samples. MRD mnitring based n anligen receptr gene rearrangements utilizes 'fingerprint-like' v- (D)-J sequcnccs f leukemie clnes fr primer design. Nnspecific amplifieatin in plyclnallymphcytes with simila r rearrangemcnts is usually determined using pled PB DNA frm 5-10 healthy dnrs, and its ecurrence depends n the type r Ig/TCR targel and the number f inserted N nllcletides (abut 30-40% in fgh whereas 90% in TCRG targets)40 Recently, van der Velden el al 41 reprted thal the level f nnspecific ampli ficatin in IGH largels depends n lhe lime pint during the ind uclin treatment and is the highest in the pst-maintenance perid dlle L Ihe prevalence l' CDIOp'Tdpe g precursr B eells with cm plete VH-JH rearrangemenls in the B-cell empartmenl. Thc aulhrs cncluded, hwever, thal ESG-MRD-ALL guidelines fr interpretatin f RQ-PCR data were sufficient fr frntline ALL therapy mnitring, with less than 2% falsc-psilive results. As we were limited in sample size, s \Ve culd nl y analyze tw lgh targets representing the same type (VH3 and JH4) f rearrangement t minimize assay-specifie variatins. Bth assays had n baekgrund in PB buffy eat; stili, \Ve bserved 20 and 15% false-psilivc results using regenerating pst-sct BM samples. Regarding immune cell recnstitutin, SCT cnstitutcs a unique siluatin. Accrding t the KREC levcls representing in ur setting the utput f B eells frm BM, thc median Icvel remain$ lwer tha n that f the cntrl grup unlil I-year pst-sct. This resull is in cncrdance with lhe stud y f K k el al. : 2 wh bserved a depressin r ttal B-I ymphcyte cunt until 18 mnths psl-sct. Hwever, a fractin f patients had higher va lues than hca lthy BM dnr startin g in a few ca ses as sn as day 60 psl-sct, and creating mre than half f the chrt 1-3 years pst SCT. Higher numbers f lotal B cells were als bserved in a study f patients surviving yea r$ after lranspjanta ti n 4J The prblem r extensive regeneratin causing unspccifie primer binding culd be theretically vercl11c by using regenerating BM DNA instead f DNA frm buffy cats as a negative entrl; hwever, the availability ť such Bne Marrw Transptanlalin

125 Drawbacks l pst transplant MRD in childhd ALL E Frnkva el al b 25 $ a 8 7 P< E 6 5 E 15 "';:; m '6 li) (1) 4 0;0 ó v 10 c 3 :<; u "- w"o 2 m 5 cr: Y: 1 u :t P< False-psitive MRD Negative MRD False-psitive MRD N egative MRD n=26 n=74 n=18 n=59 C 35 d 35 P< * "- 15 m 15 M u u P= "i "- I I False-psitive MRD Negative MRD False-psitive MRD Negative MRD n=18 n=59 n=15 n=54 t"igure 6 Lymphcytc rccollstit utin in minimal residua l di sca sc (MRO)-ncga ti ve vs :viro ralsc-psiti vc samplcs (all time pints tgcthcr). (a) Expressed as K-d ele ti n cxl'isin cirdes (KREC) num bers rela ti ve t the dnr BM sample. (b) Expresscd as a perccn tage f B-cell precu"rs (C D I 9'''''C045'''''') and (c) S-cell percentage (CD 19"''') a ut l the tolal BM cell number. (d) The number ft cells (CD 3"''') in the tw grups W<l S nt diffcrent. Thc Mann- Whitllcy test was used I' r sla tistical analysis. Thc sampk was assessed as MRO fa lse posili ve ifpsilivity accrding t Eurpean Study Grup n Minimal Residual OisCJSC in ALL (ESG-MRO-ALL) critcria Was de,ected in al!cast nc f thc t\va nn-scl f-spccific assays. material in practice is very limited. Our recmmendalin is 10 cntinue using PB buffy cats while carefully judging cases uf nol quantifiable psl-sct MRD psiti vily. As a ll lhe RQ-PCR prd ucls we s equenc ť d and analyzed by nchip eleclrphresis differed frm the specific nes, perfrming at least ne f the tw techniques wuld pay fr in such cases. The impacl f preemplive therapy based n pasl transplant MRD Ol' c himerism deteclin has nl been pr ve n s far n a larger chrt f pa ticnts. In ur previus sludy, all atlempts used t averl psl-set relapse shwed nly a limited r lemprary e ffecl." On l he basis f lhese resulls, we are nw wrking n pre-lra nsplanl MRD mnitring t enable adding lreatmenl t minimize MRD level befre the transpla nt a nd thus the ri sk r relapse. Hwever, pst lra nsplanl MRD m nitring stili remains an exlremely useful tl fr thera p y management, if judged with cauti n. Acknwledgements This wrk was supprtcd by MSM , MZO , MZdNR8269-3(2005, MZdNR and GAUK 7543/ References Eckert C. Bindi A, Seegcr K, Cazzaniga G, Ha rtmann R, Bcyermann B e l al. Prgnstic value l' minimal residual di sease in relapsed childhd acutc Iymphblaslic leukaemia. Lancel 200 1, 358: Flhr T, Schrauder A, Cazzaniga G, Pa nzer-grumayer R, va n der Velden V, Fischer S el al. Minimal residual di,easc-dircclcd risk stratifica lin using real-time quanlilalive PCR analysis l' immungjbulin and T-ce ll receptr gene rea rrangements in the internatina l mullicenler lrial AIEOP-BFM t\ll 2000 fr childhd acute Jymphblastic leukemia. Leukemia 2008 (in press). Pui CH, Schrappe M, Ribeir RC, Niemeyer C M. Childhd and adlescent Iym phid and myclid Icukcmia. lienwll(jy (Am Sc HemalOl Educ Pr(Jl'am ) 2004; 2004: van Dngen JJ, Seriu T, Panzer-Grumayer ER, Bindi A, Pngers- Willemse MJ, Crral L el al. Prgnslic valuc l' minima l residual di scasc in acute Iymphblastic Icukacmia in childhd. Lancel 1995; 352: Bader P, Hancck.I, Kreyenberg H, Gulden NJ, Nielhammer O, Oakhill A Cl al. Minimal res idual disease (MRD) slalus prir 10 allgeneic stem cell lransplantalin is a pwerful pred ict r fr pst-transplant ulcme in children wilh ALL. 1.RlIkemia 2002; S Knechtli CJ, Gulden NJ, Ha ncck JP, Grandage VL, I-Iarris EL Garland RJ el a!. Minima! residual disease status befme allgcncic bne marrw transplantalin is an imprtant determinant f successful utc me fr children and adlescents with <leutc Iymphblastic Icukemia. Bld 1998; 92: ()79. 7 Krejci O, Van der Vel den V, Bader P, Kreyenberg H, Gulden N, Hancck J CI a!. Leve! f minimal residua I disease prir t haematpielic transplantatin predicls prgnsis in paedialric patients with acule Iymphblastic Icukaemia: a reprt f the pre BMT-M RD Study Grup. Leller. BOl/e Marml\' Tramplmll 2003; 32: Sramkva L, M llzikva K, Frnkva E, Krcjci 0, Scdlacck p, Frma nkva R el al. Detcctahle minimal residua I discase befre a llgeneic hematp ictic slcm cell transplanlatin predicls extremely pr prgnsis in childrcn with Marrw Transplantatin

126 Drawbacks f pst lransplant MRD in childhd ALL E FrO/lkva et a/ acule lyrnph blas lic leukerni a. Pedilr B/d Cncer 2007; 48: Bader P, Bec k J, Frey A, Sch legel PG, Hebarth H, Handgreli nge r R cl al. Serial a nd qua nlitalive analysis f mi xed herna tpielic chimerisrn by PC R in palients wilh acute Icukemias a ll ws lhc predictin f relapse a ft er a llgeneic BMT. Bne Marr lv Tramplanl 1998; 21 : Zelterquist H. Ma tlss n J, zunel M, Nasrnan-Bj rk f. Svenberg P, T arnrn ik L el al. Mixed chimeri sm in the B cell lineage is a rapid and sensili ve indieatr f minimal resid ual discase in b ne rn a rrw transplant recipient> \\' ith pre-b cell acute Jyrnphblastic leukerni a. Bne M rrw Ti-ansplan! 2000; 25: II Sa nchcz J, Scrra n J, Grncz P, M arlincz F, Martin C, Mader L cl l. Clinica l va lue f immunlgicalmnitring l' minimal residual disease in acule Iyrn phblas lic leu kaemia after allgeneic transpl.anta ti n. Br J HaelllulGl 2002; 116: Radi eh J, Gehly G, Lec A, Avery R, Brya nt E, Edmands S cl l. Detec ti n f ber-abl transcripts in Phil adelphia chrm SOllH>psitive ac ute Iym phblastic leukemia a ft er ma rrw lranspla nta till. Blrt 1997; 89: Knec htli CJ, Gulden NJ, Hancck.I P, Harris E L. G a rl a nd RJ, Jnes C 1'1 ul. Minimal rcsidual discase status as a prcdictr f rela pse after allgen ei, bne ma rrw transplanta ti n f r children with acllte Iymphblastic leukaemia. Br J Hemtl 1998; 102: Mi glin M, Beriss G, Grass R, Ca nepa L, la vi M, Pierri f CI al. AHgeneic bne ma rrw transplanla tin (BMT) f r adulls wi lh acule Iymph blastie Icukemia (ALL): pred ictive r le f minima l residual disease moniloi"ing n relapse. Bne MrrlV Trnsplanl 2002; 30: Radi ch J, Ladne P, Gley T. Plymerase chain reaclinbased detec ti n f minimal residual dis use in acute Iymphblastic leukemi a predicts rela pse a fter a ll geneic BMT. Bil Blrt MrrlV TrnJplanl 1995; I : Uzunel M, Ja ksch M. Mattssn J, Ringden O. M in ima l re idual disease detccti n after al lgeneic stem ce ll transpl a mati n is crrela ted t relapse in patients with ucule Iym phblastic leukaemia. Br J Hem%l 2003; 122: Spindli O, Peruta B, Tsi M. Guerini V, Sa lvi A, Zantti MC el al. Clearance f minimal residual d iscase a ft er a llgeneic slem ccll transplan la ti n a nd thc prcdicti n f thc clinical ulcme f adult palients with hi gh-risk acule Iymph blasti c leukemia. HuemallOl/ica 2007; 92: / Bader P, Klingebiei T, Seha ud t A, Theu rer M ainka U, Handgrctinger R. La ng P el al. Prcventi n f relapse in pediatrie pa lienb wi th ac ulc leukcmias a nd MDS after allgeneic SCT by ea d y immuntherapy initia ted n the basis f in creasing mixed chimerism: a single center experi ence f 12 children. Leuke/l/ia 1999; 13: Cllin s Jr RH, G ldstcin S, Giralt S, Levine J, P rler D, Drbyski W Cl ul. D nr leukcyte infusins in acute Iymphcylic leukemia. Bne MrrOI!' Tramplanl 2000; 26: 51/ Dminietl A, Pzzi S, M igli n M, Albarracin F, Piaggi G, Bcrt l tti F Cl al. Dnr Iymphcyte infusins f r the lrea lment f minimal resid ua l di sease in acute leukemia. Bld 2007; Keil F, Kalh, P, Haas OA, I;ritsch G, Reiter E, Ma nnhalter C el al. Relapse f Philadclphi a chr msmc psitive acule Iymphblasli c leukacmi a a ft er ma rrw lranspla nla li n: sustai ned m lecula r remissin after earl y and dsecscala ting infusi n f d nr IClIccylcs. Br J Haemull 1997; 97: Lren AW, Prter DL. Dnr leukcyle infusins f r thc treatment l' relapsed acltte leukemi a after a llgeneic stem cell transplantatin. Bne M urrlv Tral1 spl l ; 41: 4l)J Mehta PA, Davics SM. Allgeneic tra nsplanta ti n f r childhd ALL. Bne MarrOlv Tramplnl 200S; 41: Pui CH, Jeha S. New therapeutic strategies fr lhe treatm ť nt f acute Iymphblastic leukaemia. N al Reu Drl/q Disell!' 2007; 6: Schil ham MW, Balduzzi A, Bader P. ls lhere a rle fr minimal rcsid ual disease Icvcls in thc trca tmcnt l' A LL pa tients wh receive a llgeneic stem cells') BOlle Marr ll' Trnsplunl 2005; 35 (Suppl I ): S49-S52 26 Yaza ki M, And h M, It T, Ohn T, Wada Y. Succcssful pn:vc ntin f hcma l lgical rel a psc f r a pa ticnt with Philadelphia chr msme- psiti ve ac Ul C lymphblas lic leukemia a ft er a ll geneic bne marrw tra nsplantati n by d n r leukcyte infusin. Bne Marrw Tra/lSplalll 1997; 19: van der Velden VH, C t7.z<tniga G, Schrauder A, Ha m:ck J, Bader P, Panzer-Grumayer ER el al. Ana lysis f minimal resid ua I di sease by fg/tcr ge ne rea rra ngements: guidelines f r interpretati n f real-time q ua ntita ti ve PCR data. Lellkelllia 2007; I. 28 P nge rs-willemse MJ, Seriu T, Stlz F, ďani e ll E, G a meir P, Pisa P el l. Primers a nd prtcls f r slanda rdized detectin f mini ma l residual disease in aeule Iym phblaslic le ukemia using im munglbulin and T ce ll receptr gene rearrangements a nd TAL! deletins as PC R targets: rep rt f the BfOMED- 1 Cncerl ed Aclin: in vcs tigatin l' mi nim al residual disease in acute leukemi a. Lel/kemia 1999; 13: van Dngen JJ, La ngcra k A W, Bruggcma nn M, Evans PA, Hummel M, Lavender FL el al. Design a nd sta ndardizatinn uf PC R primers and pr tcls f r detec ti n f clnal ii11i11un glbulin a nd T-cell receplr gene recmbina li ns in suwect Iymph pr lifc ra ti ns: rcprt f thc BIOMED-2 Cnccrtcd Actin BM H4-CT Leukemi 2003 ; 17: Langerak AW, W lvers-tetter fl, va n G aslel-m l EJ, Oud ME, van D nge n JJ. Basic helix-ip-hclix prleins E2A and H EB induce imma ture T-cell receptr rearrangements in nnly mphid cells. Bld 2001 ; 98: van der Velden VH, Wijkhuijs JM, Jacbs DC. va n Wering ER, va n D ngen JJ. T cell receptr gamma gene rea rrangemenls as t.argels fr detectin f millimal residua l disease in acute Iymph blaslic leu kemia by real-time quantilalive PC R analysis. Leukemia 2002; 16: va n der Velden VH, Willemse MJ, van der Scht CE, Ha hjen K, van Wering E R. va n Dngen JJ. Immunglbulin kappa deleting element rca rra ngements in precursr-b aeute Iy mphblastic Icukemia a re sta ble targets f r detectin f mi ni ma l I"esidua l d isease by real-time quantita li w PC R. Leukemi 2002; 16: Verhagen OJ, W ill emse MJ, Breunis WB, Wijkhuijs AJ, Jacbs DC, Jslcn SA Cl al. Applicati l1 f gcrmlinc fgh prbes in real-time qua ntila tive PCR fr thc dclccli n l' mi nima l residual di seasc in acute lymph blastic leukemia. Leukemi 2000; 14: P ngc rs Willcmsc MJ, Vcrh agcn OJ, T ibhc GJ, Wijkhuijs AJ, de Haas V, Rvers E el al. Real-tillle quantitati ve PC R fr the detectil1 f minima l residua l disease in acutc Iymphblaslic leukemia using juncti naf regi n spc ifi c T aq Mun pr bes. Leukemiu 1998; 12: Luci P, Pa rreira A, va n den Beemd MW, van Lchem EG, va n Wering E R, Baars E el al. 1"1011' cytmelric a nalysis l' nrma l B cell differentiatin: a fra me f reference f r thc detectin f minimal residual discase in precursr-b-all. Leukemia 1999; 13: Bne Marrw Transplantatin

127 Drawback, l p,t transplant MRD in childhd ALL E Frnk'!a el a! 36 van ZChll MC, Szczepanski T, van der Burg M, van Dngen Jl. Rcplicatin histry f B Iymphcytes rcvcals hmcstatic prliferatin and extensive antigen-induced B cell expansin. J Exp M ed 2007; 204: Ck GP, Tmlinsn 1M. Thc human ill1munglbulin VH repertire. ImmLlnl Tday 1995; 16: Ra:1phrst FM, Raman CS, Tami J, rischbach M, Sanz r. Human 19 heavy chain CDR3 rcgins in adult bne Illarrw pre-b cells display an adult phentype f diversity: evidence fr structural seleetin l' DH a min aeid sequences Immlln! 1997; 9: Hazenberg M D, Verschuren M C, Hamann D, Miedcma F. van Dngen JJ. T cell receptr excisin eircles as Illarkers fr recent thymic cmigra11ls: basie aspcets, technica l apprach, and guidelines fr inlerpretatin. J Ml Med 200 I; 79: Van Der Velden VH, Hchhaus A, CaZ7.Átniga G, Szezepanski T, Gabert J. Van Dngen JJ. Deteetin l' minimal residual discase in hematlgie malignancies by real-time quantitative PCR: principles, appraehes, and labratry aspects. Leukemia 2003; van der Velde n VH, Wij khuijs JM, van Dngen JJ. Nn-specific amplifieatin f patient-speeific IgITCR gene rcarrangcments dcpends n the time pint during therapy: illlplicatins rr minimal residua l disease mnitring. Leukemiu 20013; 22: Kk ll. Gldman F, Padley D, Giller R, Rumclh a n S, Hlida M el al. RecnstrueLin f thc immullc system artcr unrelated r partially matched T-cell-depleted bne mrr\v transplantatin in c hildrcn: immunphcntypic analysis and factrs arrcctin g the speed r recvery. Blud 1996; 88: Strek J, l seph A, Es pin G, D awsn MA, D uek DC, Sullivan KM e l al. ImmuniLY f patients surviving yedrs after allgencic r syngeneic bne marrw transplant8.lin. B!d 200 I: 98: Supplemenlary Infrmatin accmpanies the paper n Bne Marrw Transplantatin websitc ( Ma rrw Transplantatin

128 E. Mejstříkvá, strana 116 Př ílh a 7 Minimal residual disease (MRD) analysis in the nn-mrd-based ALL IC-BFM 2002 prtcl fr childhd ALL: is it pssible t avid MRD testing? E Frnkva, E Mejstrikva, S Avigad, KWChik, L Castill, S Manr, L Reznickva, T Valva, K Zdrahalva, O Hrusak, Y Jabali, M Schrappe, V Cnter, S Izraeli, CK Li, B Stark, J Stary and J Trka Leukemia (ff 6.924)

129 E. Mejstříkvá, strana 117 ORIGINAL ARTICLE leukemia (200S) ature Publishing Grup AII rights reserved /08 $ "inimal residua I disease (MRD) analysis in the nn-mrd-based AU IC-BFM 2002,rtcl fr childhd ALL: is it pssible t avid MRD testing? "nkva 1, E Mejstrikva 1, S Avi ad2, ', KW Chik 4, L Casti ll0 5, S M anr 3, L Rezn ickva 1, T Va lva 1, K ZdrahJlva \ O Hrusak \ labali 6, M Schrappe 7, V Cnter, S Izraeli 9. 1, CK Li 4, B Stark2.J, J Stary l and J Trka 1 iťfjil rtment f Pediatric Hemat%gy and Onclgy, CUP, Secnd Medical Sch/, Charles University and University Hspita/ ml, Prague, Czech Repub/ic; 2Pediatric Hemat% gy Onc%gy Department, Schneider Chi/dren 's Medical Center f Israel, 'ah Tikva, /srael;.1 Sack ler Faculty f Medicine, Tel Aviv University, Tel Aviv, Israel; 4 Department f Pediatrics, Prince f Wales 1SfJital, The Chinese Universit:.. f Hng Kng, Hng Kng, China; "Servici Hemat Onclógic, Centr HspJtalari Pereira '&Sť /l, Mntevide, Uruguay; Department af Pediatrics, Reginal Hspital, Ceske Budejvice, Czech Republic; ' Department f '!iiatrics, University Hspita l Schleswig-Hlstein, Kiel, Cermany; 8Departm ent f Pediatrics, University f Milan-Biccca,!pfdale San Cerard, Mnza, Italy; qpediatric Hemat-Onclgy, Cancer Research Center, Sheba Medical Center, Tel lshmer, /srael and losa ckler Faculty f Medicine, Tel Aviv University, Tel Aviv, /srael 'l1e ALL IC-BFM 2002 prlcl was crealed as an alternalive 10 MRD-based AIEOP-BFM ALL 2000 sludy, 10 Inlegrale early tipoilse crileria Inl risk-grup slratlficalin in cunlries nt liirming ruline PCR-based MRO lesling. ALL IC slraliflca IIXI cmprfses Ihe respnse 10 prednisne, bne marrw (BM) IIIIphlgy al days 15 and 33, age, WBC and BCRlABL r MLU IF4 presence. Here, we cmpared Ihis slratificalin 10 Ihe MROcrileria using MRO evalualin in 163 palienls frm fur tll le member cunlries al days 8, 15 and 33 and week 12. lad negauvily al dav 33 was asscialed with an age f 1-5, WBC<20000,11-', nn-t immunphenlype, gd ndnisne,respnse and nn-m3 mrphlgy al dav 15. There n significanl asscialins wilh gen der r hyperdiplidy Ihe sludy grup, r wilh TEUAML 1 fusin wilhin BCP-ALL. '-Jents wilh M1/2 BM al dav 8 lended 10 be MRO negalive al Ieek 12. Palienls slratlfied inl Ihe slandard-risk grup had a liiier respnse Ihan inlermediale-risk grup palienls. Hw Mr, 34% f Ihem were MRO psltive al dav 33 and/r week 12. Our findings revealed lhal mrphlgy-based ALL IC 'IIi grup slralificalin allws Ihe Idenlificatln f mst MRO h risk patienls, bul fails 10 discrimlnale Ihe MRO lw-risk pp assigned 10 Iherapy reduclin. _',J.emia advance n line publicatin. 28 February 2008; : /leu {eywrds: acute Iymphblastic leukemia; minima I residual ase; risk-grup stratificatin ; immunglb ulin and T-cell receptr e rearrangements; bne marrw mrphlgy Intrductin ra l retrspective studies frm the late 1990s ha ve shwn the nical,ignificance f minimal resi dual disease (MRO) in "ildhd acute Iymphblastic leukemia (ALL}.1 -] Based n resul ts, MRO testing has becme a part f the risk-grup alificatin prcedurc in several f th e mst prgressive ALL :ealment prtcls - 7 ln 2000, the Internatinal Berlin 'ankiurt- Munster Study Crup (I -BFM-SG) incrprated MRO ling int risk-grllp striltificati n in the AIEOP-BFM ALL 2000 I. Alrnst all 'classi ca l' risk features (except prednisne 'IpOnse, t(4;11), t(9;22) and inductin failure) were mitted in 'lltelpndenee: Dr J Trka, Department f Pediatrie Hema tlgy and l!!clgy, Charl es Univ"rsity, 2nd Medieal Sehl, V uvalu 84, Pragu > 5, zeeh Republic.. ail: jan.trka@lfmtl.cuni.ez ':I:eived 2 JJnuary 2008; aeeepted 17 January 2008 this risk-grup stratificatin. M RO negativity at day 33 (d33, end f inductin phase 1) and at weekl2 (w12, befre cnslidatin treatmentl stratified patients t the standard- (Iw) ri sk grup, w hile high M RO level at w12 was an additinal cntributin t the cla ss ical high-risk featu res U Mi nimal residual d isease mnitring in the A IEOP-BFM ALL 2000 trial is based n real-tirne quantitative PCR (RQ-PCR) detectin f patient-spec ific immunglbulin (lg) and T-cel l receptr (TCR) gene rearrangements, whi ch is currently cnsidered the mst reliable tl fr MRO cliagnstics. Hwever, this methd is time-cnsumi ng, lgistically demanding and relatively expensive. Mrever, t guarantee the credibility f the result s, it requires regul ar inter-iabratry quality cntrl s 9 Fr these reasns, thi s methd is stili inapplicable in many labratries arund the wrld. ln 2000, many cuntries within I-BFM-SG were nt able t apply rutine MRO testing t clinical practice; therefre, a new prtcl, ALL IC-BFM 2002, was desi gned in parallel t AI EOP BFM ALL Cuntries that jined the ALL IC cnsrtium wanted t test the pssibility f (at least partially) gaining additinal prgnstic infrrnatin by nn-mro-based methds. The patients were stratified int standard-risk, intermediate-risk and high-risk grups (SR G, IRG and HRG, respectively), accrding t age, white bld cell (WBC) cunt, blast prprtin in peripheral bld after 7 days f prednisne and a si ngle intrathecal d se f methtrexate (prednisne respnse) and the presence f t(9; 22) and t(4; 11) fu sins (Figure 1). As the mrphlgical assessrnent f bne marrw (BM) at day 15 (d15) prvided additinal prgnstic infrmatin, 10 d15 BM evaluatin was newly added t the stratificatin scheme. A 510w respnse t treatment detected as M3 BM at d15 re-striltificd patients t higher risk grups. Mre th an 800 children a year frm 12 cuntries all arund the wrld (including Argentina, Chile, Cratia, Czech Republic, Hng Kng, Hllngary, Isra el, Pland, Serbia, Slvakia, Slvenia and Uruguay) were trejted accrding t the ALL IC prtcl. Apart frm the treatment questins, ne f the ga ls f th is study was t cmpare thi s riskgrup assessment t th e MRO-based criteria used in AIEOP-BFM ALL Therefre, this study asked the qllcstin wh ether it is pssible t avid MRO testing in sme subgrups f ratients. The study was ca ll ed 'Mini Risk' and collsisted f MRO evaluatin in 163 patients treated in fur rn ember cuntries f the A LL IC cnsrtium (C zech Republ ic, Isracl, Hng Kn g and Uruguay).

130 E. Mejstříkvá, strana 118 MRD and risk grup stratificatin in childhd All treatment prlcl E Frankva et a/ Patients, materials and methds Pa tients A ttal f 207 children with ALL (age 1-18 years) treated in the Czech Republic (Nvember 2002 t February 2004, n = los), Israel Uanuary 2004 t Oecember 2004, n = 48), Hng Kng (January 2003 t March 2004, n - 36) and Uruguay (April 2004 t March 2005, n = 18) were included in the Mini Risk study. AII children were treated accrding t the ALL IC-BFM 2002 prtcl. As Ihe Mini Ri sk study was mainly aimed at SRG, sampling f SRG patients in the Czech Republ ic cntinued t Octber Mrever, Czech HRG and T-cell ALL (T-ALU patients cnsecutively diagnsed up t Oecember 2004 were enrlled in the study t acquire suffjcient numbers f patients in dg. Oay 8 Oay 15 Oay 33 Risk grup: agel 6yand age<10rl!6yrsr 1(9;22), 1(4;11),r WBC< and WBC l! and blasls d8l! blasls d8< blasls d8< Ml/2 I M3 I Figure 1 The risk-grup stratificatin scheme in the ALL-IC BFM 2002 trial. M1/2/3, BM status accrding t mrphlgy, Ml «5% blasts), M2 (5-24% blasts) and M3 (:;" 25% bl asts). BM, bne marrw. the analyzed subgrups. Twenty patients were nt analyzed fr MRO: 3 because f early death during the inductin phase and 17 because f pr quality r missing diagnstic ONA. The BM sampling was perfrmed at up t six fixed time pints alng the curse f the treatment prtcl: d8 (Czech Republic nly) and d15 f inductin, end f inductin phase 1 (d33), precnsl idatin (wl2), pre-reinductin (w22) and at the end f the first year f treatment (w52). BM was classified as Ml «5% blasts), M2 (5-24% blastsl and M3 (:;,, 25% blasts) by natinal reference labratries using standard mrphlgical criteria. AII patients r their parents r guardians gaye infrmed cnsent fr the treatment study. Treatment Figure 2 shws the treatment sc heme f the ALL IC-BFM 2002 prtcl. In briec after 7 days f sterid prephase and ne injectin f i.t. MTX (intrathecal methtrexate), all patients received the 8-age nt, 8-week inductin therapy (prtcl I). Cnslidatin therapy (prtcl mm/ml cnsisted f fur curses f high-dse (HO) MTX 2 g m- 2 (5 g m- 2 fr T-ALL) fr SRG and IRC patients. Cranial irradiatin was applied in nn-transplanted HRG patients, T-ALL patients and in patients with CNS status 3. At the beginning f delayed re-inductin, patients were randml)' assigned t receive ne prtcl II vs tw prtcl III (using le ss dexamethasne, vincristine, cyclphsphamide and anthracyclines) treatments fr SRC and ne prtcl II vs three prtcl III treatments fr IR C. HRC therapy cnsisted f three HR-blcks and triple reintensificatin w ith three prtcl III treatments (HR-ll vs six HR-blcks plus prtclll treatment (HR-2B) vs three HR-blcks Gy' nly fr T-ALL I 6-MP /MTX t t t i 6 MP/MTX : j-':", e W j lh t d15 d33 w12 I I dx 8 i t t i III' ** mm S IR HR PRED-PR IR. M3d1 5 1(9;22) 1(4;11) NRd33 m t 1_ 1_1 [I 6-MP/MTX ; ".GC"_. BFM 8r -:"T 8 6-MPIMTX 12Gy' AII-SCT# 12Gy' 4w' m=[l [ [ [ t 6-MP/MTX 6-MPIMTX I [ 6-MPIMTX 12Gy' I I... 'I,1i: O W Figure 2 ALL IC-BFM 2002 trea tment. 1 BM sampling;.u i.t. MTX in maintenance therapy; " Prt. I', DNR 30mgm 2 nly fr SR patients with BCP-ALL; 'BCP-ALL, MTX 2 g m- 2 per 24 h x 4; T-ALL, MTX 5 g m- 2 per 24 h x 4; 'CNS status 1/2, pe RT - 12 Gy; CNS status 3, tcrt:12/18 - dsage by age al' treatment del ivery, iniants < 1 year f age had neither pcrt nr tcrt; sn randmizatin f AIEOP vs BFM but chice by grup accrdin g t previus experience with n f the 1\'\10 high-risk strategies. i.t. MTX, intratheca l methtrexate.

131 E. Mejstříkvá, strana 119 :' l\v prtcl II treatments (HR-2A). Maintenance therapy a ttal treatment duratin f 24 mnths cnsisted f lercaptpurine daily, MTX weekly and extended i.t. MTX children re eiving HO MTX 2 g m- 2 in cnslidatin. elements f this BFM-type therapy have already been JJ/ished. J J. J 2 h l' cytmetry w cytmetry immunphentyping f BM aspirates was fflnned at diagnsis using a panel f mabs recmmended the Eurpean Grup fr th e Immun%gica/ Characterizatin Leukemias. J3 Jelectin f fusin genes 'lie presence f TEUAML 7, BCR/ABL and MLUAF4 fusin genes 'as examined as a part f rutine ALL diagnstics by real-time ICR in the Czech Repub/ic and by flurescence in situ rbridizatin in Israel, Hng Kng and Uruguay. DNA index :ne DNA index was assessed rutinely at diagnsis using the 'yc/etestp/u s DNA Reagent kit (BO, San Jse, CA, USA) as scribed previus/y.14 The DNA index w as defined as a rati f ne mde f flurescence f cells in the GO/G1 phase and the mde f flurescence f nrma I peripheral bld in GO/ G1. rgnstically re/evant hyperdip/idy was assessed as havi ng a D, A index 1.16 and ";'1.6. Oetcclin f residua/ disease '.\nnuclear cells frm the diagnstic BM samples were lolated by Ficll-Paque (Pharmacia, Uppsa/a, Sweden) density entriíugatin and stred in /iquid nitrgen. Fllw-up BM r?eripheral bld samples were prce' ed by erythrcyte Iysis,nd stred at - 80 ve. Genmic DNA was is/ated by the QIAamp DNA Bld Mini Kit (Qiagen GmbH, Hi/den, Germany). DNA was stred at -20 n C befre prcessing. Primers and prtcls fr detectin f rnmunglbulin heavy chain, immunglbulin light chain K, ' -cell receptr y, T-cell receptr gene rearrangements and ' AL 1 deletins were dc'scribed previusly. ".11, Clnality f the PeR prducts was cnfirmed by heterduplex analysis. J7 lequencing was perfrmed using the ABI PRISM 310 Genetic n a /yzer with the BigOye Primer v3.0 Sequencing Kit (Appl ied 3isyslems, Fster City, CA, USA). Variable (Vl, diversity (O) Ind jining Ul regins f the immunreceptr gene were rdentiíied by cmparisn with sequences in GenBank using the ImMunGeneTics (IMGT) Oa tabase ( IMGT, Eurpean Biinfrmatics Institute, Mntepe/lier, France) Jnd the IGBlast search ( a tinal Center fr Bitechn%gy Infrmatin, Bethesda, MD, USA) Patient-specific frward primers fr RQ-PCR were designed using the Vectr NTI 8 Suite Sftware (Infrmax, Bethesda, MO, USA). Family-specific reverse primers and prbes fr immunglbu/in heavy chain, immunglbulin light chain K, T-ce/l receptr 8 and T-ce/l receptr y were described previusly.j8-21 IglTCR RQ-PCR was perfrmed using the icycler IQ'" real -time per Oetectin System (Bi-Rad, Hercu/es, CA, USA) and the ABI Prism 7700 real -time PCR Sys tem (Applied Bisystems, fster City, CA, USA). Standard curves were prepared by diluting the diagnstic samples in plyclnal DNA frm healthy dnrs. The albumin ge ne was used t nrmal ize the DNA MRD and risk grup slralificalin in childhd ALL Irealmenl prlcl E FrnkOlla el a/ cncentratrn and qualily.22 The E5G-MRO-ALL (Eurpean Study Grup n Minimal Residual Oisease in ALL) criteria fr RQ-PCR sensitivity and quantitative range interpretatin were used 2J Feasibi/ity f MRO mnitring A tta/ f 187 patients were investigated fr the presence f clnal IglTCR rearrangements. In 179 (96'10) patients, al least ne mnclnal marker was fund. Patient-specific RQ-PCR assay with minimal sensitivity f 10-4 was established fr 163 (87%) patients. The main reasn fr inadequate sensitivily was early amplificatin f cntr/ DNA frm healthy dnrs. One hundred and fur patients (53%) had tw sensilive IgfTCR targets. We have prev ius/y shwn a gd crrelatin between tw independent IglTCR targets during the ALL IC-BFM 2002 inductin treatment 24 Higher values were used fr MRO analysis in patients with tw IglTCR targets. Statistica/ ana/yses Oistributin f variables between grups with psitive and negative MRO was assessed using Fisher's exact test. The Mann-Whitney and Kruska/-Wa/lis tests were used t cslimatc significance f differences cncerning cntinuus MRO values. The statistical analyses were perfrmed using StatView versin 5.0 (StatView Sftware, Cary, Ne, USA). Results Fr intergrup analys is, a cnsecutive/y recruited chrt af patients was anal yzed, with MRO values available in 69 (d8), 87 (d15 J, 133 (d33) and 133 (wi2) samples. Fr internal SRG, HRG and T-ALL grup ana/yse s, augmented cnsecutively recruited grups were used as described in the Patients sectin. MRO and ALL IC-BFM 2002 risk grups Table 1 shws the distributin f MRO psitivity and negativity at d33 and w12. Overa/l, 68 f 133 (51 %) cnsecutively diagnsed patients had, at d33, a BM Ihat was negative fr MRO (d33 MROnc- g ) and 107 f 135 (79%) were MRO negative at w12 (w12 MRO ne ). Twenty-five f 133 (19%) patients had, at d33, MRO levels that were higher than 10-3 MRO crrelated significantly with the ALL IC-BFM 2002 risk grups. Median MRO level at d33 was 1.0 x 10-3 in HRG patients cmpared t 1.9 x 10 s in IRG patients and O in SRG patients (Figure 3a). Standard-risk grup patients respnded better in terms f MRO negativity at d33 than IRG patients (P= ). Hwcver, 21 f 62 (3 3.9%) SRG patients fr whm bth d33 and w12 fl/w-up samples were available were d33 and/r w12 MRDP" (ranging frm brderline psitivity t '1.5 x 10-2 at d33 and t 1.2 x 10-4 at w12). These palients wuld nt qualify as MROba sed SRG in AIEOP-BFM ALL Figure 3b shws MRO clearance during the initial phase f treatment in the ALL IC 5RG, highlighting patients with slw m/ecu/ar respnse. They did nt differ signiricant/y frm thse with rapid m/ ecul,jr respnse with respect t gen der, WBC, BM mrph%gy at d15 r presence f hyperdip/idy r TEUAML 7 fusin. The nly difference was in a higher prprtin f M3 BM at d8 in MRO slw respnders (P= 0.016, see be/w). Cnversely, 26 f 64 (40.6%) cnsecutive/y diagnse ALL IC IRG patients were MRO negative at bth d33 and w12 (15 patients by 2 IglTCR targets, thus fulfil/ing AIEOP-BFM ALL 2000 criterin fr SRG). Leukemia

132 E. Mejstříkvá, strana 120 MRD and risk grup stratificatin in childhd All treatment prtcl E Frankva et al 8 a. (]) c. '!1 c "O (]). cr: 8:: MR and c/inical/bilgical factrs Age. Using a cutff f 6 years applied in the ALL IC-BFM 2002 stratific:atin, palients lder than 6 years were mr0 likely t be d3 3 MRDP, than patients 1-5 years f age (P= ). Quantitative MRD levels differed significantly at d15 (P=0.045) and d33 (p=0.002s) between the tw grups and shwed n significant difference at d8 and w12 (Figure 4a). In w12, neither a 6-year nr 10-year cutff significantly distinguished MRD negative patients frm thse wh were MRD psitive. White bld cell cunt. Patients with a presenting leukcyte cunt f less than at diagnsis, crrespnding t the cutff used in the ALL IC-BFM 2002 stratificatin, were mre likely t be d33 MRDneg than thse with WBC> (P= ). The difference was stili present at w12 (P= ). Figure 4b shws bx-plts representing quantitative MRD levels fr WBC lwer r higher than during the initial phase f therapy, shwing a significant difference between the tw grups at d33 (P= ) and w12 (P= 0.018) Cender. There w as n difference in mlecular respnse between bys and girls, neither in achieving d33 r w12 MRD negativity, nr ln MRD level s at respective time pints during therapy (Table 1). Immunphentype. Patients with BCP-ALL were mre likely t achieve d3 3 MRD negativity than thse with T-ALL (P= , Table 1) Hwever, this difference was nt distinct at w12 When cmparing quantitative MRD levels, patients with BCP-ALL had significantly lwer MRD levels at d1s (P= 0023) and d33 (P= 0.002) than T-ALL patients; the difference was nt significant at w12 (Figure 4c) A multivariate analysis inciuding age, WBC and B vs T immunphentype did nt shw a significant impact f immunphentype n d33 MRD statu s (P= 0.26), which was caused by its crrelatin with WBC (WBC: P= 0.029; age: P= 0.039). c '" u ' : "D c '" u '" S u 'O ti Ol <l E TEUAML 7. Althugh median MRD level in d33 MRDPS patients was 2.3 x 1O- in TEUAML7-psitive cmpared t 3.0 X lo-l in TEUAMLl-negative BCP-ALL patients, there was n significant difference in achieving d33 MRD negativity between patients with and withut the TEUAML 7 fusin (Table 1). Within the cnsecutively diagnsed TEUAML 7 grup, 10 f 31 (32.3,{») patients had detectable MRD at the end f inductin. There was n impact f the TEUAML I fusin n w12 MRD status. Other chrmsmal translcatins. As the patients with t(9; 22) have been treated accrding t the EsPhALL prtcl sin ce 2004 in the Czech Republic and Israel, there were nl y fur patients with the BeR/ABL fusin in ur chrt, thus preciuding statistical analysi s. Similarly, there were n children with t(4;11) in the chrt. ONA plidy. The data cncerning DNA plidy were nly available in Czech, Hng Kng and Uruguay patients. There was n significant difference in mlecular respnse between patients with a hyperdiplid phentype and thse with a nrma I karytype, neither in achieving MRD negjtivity (Tahle 1), nr in MRD levels at respective time pints during therapy (data nt shwn). ukemia

133 E. Mejstříkvá, strana 121 a 1.00E+Ol 1.00E+OO 1.00E-Ol 1.00E E E E-OS neg. db d15 MRD and risk grup stratificatin in childhd ALL treatment prtcl E Frnkv3 et aj -L i- --U d33 w12 fl: U C fl: :E b Figure 3 MRD and ALL IC-BFM 2002 risk-grup strati fi catin. (a) Quantitative MRD levels (Igarithmic scale) at d8, d15, d33 and w12 accrding 'v lhe ALL IC-BFM 2002 ri sk grups. (b ) MRD c1 earance in patients stratified t thl' ALL IC-BFM 2002 standard-ri sk grup. Empty diamnds indicatc.. Iienls with MRD psitivity at d3 3 and/ar w12, wh wuld nt qualify as SRG in th e MRD-based AIEOP-BFM ALL 2000 tria I. MRD, minimal residual di sease; SRG, sta ndard-risk grup. \1RD and early respnse t therapy Prednisne respnse Nne f the patients with mre than 1000 blasts fll I in peripheral bld afte r 1 week f predn isn e mel ne i.t. MTX (pr prcdnisne resp nse) achieved negativity,td33 (P = , Tabl(' ll. Th e difference rem ained si gnifica nt II \V12 (P= 0031) Quantitative MRO levels differed signi fi "antly between prednisne pr and gd respnders at d15 p ), d33 (P< ) and w12 (P= 0.032, Fi gu re 5a) level 5 x 10-4, 15 (1 4%) patients had an M RO lwer th an thi s value. Nn e f these patients were d33 MROP" cmpared t 53 (60%) patients with d'15 MRO higher th an 5 x Similar resul ts were bserved using an MRO d15 cutff f 1 x 10-3 The MRO lw-risk grup defined by this cutff cmprised 19 patients (18%) and nly 1 f these pati ents w as MRO psitive at d33, cmpared t 51 (59%) in the secnd grup. Day 15 bne marrw mrphlgy (BM d15). The d15 llrphlgy evaluatin was perfrmed centrall y in the ALL IC BFM 2002 prtcl due t BM d1 5 implementatin in risk up stratificatin. In the w hle chrt, n ly tw patients were re stratified frm SRC t IRC and tw pjtients (r m IRC t HRC. w IRC patients w ith M3 BM al d15 were nt trea ted as HRC due t treatment intlerance. Patients with M3 BM d15 were mre likely t be d33 MROP, than patients with Ml and M2 P= O.03, Tab le 1). Figure 5c shws the cm parisn f d1 5 BM lt4tus with M RO levels at d 15 and its impact n quantitative d33 md \V12 MRO levels. Th ere was n difference in MRO status ':etween patients with Ml and M2 BM n d15 al,jny time pint. Figure 6 shws the crrelatin f mrphlgical- and PCRbased d15 BM assessme nt, w ith 28 f 95 (29%) samples m luated differently by each methd. Th ree cases were l.iscssecl as Ml by mrphlgy and M3 by PCR, and, vice, rsa, ne case was evaluated as M3 by mrphlgy and Ml hy per. We then evaluated th e impact f PCR-b ased MRO at d15 n PCR-based MRO at d33 (F igure ll. Using the MRO cu tff Day B bne marrw mrphlgy (BM db) Oay fl BM mrphlgy is assessed as a pa rt f the A LL IC-B FM 2002 in the Czech Republic. The prprtins f Ml, M2 and M3 d8 BM in th e cnsecutively recruited grup were 12, 24 and 64 /.., respectively. BM d8 status had n impact n d33 MRO psitivity (Tab le 1). Hwever, this was main ly due t a higher percentage f Ml BM at d8 (7 f 21, 33%, P= ) in T-ALL patients, wh tended t have slwer MRO respnse during th e induetin phase. Interestingly, nly 1 f 14 SRC patients with d8 Ml r M2 BM w as psitive at d33, cmpared t 13 f JO patients with db M3 BM (P= 0.019). The impact f da BM status n MRO status is stili ev ident at w12, even when analyzing th e w hle chrt, including T-ALL patients (Table 1). Figure Sb shws the quantitative MRO level s accrding t d8 BM status, with significa ntly higher levels at d15 in patients with M 3 BM at da. lne bse rved n signi ficant crrelatin between db and d33 MRO levels (data nt shwn). The verall results f db BM evaluatin and its impact n survival in a larger ehrt will be reprted after sufficient fllw-up. Leukemia

134 ukemia E. Mejstříkvá, strana 122 MRD and risk grup stratificatin in childhd ALL treatment prtcl E Frnkva el a/... a db d15 d33 w E+Ol P=O E b 1.00E-Ol 1.00E E-Q3 1.00E-Q4 1.00E-05 neg..... t $ P=0.424 <6 yrs 6yrs <6 yrs P=O yrs <6 yrs P=O.0025 H".. 6 yrs < 6 yrs 6 yrs 1.00E+01 P=O E P=O.01B... a:: T E? () 1.00E-Ol 1.00E-02 Cl 1.00E-Q3 a:: ::!: 1.00E E-05 P=O.14 P=O.50 neg. I. <20000 t - ' 20000,,1-' <20000,, ,,1-1 C 1.00E+Ol.... T $ 1.00E E-Ol 1.00E-02 P=O.OO P=O E E E-05 P=O.454 P=O.023 neg. BCP-ALL T-ALL BCP-ALL T-ALL BCP-ALL T-ALL BCP-ALL T-ALL. Figure 4 Relatin f ciinical ieatures t MRD at db, d15, d33 and w12. Quanlitative MRD levels (Igarithmic scale) were related t (a) age al diagnsis, (b) presenting while bld cell cunt al diagnsis and (c) B vs T immunphentype. MRD, minimal residual disease; WBC, white bld cell. Discussin Mst mdern treatment prtcls fr childhd ALL have implemented sme srt f MRD assessment int their risk-grup stratificatin, aimed at bth treatment intensificatin and reductin. Using MRD w ith the aim f therapy reductin requires a highly sensitive methcl (at least ), which s far has nt been cmmnly accessible fr many cuntries wrldwide. The ALL IC prtcl was designecl t span the perid during which the invlved cuntries cst ablishecl rutine MRD testing. One f the gals f the design w.1s t implement d1 5 BM mrphlgy evaluatin t re- strjtify early slw respnders t treatment intensific.1tin. Antigen receptr-ba sed MRD evaluatin was used in aur study t determine the crrelatin f ALL IC risk-grup assignment with mlecular respnse during the initial phase f therapy. MRD crrelated strngly with ALL IC risk grups. As expected, HRC patients shwed slwer ml ecular respnse than IRC and SRC patients. Nne f the analyzed patients wulcl be stratified int HRC by AIEOP-BFM ALL 2000 criteria, slely based n high MRD level at w12. AII such patients were.1ls prednisne pr respnders. IRC patients had higher MRD levels al djj than SRC patients. Hwever, abut ne-third f ALL-IC SRC patients were psitive at the end f induclin and/r at w12. Based n the previus findings, these patients have a higher risk f relapse 3 Cnsequently, n lreatment reductin wuld be justified in a prtcl based n ALL IC stratificatin criteria. Next t age and WBC as classical ri sk factrs, we bservecl tl significant difference in mlecular respn se between BCP-ALL and T-ALL patients. BCP-ALL patients shwed a better respnse at d15 ancl djj, while the difference between the tw grups was n lnger clistin ct at w12. Thi s finding is in agreement with a previus study cmparing BCP-ALL and T-ALL patients treated accrding t the ALL-BFM 90 prtcl 25 ancl implies the ptential benefit available t T-ALL patients frm tre.1tment mdalities used later in th e treatment. As mst f th e T-ALL patients were psitive at d33 and negative al w12, anther time pint in between the tw might be beneficial fr ri sk stratifica tin f T-ALL patients in BFM-basecl prtcls. BM evaluatin at d15 has been an integral part f the ALL IC stratificatin and MJ BM at d15 shwed a negative impact n d33 MRD in ur stu cly. Only fur patients in ur chrt w re re-stratified int therapy intensificatin based n MJ BM d15. In all fur ca ses, the mrphlgi ca l evaluatin was cncrdant with the PCR-based evaluatin. In general, the crrelatin between mrphlgy and PCR was far frm ideal. II ( uld be explained by a difficult BM evaluatin at this time pint. On the ther hand, RQ-PCR als has limitatins, mainly in the exact determinatin f high MRD level s: ne PCR cycle clifference means a twflcl difference in MRD value. Using a cutff f

135 E. Mejstříkvá, strana 123 a b 1.00E+01 d E+OO I... C? 1.00E E E E E-05 neg. 1.00E+01 PGR P=O.037 PPR, 1.00E+OO 1.00E-01 a: u 1.00E-02 9 C 1.00E-03 ', '. ", ' a: :E 1.00E-04 C 1.00E-05 P<O.OOO1 neg. BMd8 M1... M M3 1.00E E+OO Eť :. :. : : : : : 1.00E-01 $ -:; '.' :- 1.00E E E E-05 P<O.0001 neg. L- -L I M1 MRD and risk grup stratificatin in childhd ALL treatment prtcl E Fran kva el al d33 P<O.0001 w12 P=O.032 PGR PPR PGR PPR _L M2 0, " P=O.122 M3 P=O ;. P=O.229 M1 M2 M3 I L _L P=O.279 BMd15 M1 M2 M3 M1 M2 M3 M1 M2 M3 figure 5 Relatin r earl y treatment respnse in PB (a) and BM (b, c) t MRO at d15, d33 and w 12. Quantitative MRO levels (Igarithmic scal el were related t (a) blast cunt in PB aiter 7 days f prednisne and ne i.t. MTX (prednisne respnse) r less than 1000d-' (PGR) vs mre than 1 000li 1 (P PRI, (b) BM status at d8 (BCI'-ALL nly) and (c) BM status at d15. BM, bne marrw; i.t. MTX, intrathecal methtrexate; MRO, minimal residual discase; PB, peripheral bld; PGR, predn isne gd respnders; PPR, prednisne pr respnders. i X f r per at d15, we culd identify a small grup ipatients (14'/'0) wh achi eved,\lird negativity at d33. This is n agreement with th c previus stu dy f Panzer-Grumayer et al.,26 wh bserved an excellent utcme in a similar grup f patients treated accrding t the ALL-BFM 90 prtcl. Hwever, the use f IglTCR-based MRD mnitring (r treatment assignment in such an ea rly time pint is limited by the extreme lgistical requirements f this methd. Flw cytmelry seems t be a mre cnvenient tl fr the early identificatin f patients with excellent prgnsis BM db evaluatin n the BFM-based prtcl has nt been reprte s far. The Chi Idren' s Onclgy Grup slud)' cncerning BM db reflecls a different treatmenl apprach (withut a prednisne pre-phasel. With regard t this, it is nt surprising lhat the prprtin f Ml and M2 marrws in the Children' s Onclgy Grup study is significantly hi gher. 29 ln ur study, BCP-ALL patients with M3 BM d8 were mre likely t be MRD psi tive at bth d33 and w12. This trend was even preserved in SRG. Hwever, 67% f SRG patients in ur chrt had M 3 BM d8 an mre than half f I'hem were subsequently d33 MRD negative, which impairs the practical use f this factr. Our results indicate that M'I BM d8 might ptentially identify a small grup (11 %) f BCP-ALL patients with excellent prgnsis. Hwever, it will be necessary t ex tend the chrt and perfrm a fllw-up t cnfirm this hypthesis. Patients with TEUAML 7 translcatin did nt dif(er frm the ther BCP-ALL patients in mlecular respnse. Abut ne-third f TEUAMLI-psitive patients had detectabl e MRD at d33. Accrding t a previus study, thse patients have a higher risk f subsequent relapse 30 ln cntrast t the well-dcumented favrable prgnstic impact f hyperdiplidy,3 1 abut half f the hyperdiplid cascs were MRD psitive at d33. This culd ptentially mean that thse patients have a greater risk f rel apse. Unfrtunately, the riginal BFM MRD study3 lacked infrmatin n DNA plidy. Brwitz el aj2q reprted a surprisingly high percentage f MRD psitive ca ses at the end f inductin amng paticnts with favrable trismies, despite the excellent prgnsis f this grup. Leukemia

136 E. Mejstříkvá, strana 124 MRD and ri sk grup stratificatin in childhd ALL treatment prtcl E Frnkva et al 10, , 2 M3 : M3m: 4, >-.. tl 01!..... L _! (5 M2m/M1 PCR :. 8.s= Q ,M2 M2m/M3PCR E ll) "C..t. I, r ; -, -i i{.- t. -:: ; t.: , : : :.. tl M1m/M3PCR M1... : 9 : 3 :M1m/:M2PCR,, Negative (n=1) 1E-05 1E-04 1E d15 MRD (lgftcr) figure 6 Crrelatin f mrphlgical (m) and PCR-based BM assessment at d15. Percentage f blasts accrding t IgfTCR-based RQ-PCR (x axis) vs percentage f bl.jst5 accrding t mrphlgy (y axis) in 95 BM sampl es. BM, bne marrw; RQ-PCR, real-time quantitative PCR. 0.1 '" "C '" Ci" 0.01 U 'a, ::- 1E-03 Cl CI: :E 1E-04 5E I I I I 1E-05 >: : 15 (14%), >.! I 19 (18%) $ I I #,.: I #. I Negative 1E-05 1E-04 1E MRD (lgftcr) d15 Figure 7 Impact f PCR-based MRD at d15 n PCR-based MRD at d33. Pcrcentage f blasts at d15 (x axis) vs percentage f blasts dt d33 (yaxis) in 104 BM samples. Arrws indicate the respcctive d15 cutffs f 1 x la-oj and 5 x thal define the MRD lw-ri sk grups. BM, bne marrw; MR O, minimal residual disease. Our stud)' was aimed at errelatin f elinieal, mrphlgieal Jnd bilgieal stralifieatin criteria used in the ALL IC-BFM 2002 prtel with MRD clearanee. Generall)', MRO reduetin during the first 3 mnths f therap)' errelated with ALL IC-flFM 2002 risk grups. This was mst distinet in the high-risk grup, implying that the 'classieal ' criteria used in ALL-IC are able t ielentify mst HRG patients. Hwever, there was a large verlap between the intermediatc- and standard-risk grups eneerning MRO negativity at the end f induetin. Thus, the ALL le criteria dre nt able t reliably define the lw-risk grup ptentially assigned t therapy reduetin, whieh is the ehallenge f mdem leukemia treatment. Ouring ur stud)', the cuntries invlved implemented the methdlgy f PCR-based MRO testing and are nw prepared t use the MRO-based prtel. Stili, great effrt shu ld be made t the identifieatin f sim pler stratifieatin criteria (fr example, flw eytmetry MRD ass('ssment), sinee PCR-based MRO testing is stili unavailable in many euntries. Acknwledgements This wrk was supprted by MSM , MZOOOO 64203, MZdNR8269-3/2005, Israel Caneer Assciatin and Children's Caneer Fundatin f Hng Kng. We thank the fl lwing participating clinical eenters fr eliniea l management and sample clleetin: Czech Republic: Brn U Sterba), Ceske Budejviee (Y Jabali), Hradec Králvé U Hak), Olmuc (V Miháll, OstravJ (B Blazekl, Plzeň (Z Černá), Prague U Stary), Ústí nad Labem (O Prchazkva); Israel : Afula (H Gavriel), Beer-Sheva U Kapelushnik), Haifa Bnei-Zin (O Attias), Haifa Rambam (R Elhasidl, Hln (A Ballinl, Jerusalem Hadassa h (M Weintraubl, Jerusalem Shaarei Zedek (H Miskinl, Petah-Tikva (G Avrahamil, Rehvt (O Stheger), Tel Aviv (Y Burstein), Tel Hashmer (S Sielrai). 'vve als thank S Bendva fr sequeneing and A Vrzalva fr data management. emia

137 E. Mejstříkvá, strana 125 eierences 1 Cdve H, van der Werff ten Bsch i, Sueiu S, Guidal C, Waterkeyn C, Otten J et " I. Clinieal signifieanee f minimal residual disease in ehildhd aeute Iymphblastie leukemia. Eurpean Organi zatin fr Research and Treatment f Cancer- e Childhd Leukemia Cperative Grup. N Engl) Med 1998; 339 : Custan Smith E, San ch i, Hancck ML, B)'ett JM, Behm FG, Raimndi SC el al. Clinical imprtdnce f minimal residual disease in childhd acute Iymphblastic leukemia. Bld 2000; 96: J van Ongen Ji, Seriu T, Panzer-Grumayer ER, I:lindi A, Pngers-Willemse MJ, Crral L el al. Prgnstic value f minimal residual disease in Jcute Iymphblastic leukaemia in childhd. Lancel 1998; 352: Arie M, Baruchel A, Bertrand Y, Bindi A, Cnter V, Eden T el al. The seventh internatinal childhd acute Iymphblastie leukemia wrkshp reprt: Palerm, Italy, January 29-30, Leukemia 2005; 19: Pui CH, Relling MV, Sandlund JT, Owning IR, Campana O, Evans WE. Ratinale and dl!sign f TOI"al Th rapy Study XV fr ncwly diagnsed childhd acute I)'mphblastic leukemia. Ann Hemal/2004; 83 (Suppl 1): SI24-S126. b Schultz KR, Pullen Di, Sather HN, ShuSler Jj, Oevidas M, Brwitz MJ el al. Risk- and respnse-ba ed classifi CJtin f childhd B:preeursr acute Iymphblastic leukemia: a cmbined anillysis l prgnstic markers frm the P(!diatric Onclgy Grup (PO ) and Children's Can ce r Grup (CCG). Bld 2007; 109: i Zhu L Gldwasser MA, Li A, Oahlberg SE, Neuberg O, Wang H el al. Quantitativc analysis f minimal residual disease prcdicts relapse in childrcn with B-lineage aeute Iymphblastie leukemia in OFCI ALL Cnsrtium Prtc l Bld 2007; 110: B Stanulla M, Schaeffeler E, Flhr T, Cari G, Schrauder A, Zimmermann M el al. Thipurine methyltransferase (TPMn genolype and early treatolent respn se t Olercaptpurine in childhd acute Iymphblasti c leukemia. )AMA 2005; 293: van der Velrll 'n VH, Pan zer-grumayer ER, Cazzaniga G, Flhr T, Sulln R, Schr.. 1Uder A et J I. Optimizatin f PCR -based minimal residual disl'ase diagnsti cs fr childhd acute Iymphblastic leukemia in a multi-centcr setting. Leukemia 2007; 21 : Lauten M, Zimmermann M, Reiter A, Beier R, Gadner H, Niemeycr C el al. Bne marrw da y 15 has an additinal impact n the predictin f event free survival in children w ith acute Iymphblastic leukemia characterizcd by th e prednisne respnse ; 100 (11): 69a, abstract r I N,1Chman lb, Sather HN, Sensel MG, Trigg ME, Cherlw JM, Lukens IN cl al. Augmented pst-inductin therapy fr children with high-risk acute Iymphblastic Icukemia and a slw respnse t initial therapy. N Engl) Med 1998; 338: Schrappe M, Rciter A, Zimmermann M, Harbtt J, ludwig WO, Henze G el al. Lng-term results f fur cnsecutive trials in childhd ALL perfrmed by th e ALL-BFM study grup frm /981 t Berlin-Frankfurt-Munster. Leukemia 2000; 14: II Bene MC, Castldi G, Knapp W, Ludwig WO, Matutes E, Orfa A el al. Prpsals fr the immunlgical class ilicatin f acute If'ukemias. Eurpean Grup fr the Immunlgical Charac terizatin cf leukemias (ECll). Leukemia 1995; 9: Hiddemann W, Wrmann B, Ritter J, Thiel E, Ghde W, Lahme B el al. Frequency and clinical significance f DNA dneuplidy in ucut ' leukemia. Ann N Y Acad Sci 1986; 468: Pngers-Willemse MJ, Seriu T, Stl z F, d'aniell E, Gameir P, Pisa P el al. Primers and prtcls fr standardizcd dctectin f minimal residual disease in dcutc Iymphblastic leukemia using immunglbul in and T cell receptr gene rearrangements and TAL1 deletins as PCR targets: reprt f the BIOMEO-l CON CE RTE O ACTION: investi ga tin f minimal residual disease in acute leukemia. Leukemi ; 13: lb Szczepanski T, Pngers Willemse MJ, Langerak AW, Harts WA, Wijkhuijs AJ, van Wering ER el al. 19 heavy chain gene rearrangements in T-cell acute Iymphblastic Icukemia exhibit predminant OH6-19 and OH7-27 gene usage, can result in MRD and risk grup stratificatin in childhd All treatment prtcl E Frnkva el al cmple\e V-O-I rearrangements, and are rare in T-cel\ receptr alpha beta \ineage. S/d 1999; 93: van Ongen Jl, Langerak AW, Bruggemann M, Evans PA, Hummel M, Lav'nder FL el al. Design and standardizatin f PCR primcrs and prtcls fr detectin f clna I immunglbulin and T-cell receptr gene recmbinatins in suspect Iymphprliferatins: reprt f the BIOMED-2 Cncerted Actin BMH4-CT Leukemia 200.1; 17: Langerak AW, Wlvers-Tetter ll, va n Gastel-Ml EJ, Oud ME, van Ongen Jl. Basic heli x-ip-helix prteins E2A and HEB induce immature T-ce ll receptr rearrangements in nnlymphid ri' li s. Bld 2001 ; 98: Veln der Vel den VH, Wijkhuijs JM, Jacbs DC, van Wering ER, van Ongen JJ. T cell receptr gamma gene rearrangements as targets fr detectin f minimal residua I disease in acute Iymphbl as tic leukemia by real-time quantitative PCR analysis. Leukcmia 2002; 16: van der Velden VH, Willemse MJ, van der Scht CE, Hahlen K, va n Wering ER, va n Ongen JJ. Immunglbulin kappa deleting element rearrangements in precursr-b acute Iymphblastic leukemia are stable targcts fr dctedin f minimal residua l disease by real-time quantitati vc PCR. Leukemia 2002; 16: Verhagen OJ, Willemse MJ. Breunis WB, Wijkhuijs AI, Jaebs DC, Jsten 5A el al. Applicatin f germline IGH prbes in real-time quantitative PCR fr th" detectin r minimal residual disease in acute Iymphb lastic leukemia. Leukemia 2000; 14: Pngers Willemse MJ. Verhagen OJ, Tibbe GI, Wijkhuijs Ai, de Haas V, Rvers E el al. Real-time quantitative PCR fr the detectin f minimal residual disease in acute Iymphblastic leukemia using junctinal regin specific TaqMan prbes. Leukemia 1998; 12: va n der Velden VH, Ca zzaniga G, Sehrauder A, Hancck J, Bader P, Panzer-Grumayer ER el al. Analysis f minimal resi dua I disease by IgffCR gene rearrangements: guidelines fr interpretatin f real-time quantitative PCR data. Leukemia 2007; 21: Frnkva, Madz i, Zuna J, Reznickva l, Muzikva K, Hrusak O lol al. TEUAML 1 real-time quantitative reverse tran scriptase PCR can cmplement minimal residua I disease assessment in childhd ALL. Leukemia 2005; 19: Willemse MJ, Seriu T, Hettinger K, d'aniell E, Hp WC, Panzer Grumayer ER el al. Oetectin f minimal residual disease identifies differences in treatment respnse between T-ALL and precursr B-ALL. Bld 2002; 99 : Panzer Grumayer ER, Schneider M, Panzer S, Fasching K, Gadner H. Rapid mlecular respnse during early inductin chemtherapy predicts a gd utcme in childhd acute Iymphblastic leukemia. Blad 2000; 95: Bass G, Gaipa G, Valsecchi MG, Veltrni M, Owrczak M, Ratei R el al. Early evaluatin f bne marrw minimal res idual discase by flwcytmetry n da y 15 is feasible n a multiccntt'r basis and bears strng prgnstic valu ' in childhd acutl' Iymphblastic leukemia. The AIEOP-BFM experience. Bld 2007; 110 (11): 426a, abstr'lct [1423J. 28 Mejstrikva E, Frnkva E, Batinic O, Oubravcic K, Kiss F, Kappelmayer I el al. Standardized 4 clr flw cytmetric minimal residual disease detectin failed t vercme regenerjtin prblems but identiiies early blast clearence predi clive af mlecular remi ssin after inductin in childhd B lineagc leukemia. Bld 2006; 108 (11): 521 a-522a, abstract [1842J. 29 Brwitz MJ, Pullen Oj, Shuster Jj, Viswanatha O, Mntgml'ry K, Willman CL el al. Minimal residual disease detectin in childhd precursr-b-cell acute Iymphblastic leukemia: relatin t ather risk factrs. A Children's Onclgy Grup study. Leukemia 2003; 17: Madz L Zuna J, Muzikva K, Kalinva M, Krejci O, Hrusak O el al. Slwer mlecular respnse t treatment predicts pr utcme in patients with TEUAML 1 psitive acut I)'mphbl astic leukemia: prspective rcal-time quantil'ative reverse transcriptaseplymerase chain reactin study. Cancer 2003; 97: Truewrth y R, Shuster J, Lk T, Crist W, Brwitz M, Carrll A el al. Plidy r Iymphblasts is the strngest predictr f treatment utcme in B-prgenitr cell acute Iymphblastic leukemia f childhd: a Pediatric Onclgy Grup study.) Ctin Oncl 1992; 10: Leukemia

138 E. Mejstříkvá, strana 126 P řílha 8 CD44 and CD27 delineate B-precursr stages with different recmbinatin status and with an uneven distributin in nnmalignant and malignant hematpiesis M. Vaskva, E. Frankva, 1. Starkva, T. Kalina, E. Mejstrikva & O. Hrusak Tissue Antigens, 2007, (ff 2,245)

139 E. Mejstříkvá, strana 127 Tissue Antigens ISSN CD44 and CD27 delineate B-precursr stages with different recmbinatin status and with an uneven distributin in nnmalignant and malignant hematpiesis M. Vaskva 1,2, E. Frnkva 1,2, J. Starkva 1,2, T. Kalina 1,2, E. Mejstrikva 1,2 & O. Hrusak 1,2 1 Department l Pediatric Hematlgy and Onclgy, 2nd Medlcal Schl. Charles Univers',ty Prague, Prague, Czech Republic 2 Ch ildhd Leukemia Invesllgalin Prague. Prague, Czech Republic Key wrds acute Iymphblastic leukem ia; B cell develpment; CD2 7; CD44 Crrespndence Martina Vas kva Childhd Leukemia Investiga tin Prague V Uvalu B Prague Czec h Republic Tel: Fax: martina.vaskva@iimtl.cu ni.cz Recelved 22 March 2007; revlsed 14 August Octber 2007; accepted 21 Octber 2007 dol /j x Abstract The expressin fc027 and C044 crrelale with lhe gentype f B-precursr acule Iymphblastic leukemia (ALL). Based n the expressin f these antigens, we identified cunterparts f TEL/ AML/pS and TEL/AML/"e g leukemic cell s in nnmalignant bne marrw. Althugh C027 is knwn as a marker f malure memry B cells, we recenlly shwed thal C027 is als expressed by malignant and nnmalignant B precursrs. Here, we shw that C027 and C044 delineate stages f B-precursr develpment. Well-established dífferentiatin markers shwed thal Ihe develpmental sequence starts frm undetermined prgenitrs, expressing C044. Upn B-lineage cmmitment, cell s gain C027 and lse C044. The C027p'C044neg (C027 single psitive, 27SP) cells are the ea rliest stage within COIOPsCOl9 PS B precursrs and express RAC-I and TDT. These cells crrespnd t TEL/AML/pns ALL (1/4 pediatric B-precursr ALL). The develpmenl fllws t C027/C044 duble-psitive (27/440P) stage, 44SP stage and C027/C044 duble-negative (27/440N) stage. Befre exit t periphery, C044 is reexpressed. The 27/440P cells are mstly large and prfundly suppress RAG-I. Oespite their presumably high prliferatin ptential, 27 /440P cells rarely dminate in leukemia. At 44SP stage, which crrespnds t TEL/AML/ne g leukemias, RAC-I is reexpressed and 19 light chain gene Slarts 10 be rearranged. Intrductin By making the lineage decisin, human prgenitrcells start the B-lineage dcvelpment in the bne marrw (BM) [reviewed in (I, 2»). This early stage is accmpanied by the upregulatin f B-cell-specific lranscriptinal regulatrs Pax-5 and very likely als early B-cell factr. Since the earliesl stage, the B-lineage-cmmitted cells start t rearrange thc genes fr 19 heavy chain (lch). Upn successful ICH rearrangement, the recmbinatin machinery is suppressed and cells quickly prliferate. In the fllwing stage, 19 light-chain (lcl genes are rearranged. Cells that cm plete bth ICH and ICL are ready t be functinally cmpetent and develp int na)'ve mature B cells. Such cells leave Ihe BM envirnment. On cell surface level, the first B-cmmitted cells express C034, which disappears in the curse f maturatin. Very ear1y after B-lineage decisin, COlO is expressed and cntinues t be present n the cell surface untillch and ICL are rearranged. An imprta nt surface marker f B lineage, COI9, is expressed since the very early stage when ICH rearranges. Experimental evidence shws that CD I O precedes the expressin fc019, perhaps in majrity fcells. The CD IOpsC034p,CO19 neg cells are mstly cmmitted t B lineage, althugh they can develp als t ther lineages (3). Hwever, the mst immature B-precursr leukemia stage called pr-b is defined as COI9p'C0341""COLOneg (4, 5). Leukemia nmenclature, ref1ecting the current understanding f malignant transfrmatin during Iymphpiesis, lherefre assumes CD 19 expressin befre COlO. At COlOpsCOl9PS stages f develpmenl, imprtant events ccur including ICH rearrangemcnt cmpletin, cell expansin ancl ICL rearrangement. This CI 2007 The Au Ihr Jumal cmpll Iln ':> 2007 Blackwell M un s ga ard

140 E. Mejstříkvá, strana 128 C044 and C027 delineate B-precursr develpment M. Vas kva et al. CD IOp'CD 19pS immunphentype is fund in the majrity f B-cell-precursr acute lymphblastic leukemias (BC P ALLs). Our previus study shwed that majr gentypic BCr ALL subsets strictly crrelate with the surface C027 and C044 expressin (6) (updated results are in If2.cuni.cz/files/archiv/C044_and_ C027 _ updated _results. pdf), thus cnfirming RNA genmics data n prtein leve! (7). [nterestingly, TEL/AMU!"" BCP ALL crrespnds t C027 ps phentype, in the absence f C044. Althugh C027 was cnsidered t be a general marker fr memry B cells in humans, we shwed its expressin als n COIOP'COl9 P S B-cell precursrs (6). [ts expressin in BCP ALL and in nnmalignant B precursrs was then cnfirmed in anther study (8). C027 (TNFRSF7, T-cell activatin antigen) is a II O-kOa transmembrane glycprtein cmpsed f disulfide-linked 55-kOa mnmers, and it is a member f the tumr necrsis factr receptr fami ly. In humans, it is expressed n the large subset f peripheral T cells, n mst medullary thymcytes (9) and n natural killer cells (10). [n mre mature stages f B-lineage develpment, it is expressed n smatically mutated B cells(ll). C044 (Hermes, Pgp-I) is a cell surface glycprtein cded by 10 standard exns fund in all C044 isfrms; the ther 10 are variably spliced (12). C044 was riginally identified n hematpietic cells (13), but it was als fund n a wide range f lher tissues (I 16). The C044 medíates cellular adhesín. It is a receptr fr hyalurnate (17), but il binds ther cmpunds f extracellular matrix als. II is invlved in the prcess f Iymphcyte activatin (18), and its inleractin with strmal cell s is imprtant during Iymphpiesis and myelpiesís (19, 20). The C044v6 splice variant is ften assciated with mdastatic ptential f nnhematpietic neplasias. fr cxample, in gastric adencarcinma (21). lts exprcssin als crrelates wíth shrter survival f patients with <leule myelblastic leukemia (22) and is mre frequently exprcssed in medium- r high-risk grup in pediatrie ALL (23). We searched fr cells with C027 and C044 exprcssin crrespnding t leukemia subtypes In nnmalignant BM. Amng CO I OpsCO 19 pos cells, we fund C027 p 'C044 neg B precursrs (C027 single psitive, 27SP) crrespnding t TEL/ A MUPS leukemia and C027ncgC044ps (44SP) cells that crrespnd t mst ther ALL subtypes and dublepsitive (27/440P) and duble-negative (27/440N) cells, which are rarely seen in BCP ALL. We tested the hypthesis that the expressin f C044 and C027 nnrandmly crrelates with the differentiatin stage f B precursrs. Therefre, we investigated differentiatin markers with knwn dynamics during B-cell develpment (COlO, C034, intracellular IgM, intracellular VpreB (CO 179a), terminal dexyribnucletidyl transferase (TdT), RAG-I and 19 gene rearrangements] in immunphentypic subppulatins defined by C044 and C027. Materials and methds Patients BM specimens f children withut any evidence f malignant r residua I malignant disease (patients I and mre years after BM transplant, after the end r the ALL therapy and palients investigated t exclude hematlgieal malignancy) were used. Spccimens were cllected accrding t the Czech law and institlltinal regulatins and with infrmed cnsenl. Only leftver material frm specimens after cmpleted diagnstic investigatins was used. Flw cytmetry Cell suspensin f the unseparated BM r peripheral bld (PB) was stained with fur- t eight-clr cmbina tins f mnclnal antibdies (mabs). The fllwing tlurchrme-iabeled mabs were used: anti-c044 flurescein isthicyanate (FITC) (reacting with the standard isfrm f C044) and anti-c027 phycerythrin (PE) (BO, San Jse, CA), anti-co 10 ECO, anti-col79a PC5, anti-co 19 PC7 and anti-c034 allphyccyanin (APC) (Immuntech, Marseille, France), antí-tdt FITC (Oak, Glstrllp, Oenmark), anti-c020 Alexa405 (Sertec, Kidlingtn, Oxfrd, UK) and anti-lgm Oymics647 (Exbi, Prague, Czech Republic). In additin, OAPI (4,6-díamidin-2- phenylindle) (Mlecular Prbes, Leíden, The Netherlands) and FIX&PERM cel.1 permeabilízatin kit (An der Grub, Vienna, Austria) were used. Nnmalignant BM samples were analyzed using FACS Aria (BO) and BO LSRII (BO) tlw cytmeters and srted using FACS Aria tlw cytmeter (BO). Fr plychrmatic tlw cytmetry experiments, phtmultíplier (PMT) vltage was set abve electrnic nise threshld and autmated cmpensatin matrix calculatin was perfrmed using single-clrstained tubes (DIVA r SUMMIT 4.3). Gating strategy f cmpensated data was determined using Flurescence Minus One cntrls (24). Analysis was perfrmed using FLOWJO sftware (Treestar, Ashland, ORl using the same strategy f psitivity determinatin. Fr each sample, 4 x 10 5 t 4 x 10 6 events were recrded. Gating strategy was used fr the analysis and srting f the cells with a given immunphentype as fllws: CO I Ops cells were selected frm the gate f CO 19 p 'OAPl nc g cells (live B-lineage cejls). Fur subppulatins based n <..'044 and CD27 psitivity and negativity were identified accrding t Flurescence Minus One cnlrls amng these cells (Figure I). The cells falling abve r belw a threshld f flurescence intensity set by these cntrls are called psi/ive r nega/ive subppula/ins thrughut the paper. The experiments with srted subppulatins were perfrmed in duplicates r triplicates. The purity f srted subppulatins was always mre than 95%. Thcrefre, the The Authrs Jurnal cmp'latin Blackwell Munksgaard

141 E. Mejstříkvá, strana 129 M. Ifaskva et al. C044 and C027 delineate B-precursr develpment A.000 '' '' loo,a' 10 4 U Ol (f) 1000 ll,a' S'OJ U 1000,r:?,' ' lo 4000 lol,a' '' '' 102 to' to' Figure 1 C027 and C044 expressi n in nn- SSC OAPI C010 10" mal,gnant BM and PB. Gating s Ira legy used in seven-clr staining l ne BM spec,men lr B C010+ C020+C010- C020+ in PB analysis l lhe differentiatin markers in parl,cular subppulatins and lr the ir srting (A) COl Ope', cells were sel ecled Irm the gate f C0 19"" OAPlng cells (I.ve B-lineage ce lls) (B) C027 and C044 ex pressin in COl OOO' C019 P. cells in BM. in C019"""C0 20PO' C010 n cells in BM and in C020 00, cell s in PB l differen t pal.ents. BM. bne marrw; OAPI diamidin-2-phenyli ndle; FSC. lrward scaller; PB. peripheral bld; SSC. s,da scaller. I"- ('j O (),' ta',a',0' 10 2 '' to' ta' D,a',0' ' 'a' a,',j t' '',',',',' C044 U,a',a',a' t' results f the mrna and DNA analyses indeed describe the srted subppulatins. Real-time quantitative reverse transcriptinplymerase chain reactin Cmplete RNA frm srted cells was islated by RNeasy Micr Kit (Qiagen GmBH, Hilden, Germany) accrding t manufactllrer's instructins. RNA was cnverted int cmplementary DNA (cdna) using MM LV Reverse Transcriptase (Gibc BRL, Carlsbad, TX). Real-time quantitative reverse transcriptin- plymerase chain reactin (PCR) analyses were perfrmed lising LightCycler rapid thermal cycler system (Rche Diagnstics GmbH, Mannheim, Germany). Flurescent DNA-binding dye SYBR Green (FMC BiPrducts, Rckland, MA) was used fr quantificatin f RA G- 1 and TDT gene expressin. Cntrl gene beta-2-micrglbulin (b2m) was measured using hybridizatin prbes as described previusly (25). The primer sequences were as fllws - fr TDT: frward 5'-gTCgTgCCTTTgCCCTgTI-3 ', reverse 5' -TC CgCTCATgTgTggCATAg-3' and fr RAG-/: frward 5' -TgAgTAATATCAACCAAATTgCAgACA-3 ', reverse 5' -ggatctcacccggaacagc-3'. The cmpsitin f PCR mix was as fllws: I U f Platinum Taq DNA plymerase in the PCR buffer prvided by the manufacturer (Gibc BRL - Life Technlgics Inc., Gaithersburg, MO), MgCI 2 3 mm (fr RAG-/) r 2 mm (fr TDT), dexynucletide triphsphate 0.2 mm each, bvine serum albumin 0.25 (lg/(ll, primers 0.5 (lm eaeh; flurescent signal was generated lising 0.2 (ll SYBR Grecn (2 x 10-4 fthe stck cncentratin, dillltcd by dimcthyl sulfxide; fr RAG-I and TDT). One micrliter f cdna was added in a final vlume f20 (ll. The LlGHTCYCLER prgram fr RAG-I and TDT cnsisted f the initial denaturing at 94 C fr 90 s, fllwed by 40 PCR cycles: 95 C fr 5 s, 62 C fr 40 s (single flurescence measurement), nc fr 12 s. The melting curve analysis was perfrmed t cnfirm specific amplificatin and t identify nnspecific templates after each run. RAG- I a nd TdT mrna expressin was shwn as a rati t b2m expressin; this va llle was nrmalized t 1 in the mst immature subset investigated. Real-time quantitative per analysis f immunglbulin gene rearrangements DNA frm srted cells was islated by QIAamp DNA Bld Micr Kit (Qiagen GmbH). Multiplex real-time quantitative PCR (RQ-PCR) fr lgh detecting virtually all cm plete lgh rearrangements and RQ-PCR fr intrn recmbina tin signal seguence t kappa deleting element ( RSS-Kde) was perfrmed using family-specific V segment frward primers and J segment-specific reverse primers and prbes as described previllsly (26, 27) in the icycler IQTM therma l cycler system (Bi-Rad, Hercules, CA). The starting cncentratin f template was measured against the dilutin series f psitive-cntrl DNA in germ-line (unrearranged) Hela DNA. REH cell line served as a psitive cntrl fr intrn RSS-Kde recmbinatin. Samples f patients with ALL cntaining 87%, and 97% f clna l cells with mnallelic rearrangemcnts were used fr standard curve preparatin in VHI-3- JHI-ó and VH4-7-JH 1-6 assays, respectively. The cycling cnditins wcrc as fllws: initial denaturing at 95 C fr 10 min, 50 cyclcs 2007 l he AuthlS Jurnal cmplla{,n II:J 2007 BI. ckwell Munksgaard 3

142 E. Mejstříkvá, strana 130 C044 and C027 delineate B-precurs r develpment M. Vaskva el al. denaturing at 94 C fr 15 s, annealing extensin at 64 C (lch) r 62 C (intrn RSS-Kde) fr I min; DNA at a cncentratin f g / J.lI was used fr cach PCR reactin. AlI the assays reached sensitivity f at lea st 1% f rearranged a lleles in the germ-line backgrund. Each sample was run in duplicate, and a mean value was used fr further analysis. Albumin gene was used t nrmalize the D A cncentratin and quality (28). ICYCLE R IQ Optical System sftware versin 3.0a was used fr quantjfícatin, and a fínal value was shwn as a percentage f rearranged a lleles relative t the respective clnal cntrl DNA, which was set as 100%. Results C027 and C044 expressin define phentypic stages in B precursr develpment As CD44 negativity in cmbinatin with CD27 psitivity is fund exclusively in ne subtype f leukemia (TEL/ AMU P O') (6), we searched fr such cells amng B precursrs in nnmalignant BM. Within CD IO p 'CDI9 p, cells, such 27SP cells were present in all 14 specimens. In additin, 44SP cells as well as 27/44DP and 27/44DN cells were fund (Figu re 2). Next, markers f B-precursr differentiatin were investigated by plychrmatic flw cytmetry. The expressin f CD44, C D27 and a B precursr defíning the cmbinalin f CD19 and C D IO was studied tgether with the differentiatin markers C D34, TdT, cytplasmic IgM and cytplasmic VpreB (CD 179a). The percentage f CD34 ps cells is the highest in 27SP and decreases gradually in 27/44DP, 44SP and 27/44DN subppulatins (Figure 3A,B). A similar lrend is fund in the percentage f CD lo b",ghl cells, which becme virtually missing in CD27 neg B-precursr stages (Figure 3C,D). This sequence f develpmental stages was further supprted by O Ll C 50 cr 40 ID 30. '" ::J <JI 20 O $ O 10 O 27SP 27/44DP 44SP 27/44DN Figure 2 Frequencies f subppula tins de fined by C027 and CD44 expressin within CDlO""" CD19PQ B precursrs. Furteen speclmens were used fr this analysis. DN, duble negative; OP. duble psitive; SP, single psitive. a graduallss fintracellulartdtand VpreB (Figure 4A,B) and by the increase fintracellular [gm pns cells (Figurc 4C). The bserved sequence f develpmental stagcs l' 8 precursrs is thus: 27SP, 27/44DP, 44SP and 27í44DN. We fit these subppulatins int tw well-cslablished mdels f B-cell develpment (Table I) (2,29). 27/440P cells dwnregulate the key recmbinatin enzymes We srted subppulatins ba sed n the CD44 and CD27 expressin t cmpare their recmbinatin ptential by measuring TdT a nd RAG-I m RNA expressin by RQ PCR. Similar t the prtein level, TdT mrna expressin decreases in cncrdance with the suggested develpmental stages (Figure 5A). Interestingly, the 27/44DP cells express the lwest amunt f RAG-l transcripts (Figure 58), suggesting that these cell s are in the stage f suppressed RAG- I expressin after cmpleted ICH rearrangement. RAG-I is reexpressed during IC L rearrangement, as prven by the reappearance in the 44SP cells. Because the cells with a dwnregulated RAC-I are knwn t be frequent amng the large prliferating cells, we analyzed the percentage f large cells (eslimated by cytmetry as the prprtin f cells with a higher frward scatter). The 27/ 44DP subppulatin appears t be cmpsed mstly by the large cells, based n the highest percentage f cells with high fnvard scatter (Figure 6A,B). Immunglbulin gene rearrangement After a successful rearrangement f ICH genes in early B precursrs, cells prliferate and ICL genes start l rearrange. In all fur subppula tins, heavy-chain genes (bth segments VHI-3- JH and VH4-7-JH) were rearranged (data nt shwn), prving tha l heavy chains start t rearrange at r befre lhe earliest stage ťdifferentiatin amng lhe analyzed subppulatins. The lw quantilalive range fthe system fr VHI-3- JHand VH4-7-JH detectin did nt enable theexact quantifícatin, mainly because f a limited DNA cncentratin btained frm srted cells. Nexl, we investigated the ICL rearrangement. The system detected the intrn RSS-Kde rearrangements, whích appear in the late phase f ICL rearrangement. As shwn in Figure 7.ICL genes begin t be rearranged al the 44SP stage, whereas intrn RSS-Kde rearrangements are virtually missing al earlier stages. Bth C027 and C044 reappear at C020pSC010neg stages As reprted earlier, mature PB B Iymphcytes are CD44pS (15). Our data shw that majrity f CD20 P ' CD I One g cells express CD44 already in BM, while PB B Iymphcytcs are almst exclusively CD44 P, (Figure lb), cntrasting with BM CDIO P, cells, which cntain a grealcr fractin f 4 c 2007 The Authrs Jurnal cmpllat,n 2007 Blackwell Munksgaard

143 E. Mejstříkvá, strana 131 M. Vaskva er al. C044 and C027 delineate B-precursr develpment A 100 4í <rl SP :=J 9 <rl 60 4i a. 27/44DP.!!! Qi 40 (J 44SP 20 <t C") 27/44DN U 27SP 27/44DP 44SP 27/44DN < 10 5 B CD34 4í 60 Figure 3 Expressin f C034 and COlO w ilhin <rl. C027- and CD44-defined subse l s. Tha percenlage ::> 50 <rl f CD 34 ""0 cells (A) and C034 flurescence 4i 40 a. inlensity (B). The percenlage f C01 0b<>gh, cells.!!! 30 (C) and COlO flurescence inlensi ty (O) Furtean Qi (J specimens w ere used fr this analysls. The verlical f 20 lines dlslll1gulsh CD34""" and C034"0<I cells r 10 C010",,,hl and CDl Od,m cells. ON, duble negative; OP, duble psitive; SP, single psltlve; TdT, lerminal dexyribnuc le lidyllransferase. C O U 70 O 27SP 27/440P 44SP 27/440N ()3 10< 10 5 O CD10 27SP 27/44DP 44SP 27/440N CD44 ncg cells. Thus, immature, na'ive B cells reexpress CD44 in BM, befre they exit t periphery. lack f C027 expressin in stem cell s Within CD34 P, cells, Nilssn et al. reprted higher prprtin f CD27 PS cel ls in CDI9 ncg subppulati n cmpa red with CD 19''''' subppul atin, which was in terpreted that B-lineage-cmmitted CD 34PS cells express!ess CD27 (8). Althugh we used flu rchrme (PE) with hi gher flurescence intensity and a higher reslutin than FITC used in Nilssn's stud y, we fund nly 1.9 ± 1.7 % f CD27 p, cells (n = 14) amng CDI9negCD34ps cells. As we used a reliable cytmetric system acquiring millins f events and selecting exc lu sively viable cells fr lhe analys is, we culd further divide these CD 19ncgCD34ps cells. We used CD 10 fr finer divisin f the CD 19negCD34ps ce lls because it is knwn that the C D 19 neg CD I Op'CD34 pn, cel ls are biased tward s B lineage, althugh they ca n develp als int ther lineages (30, 31). The CD IO ncg and C D IO ps fra ctins f CD 19ncgC D34pm ce lls cntained 0.23 ± 0.21 % and 38.8 ± 26.3% C D27 ps cells (n = 14), respectively. ln cmparisn, CD 19p'CD34 Ps ce ll s cntain 67 ± 14.1 % C D27 ps cells (11 = 14). ln CD34psCDI9neg su bppulatin, the acquisitin f CD IO is accmpa nied by CD44 A B c 27SP 27SP Figure 4 The I<1 lensities f inlracellular TdT (AJ, intracellular C0 179a (B) and intracellular IgM (C) w llhl C027- and C044-d eflf1 ed subsels. Represenlalive sampl es f five m easuremenls are shwn The verllcal hnes d, s ng uish poslllve and negatlve cells. ON, duble nsgative; OP, du ble psilive; SP, single pslt,ve; TdT, lerminal dexyribnucle lidyl transferase intracellular T dt C () intracellular CD179a P 27/440P 27/44DN O ' ID' intracellular 19M 27/44DN 2007 The Aulh rs Jurna' c mp'"n ll!) 2007 Blackwell Munksgaard 5

144 E. Mejstříkvá, strana 132 C044 and C027 delineate B-preeu rsr develpment M. Vaskva er a/. Table 1 The nl dels f B-e II evelpmen t" LeBien (2) Lken et al. (291 CD2 7 and CD44 Pr B (I) Pre-B I (II) Pre-BI I (II) Immature B (lili (IV) CD19, CD10, CD34, CD24, IL-7R, RAG, VpreB, Ig-(X, VDJ H CD19, CO lo, CD24, pre-b receptr, lw RAG, IgM HC CD 19, CD10, CD24, pre-b recept r, RAG, IgM HC, VJ K CD19, CD10, CD20, CD21, CD22, CD24, CD40, 19M CDl t"uh, C034, TdT CO lo CD1 0+, lgm IgM 27SP 27/44DP 44SP. 27/44DN 27/44DN DN, duble negative; DP, duble psltlve; HC, heavy ehain; SP, single psitive; TdT, terminal dexyribnueletidyl transferase a We shw CD27- and CD44-defined differentiatin stages in lhe cntext f tw publlshed mdels. The stages in the mdel by L ken et al. (291 and LeBlen (21 are assigned by numerals and the" names, respectively, in the first clumn. dwnregulatin (Figure 8), which is in line with ur results that C044 negativity tgether with C027 psitivity is fund in the earliest CO 19 ps cells. Discussin We previusly reprted that C027 and C 044 define ALL subtypes (6). Thc data presenled here shw that the expressin f these mlecules crrelates nnrandmly with several independent markcrs f B-precursr differentiatin. Amng CD I Op'CO 19 ' '''' cdb.. bth maturity f lg rearrangements and the expressin f differentiatin markers prve the fllwing develpmental sequence: 27SP, 27/440P, 44SP and 27/440N. The data shwing heavy chain gene rearrangements in 27SP, 27/440P, 44SP as well as 27/440N cdls indicate that IGH rearrange at stages up t 27SP. Upn transitin t the 27 /440P stage, in which the large cells dminate, RAG-I expressin is suppressed, Afterwards, C027 disappears and cells enler the next stage, 44SP. This stagc is characterized by res tarting the recmbinatin machinery (shwn by RAG-I reexpressin). Only at this stage, cells start t cntain cmpleted lg L rearrangements (shwn by KDE detectin). Cells apparently attain smaller size at 44SP stage. This prcess is fini shed by lss f CD 44. The resulting 27/440N phentype dminatcs amng the C D J OPs B precursrs in human BM. The 27 /440N cells cmplete the differentiatin prccss befre the cells lse CD10, regain C044 and are allwed t exit t periphery. Interestingly, whereas RAG-I is prfundly supprcssed at 27/440P stage, TdT expressin decreases gradually thrughut the differentiatin. The suppressin f RAG-I may be imprtant during the cell prliferatin as RAG-l (unlike TdT) may cause unwanted DNA recmbinatin during replicatin. This may explain the differences between TdTand RAG-I expressin a t the 27/440P stage, conlaining la rge prliferating cells. The knwledge n B-precursr develpment can be cmbined with the leukemia diagnstics t discver the cunterparts f the dminant leukemia ppulatin. The 27SP cell s are physilgical cunterpa rts f TEL/ A M LlPS A LL, and the 44SP cells are the principaj cunterparts f ah ther B-precursr ALL subtypes. The 44/270P and 44/ 270N immunphentype is rarely seen amng B-precursr leukemias. This cntradicts a lgical expectatin th at the prliferating cmpartment (large pre-b, mstly fund in 44( 270P stage) might be mre likely t transfrm int malignancy. Because the nnmalignant cunterparts f TEL/ A M LIPO' ALL are less mature than the cunterparts f TEL/AM LI" g ALL, it is pssible t speculate that the differentiatin f TEL/ AM LIPO' leukemic cells is blcked in earlier stage than in ther leukemias. After exit t periphery, a subset f B cells reexpresses CD27 during the prcess fsmatic hypermutatin and it is then cnstitutively present as a marker fmemry cells (32). ln line with this, we bserved a C027 P, subppulatin amngc020pscoloncgcells nt nly in PB butals in BM. The BM C027p'C020PsCO IOnc g B cells are prbably recirculating memry cells. Migratin f memry cells t BM was prven by the analysis f BM cells with preferential A TdT B RAG E 0.8 E 0.8 N N e -f I- "(J 0 I- OA C2 OA O O 27SP 27/44DP 44SP 27/44DN 27SP 27/44DP 44SP 27/44DN Figure 5 Recmbinatln enzyme terminal dexy ribnucletidyl transferase (AI and RAG-l (BI mrna expressin. Expressin levels are shwn as rati t cntrl gene expressin; this valu e was nrmalized t 1 in the mst immature subset investigated. Experiments were perfr med in duplicates. DN, duble nega tive; DP, duble psltlve; SP, single psitive; TdT, terminal dexyribnucletidyl transferase The Au \hrs Jvrnal crnplalin <rl 2007 Blackw eh MtlnksgaBrd

145 E. Mejstříkvá, strana 133 M. Vas kva B I al. CD44 and CD27 delineate B-precursr develpment Figure 6 Frequencies f large ceus dehn ed as the subppulatin with the high FSC (A) and representatlve sa mple f FS C intensity. Furteen specimen s were used fr this ana lysis. DN, duble negative; DP. duble psitive; SP, single psitive ON. duble nega tive; DP. duble psitive; FSC, frw ard scalter: SP. single psltive. A 'á 50 'E li O SP 27/44DP 44SP 27/440N FSC B 27SP 27/440P 44SP 27/440N muta tins in the cmplementarity dct.:rmining regins (CDR) (33) f the VeD)] rcgins, which is the pattern that evlves during thc antigen sclcctin in gcrminal centers. Interactin f CD27 with its ligand CD70 expressed n activated T and B cclls regulatcs B-cell grwth and differentiatin t IgG- and IgM-prducing cells (34, 35). At the early develpmental slages, CD27 expressin was reprte:d n munnc hematpietic stem cells (36), and Nilssn et al. reprted a higb C D 27 expressin in human CD34 P > cells even bcfre C D 19, similar t mice (8). Althugh we did bscrve sucb cejls, lhey we re a!mst always CD \Ops and their percentage increases nly after B lineage cmmitment. Because the C D27 and C D44 are knwn t play a rle in appttic Ol' adhesin prcesses, it can be speculated tbat their expressin merely ref1ec!s the functinal status f the precursr B cell, regardless f its develpmental stage. Hwever, ur data clearly shw that CD27 and CD44 are expressed in an rganized fashin during the precursr develpment. Cnsequently, this C ll> E OJ (J) C Ol!l' "t' intrn RSS-Kde 27SP 27/440P 44SP 27/44DN Figure 7 Immunglbulin light-chain gene rearrangement.the percentage f intrn RSS-Kde rearrang emen ts is shw n. The experiment was perfr med ln triplicate. ON, duble negative; DP. duble psitive: SP. Single psitive. frms a basis fr a further research int functinal similarities between nrma! precursr and the Ieukemia cell. A!thugh the straightfrward explanatin f the presented data is that the bserved subppulatins ref1ec! cnsequent develpmental stages, alternative scenaris may be prvided. We may hypthesize lhat the fjlwing phenmena may nt represent regular features in B precursr differentiatin a t CD \OpsCD 19 ps stage: (i) CD27 expressin, (ii) the decrease in CD44 exprcssin r (iii) the reappearance f CD44 secn in 27 /44DP and 44SP cells. The scenari (i) is definitely pssible in lransgenic a nimals because B cells d develp in CD27- I - mice (37). Hwever, ur data d nt supprt this scenari as a majr pathway in healthy humans. The CDIOP<ISCDI9 pns B precursrs wuld start frm the 27/44DN phentype, which cntains n ly few CD34 ps and TdT PS cells - t the cntrary, mst cells have a mre mature phentype with rearranged ICL. Such immature cdls wuld diffcrcntiate int the 44SP phentypc, which cntains at least sme largc pre-b cells. The explanatin f the fact that wc d sec majrity fimmature (CD34 PO ', TdTP" ICL-unrearrangcd, i_igmnes, i-vprebps and CDIOb'ihl) cell s amng CD27 PS cells wuld require a cmplicated assumptin lhat sme immature cells may express CD27 fr a prlnged time, tbus increasing the apparent frequency. Accrding t the '' '',' t:!' CD34+CD19-,' r',rl,' CD34+CD19+,02 '' '' '',',rl '',' CD44 Figure 8 CD44 expressin in CD1 0P<>sCD34psCD19neg and in CD19psCD34 P<>'cells. C 2007 lha Authrs Jurnal mplla\lon C 2007 Blackwall Munksgaard 7

146 E. Mejstříkvá, strana 134 C044 and C027 delineate B-precursr develpment M. Vaskva et a/. scenari (ii), the mst immalure cells wuld enter the 27 /44DP stage. Therefre, the cells wuld need t have cmpleted ICH prir t the OIOP'CDI9 ps stage. Analgically t the scenari (i), we wuld need t accept that sme cells might stili lse CD44 and acquire the 27SP phentype. Our bscrvatin f high RAG-l expressin at the 27SP cell s makes this scenari very unlikely as we wuld assume that the cells with cmpletely rearranged ICH reexpress RAG-l upn lsing CD44 befre returning back t the RAG-l n"g 27/44DP phentype. The scenari (iii) als appears unlikely as differentiating frm 27SP directly t 27/ 44DN phentype wuld circumvent the large pre-b stage with suppressed RAG-l. ff this scenari ccurred in a significant fractin f cells, it wuld cntradict the current understanding f B-precursr differentiatin. A pssible rle r CD27 is the regulatin f apptsis because assciatin with appttic cascades was reprted. Data frm different mdels illustrate that the net effect f CD27 may be either negative r psitive. Nlte et al. shwed that murine CD2T - prgenitrs prliferated mre rapidly, suggesting a regulatry rle f C027 in the grwth f these cells. They prpse that such a regulatry rle may be triggered by the interactin f CD27 n B precursrs with CD70 n activated T cells. This culd be beneficial during infectin as the presence f freign antigen in the BM culd induce an unwanted selective tlerance (37). CD27 triggering n primary plasma cellleukemia has antiappttic effect (38). Overexpressin r CD27-binding prtein Siva induces apptsis in cell lines (39). lt was als shwn that CD27 assciates with tumr necrsis factr-receptr-assciated factr (TRAF)2 and T RAF5 signal transducers respnsible fr NF-KB activatin (40). Apptsis plays an imprtant rle during B-cell develpment when cells unsuccessfully rearranging 19 gcnes die by apptsis. The questin is whether CD27 n B precursrs culd mediate prappttic r antiappttic signal because the published data cncerning CD27 rle in apptsis are diverse in different cell types. Althugh ur data d nt answer this questin, it is bvius that amng B prccursrs, CD27 identifies mainly thc earliest stages at r befre the start f lg rcarrangement. The specificity f the early-stage detectin is strengthened when CD27 psitivity is cmbined with CD44 negativity. Our data shw that during B-cell develpment, CD44 underges tw waves f dwnregulatin. If the lincmmitted CD34 p S cells are mst ly CD44 P " then CD44 expressin decreases tgether with the tw-step acqllisitin f CDlO (Figure 7). The CD44n, cells have been described previusly amng CD34 P, BM cells and have been, in line with ur results, shwn as CDlOp' CDI9pS B precursrs (41). These CD44 ncg cells are 27SP. The fllwing reemergence fcd44, resulting in 27/44DP stage crrespnds with ne f its suppsed functins, which is regulatin f cell prliferatin. While suppressing RAG-j expressin, cells prliferate at the 27/44DP. The expressin f CD44 again ceases nly Lw stages dwn, at Lhe 27/44DN stage, in which ICL are fully rearranged and the cell s d nt prliferate and are nt dependent n CD44-mediated cntact with strmal cells. The rle f CD44 during hematpiesis was experimentally shwn by the additin f anti-cd44 mab that inhibit r enhance strmal ceij-dependent hematpiesis (42). There are mre mdels f B-lymphcyte develpment, and the nmencla ture f B-cell develpmental stages is stili unsettled. Any nmenclature shuld be based n fítting surface markers with lg gene rearrangement status. CD27 and C 044 extend the B-cell develpment mdel becallse their expressin als renects nt n ly the lg rearrangements status but als a different likelihd t transfrm int leukemia and/r t blck the differentiatin in different genetic subsets f A LL. Acknwledgments We thank the cytmetric technician Pavel Semerak. The cllabratin f alj Czech Pediatrie Hematlgy centers [Ieaders: B. Blazek (Ostrava), Z. Cerna (Plzen), J. Hak (Hradec Kralve), Y. Jabali (Ceske Budejvice), V. Mihal (Olmuc), D. Prchazkva (Usti nad Labem), J. Stary (Praha) and J. SLerba (Brn)] is appreciated. This wrk was supprted by grant ns GAUK 80/2004, IGA MZ CR NR/ , VZ MSMT MSM002l6208l3 and GACR 301 /06/ P162. References I. Bim B, Spits H. Oevelpment f human lymphid cel!s. Annu Rev Imnwn/2006: 24: LeBien TW. Fates f human B-cel! precursrs. B/d 2000: 96: Galy A, Travis M, Cen O, Chen B. Human T, B, natural kiljer, and dendritic cells arise frm a cmmn bne marrw prgenitr cell subset. lmmunily 1995: 3: Bene MC, Castldi G, Knapp W et al. Prpsals fr the immunlgical classificatin f acute leukemias. Eurpean Grup fr the Immunlgical Characterizatin l' Leukemias (EGIL). Leukemia 1995: 9: Hrusak 0, Prwit-MacOnald A. Antigen expressin patlerns renecting gentype f acute leukemias. Review. Leukemi 2002: 16: Vaskva M, Mejstrikva E. Kalina Tet aj. Transfer l' genmics infrmatin t Ow cytmetry: exprcssin f C027 and C044 discriminates subtypes f acute Iymphblnstic leukemia. Leukemia 2005: 19: Yeh EJ, Rss ME, ShurtleffSA et al. Classificatin, subtype discvery, and predictin f utcme in pediatri" <Ieule Iymphblaslic leukemia by gene expressin prfiling. Cť1ncer Cell 2002: I: Nilssn A, de Milit A. Mwafi Fet al. Exprcssin f CD27-C070 n early B cell prgenitrs in the bne marrw: l he Authrs Jurnal cmp,latin " 2007 Blackwell Munksg aard

147 E. Mejstříkvá, strana 135 M. Vaskva el al. CD44 and CD27 delineate B-precursr develpment implicatin fr diagnsis and therapy f childhd A LL. Exp Hema/O/2005: 33: van Lier RA, Brst J, Vrm TM et al. Tissue distributin and bichemical and functinal prperties ftp55 (CD27), a nvel Tcell differentiatin antigen. J Iml11unl1987: 139: Sugita K, Rbertsn MJ, Trimt Y, Ritz J, Schlssman SF, Mrimt C. Participatin f the CD27 antigen in the regulatin f [L-2-ctivated human natural killer cells. J Il11mun/1992: II. Klein U, Rajewsky K, Kuppers R. Human immunglbulin (lg)m + 19D+ periphcral bld B cells expressing the CD27 cell surface antigen carry smatically mutated variable regin genes: CD27 as a general marker fr smatically mutated (memry) B cells. J Ex p Med 1998: 188: Screatn GR, Bell MV, Jacksn DG, Crnelis FB, Gerth U, Bell JL Genmic structure f DNA encding the Iymphcyte hming receptr CD44 revca ls atleast 12 a lternatively spliced exns. Pre Nafl Acad Sci USA 1992 : 89: Jalkanen ST, Bargatze RF, Herrn LR, Butcher EC. A Iymphid cell surface glycprtein invlved in endthelia I cell recgnitin and Iymphcyte hming in man. Eur J Immunl 1986: 16: Cper DL, Dugherty G, Harn HJ et al. The cmplex CD44 transcriptinalunit; alternati ve splicing f three internal exns generates the epithelial frm f CD44. 8ivehem Biphys Res Cvmmun 1992: 182: Fx SB, Fa wcett J, Jacksn DG et al. Nrmal human ti ssues, in additin t s me tumrs, express multiple djfferent CD44 isfrms. CW1Cef Res 1994: 54: Mackay CR, Terpe HJ, Stauder R, Marstn WL, Stark H, Gunthert U Expressin and mdulatin fcd44 variant isfrms in humans. J Cell Biv/1994: 124: Aruff A, Stamenkvie l, Melnick M, Underhill CB, Seed B. CD44 is the principal cell surface receptr fr hyalurnate. Cell 1990: 6\: Huet S, Grux H, Caillu B, Valentin H, Prieur AM, Bernard A. CD44 cntributes t T cell activatin. J Il11mun/1989: 143: Miyake K, Medina KL, Hayashi S, On S, Hamaka T, Kincade PW. Mnclnal antibdies t Pgp-ljCD44 blck Iymph-hempiesis in lng-term bne marrw cultures. J Exp Med 1990: 171: Mll J, Khaldyanidi S, Sleeman JP ct al. Tw different functins fr CD44 prteins in human myelpiesis. J C/in InveSl 1998: 102: J M, Lee HK, Kang YK. Expressin f E-cadherin, beta-catenin, CD44s and CD44v6 in gastnc adencarcinma: relatinship with Iymph nde metastasis. An/icaneer Res 2003: Legras S, Gunthert U, Stauder Ret a l. A strng expressin f CD44-6v crrela les Wilh shrter survival f palients with acule myelid leukcmia. B/d 1998: 9\: Magyarsy E, Sebestyen A, Timar J. Express in f metastasis assciated prtcins, CD44v6 and NM23-H J, in pediatric acute Iymphblastic leukemia. An!icancer Res 200 I: 21: Rederer M. Spectral cmpensatin fr nw cytmctry: visualizatin artifacts, Iimitatins, and caveats Cy/UI1lC'/ry 2001: 45: Zuna J, Muzikva K, Madw J, Krejci O, Trka J, Temperature nn-hmgeneity in rapid airnw-based cycier significantly aitects real-time PCR. BiUlechniques 2002: 33: 508, 510, van Zelm MC, van der Burg M, de Ridder O et al 19 gene rearrangement steps are initialed in early human precursr B cell subsets and crrelate with specific transcriptin factr expressin. J Immunl2005: 175: Langerak A W, Nadel B, De Trbal A et al Unraveling the cnseculive recmbinatin events in the human IGK lcus. J Immunv/2004: 173: Pngers-Willemse MJ, Verhagen OJ, Tibbe GJ et al Real-lime quantitative PCR fr the detectin fminimal residual disease in acute Iymphblastic leukemia usingjunctinal regin specific TaqMan prbes. Letlkemia 1998: 12: Lken MR, Shah VO, Daltili KL, Civin CL Flw cytmetric analysis f human bne marrw. JI. Nrmal B Iymphcyte develpment. B/vd 1987: 70: Ryan OH, Nuccie BL, Ritterman I, Liesveld JL, Abbud CN, Insel RA. Expressin f interleukin-7 receptr by lineage-negative human bne maitw prgenitrs with enhanced Iymphid prliferative ptential and B-Iineage differentiatin capacity. Bld 1997: 89: Haddad R, Guardila P, lzac B et al Mlecular characlerizatin fearly human T jnk and B-Iymphid prgenitr cells in umbilical crd bld. Blvvd 2004: 104: Klein U, Tu Y, Stlvitzky GA et al Gene expressin dynamics during germinal center transit in B cells. Ann N Y Acad Sci 2003: 987: Paramithitis E, Cper MO. Memry B Iymphcytes migrate t bne marrw in humans. Pre Na!/ Acad Sci USA : Agematsll K, Kbata T, Yang FC el al CD27jCD70 interactin direclly drives B cell IgG and IgM synlhesis. EurJ Immww/1995: 25: Kbata T, Jacqul S, Kzlwski S, Agematsu K, Schlss man SF, Mrimt C. CD27-CD70 inleractins regulate B-cell activatin by T cells. Prve Nall Acad S ci USA 1995: Wiesmann A, Phillips RL, Mjica Mel al. Expressin f CD27 n murine hematpietic stem and prgenitr cells. Immtlni!y 2000: 12: Nlte MA, Arens R, van Os Ret al Immune aclivatin mdulales hematpiesis thrugh interactins betwccn CD27 and CD70. Na/ Iml11u : 6: Guikema JE, Vellenga E, Abdulahad WH, Hvenga S, Bs NA. CD27-triggering n primary plasma cellleukncmia cells has anti-appltic effects invlving mitgen activated prtein kina ses. Br J Haema/U12004: 124: Prasad K V, A Z, Y n Y et al CD27, a member f the tumr necrsis factr receptr family, induces apptsis and binds t Siva, a prappttic prtein. Pre Na!1 A cad Sci USA 1997: 94: Akiba H, Nakan H, Nishinaka Set al CD27, a member fthe tumr necrsis factr receptr superfamily, activales C 2007 The AUlhrs Jvrnal cmpdalin C 2007 Blac, wall M nksgaard 9

148 E. Mejstříkvá, strana 136 C044 and C027 delineate B-precursr develpment M. Vaskva et aj. NF-kappa B and stress-aclivaled prlein kinasejc-j un N-lerminal kinase via TRAF2, TRAF5, and NF-kappaB-inducing kinase. J Bll Chem 1998: 273: Deguchi T, Kmada Y, Sugiyama K et al. Expressin f hming-assciated cell adhesin mlecule (H-CAMjCD44) n human CD34+ hemalpielic prgeni tr cells. Exp HemalUl 1999: 27: Ghaffari S, Dugherty GJ, Eaves AC, Eaves CJ. Dive l'se effecls f anti-cd44 antibdies n lhe strmal cell-mediated supprt f nrma I bul nt leukaemic (CM L) haempiesis in vitr. Br J Haemall 1997: 97: C 2007 The Authrs Jurnal cmpilatin 2007 BlackweU MUrlksgsard

149 E. Mejstříkvá, strana 137 Přílha 9 Childhd secndary ALL after ALL treatment Zuna J, Cavé H, Eckert C, Szczepanski T, Meyer C, Mejstrikva E, Frnkva E, Muzikva K, Clappier E, Mendelva D, Butard P, Schrauder A, Sterba J, Marschalek R, van Dngen.TJ, Hrusak 0, Stary J, Trka J. Leukemia, 2007, (ff 6,924)

150 E. Mejstříkvá, strana 138 Leukemia (2007), Nalure Publíshing Grup AI! rights reserved /07 $ ORIG INAL ARTICLE Childhd secndary AU after ALL treatment J Zuna 1, H C;:Jvé 2, C Eckert J, T Szczepanski 4,s, C Meyer 6, E Mejstrikva 1, E Frankva), K Muzikva 1, E Clappier 2, O Mendelva?, P Bautard B, A Schrauder", J Sterba 7, R Marschalek 6, JJM van Dngen 4, O Hrusak 1, ) Stary 1 and J Trka 1 ICLlP (Childhd Leukaemia Investigatin Prague), Department r Paediatric Haematlgy and Onclgy, Charles University, 2nd Medical Schl, Prague, Czech Republic; 2 Labratire de Bichimie Cénétique, Hpital Rbert Debré, Paris, France; l Oepartment r Paediatric Onclgy/Haematlgy, Charite Medical University Berlin, Bertin, Cermany; 4Department r Immunlgy, Erasmus Me University Medica l Center Rtterdam, Rtterdam, The Netherlands,' SDepartment r Paediatric Haematlgy and Onclgy, Silesian Mdical Academy, Zabrze, Pland; ('Institute r Pharmaceutical Bilgy/ DCAL, University ar Frankfurt, Frankfurt/Main, Cermany; / DepJrtment í Paediatric Onclgy, University Hspital, Brn, Czech Republic; Paediatric Onc-Haematlgy Unit, University Hspital, Caen, France and 9Department r Paediatrics, Un iversity Hspital, Kiel, Cermany Dala n secndary acule Iymphblastlc leukaemla (sall) lllwing ALL treatmenl are verv rare, Hwever, the incidence might be underestimated as salls withut a significanllineage shlft mighl aulmatically be diagnsed as relapses. Examina Iln f immunglbulin and T-cell receptr gene rearrangemenls brughl a new tl thal can help in dlscriminatin between relapse and sall We fcused n the recurrences f childhd ALL 10 dlscver the real frequency f Ihe sall after ALL Irealment. We cmpared clnal markers in matched presenlatin and recurrence samples f 366 patlents treated accrding t the Berlln-Frankfurt-Munster (BFM)-based prlcls, We fund tw ca ses f sall and anther three, where the recurrence is suspicius f being sall rather than relapse. Our prpsal fr Ihe 'secndary ALL after ALL' dlagnslic criteria is as fllws: (A) N clnal relatlnshlp between diagnsls and recurrence; (B) significant immunphentypic shift - slgnlflcanl cytgenetic shift - galn/lss f a fusln gene, Fr Ihe sall (A) plus at leasl ne (B) criterin shuld be fulfilled. With these crileria, the eslimated frequency f the sall after ALL is accrding 10 ur data 0.5-1,5% f ALL recurrences n BFMbased prtcls. Flnally, we prpse a Ireatment strategy fr Ihe patlenls with secndary disease, Leukemia advance nlíne publicatin, 26 Apríl 2007; di:1 0_1 038/sjJeu_ Keywrds: secndary acute Iymphblastíc leukaemia; chíldhd; relapse Inlrductin Secndary r treatment-related acute leukaeltlia is a well-knwn cmplicatin l previus cancer therapy. The vast majrity l cases in paediatric patients cmprise secndary acute myelid leukaemia (AMU, whereas secndary acute Iymphblastic leukaemia (ALU ís cns ídered t be a rare disese. Case reprts f secndary ALL (salu in children have been described fllwing treatment f varius malignant diseases (Wí lm' s tumur, Hdgkin's disease, neurblastma, Ewing's sarcma, stesa rcm a, medullblastma, retinblastma, ependymma and s n)l,l Hwever, althugh ALL is the mst cmmn malignancy in childhd, the data n childhd sall fllwing ALL treatment are scarce. Crrespndence: Dr lan Zuna, (LIP, Department f Paediatric Haematlgy and Onclgy, Charles Univ 'rsity Prague, 2nd Medical Schl, V Uvalu 84, Prague S , Czech Republic. jan_zunawlrmtl.cuni.cz Received 5 March 2007; revised 27 March 2007; accepted 28 March 2007 ln fur large studies describing the incidence f secndary neplasms in children treated fr ALL, n secndary ALL w as diagnsed amng the ttal f mre than 2S 000 children develping altgether 171 secndary malignancies,l--<" Th e data demnstrate tw fa cts (1) ALL treatment bears a relatively lw risk in terms f secn dary tumurs cmpared with treatment f ther frequent childhd malignancies 7 (2) Diagnsis f secndary ALL after ALL treatment is extremely rare. This rareness might be caused by the fact that ALL recurrence after ALL treatment is usually autmatica lly diagnsed as J relapse f the riginal leukaemia. Cmparative analysis f immullglbulin (lg) and T -cell receptr (T R) gene rearrangements brught a new tl that can help in discriminatin between real relapse and sall clnally unrelated t the riginal disease_ 8 Only very lew case reprts have been published adm itting that a suppsed ALL relapse might represent a secndary malignancy but n cmprehensive study aimed at determining the frequency f secndary ALL after ALL treatment has been presented 50 far. ln ur study, we aimed t answer the questin w hat is the Jctual frequency f this phenmenn and t shw that it might be underestimated. By cmparisn f IgffCR rearrangements and ther markers f the malignant clne in matched pre5entatin and recurrence samples, we screened a series f 366 patients cn secutively diagnsed in fur centres and treated accrding t the Be rlin-frankfurt-munster (BFM)-ba sed prtcls_ We fund tw cases with secndary ALL and anther three in which the secnd malignancy is suspicius f being sall rather than relapse. On the basis f ur results, we prpse guidelines fr defining the secndary ALL after ALL treatment. Malerials and melhds Patients A ttal l 366 childhd pati ents with relapsed ALL were analysed bth at diagnsis and recurrence f the disease in fur centres (Prague, Paris, Berlin, Rtterdam). AII children were treated accrding t the BFM r BFM-related prtcls (BFM (n = 81), (Eurpean Organisat in r Research and Treatment í Cancer) EORTe (n = 199), (Dutch Childhd Leukemia Study Grup) DCLSG (n = 86)), The patients ar( cnsecutive unselected cases frm given prtcls in whm marker stability fr all recurrences f childhd ALL was assessed at re5pective centres. Infrmed cnsent fr the therapy and jint research examinatin was btained frm patients r their guardians, and

151 E. Mejstříkvá, strana 139 ChildhO()d secndary ALL afte, ALL t,eatment JZuna el a/ prtcls were reviewed by Institutinal Review Bards (IRB) r Research Ethics Cmmiltees (REC) f respective centres. Patient UPN5 was rcprted previusly in Ihe study cncerning IgfTCR rearrangements " ImmunrC'ceptr gene rearrangements We examined Ihe IgfTCR gene rearrangement patterns in bne marrw samples f Al.l. patients using PCR primer set s cvering the vast majrity (> 90%) f Ig-heavy chain (lch), 19-I\: (lck), TCR-ó (TCRO) and TCR-y (TCRC) rearrangements in B-cell precursr (BCP) ALL and the set f rea ctins cvering the T-cell acute Iymphblast ic leukaemia (T-ALL) rearrangements (TCRO, TCRC and 51L-TALI rearrangements). In cases with n clnal relatinship between the samples frm diagnsis and recurrence in these lci, we added examinatin f incmplete ICH rearrangements, and (except fr the patient UPN4, where the lw amunt f available DNA precluded the analysis) bth cmplete and incmplete TCR-{3 (TCRB) rearrangements. AII detected rearrangements were sequenced and cmpared between the primary and secndary leukaemia t distinguish cmpletely new rearrangcments frm related rearrangements with secndary changes. In thc discrdant patients, the diagnstic samples were analysed fr the presence f all new 'recurrence rearrangements' t exclude their presence even at lwer level in the riginal leukaemic ppulatin. The sensitivity f this analysis was 10-4 _10-5 in thc patients UPNl-4 and 10 L in patient UPNS. Sequences f primcrs and PCR cnditins were specified elsewhere. I O- U T reliably distinguish clnal PCR prducts frm plyclnal, we perfrmed heterduplex analysis f fragments using plyacrylamide gel. 14 Fusin gene determinatin and cytgenetics Presence f TEL-AML 1, BCR-ABL and MLL-AF4 fus in genes was exa mined as a part f rutine ALL diagnstics al riginal diagnsis and recurrence. MLL fusin sequence in patient UPN1 was establishcd at the Diagnslic Centre fr Acute Leukaemia (DCAL) in Frankfurt. A lng-dista nce inverse PCR methd was uscd t determine the genmic fusin break pint. ls Rutine karytyping was perfrmed at diagnsis and recurrence f the disease. In smc cases, flurescence in silu hybridizalin analysis targeted t MLL gene rearrangements was added at the time f recurrence. Flw cytmetry Flw cytmetry immunphentyp ing f bne marrw aspirates was rutinely perfrmed at cliagnsis and at rel apse using panel f mabs recmmendecl by the Eurpean Crup fr the Immunlgic I Characterizatin f Leukemias. 1 ó Genetic identity cnfirmatin ln three patients (UPN2, UPN3 and UPN4), suspect frm the secndary ALL, a palient identity cnfirmalin f diagnstic and recurrence samples was perfrmed t ru le ul the pssibility f sample cnfusin. Micrsatellite testing using AmpFISTR Prfilerplus Kit (PE Applied Bisystems, Darmstadt, Cermany)17 r by PrmegaPwerpl ex 16 kit (prmega, Madisn, WI, USA) was used fr th e affirmalin. Results Amng 366 relapscs analysed in ur study, we fund five cases withut any clnal relatinship between diagnsis and recurrence f the disease. We aimed t verify lhe discrd ance f clnal markers in these patients at different levels - by the anal)'sis f immunphentype, cytgenetics, fusin genes and IgfTCR rearrangements. Th e IgfTCR rearrangelllents were present as spec ific clnal markers in virtuall)' all ALL pati ents. Thus, we fcused n detailed analysis f the rearrangements in the fivc patients and besides rutine IgfTCR screening, we cmpared sequences f the rearrangements at diagnsis and recurrence; and we als attempted t backtrack all new rearrangcmcnts frm the recurrence f the disease back t lhe riginal diagnsis. Neither the cmparisn f sequences nr thc backtracking shwed an)' clnal relatinship between th c primary and secndary leukaem ia in these five cases. Thc patienťs characteristics are summarized in Table 1. In additin t the cmpletely new pattern f IgfTCR rearrangelllcnts at the time f ALL recurrence, 2/5 patients (UPN 1.lnd UPN2) shwed additinal immunphentypic (Iineage switch frm BCP t T-cell leukaemia) and genetic (ccurrence f a new MLL fusin gene, lss f TEL-AML 7 fusin gene) features supprting designatin as the sec ndary leukaemia. In th e patient UPN1, the recurren ce referred here is the sec ncl rccurrence; the first recurrence f thi s chil d bre all clnal signs f a genuine relapse with immunphentype, cytgenetics and IgfTCR rearrangements crrespnding t the r iginal diagnsi s. At the secnd recurrence this patient shwed cmplele immunphenlypic switch frm BCP t T-ALL, lhe blast cells lst th eir hyperdiplid character (DNA index was and 1.00 at diagnsis, th e first recurrence and the secnd recurrence, rcspectivelyl <lnd a nvel type f MLL gene rearrangement appeared with a fusin t the MAML2 gene at 11 q21. Discussin T ur knwledge, nly six cases f ALL recurrcnce that might be cnsidcrcd as being secndary rather than relapsing leukaemia have been described 50 far. Thc rcview af the literature is summarized in Table 2. The lisl f cases includes three children wilh 'Iate develping' t(4;11), 18,19 and tw ca ses where ther translcatins invlving MLL gene arse (t(11 ;14)20 and t( 11 ;16) n). In the remaining case (as well as in the t(ll ;14) case), thc assumptin that the recurrence is rather a secndary leukacm ia came frm the fact that n cmmn marker was funcl Jfter examinatín f IgfTCR rearrangements at c1iagnsis and recurrence f ALL 9,20 We are aware that definite diagnsis f an indisputable sall is intricale. In mst cases, there is a hypthetical pssibility lhat lhc discase has riginated in a very early prugenitr with ability t diffcrentiate int very dissímilar cell ppulatins with seemingly n clna I relatinship t cach ether. Unless the leukaemic stem cell is defined, it ís virlually unfeasible t rule ut the pssibility f a biphentypic/biclnal clisease at diagnsis w ith a sma ll, undetected subclne utwardly unrelated t the predminant diagnstic clne. Such cel ls culd emerge aiter an effective treatment f the majr clne and givc rist' t a dminant relapse ppulatin. Thus, the nly virtually indisputable salls are cases where a fusin gene, which is thught t be lhe first hit in leukaemgcncsis (fr cxample, TEL -AMU r MLL-AF4l, is lst al the recurrence. T preclude r at least t minimize the risk f a hidden biphcntypic/biclnal discjse at diagnsis, absence i all thc rccurrcnce-specific rea rran gements shuld be verified in th c diagnstic sample. Hwever, the prbability f a rc currcnce cnstitulecl by cclls with cmpletely unrelated clnal charilctcristics but stili riginated in lhe same leukaemic stem cell as the riginal ukemia

152 E. Mejstříkvá, strana 140 Childhd secndary ALL after ALL treatment J Zuna et a/ Table 1 Characteristics f the 5 patients with pssible secndary ALL aher ALL treatment "a/ien/ UPNi UPN2 UPN3 UPN4 UPN5 1ge at diagnsis (years) ender F M M F F :nmunphentype (P IR) BCP/BCprr BCprr Trr BCP/ BCP BCP/BCP ;usin genes IP/R) neg/neg/mll -MAML2 TEL AML 1 I neg Neg/neg Neg/neg NA/NA qrrcr (P/ R) ABCI ABC/DEF ABCD/EFGH AB/C AB/CDE ABCDElFGH Treatment preceding the ALL BFM95-SRlALL- EORTC VHR ALL-BFM 2000-MR EORTC S DCLSG-ALL-8-HR sall Rez BFM96-S2 CR preceding the sall 2.9/ (years) :R after sall N Ves Ves Ves N Outcme (mnths in CR) Txic death in the Death due 10 Secnd CR (32) after Secnd CR (72) Death in the recurmnce ex1ramedullary allbmt recurrence (thymic) pr9ressln (prgressive disease) rladiatin (Gy)" 18 N 12 N N Etpside (mg/m 2 )' N N 1350 Daunrubícin (mg/ m 2 )" :Yclphsphamidel !slamide (g/m 2 r' bb reviatin s: allbmt, allgeneic bne marrw transplanlatin; BCP, B-cell precursr; CR, cmplete remissin; IgrrCR, immunglbuhn and T cell receptr; NA, nt available; P, presentatin; R, recurrence; sall, secndary acute Iymphblastic leukaemia. 'g/tcr: in each patient, different letters stand fr differenl and unrelated rearrangements, 11 patient UPN 1, we reler t presentatin and bth first (genuine relapse) and secnd (sall) recurrences. 'Cumulative dses f selected drugs preceding the sall Table 2 Review f the literature - CJ ses f pss ibl p sall after ALL described 50 far qeference Origina/ diagnsis Secndary ALL /g/tcr rearrangemen/s Ou/cme Szczepanski et al. 20 T-ALL T-ALL Unrelated Nt reprted T-ALL T-ALL wlth t(11 ;14) Unrelated Nt reprted Millt et a/, 19 Mature B-ALL with t(8; 14) BCP-ALL with t(4;11) Unrelated CR achieved hunger et a/, 2' T-ALL BCP-ALL with t(11; 16) Unrelated (nly TCR-fl tested) Nt reprted 8rizard et al. 18 ALL BCP-ALL with t(4;1 1) Nt dne CR achieved, allbmt perirmed ALL BCP-ALL with t(4;11) Nt dne CR achieved, allbmt perirmed Abbreviatins: allbmt. allgeneic bne marrw tfansplantatin; ALL, acute Iymphblastic leukaemia; B-ALL, B-cell acute Iymphblastic Ieu aemia; BCR B-cell precursr; CR, cmplete remissin; IgrrCR, immunglbulin and T-cell receptr; sall, secndary acute Iymphblastic!eukaemia; T-ALL, T-cell acute Iymphblastic leukaemia; TCR-fl, T-cell receptr-fl. diagnsis is lw. Mrever, thi s dilemma is rather academic as frm the practica l pint f view (fr cxample, treatment purpses) such ca se shuld nt be cnsidcred as a standard re lapse anyway. Our multicentre study is the first t investigate systematically the clna I relatinship between presentatin and recurrence in childhcl ALL. We present a large chrt f patients examined n running trials and analysed subsequently with regard t reveal inci dence f pssible sall after ALL treatment. As reprts in the literjture are E'xtremely rare, n stjndards dcfining this issue have been pstulated 50 far. Our prpsal fr th, ' diagnstic criteria f '5ecndary ALL after ALL treatrllcnť is as lllws: ia) N clnal relatinship between diagnsis and recurrence (lgltcr, fusin genes Jt DNA level, cytgenetic marker). 18) significam immunphentypic shift (typically lineage switch) significant cytgenetic shift gain r lss f a fusin gene Fr the diagnsis f secndary leukaemia, (A) plus at least ne lb) criterin shuld h" fulfilled. ln ur study, tw patients (UPN1 and UPN2) meet ur criteria fr sall. The patients fulfilling nly the (A) c riterin (patients UPN3, UPN4 and UPN5 in ur study) are 'pssible' secndary ALLS, but withut additinal evidence the diagnsis f secndary leukaemia culd be challenged. The number f IglTCR markers changed between diagnsis and recurrence (the (A) criterin) might als have its significance - prviding n identical r related marker is maintained between the tw time pints, lhe mre changes detecled the higher is the prbability f secndary ALL. Thus, in ur case UPN5 with eight such changes, the sall is highly pssible even withut any (B) criterin fulfilled, On the ther hand, in case UPN3 (ni)' three changes and n (B) criterin), the diagnsis f sall c u lel be questined mre easi ly, Althugh the lnger remissin duratin culd be cnsidered as a supprting ev idence fr secndary rather than relapsed ALL, we did nt include the criterin f the time t recurrence int aur prpsal. Studies n very late relapses shw Ihat even recurrence mre than 20 years frm diagnsis ar(' clnally related t the riginal leukaemic cells (1 3/13 very late reljpses 5-24 years frm diagnsis 2 Z. 23 ). On the cntrar)', ver)' c'lrly recurrences (Iess than 1 year frm the riginal diagnsis) are certainly mre likely t be genuine relapses. Occurrence f a new fusin gene is nt a guarantcc pn se that the recurrence is a sec ndary leukaemia. Fr cxjmplc, lhc t(9;22), assciated with the BCR-ABL rearrangemcnt, cnuld bc a late appearing, therapy-related secndary event in the evlutin f the primary clne,24-2b Leukemia

153 E. Mejstříkvá, strana 141 Childhd secndary All after All treatment J Zuna el aj ALL is the mst cmmn childhd malignancy, and thus it can be suppsed that sall after ALL treatment is mre cmmn than reprted - salls withut a significant linea ge shift have prbably been autmatically diagnsed as relapses; in cases where an immunphentypic shift is cnsiderable (such as in Our patients UPN1 and UPN2), the flw cytmetry is the first methd that draws ur attentin t a pssibl e secndary disease. The main ncgenic factrs increasing th e risk f subsequent neplasms are a genetic susceptibility and a previus therapy, particularly raditherapy, tpismerase inhibitrs (etpside, dxrubicinj, alkylating agents (cyclphsphamide) and sme antimetablites (6-thiguanine). Mre intensive use f sme f th ese treatment ptins in certain lder ALL prtcls led t increased frequency f secndary malignancies t almst 5%29 Althugh tbese cmpnents are als used in current BFM-based ALL prtcl s, the verall extent f th e use is relatively lw cmpared t the treatment f ther paediatric malignancies and sme are applied nly in subgrups f patients (l-cell ALL and high-risk ALL). Als the dsing schedule is adapted t ca use as little late effeets as pssible. Only five pati ents in aur study are suspect f suffering treatment-related secndary leukaemia, and all f them were treated accrding t th e standard prtcls as well as the rest f the children in this reprt. Thus, we cannt draw any r Eas nahl e cnclusin regarcling the relat inship f primary treatment and th e risk f sall. Nevertheless, it is f nte that 3/5 case in ur reprt (pati ents Ur'N1, UPN2 and Ul) 15) unde/went a very intensive therapy befre sall. Patient U PN1 was stratified t standard risk treatment but suffered relapse and received anther prtcl f intensive chemtherapy befre her secnd recurrence identified as a secndary ALL. Patients UPN2 and UPNS respnded prly t initial treatment and were restratified t the very high-risk Mm f the EORTC prtcl and high-risk arm f the D LSC; prtcl, respeetively. Previus treatment an play a rl e in the risk f sall. Hwever, whde the link betwecn specific drugs and the risk f secndary AML is very strng, in secndary ALL the effect f previus treatment is less prnul1ced. This faet suggests that ther mechanisms - particularly geneti e susceptibility - might be als invlved. Plymrphisms f sev ra l detxificatin genes (NQ07, CYP3A and CS1) have been shwn t be related t the increased risk f seendary leukaem ia, mutatin s f ATM gene have been linked specifica lly t T-ALL. 7.JO Ntably, 3/5 patients described here suffered ALL recurrenee frm T-lineage when 2 f these J T-ALLs represented a lineage shift frm BCP-ALL. Detailed plyl1lrphism and mutatinal ana lysis f these genes might be helpful in unmasking the sall pathgenesis. On the basis f current knwledge n childhd ALL, there are prbably three typcs f disease recurrence: 1. genuine relapse frm a resistant diagnstic (sub)clne, 2. secndary leukaemia arising frlll th e ri ginal pre-ieukaemic c10ne (with sme clnal markers milintained and sme changed) as demnstrated in late relapses f TEL-AML 7 psitive cases] I and 3. pure sa LL, clnally unrelated t the riginal leukaemia. It is very difficult t distinguish between the first and secnd type f recurrenee using current sta ndard techniques as in bth f the se events sme clnal markers are maintained between the riginal diagnsis and recurrence but ther can be altered. The nly methd described 50 far t distinguish at least sme 'secndary leukaemias frm pre-ieukaemic clne' frm 'genuine relapses' is the analysis f the nn -translcated TEL gene deletins in the subgrup f patients with thl' TEL-AML 7 fusin gene. D spite th e number f published cases where the recurrence is believed t be a 'seendary leukaemia frm the riginal pre-ieukaemic clne' is less than 10,31,.12 the published data suggest that the frequeney f this type f recurrence can be as high as 20%, particularl)' in late relapses 3 1 Th e estimated frequency f the pure sall after ALL treatment is lw but nt null - accrding t ur data % f ALL recurrences n BFM-based prtcls. In ur sludy at least tw patients belng t the categry f pure sall. ln thl' 'pure sall' and the 'sall frm the same pre-ieukaemic clne' cases bth the previus and the subsequent treatment strategies shuld be cnsidered. The frequency f these types f recurrence (tgether pssibly even mre than 20% f late events) shuld be cnsidered in discussins regarding an intensity f preceding frntline treatment strategies - th ese failures might, in fact, ccur nt because f lw intensity f therapy but can be triggered due t vertreatment. As fr the adequate subsequent treatment, it shuld be stressed that we deal in fact with new diseases and nt with resistant dnes selected by a previus therapy. On the ne hand, the 'sa LL frm the same pre-ieukaemic clne' cases might be candidates fr standard frntline treatment rather than intensified relapse prlcl; hwever, as Olentined abve, disclsure f these ca ses and their distinctin frm genuine relapses in current rutine practice is intricate. On the ther hand, the 'pure sa LLs' represent secnd independent ma1ignancies f haematpietic cell s and thus sme (pssibly inherited) su sceptibility t the disease must be taken int aeeunl. In such cases, haematpietic stem cell transplantatin (SCT) shuld be cnsidered t replace the pred ispsed haematpietic cells. As the 'pure salls' (u nlike th c 'salls frm pre-ieukaelllic c1ne') can be revealed in time t adjust their treatment (immunphentyping, fusin genes detectin and IglTCR anal ysis can all be dne within a few days), we suggest an apprach applying a frntline therapy fllwed by SCT fr all the indisputable eases. Fr the 'pssible' sa LL ca ses (fulfilling nly the (A) criterin frm the abve sall diagnstic prpsa l), we wuld rather recmmend a standard relapse therapy including stratificatin accrding t a prtcl. Hwever, in the lw-risk grups (where there is nly a limited SCT indicatin in mst f the current prtcls), an SCT shuld als be discussed based n a deeper understanding and ev idcnc(' f bilgical rigin f sall. Therefre, we strngly advcate that all treatment deci sins shuld be handled with cautin and shuld be guided via study centres t ensure a harmnized clinical apprach. Acknwledgements We acknwledge Prfessr Willem A Kamps the chairman f DCLSG ALL-8 study. The wrk was supprted by grant (MSMT CR) and by the Prgramme Hspitalier de Recherche Clinique (PHRC-AOM02 003). References Hunger SP, Sklar J, link MP. Acute Iymphblastic léukemia ccurring as a secnd malignant neplasm in childhd: reprt f three ca ses and review f the literature. J Clin Onc/1992; 10: Geetha N, SreedeviAmma N, Kusumakumary P, lali VS, Nair MK. Acute Iymphbl astic leukemia ccu rring as a secnd malignancy: reprt f a case and revi ew f literature. Pediatr Hemat/ Onc/ 1999; 16: Neglia JP, Meadws AT, Rbisn LL, Kim TH, Newtn WA, Ruymann FS el a/. Secnd neplasms after acute Iymphblasti c leukemia in childhd. N Eng/ J Med 1991 ; 325: eukemia

154 4 Kimball Daltn VM, Gelber RD, Li F, Dnnelly MJ. Tarbell NJ. S li a n SE. Secnd malignancies in patients lreated fr childhd acute Iymphblastic leukemia. j Ctin Oncl 1998; 16: 2841> Lning L, Zi mmermann M, Reiter A, Kaatsch P, Henze G, Riehm H et al. Secndary ncplasms subsequent t Berlin-Frankfurt Munster therapy f acute Iymphblastic leukemia in childhd: significantly lwer risk withut crani'll radi therapy. Bld 2000; 95: Bhatia S, Sather HN, Pabust an OB, Trigg ME, Gaynn PS, Rbisn LL. Lw incidence f sccnd neplasms amng children diagnsed with acute Iymphblasti c leukemia dltcr Bld 2002; 99: 42'i Bhatia S, Sklar C. Sccnd cancers in surv ivrs f childhd cancer. Nat Rev Cancer 2002; 2: Szczcpanski T, Willemse MJ. K,lmps WA, van Wering ER, LangerJk AW, van Dngen Jl. Ml"cul,lr discriminatin between rel apsed and secndary acute Iymphblasti c I ukemia: prpsal fr an easy stratcgy. Med Pediatr Oncl 2001, 36: Szczepanski T, Willemse MJ. Brinkhf B, van W ering ER, van der Burg M, van Dngen jj. Cmparative analysis f 19 and TCR gene rearrangements at diagnsis and at relapse f childhd precursr B-ALL prvides imprved strategies fr sele tin f stable PCR targets fr mnitring f minimal residual disease. Bld 2002; 99: Pngers-Willemse MJ. Seriu T, Stlz F, ďaniell E, Gameir P, Pisa P et al. Primers and prtcls fr standardized detectin f minimal res idual disease in acute Iymphblastic leukemia using immunglbulin and T cell rec ptr gene rearrangements and TAL1 deletins as PCR targets: reprt f the BIOMED -I CON CERTE D ACTl O N : invcsti ga tin l minimal residual disease in acute leukemia. Leukemia 1999; 13: Szczepanski T, Willcmse MJ. van Wering ER, van Weerden IF, Kamps WA, van Dngen IJ. Precursr-B-ALL with D(H)-J(H) gene rea rrangements ha ve an immature immungentype with a high frequency f ligclnality and hyperdiplidy f chrmsme 14. Leukemia 2001 ; 15: van der Velden VH, Hchhaus A, Ca zzaniga G, Szezepanski T, Gabert J. van D ngen IJ. Detectin f minimal residual disea se in hematlgic malignancies by real-time quantitative PCR : principles, appraches, and labratry aspects. Leukemia 2003; 17: van Dngen JJ, Langera k AW, Bruggemann M, Evans PA, Hummel M, Lavender FL et al. D esign and standardizatin f PCR primers and prtcls lr dctcctin f clnal immunglbulin and T-cell receptr gene recmbinatins in su spect Iymphprl iferatins: reprt f the BIOMED-2 Cnccrted Actin BMt-I4-CT Leukemia 2003; 17: 22' Langerak AW, Szczepanski T, van der Burg M, Wlvers-Tcllcr ll, van Dngen JI. Het 'rduplex PCR analysis f rearranged T cell receptr genes fr clnality assessment in suspect T cell prliferatins. Leukemia 199 7; 11: Meyer C, Schneider B, Reichel tvl, Angermueller S, Strchl S, Schnittger S el Ol l. Diagnstic tl fr the identifícatin r MLL rearran gcrnents including unknwn partner genes. Pre Na II Aead Sei USA 2005; 102: Bene MC, Caslldi G, KnJpp W, Ludwig WD, Matutes E, Orfa A et al. Prpsals lr the immunlgical classificatin f aeule leukemias. Eurpean Grup fr th e Immunlgical Characterizatin l Leukemias (EGll). Leukemia 1995; 9: MassenkE'iI G, Nagy M, Lawang M, Rsen O, Genvresse I, Gescrick G el al. Reduced intensity cnditining and prphylactic Childhd secndary ALL after ALL treatment J l una el al DLI can cure patients with high-risk acute leukaemias if cmplete dnr chimerism can be achieved. Bne Marrw Transplant 2003 ; 31: Bri za rd A, H urel ll, Benz-Lemine E, Guilht F, Giraud C, Tanzer J. Tw cases f t(4 ;11) acute Iymphblastic leukemia (AL U fllw ing ALL withut the t(4; 11): secnd r secndary leukemias? Br j HElemal/1991 ; 79: Millt F, Brizard F, Srel N, Preudhmme C, Cividin M, Guilht F et al. Therapy-related acute Iymphblastic leukemia with MLL rearrangement fll wing treatment f Burkin's leukemia. Leuk Lymphma 2005; 46: Szczepan ski T, van der Velden VH, Raff T, lacbs DC, van W ering ER, Bruggemann M et al. Cmparative an alys is f T-cell receptr gene rearrangements al diagnsis and relapse f T-cell a.utc Iymphblastic leukemia (T-ALU shws high stability f clnal markers fr mnitring f minimal residual disea se and revea ls the ccurrence f secnd T-ALL. Leukemia 2003; 17: Hunger SP, Tkachuk DC, Amyln MO, Link MP, Carrll AJ, Welbrn ll el al. HRX invlvement in de nv and secndary leukemias with divem> chrmsme 11 q23 abnrmalities. Bld 1993; 81 : L N igr L, Cazzaniga G, Di Catald A, Pannunzi A, D'Aniell E, Masera G el al. Clna I stability in children with acute Iymphblastic leukemia (ALl) wh relapsed five r mre years aftpr diagnsis. Leukemia 1999; 13: \fra A, Frst L, Gdeve A, Wilsn G, Ireland RM, Lilleyman I et al. Late relapsing childhd Iymphblastic leukemia. Bld 1998; 92: Kim M, Lim J, Kim Y, Han K, Kang CS, Kim HJ et al. A case f therapy-related acute myelid leukemia assciated with inv(16), with subsequent develpment f t(9 ;22). Leukemia 2006; 20: Tsuchiya H, Migita M, Yamamri S, Kanek Y, Adachi N, Nakamura T et al. A late-appearing Philadelphia chrmsme in acute Iymphblastic leukemia cnfirmed by expressin f BCR ABL mrna. Leukemia 1995; 9: Tchirkv A, Bns JM, Chassagne J. Schepfer C, Kanld J. Briancn Gel al. Mlecular detcctin f a late-appearing BCR -ABL gene in a child w ith T-cell acute Iymphblastic leukemia. Ann HemalOl 1998; 77: Miller BA, Reid MM, Nell M, Liptn JM, Sallan SE, Nathan DG el al. T-cell acute Iymphblastic leukaemia with late develf.'ing Philade1phia chrmsme. Br j Haemat/1984; 56: Cad JE, Arthur DC, Gajl-Peczalska KJ. Litz CE. Late-develping Phil adelphia chrmsmes in a ca- f T-cell acute Iymphhlastic leukemia. Leukemia 1994; 8: Pui CH, Byen 1M, Rivera GK, Hancck ML, Sandlund JT, Ribcir RC et al. Lng-term results f ttal therapy studies 11, 12 and 13A fr c hildhd acute Iymphblastic leukemia at St Jude Children's Rcsearch Hspital. Leukemia 2000; 14: LiberlOn E, Avigad S, Stark B, Zilberstein L Frccdman L, Grfine M el al. Germ-line ATM gene alteratins are assciated with susceptibility t spradic T-cell acute Iymphblastic leukemia in children. Genes Chrmsmes Cancer 2004; 39: Zuna J, Frd AM, Peham M, Patel N, Sah a v, Eckert C el al. TEL deletin analysis supprts a nvel vi ew f relapse in childhd acute Iymphblastic leukemia. Clin Caneer Res 2004; 10: Frd AM, Fa sching K, Panzer-Grumayer ER, Kenig M, H aas OA, Greaves MF. Origins f ' Iate' relapse in childhd K ute Iymphblastic leukemia with TEL-AML 1 lusin gene,. Bld 2001; 98: Leukem;a

155 E. Mejstříkvá, strana 142 P ř ílha 10 Allgeneic stem cell transplantatin in children with leukemia using human leukcyte antigen-mismatched unrelated dnrs Sedlaeek P, Fnnan.kva R, Mejstrikva E, Keslva P, Hubaeek P, Dbrvlna M, Vrana M, Kupkva L, Pittrva H, Stary J. Pediatrie Transplantatin, 2007, (lf 1,505)

156 E. Mejstříkvá, strana 143 Pedi(llr Trll:splrml(lf;ulI 2fJ08: I.'.!4-3/ Cpy riglu 2007 Blckwe/l MlIllk.\gaard Pediatrie Transplantatin 001: 11I.IIIIU.1J9Y J J0762..\' Allgel1eic stem cell transplantatin in children with leukemia using humal1 leukcyte antigen-misll1atched Ul1related dnrs Sedlacek P, Frmankva R, Mejstrikva E, Keslva P, Hubacek P, Obrvlna M, Vrana M, Kupkva L, Pittrva H, Stary J. Allgeneic stem cel! transpla ntatin in children with leukemia using human leukcyte antigen-mismatched unrelated dnrs Pediatr Transplantatin 2008: 12: Blackwell Munksgaa rd Abstract: Al10geneic HSCT is a curative treatment, when chemtherapy fai1s, fr certain malignant diseases. ln Eurpe, n ly 15 % f the indicated children have an HLA-matched sibling available; in 65-70% f thers, HLA al!ele-matched (9-10/ 10) UOs can be identified. Fr the rest, it is necessary t identify ther alternative dnrs (HLA-mismatched family r unrelated crd bld). We present ur d a ta f HSCT using HLA partially alle1e-mismatched (7-8/l0) UOs in 24 children with leukemia. Unifrm GvHO prphylaxis was used (ratg, CsA and MTX). Acute GvHO grade II was diagnsed in 70.8 % f the patients and grade III IV in 12.5 %. Overal! incidence f chrnic GvHO was 38.7% (extensive in 30%). The prbability f EFS was 60.3% (95% CI ) and OS was 74.9 (95% C I ). N difference in survival between PBSC and BM recipients was bserved. TRM at day was 4%, and veral1 was 12.5%. We cnclude that used cmbinatin f drugs fr GvHO prphylaxis is efficient even fr patients transplanted with grafts frm a HLA-mismatched UOs. lt enables stable engra ftment, gd cntr01 f G vho, full recnstitutin f immunity, and is nt cnnected with unacceptable transplanhelated mrtality. Petr Sedlacek', Renata Frmankva', Ester Mejstrikva', Petra Keslva\ Petr Hubacek', Marie Dbrvlna 2, Milena Vrana 2, Libuse Kupkva 3, Helena Pittrva 4 and Jan Stary' 1Department l Pediatric Hematlgy and Onclgy, University Hspital Mt l. 2nd Medical Schl, Charles Universi ty, Prague, Czech Republic, ' Institut e f Hematlgy and Bld Transfusin. Prague, Czech Republic, JCzech Stem Cell Registry, Pragu e, Czech Republic, 'Czech Natinal Marrw Dnrs Registry, Pilsen, Czech Republic Key wrds: allgeneic hematpie ti c stem cell lrans plantatin - human leukcyte antigen mismatched - Ieukemla - unrelated dnr - chlldren Petr Sedl acek. MO. PhD. HemalO pletlc Stem Cell Transplant Unit, Department l Pediatric Hematlgy and On clgy, UniverS ity Hspital Mtl and 2n d rviedica l Sch l, Charles Universi ty, V Uvalu , Prague, Czech Republic Tel Fax: petrsedlacek@llmtl.cunicz Accepted lr publicatin 11 May 2007 Allgeneic HSCT is a ptentially curative treatment fr cerlain malignant diseases. It is ften indicated ln patients wilh leukemia where respnse t chemtherapy is inadequate. Unfrtunately, in abut 15-20% f the patients, we are nt able t find a HLA-matched RD r UD. Infusin f a graft frm a HLA partially mismatched dnr, unrelated crd bld, r Abbreviatins: *, with 12 men and 12 wmen; pair, ne pair ut f 24 pairs (dnr-recipient); ABiL, acute biphentypic leukemia; ABLC, amphtericin B lipid cmplex injectins; AdV, adenvirus; AML, acute myelgenus ieukemia; ANC, abslute neutrphil cunt; ATG, antithymcyte glbulin; I3KV, BK virus; BM, bne marrw; cgvhd, chrnic graft vs. hst disease; CML, chrnic myelgenus leukcmia; CMV, cy tmegalvirus; CsA, cyclsprine A; DLI, dnr Iymphcyte infusin; EBV, Epstein-Barr virus; EFS, event-free su rvival; ESG-MRD ALL, Eurpean study grup n detectin f MRD in acute Iymphblastic leukemia; FPIA, flurescence plarizatin immunassay; GvHD, graf! vs. hst discase; HHV6, human herpesvirus 6; HHV7, human herpesvirus 7; HLA, human leukcyte antigen; HLA-A,B,DR, human leukcyte antigens-a,b,dr; HSCT, hematpietic stem cell transplantatin; HSV, herpes si mplex virus; IFI, invasive fungal infectin; IgHjTCR, immunglbulin heavy chain rearrangementjt cell receptr; 1ST, immunsupprcssive therapy; MRD, minimal residua I disease; MTX, met htrexate; OS, verajl survival; PBSe, peripheral bld stem cells; PCR, plymerase chain reactin; PCR-SSP, plymerasc chain reactin-sequence specific primer; QL, quality f liťe; STR, shrt tandem repeats; ratg, rabbit antithymcyte glbulin; RD, related dnr; TRM, transplant-related mrtality; UD, unrelated dnr; VNTR, variable number tandem repeats; VZV, Varicella zster virus. 24

157 E. Mejstříkvá, strana 144 HseT in leukemia using HLA-mismatched dnrs haplidentical family dnr with graft manipulalin is then cnsidered with preference mstly based n lcal experience and/r availability (I). Hwever, all these alternatives have an increased risk f pst-transplant mrbidity/mrtality because f an increased risk f GvHD, graft failure, and slw immune recnstitutin (2, 3). Furthermre, in patients wilh malignancies, manipulatin f the graft may adversely affect a favrable allreactive effect direcled against residual disease (4). Since the beginning f 1999, HLA typing using PCR methds was rutinely available at ur institutin enabling high-reslutin (allele) typing f class I (A*, B*, Cw*) and dass Ir HLA antigens (DRBI *, DQB 1 *) in all patient-dnr pairs. Based n level f HLA allele match between dnr and recipient, we were able t identify an acceptable HLA partially mismatched dnr (7-8/10) fr a majrity f patients lacking a fuhy matched (9-10 ut f 10 a]jeles) dnr. Here, we reprt ur dinical experience with unifrm GvHD prphylaxis using a cmbinatin f CsA, MTX, and ratg prir t unmanipulated graft administratin in children with leukemia (5, 6). Patients and methds Between January 1999 and December 2006, in ur unit, 24 cnsecutive child ren with leukemia (detailed diagnses are shwn in Table I) underwent 26 allgeneic HSCT usíng an HLA-mismatched UD because we failed t identify a suitable HLA-matched dnr in the time frame available. The interval between search and day f HSCT ranged frm 98 t 492 days, med ian 147 days. These 24 patients (a ge range yr; medían 11.3) were tra nsplanted with unmanipulated grafts fr m UD mismatched in tw (13 patients) r three (II patients) HLA a lleles. The lcatins f the varius a llele mismatches prspectively identined by PCR-ssr were as fllws (A* -2x, B* -1 3x, Cw -27x, DR BI- -4x, DQB I * -13 x). Six ut f 24 dnr- recipient pairs were matched in six ut f six alleles in lci A-, B*, r DRBI*' Anther 17/24 (71%) pairs were mismatched in nve ut f six alleles, 1/24 pair was mismatched in B*, DRB I (and Cw ) alleles (fur ut f six al leles); details in Table I. The median age f UD was 34 yr (age range 22-49) with 12 males and 12 females. Cnditining regimens used fr nrst HSCT were fully myelablative in 23/ 24 patients (Table 2). Unifrm GvHD prphylaxis cnsisted f cmbinatin f CsA, MTX, and ratg. CsA starting at day I befre infusin f the graft was given in tw t three daily infusins (ver tw h) t maintain the trugh serum levels f g/ L (met hd f detectin - FPIA). MTX was given n day -f I (15 mg/m 2 r n ly 10 mg/ m 2 in mre advanced disease), day + 3 (10 mg/m"), and day + 6 (10 mg/m 2 ) with ieucvrine rescue (15 mg/m 2 ) in a single dse 24 h fllwing every dse f MTX. Thymglbuline was used in fur patients in a daily dse mg/kg fr days -4 thrugh -I (ttal mg/kg). Later n, within further 20 patients, ATG Fresenius S was used in a daily dse 10 mg/ kg f r days -4 thrugh -I (ttal 40 mg/ kg). Primary grafts were PBSC (n = 13) and BM (n = ll). The nnal decisin abut type f graft was made by the dnr and/r lca l harvest center based n trans pi a nt center preference. C haracteristics f grafts are shwn in T a ble 3. Tw patients later received a secnd graf! (PBSC) frm the same dnr, bth fr leukemia relapse. ACLlte and chrnic GvHD were díagnsed and graded usíng established criteria (7, 8) and were primarily treated with prednisne, CsA, tacrlimus, sirlimus, r MMF in standard dses (9-11 ). Day f neutrphil engraftment was defined as the nrst ut f three cnsecutive days when the ANC reached 0.5 x 10 9 / L r mre. Platelet engraftment was denned as plate let cunt 20(50) x 10 9 /L r mre fr seven cnsecutive days withut transfusin. Chimerism was assessed by using PCRbased a nalyses f plymrphic VNTR/STR n recipient frm unseparated peripheral bld frequently starting n day + 14 and then nce weekly until day + 100, later less frequently in patients with stable full dnr chimerism, t cnnrm efficient engraftment and t rule ut risk f late graft failure/ rejectin r relapse ( 12). PCR assay f specinc fusin genes and IgH/TCR receptrs accrding t the type f leukemia was used fr MRD mnitring pre and a fter HSCT. The testing was prceeded and evaluated accrding t the criteria f the ESG-MRD-ALL (13, 14). A marrw sample was ta ken rutinely in patients with any denned leukemia target tw t three wk befre HSCT, a t days + 28, + 60, + 100, 6 and 12 mnths after transplantatin, r in ca se f decreasing verall chimerism r psitive M RD in previus samples. A cmplete hematlgical remissin was defined as less than 5% blasts in the marrw aspirate and functinal hematp iesis. Surveillance f viral infectins as a cmmn cause f transplant-related mrbidity and mrtality was based n quantitative real-time PCR technique n DNA frm whle bld. EBV and CMV were screened rutinely as part f weekly testing. 0ther viruses, HSV, VZV, H HV6, HHV7, adenviruses grup A-C, and BK virus (15-1 7), were tested nly in ease f clinical suspicin. Results fr leuktrphic viruses (CMV, HHV6, HHV7, and EBV) were nrmalized t human genmic equivalents assessed by quantincatin f the albumin gene. AII these studies were apprved by leal ethical cmmittee and all pa rents signed infrmed cnsents. Results Hematpietic engraftment and chimerism Full trilineage-stable primary engraftment was achieved in ah 24 children (100%). Engraftment characteristics are listed in Table 3. Cm plete dnr chimerism was bserved in all 24 patients, and culd be dcumented after a median f 21 days (range 14-98) with n difference between PBSC and BM. Reappeara nce f mixed chimerism was detected nly in patients with emerging \eukemia relapse. GvHO incidence and severity Acute GvHD grade ]J was diagnsed in 17 (70.8%) patients; grade III-IV in three (12.5 %). Overall incidence f chrnic GvHD in 23 evalu- 25

158 N CTI Ta ble 1. Oate AGVHO cgvho 1ST in UPN Dg at SCT Stage l SCT 1st MM 2nd MM 3rd MM ratg brand Graft (DL I) C03 + (kg) bw Grade grade Event Outcme SUJ l v r s 114 CML AP X-99 Cw Cw DOBl Thym 16 mg/kg BM (1) 10/6 III Extensive Cytg.relapse Alive/Well Nne 11 6 MOS RAEBI/AML XI-A9 Cw Cw DOBl Thym 16 mg/kg BM O Nne Alive/well Nne 122 ALL CR DOBl DOBl Thym 16 O1g/l:g BM III Nt eval EBV PTLO Oied 142 CML CPI B Cw Fresenius BM II Extenslve Al ive/well Nne 143 CML CPI IV-Ol B Cw DOBl Fresenius PBSC II Extensive Alive/we ll Nne 148 CML CPI VI-Ol Cw DOBl DOBl Fresenius BM II Limited Al ive/well Nne 153 MOS RC IX-Ol Cw Cw Fre senius BM O Nne Alive/Well Nne 159 NHL CR3 XI I-Ol B Cw DOBl Fresen ius BM Nne A1ive/Well Nne 173 ALL CR2 X-02 A Cw Cw Fresen ius BM Nne CM V pneu010nia Died 183 CML CPI B Cw DOBl Fresenius PBSC Limited Alive/we ll Nne 200 AML PRl IX-03 ORBl Cw Cw Fre se nius PBSC (1) 10/6 Nne Relap se 200 CR Fresenius 50 mg/kg PBSC Nne Alive/well Nne 211 Ph+ALL CRI B Cw Fresenius PBSC Extensive Alive/well Nne 216 AML CR3 IV-04 ORBl Cw Fresenius PBSC (4) 10/ 5: 5 x 10/6:1017: 5 x 10/6 Nne MRO psitive Alive in relapse Nne 223 Ph+ALL CR l VII-04 B Cw DOBl Fre sen:us PBSC Nne Alive/well Nne 233 MOS RAEBI XI-04 B Cw Fresenius PBSC IV Extensive Ext. cgvho Oied 244 Ph+ALL CRl A DOBl Fresenius BM II Nne Relapse Oied 245 ASiL CRl VI-05 S Cw Fresenius PS SC (2) 10/6; 5 x 10/6 II Nne Relapse 245 CR2 VII-06 Fresenius PSSC III-IV MOF Oied 251 AML CR2 VI-05 S Cw Cw Frescnius PBSC II Nne Alive/well Nne 253 ALL CR3 VI-05 ORSl S Cw Thym 16 mg/ kg PB SC Extensive Relap se Al ive in relap se Nne 258 Ph +ALL CR2 IX-05 B Cw Frese ni us PB SC Nne Ahve/well Nne 266 smos RAEB 1-06 S Cw Fresenius PBSC Nne Aliv8/Well Nne 268 ALL switched t AML CRl 1-06 ORBl DOBl Fre se nius PB SC Exten sive Alive/well CsA laper 282 saml CRI VII-06 Cw DOBl Fresenius BM Nne Alive/well Nne 285 MOS RC/m an IX-06 S Cw Frese nius BM nne Alive/well MMF Nt eval.. nt eva luable... (fl tt1 Q.. n Vl... '"'1< O < 1" Vl Iq ::l l

159 E. Mejstříkvá, strana 146 HSCT in Icukcmia using HLA-mismatched dnrs Table 2. Characteristics f cnd itining regi mens used prir first HSCT (n = 24 patien ts) UPN 153 Fractinated ttal bdy irradiat ln (rtb I) rtbi 14.4 Gy rtbi 12 Gy Oral busulphan (Bu) Bu 16 mg/kg Fludarab lne (Flu) Flu 160 mg/m 2 Cyclphsphamide 120 mg/kg Etpside 60 mg/kg Cyclphsphamide 120 mg/ kg Melphalan 140 mg/ m 2 Thitepa 15 mg/kg 9 Characteristics l cndllining regimen s used prir first HSCT (n = 2 patients) UPN 200 UPN 245 Fludarabtne Melphalan Cyclsprine A Methtrexate ratg Fresen ius rtbi Etpside Cyclsprine A Methtrexate ratg Fre se nius 150 mg/m mg/mz 3 mg/ kg LV. 10 mg/m 2 50 mg/kg 12 Gy 60 mg/ kg 3 mg/ kg iv 10 mg/m 2 40 mg/kg (0-70-3) (0-2) (start O-I) ( ) ( ( (0-11 (start 0-11 ( ( Ta ble 3. Characteri stl cs l primary grafts. engraf1ment and graf1 versus hst disea se PBSC BM Tta1 (n = 131 (n = 11) (n = 241 NC/kg bw x 10 8 median/range 12 ( ( J C034+ cells/ kg bw x ( ( ) 6 median/ range C03+ cells/kg bw x lob 37 (06-158) OJ ( median/range engraftment f 16 ( ( ANC >0.5 x 10 9 /1 med lan/range engraf1ment l platelets 23 ( ( >20 x 10 9 /1 median/range engraftment f platelet 23 ( (19-100) 24 >50 x 10 9 /1 median/ra nge agvhd nne 2 (11) 2 (91 4 r I agvho ll/ IV 20/24 (83%) agvho nne r Ilmiled 9 (5) 8 (2) 17 agvho extensive 7/ 23 (30%) alive/well I I 19 allve wilhul event 9 16 able patients was 38.7%; 8.7% experienced 1imited and 30% extensive, respectively (Tables 2 and 3). Relapse rate. preventin, and treatment Leukemia relapse ccurred in five (hematlgical in 4, cytgenetic in I) ut f 24 (20.8 % ) patients days after HSCT (median 410 days). Until nw, tw patients died as a cnsequence f leukemia relapse at a median 134 days after relapse cnfirmatin. Eight dnr Iymphcyte infusins directed accrding t the level f M RD pst-transplant r mixed and increasing chimerism were givcn t fur patients (CML, AML, AML, ABiL) days after HSCT (median 246 days) in dses f I x 10 5 t 5 x 107;kg CD3 + cells (median 2.5 x 10 6 ). In tw patients (AML, ABiL), it failed t prevent hematlgical relapse (18-20). These tw patients, subsequently, underwent high-dse chemtherapy, achieved CR, and were retransplanted with PBSC [rm the same dnrs as befre (III and 155 days fllwing 1st HSCT) (Table 2). One patient remains in remissin; the ther died f regimen and early GvHD-related txicity. Tw ther (AML and CML) cntinue in cmpjete remissin 26 and 72 mnths fllwing the last dse f DLI. Infectius cmplicatins In 16 ut f 24 patíents (67%), reactivatin f CMY, EBY, BKY, r AdY was detected. The cmmn pathgens include CMY in II paticnts (46%) with ne patient wh died due t CMY pneumnia; EBY in eight patients (33%) with ne patient wh died as a cnsequence f EBY Iymphprliferative disease; hemrrbagic cystitis in rur patients where BKY was detected in urine in all fur, and three patients, where AdY (sertype 31) was detected in bld, but nne f them deve\ped c1inical symptms dcspite n therapy was given. Fungal infectins were nt frequent in lhis chrt with very high risk f develping IFI. Myctic pneumnia was prved (Asperf{illus species) in ne and pr babic in secnd patient, in btb nly pretransplant. Bth werc trcalcd during early pst-transplant perid with ABLC, 27

160 E. Mejstříkvá, strana 147 Sedlacek et al \ '::i I II II III (fl ll. W n=24 n=24 (fl III I I I I ' II Yr Yr Fig. I. Prbability f verall survival and event-free survival in entire chrl f patients I (fl ll. w 40 PBSC (n = 13) -+- BM (n = 11) I I (fl PBSC (n = 13) -+- BM (n = 11) 20 O P = n.s 20 O p = n.s O Yr O Yr Fig. 2. Event-free survival and veral! surviva l in patients transplanted using bne marrw and peripheral bld stem cells. which was later switched t ral vricnazle. Nne f them suffercd frm reactivatín f I 1. Al! ther patients receíved prphylactic ral suspensin f ítracnazle. In patients with extcnsive chrnic GvHD, we usually used prphylaxis with ral vricnazle. N patient ín this chrt díed as a cnsequence f fungal infectin and that was als cnfirmed n autpsies. QL fllwlng HSCT Patients n n cntinuus 1ST are usua lly fully active, have n Iimitatins, and cntinue with nrmallífe. Out f seven patients wh did suffer frm chrnic extensive GvHD, ne died with activc extensive cgvhd, ne is n CsA tapering with n signs f cgvhd and five are ff any 1ST (Table I). S far, it appears that there is n difference in QL when cmparing this grup witb the ther patients transplanted at ur institutin using 9-10/10 HLA-matched UDs. Overall utcme EFS is calculated frm the date f transplantatin t tbe last fllw-up r first event (death r relapse f the primary disease whatever ccurred first). Prbabilities f EFS and OS are estimated using the KapJanMeier methd. Median fllwup till first event r last fllw-up f t tal chrt is 1.57 yr (range yr). Accrding t the type f graft, median fllw-up is 1.65 fr PBMC (range yr) and 1.24 fr BM (range yr). The prbability f EFS was 60.3% (95% CI ) and OS was 74.9 (95% Cl ) (Fig. I). EFS f BM grup was 56.8 (95% Cl ) and OS was 68.2% (95% CI ). EFS f PBMC grup was 60.6 (95% Cl ) and OS was 77% (95% Cl ). Difference between PBMC and BM grups in EFS and OS is nt statístically significant (Cx Mantel test) (Fig. 2). TRM at day was 4% with veral! TRM 12.5%. Altgether, five patients died at a median f 1.54 yr pst-transplant (range ), tw (8.4%) died as a cnsequence f leukemia relapse, ne f CMY pneumnia (0.68 yrs), ne f EBY lymphprliferative disease (0.2 yrs), and ne f gastrintcstinal bleeding because f extensive GvHD (1.65 yr). 28

161 E. Mejstříkvá, strana 148 HSCT in leukemia using HLA-mismatched dnrs Discussin Imprvements in HLA typing at the al1ele level, wider spectrum f efficient drugs fr GvHD prphylaxis and therapy, and prspective PCR quantitative mnitring f viral lad have led t decrease in TRM in patients transplanted frm HLA-malched UDs. Which alternative dnr is better in the case f n available HLA-matchcd dnr remains t be reslved. Different centers have differenl preferences mstly based n lcal experience. Many centers successfully use unrelated erd bld where the na"ive immune system permits reduced stringency f HLA and, therefre, wilhin the acceptable level f mismatch, it is pssible t find a suitablc dnr fr the majrity f children. Its wide use althugh is limiled by the efficient cell dse availahle fr lder children and adults (21, 22). This can be vercme by using duble crd transplants (23). Other disadvantages include naivete f immunity against viruses and unavailability f crd bld fr ptential adptive immllntherapy r re-transplantatin. Use f haplidentical family dnrs is pssible, but large and frequent experience f cperaling labratries fr preparatin f T-celldepleted graft is essen tial t limit the risk s f nn-engraftment and GvHD. High incidence ť viral infectins in the early pst-transplant perid increases the risk f TRM. Therefre, this methd is mre restricted t several eenters with large experienee. New techniques f depletin may imprve the immune reenstitutin and graft vs. leukemia effect withut the enrmus risk f serius GvHD (24). We present ur experience with anther alternative. HLA-mismatched UDs were prspectively selected ba sed n level f allele mateh. We and thers speculate that allele Ol' antigen mismatch is equal1y ad verse t survival. In ur clinical experienee, UD with upt three allele mismatches (n mre than ne in lci A*, B*, r DRB I *) culd be used fr a patient with malignant disease wilh acceptable risk fr txicity iť adequate sertherapy is given tgether with a myelablative cnditining regimen. On the cntrary, we speculate that the practice still used in many eenters t select dnrs based n HLA match in A *, B*, r DRB I * lci, with n respect t numbers f ptential mismatehes in Cw* and/r DQB1* lci, is nt efficient. Such attitude may explain inferir utcme results cmpared with thse achieved in ur chrt. It is nt rare t have many Cw* and/r DQB I * mismatches even in dnr-recipient pairs, ther vice allele matehed in 5-6/6 in standard A*, B*, and DRBI* lci. ln ur series we did nt bserve engraftment prblcms. All patients experienced primary and stable engraftment with full dnr chimerism. Reappearance f mixed chimerism was detected nly as a cnsequence ť emerging relapse f leukemia. Highly incident acute GvHD mstly f grade II was manageable by standard crticsterids. Rate f leukcmia relapse as well as the incidence f falal viral infectins was lw. We speeulate that lhc dse f ratg given in ur chn f patienls is safe in preserving the graft vs. leukemia effect (high incidence f acute GvHD, lw incidence ť relapses), and is efficient in prtecting the patient against mderate t severe GvHD withut incrcasing the risk f pst-transplant fatal infectins (very lw TRM). There is cnsenslls that matehing f UDs and patienls fr HLA c1ass II allclcs imprves the utcme f HSCT. Hwever, the significancc f HLA class I allelic mismatches fr transplant utcme is under nging discussin, and reprts n lng-term effecls like chrnic GvHD are rare. Sme studies, especially published earlier, are biased by the fact lhat HLA typing was nl perfrmed by PCR methds al high-reslutin level (fur digits) in all typed alleles. Other studies are biased by different prprtin f minrities relevant t the different incidence f certain HLA alleles amng patienls and/r recipients (25). Serlgically undisclsed HLA dispari ties accunt fr the increased rate f pst-lransplant cmplicatins. Whereas, a HLA-ABDR-serlgically identicaj dnr can be identified in the Internatinal Registry fr> 90% f the patients. nly upt half f them can benefit f a highly cmpatible dnr if dnr selectin is based n allele level matehing fr HLA-A/B/Cw/DRB I / B3/ B5/DQBI lci amng the Caucasian ppulatin. Mst f the inempatibilities are cjustered in a limited num ber f sertypes that can be targeted first d uring the searches. Because f linkagc disequilibrium (e.g., B-Cw r DRB l-dqb I), incmpatibilities at a given lcus are ften assciated with disparities at adjacent lci (26). Schaffer et al. ha ve pu blished an analysis f utcme in 104 dnr-recipient pairs, transplanted in between 1988 and 1999, retrspectivcly typed fr HLA class I and elass II by PCR-SSP. They encjuded that genmic HLA class I and class II typ ing may imprve the utcme after unrelated HSCT and als that the awareness f HLA class I and II mismatches, nt detccted by lder methds, in a recipient-dnr pair makes it pssible t give apprpriate pre- and psl-transplantatin treatment (27). In additin, lhers investigated the assciatin ť HLA class I allele 29

162 E. Mejstříkvá, strana 149 Sedlacek et aj. mismatches and utcme. In chrt f 144 patients givcn a HSCT frm an UD wh were matched fr HLA-DRBI, DRB3/4/ 5, and DQBI alleles the risk f chrnic GvHD was significantly increascd in patients with c1ass I-mismatched dnrs (mismatch either detectcd by lw- r high-reslutin typing). A single HLA c1ass I allele mismatch significantly increased the risk f chrnic GvHD in multivariate analysis. OS was significantly reduced in patient-dnr pairs with mre than ne allele c1ass I mismatch (28). On the cntrary, Duggan et a!. reprted 57 patients receiving UD HSCT and matched fr the disease and stage with ther 57 recipients f gentypically matched RD HSCT. AI! UD recipients were matched serlgically fr A and Band by high reslutin fr DR and DQ antigens AII patients received CsA and shrt-term MTX. UD HSCT recipients als received ratg (Thymglbulin) ver three days pretransplant. They cncluded that UD HSCT recipients matched as abve, and given pretransplant ATG have similar utcmes t recipients f matched RD HSCT using cnventinal drug prphylaxis (5). Based n ur results and tgether with infrmatin published s [ar (29), we als cnclude that high reslutin f HLA al!eles, bth c1ass I and c1ass II plays an imprtant rle in the selectin f a suitable UD. Hwever, when a fully matched dnr is nt available, we shw that GvHD prphylaxis with use f ratg enables the use f an unmanipulated, partially mismatched dnr withut excessive risk f pr utcme because f severe acute GvHD. Several differen t brands f A TG are a vaila ble, and therefre, when using ATG in cnditining regimen, ne needs t cnsider the ATG brand, the adeq ua te dse a nd the prper timi ng. Exact crrelatin between different brands is nt clear yet as they have different activity against different ppulatins f cells. Als the dse may vary based n the type f dnr and cnditining regimen. Lwer dses (Thymglbulin 6-10 mg/ kg ttal; ratg Fresenius mg/kg ttal) are currently used in reduced intensity cnditining regimen when fully matched dnr is used (30) r in patients wh underwent SCT using T cell highly depleted graft frm haplidentical dnr (31). Much higher dses (Thymglbulin 15 mg/ kg ttal; ratg Fresenius 60 mg/kg ttal and mre) are used in transplants using mismatched dnrs and unmanipulated graft (32, 33). Cnclusins Our study shws that cmbinatin f CsA, shrt-term MTX and ratg in GvHD prphy- laxis prir t HSCT using unmanipulated grafts f HLA-mismatched UDs is efficient t prevent ccurrence f very severe acute GvHD grade 111- IV. Sertherapy (r A TG Freseni us; Freseni us Bitech) was well tlerated and in dses given (40 mg/kg ttal) did nt increase pst-transplant mrtality by lng-iasting depressin f immunity r increase risk f leukemia relapse. Incidence f chrnic GvHD was nt increased cmpared with series where fully matched UDs were used, mre ver in majrity f patients it disappeared within the time withut serius cnsequences (Table I). Overall utcme is satisfactry, and therefre, i t is pssible t use such alternative dnrs in patients with advanced leukemia lacking a HLAmatched dnr as a reasnable alternative t unrelated crd bld r haplidentical family dnr. We strngly recmmend t extend HLA typing fr clinically relevant Cw* and DQB 1 * lci in centers stili using nly A*, B* and DRBI * fr selectin f suitable dnr. Acknwledgments We wish t thank ur ellabratrs frm CPH (Czeeh Pediatrie Hematlgy Wrking Grup) fr referring patients, natina l registries f dnrs in Pilsen and Prague, HLA labratries namely in Institute f Hematlgy and Bld Transfusin a nd CLlP (Childhd Leukemia Investigatin Prague) in Prague. We thank David Jaebshn fr editrial help. This wrk was partly supprted by grants CEZ I and VZ References J MIANO M, LMOPIN M, HARTMAN N O. el al. Haematpietic stem cell transplantatin lrends in children ver the last three decades: A Sllrvey by the paediatric diseases wrking party f the ElIrpean grup fr bld and marrw transplantatin. Bne Marrw Transplant 2007: 39: Kl.l. GB I EL T. HANDGRHINGER R, LANG P, BADER P, NIL'T IIAMM R D. HaplidenticaJ transplan tatin fr acute lymphblastic lellkemia in childhd Bld Rev 2004: 18: LA NG p, GRElL J, BADR P, et al. Lng-term utcme after haplidentical stem cell transplantatin in children. Bld Cell s Ml Dis 2004: 33: DEY BR, SPITZLR TR. Current status ť haplidentical stem cell transplantatin. Br J Haematl 2006: 13 5: D UGG AN P, BOOTH K, ClIAUD[IRY A, et al. Unrelated dnr BMT recipients given pretransplant lw-dse antithymcyte glbulin have utcmes equivalent t matched sibling BMT: A matched pair analysis. Bne Marrw Transplant 2002: 30: FIN KE J, SCIIMOOR C, LANG H, POTTIIOI. K, BERT[ H. Malched and mi smatched allgenejc stem-cell transplant:ltin frm unrelated dnrs using cmbined graft-versus-hst discasc prphylaxis including rabbit anti-t lymphcyte glbulin. J Clin Oncl 2003: 21' PRZEPI ORKA D, WI S l)orf D, MARTIN P. et al Cnsensus cnference n acute GVHD grading. Bne Marrw Transplant 1995: 15:

163 E. Mejstříkvá, strana 150 HSCT in leukemia using HLA-mismatched dnrs 8. SII ULM AN HM, SULLlVAN KM, WEIOLN PL, et al. Chrnic gra ft- versus-hst syndrme in man. A lng-term c\inicpath lgic study f 20 Seattle patients. Am J Med 1980: 69 : CARPl NTl'I\ PA, S,\N OI,RS JE. Sterid -refractry graft,vs.-hst disease: Pas t, préscnt and future. Pediatr Transplant 2003: 7(Suppl. 3): SIMPSO N D. New develpment s in the prphylaxis and treatmen t f graft ve rsus hst disease. Expert Opin Pharmacther 200l: 2: II. VOGlLSA NG G B, ARAI S. Mycphenl ate mfetil fr the preventin and treatmenl f graft-versus-hst diseasc fliwing stem cell transplantati n: preliminary findín gs. Bne Marrw Transplant : B,\O LR p, BL 'K J, FR LY A, et a l. Seri,,1 and quantitative ana Iysis f mi xed hematpietíc chimerism by pe R in patients with ac ute leukemias aliws thc predictin f rel apse after allgeneic BMT B ne Marrw Transplant 1998: 2l: KRU CI O, VAN DER VLW I'N VH, B,\ IlLR P, et al. Level f minimal residual discasc prir t haematpietic stem cell transplantatin predicts prgnsis in paedi atric patients with acute Iymphblastic leukaemia: A reprt f the Pre-BMT M RD study grup. Bne Marrw Transplant 2003 : 32: ECKLRT C, SCRIDLU A, TA UUL T. et al. Cmparis n between TaqMan and LightCycler technlgies fr quantificatin f minimal resid ual disease by using immunglbulin and T-cell receptr genes cnsensus prbes. Leukemia 200 3: 17: KI MURA H, MORITA M, Y A BlITA Y, et al. Quantitalive analysis f Epstcin-Barr virus lad by usin g a real-time PC R assay. J Clin Micrbil 1999: TANAKA N, Kl MUR A H, IIOA K, ct al. Quantitative analys i, f cytmegalvirus lad using a real-time PCR Hssay. J Med Virl 2000: 60: PHIi'TAKIS P, BOGDA NOVIC G. KOKIIAU P. M LL-rWT H, DALl ANIS T. BK virus (BKV) quanti fica tin in urine sam ples f bne marrw transplanted patients is helpful fr diagn s is f hemrrha15ic cystitis, allhu15h wide indi vidual variatins exisl. J C1in Virl 2003: BCCK JF, KLlN GO ILL T, K RI!Y NBERG H. et al. [Relapse f childhd ALL, AML and MOS after allge neic stem cell transplantatin can be prevented by dnr Iymphcy te infusin in a critical stage f increasing mixed chimerism]. Klin Padiatr : SANCiIU..I, SmH,\NO J, GOMI.'Z P, et al. C1inical va lue f immunlgical mnitring f minimal residu al disease in acute Iymphblastic Ieukaemia after allgeneic transplantatin. Br J Haemall 2002: 11 6: YOSIIIMI A, BADER P, MATrIIES-MAHTI N S. et ul. Dnr leukcyte infusin ufter helj1atpietic Slem celltransplantatin in patients with juvenile mye lmncytic leukemia. Leukemia 2005: 19: WALL DA, CARTIR SL, KHN A N NA, et al. Busulfanjmelphalan jantithymcytc glbulin fllwed by linrelated dnr crd bld transplantati n fr treatment f infant leukemia and leukemia in yung children: The c rd bld transplantatin study (COBL T) experience. Bil Bld Marrw Transplant 2005 II PARKMAN R, COHEN G, CARTER SL, el al. Successful immune reenstitutin decreases leukemic relapse and imprves su rvival in recipíenl s f unrelated crd bld transplanta ti n. Bil Bld Marrw Transplant 2006: 12: BARK U, JN. Wh shuld get crd bld transp lants? Bil Bld Marrw Transpl ant 2007: 13(Suppl. I) LANG P, SCIIUMM M, GREIL J, et al. A emparisn between three graft manipulatin methds f r haplidentical stel11 cell transplanlati n in pe<liatric patients: Preliminary results l' a pilt study. Klin Pad ial!' 2005: OK..\MOTO S. Current sta tus f Japan marrw dnr prgram (.1M OP) and íts rles in internatinal cperatin. Int J Hemat12002: 76(Suppl. I): TIERC Y JM, VILLARO.I, RsNEK E. Selectin f unrelated bne marrw dnrs by serlgy, mlec ular typ ing and ce llular assays. Transpl lmmunl : SCIIAFFER M, AWEN LR-CANN AVA A, RLMB EHG ER M, RINGDcN O, OU,R UP O. Rles f HLA-B, HLA-C and HLA-OPAl incol11patibilities in th e utcme f unrelated stem-cell transplantatin. Tissue Antigens 2003: 62: GREINI X HT, FA[ L SCII NEIDIOR B, et a l. Impaet f HLA class I high-reslutin mismatehes n chrnic graft-versus-hst di s easc and surviva l f patients given hematpietic stem cell grafts frm un re lated dnrs. Bne Marrw Tra nsplanl TESIIIM A T, MATSUO K, MATSUE K, et al. Impact f human leuccyte anti ge n misma lch n graft-verslls-hst disease and graft failure after!'educed intensi ly cnditining allgeneic haematpiclic stem cell transplantalin frm related dnrs. Br J Haematl 2005: 130: O KAM UHA J, UTS UNOM IYA A, T ANOSAKI R, et al. Allgeneie slem-ce ll transplantatin with reduced cnditining intensily as a nvel immunlherapy and anti viral therapy fr adult T-cell leukemi ajlymphma. Bld 2005: 105: AVERSA F, T EREVI A, TAB ILl O A, et al. Full hapltype-mismalched hel11atpietic slem-ce ll transplantatin: A phasc II study in patients with acute leukemia al high risk f relapse. J C1in Oncl 2005: 23: SCIIL EUNING M, Gnrrlll 'R W, TISCII ER J, LEDDR OSE G, KOLB HJ. Dse-dcpendent cfľccts l' in viv antithymcy tc glbulin during cnditining fr allgeneic bne marrw transplan tati n frm unrelated dnrs in patients with chrnic phase CML. Bne Marrw Transpl ant 2003: 32: BASA RA N, BA UR MM;1N H, KOLBL K, et al. Antithymcy tc gl bulin fr th e preventin f graft-versus-hst di sease after un re lated hematpietic stem cell transplanlalín fr acule mye lid leukemia: Res ult s frm the multicenter German cperative study grup. Bne Marrw Transplant 2005: 35:

164 Delectin f residual B precursr Iymphblaslic leukemia by unifrm gating flw cytmelry Running lilie: Leukemia early respnse by flw cylmelry ESler Mej s třik val, l. EV3 Frr1kvó"!. máš Kal in a"", Marek Omelka'} IO, Drafů Bafin,e. Kl ara Dubravč ie, Klára Pspišdvá ' J, Manill3 Vaškval., Drnrit Luna", Alice Suk I-Iang Cheng', Margaret Ng, Ynna Leung \, Jans KappelmZlyer 6, Flra KIss!", S hai luael, 1, Balia Stfirk\ M artin Schrappe', Jan Trkal 1, Jan St3ry 2, Ondřej Hrusák l }CLlP - Ch i/dhd Leukemia In 'esljga lill Pmgue. Depa rtm enr j Pediatrie Hematlg)' and Onc% gy 1,, / Medieul Schl. Uniw>niry H.fpi/al Mt/. Pragut.' Czech Repuh/h:, JClinieal/nslitutl' /Labm/ry Diag nsis. Ull i\'ersi/y Clinlea/ Hspiwf Centre. l.greb. C, OOl i. Cenlre ( Pediatrie Hemal% gyionclgy. Schm!idcr Chi/drcn's Medical Cemre J/sre/. Petah Tk/l'a (Oepurlmelll j Anarm h:a/ lld Cel/ular POIhlgy. Prince j Wales HUjpiral. Nmzg Kng. Df.:'par/mellf fclinical BichemiJ"II) ' al/d M /ecu /ur Ptlwlgy. Medh.:a/ ulld f/ea/rlt Sdenees Cenlrc. U"ú'ersiIY {Ot.'hrt'ét!n. HUl/gal)'. Ped;atric H emol%gy t.ll1d Ollc% gy. Scheba Mt{I/(:aJ Cen1C r. Te / Haslrmer. Israel. Oťpa rrll1 e,,/!pr:diatr;c.\'. Un i\,( ".i"ily f/spi/l Sclde.su ig J-lls l e in. Klel. Cerman)'. 9 JarslOl 1 Hájek Cen/cr f r TherClica/ and App/ied SlUlis/ ies. F'atultJ' fmathemarics and Physics. Charles U"i"''er.'ri"IY. Prgll f!. C=eC'h Republic Abstract Residua! di seasé (R O) is 3n imprt ant prgnslic faclr in acutc Iymph blastlc leukemia (ALL). Flw cy tmctry (FC) ba.sed RD derectln IS easy t perfrm. bul interpret3tin req uires ex'pert 3nalysis d ut:' t indi\iiduaj differences 81ll ng patients. We fcused al the desig n f standard rzed and reprducible RO mnitri ng in ALL RD was investi gmcd by a unifrm gnt lng strategy. whic h was dcslgned internatinally and tesled in ne cen ter by IglTCR rearrnngements. Fr each &a ft:, psiti \" ity cut ff value was a s:signtd usin g quantifu::alin f nn leukemie backgrund. Cmparing t IgrrCR al 0.1 % level, 83 f 103 spccirnens were crreclly diagnscd by FC The predictivc valuc f Fe RD at day I S was then analyzed ln 8 l1n cage :\LL. da)" 15 FC signiticantly crrclatcd wl th IglTCR results at day 33 and/ar weck 12 (p<o.o I). N sigmficanl crrelatin wns fu nd in T lineagé! ALL. Thus, Fe w ith prc's(.'t unifrm gaung at dlly I S predicls PCRdele c l Ab l e M RD in 8 precursr ALL. Crrespnd ing BUlhr ' Ond rej Hrusak tel/fa." (llh lrj. J1[I.ls:1k lclfmqtqi cunl q. Oepar1mcm fpcdlatric Hematlgy s nd Onclgy 2 nd Medical Schl and Uni versity Hsp ital Mtl V Uvalu 84 Prague C.zech Republic N L(j,... Acknwledgements Wc thank J. Ridskva, 1.. Gndremva.., O. Thť.Jrner. P. Scmerak. K.,\fu7.il.;va. L Reznickl/u.. T SkeQyska fr tcehn ical as$lstance in pr vldmg RD stud,es. 1\ 1. KOVOle and V. Pelk\'<J. helped us w lih c arc ťul readmg f" lhe manusenpt A Lub helped us wi lh design ing. the prcsentatin 0 1' supplcrncnlal data Cllabratin fczech PedIatrie Hematlgy (CPH) ecnters (data man ag C;.rs A. Vrzal\'a" K. KrRmaí.lOva, lejders: B. Blazek (Ostrava), Z. Cema (Pl zen). Y. Jabali. (C<ske Bu d_j vlce). V. 'ljh al (Olmuc ), D. Prchazk". (USll nad Labem), J. SIC' rba (8rn). J. Hak and K. Tusvska (1 lrndec K.ral ve) IS bigh.ly apprcciated. Thc,,", rle was su ppr1ed by ra nts VZMSMT MS MOO IGA MZ NR8269'3i200S, NR/9SJ I GAU K 7543/2007 and by Ihc Israch Cancer ASSOClall n. T K.,,'as supp rted by GACR tP1 62 \..... 'Jl, ;;..!G ;r::... 'Jl 'v

165 frequencies in specimens w hse MRD negativi ty was evident either becausc Ihe pat lt n ts suffered frm ALL f Intrductin thc ppsite IIncage (T versus B) r becausc ;\,trd was prvcn n egatl v ť" by PCR Thc speed f leukemia clearance dunng Iherapy is a majr prgnstlc faciot. R ťs l duaj dlsease (RD) dunng the carl y rhase f th crapy can be assessed by micrscpy (I) r by mre sensitive tec hniqucs, such as n... ' cytmetry (Fr) a r p l y m e r ať chain rcacti n (per) fthe rearrangements fimmunglbulin (lg) r T cell receptr (TCR) gene segments (2-4). The strng prcdictivc value f RD i5 als ll1aintalned a1 thc level f minlma! RD (MRD) during cm plete rcmi ssin (CR) (5-7). Several strategies are uscd w hen utill zing infrmatin rrrn prevills rtr spccti\ 'č studies: slratilicatin is based n MRD Icvel rrm eilher a single limepint (8.9) ar cnsecuti ve time-pinls (7, 10). Real -lime quantitati\."c (RQ) PCR based detectin ať specific 19 and TCR gene rearrangemenls represenls the CUlTen! gld standard fr MRl). Standardizcd RQ PCR delecls MRD bolh specifically and reprducibly, wilh a delcctin limit f 10-1 t JO.s Ncvenhclcss. such PCR me l hd s are labrius and cslly. Flw cytrlll..:lry is a met hd with ac c ptablc sensilivity and w id ť availabi lity in many ce nterslcumries f r hcmatlgical and immunlgical invcstigulins. \VhiJe Fe invcsligales anligcns n inlacl cells. in large lrials cvcring $Cveral cnl incnls, il ls im pssi ble t cncentr3te MRD diagnslics ini ne lab Thc interprctatin ffc data \5 cmpllcated anu rcquires hi ghly experienced and skillcd cxpens. Therefre. II is impnant t set clear definilins and slandards, especially fr inter-iah studies. The unfrtunate reality is lhat CUlTenl publishcd papers usuall y lack detailcd mfrmatin n a tlllg str aj:ete s due t dtftcrcnces in interpreta lin arnng patienls On ly ane published study by Custan Smllh et aj. cvaluated tw sirnple prcdetined subppulatins. C D 1 CDI 9r- and CDI <j>cc D3 41""..u1 il single tj me-pint Oll day 19 (a ti me-pi nt bc fre thc achicvcmcnt f cmplctc rcm issin). Thu.s, laklng int accun( d,ocrcf1ccs amng patle.nts, it is diff1cuh r nearly im pssible t rl.:p rduce FC '\'1RD d lan SllC!!l. ThlS< IS e.speclílll y true fr ccnlcr s!cuntfl e$ lhal Patients and methds Patients Patients were recfljited frm the A.LL IC BFt:! OO2 prtc! (staned in Xl/2002). Thc prlocl Vvas dc: 5ig.ncd f r cuntrics \\Iith c1inic<t1 cxpcrience with BI ',t bnsed prlcls but w ith jimitcd cxpt rícncc and resurces fr r-.,ird tcc hniques. MRD W3S nt used fr paticnt stratiticatin Thls ran in pa rallel t the MRD based ( lgrfcr RQ PCR) treatmenl prtcl AIEOP- BFM ALL Labratri e rrm the Czech Re pu bhc, rsrael, Cralia. Hungary and Hng Kng parti cipated in tl1e Fe j\trd study. Patients cntered the study atler Iheir parent r guardians signed InfTrned cnsent, and thc ::;wdy was apprvcd by the insutulínal cthlcs cmmittee. In tolal, 11 0 patients wi,h newly di"gnsed ALL entered,he study (90 Bep ALL and 20 T ALL). The ehrt reprted he re cntaincd patients lreated in 8 ('ze'ch center s, analyzed and acquircd in a singlů Fe labratry. A summary f the patienls' ch:lracteristics is shwn in table I. The diagnsis f ALL was establishcd accrding cnvcnli nal FAB and immunlgical crileria. AII samples that mel th ese criteria and were successfully a nalyzed blh by FC and PCR were included in the sludy ln 101aL 6 12 npl es wece centrall y cvaluated (dlagnsis: 110, day 8 bne marr w(bi): 10J, day 8 peripheral bld(pll): 8J dal' 15 fi l : 108, dal' J 3 BM: 108, "'eek 12 BM: 100) N parienls wť' rc excluded as ha \'ing an unsuiwblc imrn unphcntypc fr Fe RD mnitring Fr bac.kgrund cjcu l,u i ns. 49 specimens f B linegc patients wcrc measurcd w ith T Ilneage cmbi nn ll ns r vice versa (crss li nc a e cnl(015) cr),..-< <"l t:: <"l I-.... Vl '<"l :> O > Vl 'či) are j ust starung aut wlth Fe j\ trd evalualin. Thus, \"'c d eslned a study ln bth l3 precursr 3Jld T.1\ L L paticn15 thm e\"'l.iluated ldenllcal. prc dctincd su b p pu lall n slt es. regard lcss f lhe in iti al jmmunpen t pe. w cllected cell frequcr1cies ln eat h fthcsc a t es nt individual l"i mc-pint s. The gates werc' madc up f antigen crnbinalins cmmnly used in Fe RD studies ln tta!. w(: dcfi ncd 29 g.ateslsubp puhnins in B ccll precursr (BCP) acul C Iymphblastic h:ukemitl ( A l L.) and ti ve subppul at ins in T.\ LL. In th is stud). v.c Included the sam ples wllh a\." ad a bl RD usmg bol h Fe an d PCR whlch enabk-d an I!xacl asses.sment ('If hlh mcthds fr MRD cval u81 10n at indi vidualllme-p lols. T hc bjectlve fthe study was t dc\ clp a rh u t M d reprducible FC RD apprach fr childhd ALL. cvťn fr centcrsf.cuntri es wllh linuted experiencc in Fe M RD analysis. and 10 prcc ise\y quan tiťy the backgru nd rh escnl dunng Iherapy Thís backgrund was deri \"cd frm cell Risk gruping, treatment and time-pints PauC'nts wtre 8SSIgncd 10 the standard ri sk grup (SR) when th ey ťul f1 l!ed Ihe fllv<.l ng cnlena agc < 6 years, imltalleukcytsis <2 0000j I L. gd prcdnl:llne Ics:pn sc «1000 bltlslslj.1 L) ll! day 8 ln periphera! bld. absence f BCR/A8L and MLU/\ F4 fusln genes. and achh!\ mg a CR al dlly )3. Paticnts wh fu lfdled a l1 f Ihese SR criteri3 and had mre Ihan 25 0 blasls in BM by micrscp) al dny I S were stratifi cd int thc Inlermcdiatt risk grup (lrg). Other pa1iems Wil h mre than 25'% blasts ln B I by nllcrsc.py J r d a ' 15 ""t;t e strntilled int the hlgh Ti sk grup (HRG). Olher HRO cntc.ri a weíf BCRlABL r MLlJ '-\F-I- fusil1 genes, pr

166 "<t" lf"l,.-< <:\j c: <:\j... V') '<:\j- :> > V') 'v f..t.i respnsc t predni sne at day 8 (>1000 blas t s!l in peripheral bld), a r >; %) blasts al dlly 33 in BM. AlI rcmalning patienls were.a.sslgned t the IRG Alltime-pints shwn here retl ec[ rt!rn issin inductin therapy (day 8. day 15. day 33 and wee1c 12). Remissin induclin therapy \Na,:; sc hd u l ed ver 9 \""ťcks and induded a 7-day sterid prcphasc \vit h dai ly ral prcdnisne (60 mg/ml fbdy s urfa ť area dai ly, cumulati ve dase f prcdni!inc al clay 7 had 10 be g rc31e r Ihan 2 \ O mg/ml) and a s ingle dse f intratheca\ mcthtrcx31c (agc ajjusled) n da)' 1, fllwed by predni 50ne (60 mg./m J dail y) frm day 8 10 day 28, t3pcrcd thereafter ver 9 days. It als included 8 dses f L-asparagm 3se (5000 U/m 2 /day n days 12, 15, 18, , 27, 30 and 33), daunrubicin (30 mglm} n days 8 and 15, (WO lher dses received JR and HR patients at day 22 and 29), vincristine (1.5 m w m1 n djys 8. 15,22, and 29) and tw dses f inlrathecal melhtrexate (ag('-adjusted) n days 12.and 33 (2 additinal dses n Jays 18 and 27 were adminislered in cascs "" il h leukemlc CNS invl vcment r with traumatic lumbar puncture). Frm da)' 36 t 64, Ih,,' rcgi men included: tw dses f intrathccal mt;t htrcxate ( ágť -<ldjuste d) n days 4 5 and 59. cyclphsph,mide (I glm' Oll days 36 and 64). c)' lar3bme in 4 blcks (75 mg/m' daily n days , _nd 59 62) and 6-mercaplpurine (60 mg/m' datly frm day day 62). Palien" wh had aplastic BM at day 33 underv.rcnt anther BM punctu ré nc week Jater (a sample wjlh cm plete remi ssin includin rcgencralin in BM \\:<l S analy L.ed 3S day 33). Palle nts ",,'ha rcceivcd a nn-all le therapy bet\vecn day 33 and wcck J:! (4/6 BCRJ:-\BL psiti\'c paticnls rcccivcd imalinib I1lcsy Itne 3ccQrding t thc EsPhi\LL prlocl: ne pallcn! rece ivcd thcrapy accrd ing t th c [nterfant 2003 prlcl after da)' 33) were excludcd frm lhe E1 na lyses thal cmpnsed wcek 12. Fu rt her Iherapy,\a5 nt evlualed in thl5 S:lu d Sample prcessing Samples were prcessed \Vllh ln 2-1 hun after Ihey were cljccted frm patlents Samp lc preparattn cns isled f a 15-minule Inc li b.hin wlth mncln lll Wl tibdies (mab) - sam plc-t-mab vl ume ratlos \Vere used as recrnmcnded by the manufactun!rs. Red bld cells ","erc then I) zed in a 15-minutc incuba cin (ammnium chlride), fllwed by 5 minul es l' centrifugatin (500gt discard ing f the supern Gtanl. adding f PBS and im mediate dalaacqui!uti n Fr intracdlular stai ning. the h x & Perm kit (An Dťr Gruh Birescarch. J\USlna) was uscd t\1i e\'enis were acqulred and slred in hstmde fl tes. and n l J\ C' gat( strat egy w :1S usej. Al d13g.nsis. a mini mu m f ev('n ls per l ube were J.cq Ul re-d. Ourmg RD fll w-up_ the tct minimum cunls \Vť: r c evcnls (SYTO 16 cntajnlo mab cmbmal1ns). 300,000 e\ i: nt s (the mqsi infmhlii\'c mab cmbmatin) r (!.. ents (all ther lubes) Mnclnal anlibdies CO 19 PE (elne SJ25C I), COlO FľfC (clne l2í), CD45 PerCP and APC (clne 2DI) and C f), 9 FlTC (cine TO 12) were purchjscj frm BO Bisciences (San Jase. CA. OSA). CDIO FITC (cine A l.il2), CD7 PF (chme 8H8. 1), C03 PCSIP C7 (cine UCl-rf l), CD5 PCS/ PC? (clne BLlaJ. COl9 PCS/PC? (c1011e.l4 119), C034 APC (cln L1 Q), CD58 FLTC (cloil(" MCDC D58).nd C066c PE (clne KOR-SA3544) were pllrchasc-j frm Im munótéch (Marseille, France). COlO PE (clne SS2/36) and TdT fltc (clne HT-6J were purchast:d frm DAKO (GlSlrllp, Oenmark). SYTO-16 (grccn tlurescent nucleic aci d sta in) was pur c h n J frm In vilrgen - Mlecular Prbes (Carl sb.d. CA, USA) Dala analysis Gatins defi nitins and strategles are shwn in flgures I and 2. Unif rm templales were designed in thc s ft v.:a r ť' appl11.:atins, Cellquest (BD, San Jase, CA, USA) and PlwJ (Tree Star, Oregn, USA). Gale psitins were defined acc.:rding [O rcgcncrating BM samples in pati ents \,.'ith ncgalive 1RD by 19- TCR RQ-PCR and/a r using QSC bcaj, (Quantum Simple Cellul "r. Bangs Labs, Fishers, IN, USA). In all B lineage and T lin cage mab cmbinatins. the mab reacting w ith a lineage-dctinlng anti gen (CDI9 and C07, respectively) W 3S present. In all RO subsels, the target ppulalin was calculated as a fractin fnucleated cell s (SYTO I6 F1J <). Reprted subppulalins The definilin f subppulatins is shwn in fígures I and 2. A II subppulmins were reptl ed in <li l p ;:ui n ts wl1h ALL fthe respecll\'e lin eagc, rcgard less flhe dctai lcd prcscntin g immunphentypc The truc' fraclin f cvenls ""ithln a Jť'flned regi n per t tal f Iymph id li nci1gc cells (CD I <r r CD7P'» cel ls, rcspcctivc1 y) was Illultipli ed by thc fract in fcd 19p. r CD7i"J' cel ts pe.r ltal nucleated ce ll s (SY TOI 6 p ). T hese levels f all rc prted subppulallns were stred in the database. T calculalc Ihc cxact lime pint-spcciflc backgrl.ind, we fi sdt!ct1."d a lestmg chrt, whi ch cnsisted r á randm half l' thc pe R"'" sptcimens al cach II lne-pint, and c:mbmed them \\'Ith thc c rs lincage cof"!l r ls. Fr cach,cpcrted \ (!.Iue t aj l lime-p inl s. \C ca1t:ulated Ih ť" '1 pt'n::énulc, ln rder t cncmp3ss the randrn POI ssn distnbulil') freal data arund Ihe 98 th percemi\e ťlhc represem91ive su b-chrt, we cnsidered thc three-f ld multiplicatln fs* percentile t be thc l>ackgrund CUI-tT value. T li neage 1,,'alues werc c.qlcujaled usmg B hncage crss Ill1eage cntrls nl'1 _ A ll Fr daw rept1cd Q.$ pn._-de:fi ned subppulat i ns werc cmpared \\Iith the 5ubppulatin an d timc pi nt-spccllic backgrund cut-it

167 va lues; nl y when thcy V.-eTe hlgher did we cnsidcred them t be psltiv The highest PCP >l subppulatin abve cut ffwas cnsidered an Fe RD (cut ftvalues ilre shwn in table 2.) RQ PCR l IgfTCR rearrangements Fllw-up BM r PB samples were prccssed by er)' thrcu;:yte l)' :>is and slted at -80 C. Genmic DN A \.\'as islmcd by the QIAarnpljš' DNA Bld Mini Kit (QIAG EN GmbH, Hilden, Gcnnany), and Ihe DNA " ':1S stred at -20 C unlil furthcr prccssi ng, Rearrangemcnls f irnmunglbul in hevy chain (lgh), immunglbulin hghr chain bppa (lck), T cell receptr delta (TCRD), T cell receptr gamma (TCRC) and T cell receptr beta (TCRB) V'crc identified using single r muhiplex PCR (II, 12). Clnalir)' assessmcnt. sequenc ing, palientspecific prim cr design nnd RQ-PCR wilh family- spccltic reverse primcrs and prbes fr JGH, JGK. TCRD, TCRB and TCRC were perfrmed as described previusly (13-1 S) The albumin gene was used t nrmalize DNA cncentrntln an d quahty. The ESG-M RD -ALL (Eurpean Study Grup n Minimal Residual Discasc in ALL) critria fr RQ-PC R scnsiti vity and quantitati ve rangc \I,i'cre used ( 16). Fr stati stic.s f cnt inuus... ariablcs. numerical MRD valucs (reprcsenli ng th c mean value f psili \'c \' alues within the triplic,nc) were always rcprted respectl vely The cutff"alucs rcprcsenting the backgrund f cach repr1ed subppulatln are Il st ed in Table 2 Althugh il is frequently assumed that th e nn-mahgnant B precursr backgrund is very lw ar absent at en rly ti me- painls, eur rcsuhs d sho\\' nn-zer backgrund levels evcn 31 da)' 15, \vhich must bc taken inlo accunl in Ihe data interprclatin (sirn ilar situatil1 appe,ared ut day 33, JOla not sh\\n) Graphs sh wing cell frequencies af cach individual FC subppulatin al day 15 as well as a l days an d week 12 ar 3\"nil ilblc (s('(: supplernental Infrmatin), RD evaluatin and cmparisn with RQ PCR Ig-TCR The FC RD \aluc d;jtj. represenled the frcquency f the msl prminent subppulatin abve ilscutttvalue When cmpc il in these FC RD data to Ihe leukemie cell fn.:qucncies ass..: :-st:d by PCR, majrity ť PCR.)' spccimens wen p O"S ItIVt.' als by FC (71 f 81 and 19 f 20 ln B precursr and T ALL, respectively) Elt day 15 Swrting al day 33, mst f Ihe FC data were belw Ihe cutff values, and the p c r centag f PCRlWs specimcns idcntifíed ils FC pti drc ppcd prfundly (data nt shwn) Thcrcfrc, th culff- based, fur-c lr FC focll scd at the cellular subppulatlons deseribed here mighl serve as a basis fr Ihe design f RD inv es t llin bul jl cannl be used as an RD r:va]uatin al day J3 and week 12 f ALL tnerapy, L/") L/"),... t::..., Vl,ti' > O >..., Vl. Ci) fi-i Statistics FC scnsiri" lty... vas. defmed as Ihe percenlagc f sa:m plcs psitlve by bth methds amng all PCRfk:s samples. FC specificiry was deti ned as thé pcrccntage f smnples n c.!g(h l \ é by b th methd s,.mng per""1 ssmpks Spearman Rank crrť'lm in cefticient Vlas used fr crrelatins frd betwcen IIldl \'1 dual lime-pints and was calcul.ted " ' '''g STATfSTICA,tl",are (StatSn. Inc (2006). STATfSTIC A (data analy sis sftware system), vcrsin 7 I " 1).... "j r wmo sgm, USA). A li!ll:ar-by-lin ear assciati n mdel (1 7) was used fr analyses f crrclatins between Fe RD stjbgrups at days 8 nnd 15 and PCR RD subgrups al dny 33 and week 12 ln rder 10 fít linem by lrtlca r assc r311on, we used thc R cmputmg e.nv; rnment (w'\vw r-prjl:cl.rs) Results Backgrund identificatin lr each subppulatin Specirnens wn.h a"8 d 8b l PCR and FC RD analyscs Sl d Ol) 15 were included in the study (n= 104, B precu rsr ALL: ""XX, T AI L.. '(.Xx ) ln ttal. x..:"t.x and xx..-.:. speclmens (xxx crss-lineage cntrl specimens, xxx PCRpr ven neg3livc) served 85.J basi5 fr nn Ii!:Jl(lnt backgrund identdi catin in Band T 11Il C'.ngC' "LL, Predictin l mlecular remissin at day 33 and week 12 using FC stratificatin at day 15 Next, we asked whether da)' I S FC RD culd prcdict RD at da v J J an d \,,'cck 12 as cvalualed by PCR. Usi ng Spearman ran k crrelatins, \lil: crnparcd FC RD valucs Ine<tsured by FC at day 1 S t PCR-asscssed RD al day 33 and at wee].,; 12. ln pilllellts with B precursr ALL, thi s an alysls Hldi cated a slgni ficanl crrclatin bct'\\'cen day 33 r weck 12 (PCR) and day 15 (FC) (R O 5q and O j l, p<o.006. «spectivdyl. Ths IS in cntrasi 10 T A LL p:a ti enls, whse d.ata dr d noi rea h :!)lgnificancc 111 any ť,h ese cmpansn5 (R 0 04 and 0.22, p > O 3, n!specti\ cly), Thcrefn.:, wc ana.lyzcd the levels uf day 33 anj week 12 RD (per) in categrics dctincd b) Ihe Fe RD level at da> 15, e xc l l,lsi v ly in palients wi1h B precursr ALL As shwn in Figure 4, day J 5 Fe RD C-..1tegries (defincd by ;nler\"als f FC RD ;n ascendmg rde- r) crrelsted wlih dny 33 RD b)' PCR (Prll1htr < 10''', FI!;U rc 4) A Imear-by-lint.'.ar assciat ln mdel (i e, a mdel foj" cntmgmcy tsbles where hl h rw's and clumns ar rdered and the Séres f the row!i and t:"lumns are 8" en by Iheirs NlO ks) wed slg.nlficant a550c 1I1110n bclween day 15 and dtl) 33 (p< dds ral; is ( 9 5 Cl ) The dds rati dcscribcs tht nul f prprtlns f P31 icilis in c lumn s an d ro'\\5 f any given 2.-,,2 regin w;lh bolh day 33 calegries (per) as we ll as day 15 c31cgnes (FC') rdered asccndl/lgly Sirnilar bli t wť'aker crrel at ians \!,,'ere

168 bscn:cd in B precursr ALL p atint s bet\\'!ccn Fe RD in B,t ar peripheral bld at day 8 and RD (per) al later time-pin ts (data nt shwn). Cntributin f individual valu es n day 15 panel values (25 th percentile 'NIL'), O). Similar reduccin appears t be p ss ib le in T-ALL <ll day 15. lf wc rcp l1 just CDSI"'"'CD3 nt " CD99 b '... CD5"'"' and Td-r- su bppulatins a f the CD71""'"' cell S, th e RD ynjue rcmai ns identical in 18/19 psiti\'c specimt ns al1d is reduced by a fact r f O.92 in Qne case. -.. If)... c: ;......, V>, ;> ;;::..., V> v \Ve an3 1 ' zed whlch r lhe recrd ed subppulalins cntribu!ed t th c Fe RD... alue. Amng a ll speclmcns n day \5, nl y ne af 34 recrded subppul atins (C D45"C I:CDl 01NJ-CD66cP""CO 19J».» re mained belw thc cutff value in all cases. In add.1hl n, srn e values rcuched psi ti\,iiy bul thcir le\'cls \'Jere lwer Ih an the maxim um psitivc value in <lil paticnts (I.e., lwer than the... era ll FC RD value in 10 f 29 and 1 f 5 rccrdcd values in 8 precursr an d T ALL pati ents. respectively). Thus. w\! asked whc ther a redut:ed panel f mab cmbinat ins (and a reduced number frccrdcd values) culd pr vld e acceptab lc infrmatln fr day I S FC RD. T he RD in frmalin was cnsldered acceplable if the reduccd panel g...:nerated Oln R value higher than O I f thc full pand RD value Up n exd udlng thc CD58/C DI 0/CD 19/C 0 3.t tube, thc RO mf rmat1 n was acceptable in 100% specimcns (quanutbu"'c1y, the reduced pane l rcd uced th c valucs t 0.64 t 1.0 fthe full pancl.. 'alues; 5 th pcrc t:: ntile, 1.0). Further rcd uct i n to a set f just t\\lo rna b cmbinati ns (CD I 0/C066c1CO 19/CD45 and CD20/CD I0IC DI 9/C D3-4 ) stih gene rated acceptahlc resuhs in 99% specim ens, whereas selecti ng, a sct fany O1 her Iw mab cmbinatins reduced th e numbe r ť speeimen s t fewer than 90%. Exd uding thc SYTO I6ICDI 9ICD45. CD IOIC D66clCDI 91C D4 5 r CD20ICDI OIC D I9IC D34 mab cmb;nal;n led t a rcdu cti n t l O'Ó. 82% r 83% t: ceptablc resu!ts. respectl\ d y. Excluding any frhe 1w O T lincage rn Ab crnbm:u i ns reduced the frequency f acceptable resu!ts t fewer than 90% spe..::i mens. Simdarly. rcducmg. thc B-li ll L'age panel j ust t a single rnab cmbl natiqt1 reduced the frequency facceptablc rcsults t fewer lhun 900'0 spccimc ns in all casts (data shwn) Aner reduc ing the 8 1ineage panci t LWO mab crn hi natlns (C:!O/CO 10lC O 19/C DJ 4 nd CD I OIC D66c1C D 19/C D4 5). II \vas pss ible t funher sim phfy the prcedure b) reducing th c number l' recqrded subp pulat ins. [n a red uced panci. W t' prposf! t recrd three C l su bppu lal i ns wilh rc1at i... dy hig.h cutff... al ut.:s (CO]-I"'''', CD I O"" and C Ol -I20 1K, ). fll wcd by daughter subscts f these C DI subrpulatins (CDI O"""J4... C DIO- 20"' J 4 ". CD IO..... C D I0"""66c"'" and CDIO """ - th i.nr Iw als separately in CD 15'M'. C 0 4S J - (Ind ( D45""'" fracuns; in 10taJ, 14 rt'crded subsets) Obvlusly. :lil da Llghter SUbSel:i are less Lhan r q lja l to ttl f' lr respecu \ e parem CO 19"'" subppul sllons. which enables sk lppm smt:: flhc analyscs Such a reduced panel led let l d n t lca l results in 7 1 r 83 psitl \e specimens. Thrce flhc 83 specimens wuld be c nsi dered nť ga ti.. 'e. althugl1 very 10 \\1 level [ t 1 O - ] MRD was detectcd by the CulI panel: nl y nc ť th cs e p31ie nts had (In 'IRD ab\'c 10"" al day 15, and thc Slil percentile wa!' 0 52 fthe full Discussin Study design T he speed ffc, as wc:11 as its si nglc cell. quanl ilalive nature, prtrays FC as a n ideal rl f r RO and M RO measuremenl T h!! gene r<l l lack fleukcmla specifrc antigens can be verc me by detecting LA 1Ps usl ng cmbinafins fmj.\ bs labeled Wi lh d ifferenl tlurchrmes. A general an d accepted defíniti n fan LAIP is m isslo g. hwe.. 'cr, and n cns\!nsus has becn rcachcd as t \... ha t cnstitutes.ln adeq uate negali'l:c cntrl. LAIPs usually describc a subppulmin f cells f a gi... cn lineage al a pa.n icular dlfterenti atin stage with (a) abcrrant m lecular expressln patt crn s. (b) asynchrny. and/ r (c) prfund ver- r undcrcxpressin ťmlecul es lhal are ph}' silg icah}" expressed a1 the given dl ťfe rc llii al i n stage Such mlecular d lfferences f leukemi e eells may be hlghly specifíc when c mpart,;d t BM f healthy su bj ecis. Rem lssln 0 1\,1 specl mens, hwever. cntain nn-mahgnant eell s in VnriOll$ phases f regencmtin r lhcrwisc affcc:t ť J by ehemlherapy (1 8). Mst stri kingly, the B lin eagc regcnermes, and B prcc ll rsrs are abu njant at late phases ť therapy, leading t polenl ial prblcm s wich RD deteclin A lt hugh th is p h (: n l11 n n is wi dd y accepted. the pssi bili ry th aj subppulatlns f thc rcgenerati ng cell s analn LAJP is ften ignred. In addlt lo n, standardizcd "pprachcs are necessary fr RO detcclin in Iargc.nd internat inal prtcls S far. thc intcr prelatin f FC has been largely depen dent n the expert experience l' a cytrnclri sl The presemed apprach largcly djsregards subjecti\ c C\'slUluin f Fe dala. T he di sti neti n bctween leukemie eclls and n n-malignbnt bad :H,rund cell s is quéljll1 tau\'e T Dur knwledge. this js Ihe fírsl study th al sct s thc basel lllc Ols negative B;\ 1 specimens frm Ihe same chcm thc-rupy lime plnt. The presented apprach may miss sme cl earl y ntyp lcal cell s. hv. c\"er, whcn lh.::)' d nt fi l im tlle pre -ddined rcgltls. Thls appears 10 bc Ihc reasn wh)' 111c: pres.énted ap prar.;.h d id nol lead 10 a useful crrel fln al day 33 an d week 12 Ofn!\!, C'..-tn pa l en l - 1 all red IR Invcsugalln by 4-clr I C ma}' fal l fo generatc c lini call y reklble dn:ta. T he abs lute number ť rdapsed pa!ierlls illnng Lhe Fe i\t RD-ne:gali\'c subsel (day 29) was the highc'st nmng all su ata ln a large published tri.j ljl\'lving, pnlients by Children'!; Onclgy G rup Study (2). Thus. crn pred t a pre\ lus stud\' (1 0 1 wlth rcccntly updated results by Fl hr t t :ll. ( 19) (whi ch \"I:i '5 th c ba ls fr Ihe AI EOP BFM

169 AU prtcl), Fe MRD ar theend finduclin Ireatment mi sscd a much grealer prpr1in fpatients than 19.'TCR MRD Recenl data frm Brwitz et al. (2) werc less encuraging Ihan several frhe prevl0us Fe MRO reprts. Here we shw usefulness af day 15 Fe RD; the faci lhal aur apprach failcd mlater time-pints SUpPOr1S th c reccn! caurln (2), despltc using a vet)' diitercnt apprach ;jnd a differcnl ch emtherapy prtcl. Cl early, the Usé f Fe ar dar 29 ar Jater f r MRD mnitring is still highl y impnanl AI day 29 r laler, Il rcliably dclects.a high M RD burden. whercss its use al the level f 0.0 I % shuld rcly n a rnulticlr appr ach and) r ther ll1clhdlgical impr vcmcnt s fe D I OP and/ar CDJ4P"1' B Iy mphblasts, hwe\'er, ma)' be frec f RO, at te-asi al day 15 f BFM-l>ased prtcls The relevance l nn-malignant backgrund The Sl nltegy fusing a wide pand fantibdies and repn mg predefined subppulatins as dcscri bcd here Wá.s recentlv Pllbli shed in a childhd AML MRD study. where hetergencny 3J1d phent)' pe insrablhly in leukmic cell s represenled a prblem in repl1ing MRD ( ). Ahhug h sme data cmparing FC MRD usin pati ent speclfie LAIP t PCR MRD appear prrnising (32, 33). n rč p rducib le gati ng strategy ensidcring a time-pint speciťíc baekgrund has bcen published. MAb cmbinatins - reasning The S YTO 16/CO 19 PE/C045 PerCP and SYTO 16/CD7 PE/CD45 PerCP cmbinatins were used t quantify thc prprtin f Band T li neage cell s, respecti vcl y, amng nuc1eatcd cells. In addili n, immature CD4S d,m, ''''C O I 9" li s \Vere recrd,d. The CD2Q FllCiCDIO PE/CD 19 PC7IC D34 APC e>alua!cd B cell d.ffe renuati n ( ). Changes ln CDI O exp ľess in levels in the cnlexl f('d20 nnd C034 are frequent in Alrhugh 4-clr appraches are frequenll y used fr RD detc..-cí ln, current equipmenl allws Ihe use f an JOcrcasing number f mleeules simuhaneusly. Thl5 may further imprve: the accuraey ť distinguishing leukemie frm nn-malignanl cells. even ifn new anligens are intrduced int the diagnstics. Knwledge f the nn-malignanl backgrund, hwcver. is \"ital fr the crrecl interpretatin f such RD data The presented rcsults shw lhal thc backgrund level f immature cells f bolh Ihe Band T lineage may excced O 1 % even BC P AU lh C058 FITCICDIO PE/COl 9 PC7/C[J 34 APC cmbinatin was Intrduced t detect CD58 during thc il1duc.ti n th c-rapy r---.. cr,..-< c:..., Vl,<i :> O...2:<: '... >..., Vl 'V vrexpresslon, cmmnl fu nd in BCP ALL (22-24) The CO I O FITCICD66c PElCD t 9 PC7/CD45 APC cvajuated C 0 66(.;. which is the msl colllmn aberrant myclid n,i c n in ehildhd Al.t. and u$ually dcs nt chase bct,,,'cen diagnsis and rela.pse (25). Pssiblc tcmprary changes in ils c.xpressln, hwe\cr, wuld decr"sc ils valuc in MRD. The CD99 FlTC/C D7 PE/C D5 PO/C D3 APC evaluated COJ ncgativi ry, nd hypec xpr.s"n f CD99, bth f which are cmmn in T ALL (26, 27) The intra-tdt FITC ICD7 PElC D3 PC7lint ra CDJ APC cvaluatcd the 'rdt exprcssjon in T cells, whtch 1$ predm inantl) presenl in the thymus (18) Dala inlcrprctalln W1d dcfínitin f indl \'id uai subppulatins was d ne US dcscribed in ti g ure 1 "lr1d:! Simplilied RD testing Rt."'Ccrnly Cusli.ln-Smith et al shwej the prgnstic rc! c\":tncc l' CD I O"'"'CD 1 9'* Md CD 19;-CDJ4P" fr eqll ncy al day 19 n the St. Jude pr10cal (29). Th e defi nitins fppulatins shwn in Ih ls stud) are c1 0SCSI t CD I ""'"'C D 19"" " n CD 19"' C 0 J4 Here, we shw 3 I1lgh baekgrund l' the,e subppulatins 3t da)' 15 f Ihe BFM-bascd ALL-IC BFI\ f2001 prtcl Thertfre. the publlshe-d findulgs shuld not g.enerahzed. and tnc pss!bl e presence f nn -m alignant CD l r r CD3 4r--"'1 8 l. el15 shuld be cnsidered in BM. e\'en st enrl' phjscs f hc m lh ér3py ln ag/cement ",ilh lne maln cnd usin fcuslan-smith el ni negati\ c: findmgs wlln thesc s,mplitied techni que s are likcly t spt:t:.ifica ll y ldť nl lfy palienls \\'lth lw RD Patients with hi gher numbers The predictive value l early RD As shwn herc, thc evaluatin f RD n day 15 uslng;' C}'lOmelric strategy with predefined gating \\!as pre:dicti ve cr MRD calegries, e specially al day 33. Day 15 cy tmetric RD deleclin is, thus, a ntable alternative fr PCR-bascd '1RD al day 33, espccially in setting.s where PCR-based \ltrd is una"ailable Alth ll g.h mrphlgy Hl hypplastic BM. which i:s \)' plca!ly prcsent at day 8 and 15. can crrectly idcnlify patients... ilh a high le uke mie burdcn (BM infdtratin ver 25%), Fe ean speciflcally c3tegorl ZC paticnts uslog lwe.r and mean i ngťu l threshlds (Flgure 4). Thc fac I Ihat carly FC RD d id noi errelate wlth later II mc-pints in T lin a.!!c ALL mighl h3\'1.: been intluenced by the lwer num bt.:r fpalients in thi s ALL subscl A largcr study fr l ' lineage AL L shuld test whelher RD in Ihese patlcnts req Ul res a q untitalivdy di fferent slratifícalln. 80th the IO stru mcrj\ a.n d the gatl ng shuld be slandardized fr reliable RD mnitring. es peciall y in a muhi- C"enterselfing. The pre-senled study sh \I,'s backgrund threshlds in precisely defln ed gnles nnd Ihe relevance f a 'Ime-plnt speciftc RD. Thc highcsl polcntial fr the use f FC appe.ars t be day 15 f a I3FM-baseJ prlocl. These RD vaj \lť s ma)' ldenu fy thse patients a( bth 11Igh and 10"" risk l' IR D ar the cnd l' lnduclln and al \\c(!k 12 ln BCP A.LL.

170 Reduced panel fr day 15 RD A ralhcr extenslve pand w as design cd, and quite a high number af su bppul utins were repncd in this study Fr practical reasns, lirni tmg thc number fanalyzed subppulatins is \ Ital, especia ll y in B lineag,c ALL [n a ur chrt, a reductin in th e number f subppulauns by ne -h alf( 14 subppulati ns), mitting ne mab c rnbinalin entirely ad reducing the SYTO 16/C O 19/CD45 10 SYTO 16/CD 19 prvldcd cm parable rc5u lts 10 Titles and legends t figures and tables Table 1. Pa tients, characteristics Hyperdi pl id patients were nee,ative fr all fusín genes listed in this lablc Standard, intcrmcdiate and high risk g,rup (SRO, IRG, HRO) criteria are described in materials and melhds th e rull pane l af 28 subppulatins w ilh 4 mab cmbinatins ln T A LL, \Ve nticed a decrc3sd Intensity af TdT exprcssin in resldua l T I)' mphblasts (data nt shwn) Nt surpnsingly. the tw subsets ftdtjy.'cd7p> subppulaltns were a lready t infrequent and did nt cntribute t the vcrall RD values. Neverthdess, ur Table 2. Cut-ff values Values represent thc thresh ld f r RO psitivity (A B lineagc, 8 T line.gc) l'<urnbers indi cate th e perccnlage f ccll s amng nucleated cell s abvc \I,'hich " ll valucs arc cns idcrcd RD psiti ve dala shwed n predictive \'alue l' FC at day 15 in T AL L. Thercfre, an alternali \'c 1:!pprach shuld be used fr these paticnts. Pc rl1aps day 15 culd bc rcplaced by anlh er Ji me -pint in T ALL patienls References: Table 3. FC sensitivity and specificity at different time-pints The number f FC PO' 'y nnd PCRf"D' "" (levcl 10-1 ) patienls al respecli ve lirne-pinls and Ih e crrespndlng sensut VHy nnd speciticity f FC RD Figure 1. Gating strategy in B lineage ALL AlI reprlcd a l es f r cach m Ab crnbmalin are shw n in pscudclr plts. Pl ls shw residuallcukcmk: ccll s (PCR RD 2: ) in regcncrating bne marro\... (week 12). In the CO 1 0/CD66c1C DI9/C045 crnbtnatin. subppulatl ns accrdlng 10 che levels f ('045 expressin \\,:ere a ls reprted (C045--, C045<.1'I11, CD4S n,.. detined by expressin n C045"1I g ranulcytes) Figure 2. Gating strategy in T ALL A. 1I repoi1m gaics fr each rnab cmbinalin are 5hwn in psc udclr piois. Plls shw residualleukcrnic cells (PCR-RO > ) in a bne mafrw (day 15) lgether \Vit h nn-malignant T Iymphcytes Figure 3. Crrelatin f RQ-PCR RD and FC RD at day 15 FC RD (calculared as lhe highesl frequency f che subppulatin which excecded Ihe lime pint-speciflc 00 Lr'l,-< t:: I-.... Vl, ;> O...!<: ;c... Vl 'Q) w backg rund "'alue) 15 cmpared t RQ-PCR RD ca!cularcd accrding t ESO principles. On ly sarn ples nt used fr bac r u n d q u átl tlflcati n a re s h wn. Th enu mber ť paue n ts in cach q uadrant i::. shwn Figure 4. Crrelatin between resldual disease by PCR at day 33 and residual disease by FC at day 15 in BCP ALL Pat1enlS wcrc c 31egrized besed n PCR-dclccled RO a t da" 33 inl negati,:c (\\ hite), bc-id\\.' 10-1 (bliqul!' halching). belw 10 " (.W.J Ilnd < 10'.1. \'enical halching) and ut r abve 10 " (black) The freq uencies are shwn in su hscts ť palients dc1ined by FC RD at day 15

171 C' If)... t:: I-. '-' Vl,ci > ;i: '-' Vl. Ci) References Steinherz PG. Gaynn PS, Breneman Je. Chcrlw JM, Grssman NJ, Kersey JH. et al Cytredllctin and prgnsls ln a Culť Iy mphblastlc leukerma--the Imprtance f early marrq w respllsc. reprt frm the Childrens Cncer Grup. ] Clm Onc l 1996: 14(2) Brwi t.7. MJ. Devldas f, Hu nger SP, Bwman WP, Carrll AJ, Carrll WL, el 0.1 Cliníca\ sigmfícance f minimal n:sidual disease ln..-:hildhd Ocule Iymphblastic Icukcmia and ils relati nship t ther prgnstic factrs A Children's Onclgy G rup study Bld Brwitz MJ, Pullen OJ, Sh uster Jl, Vlswa nalh n D. Mntgmery K. Willman CL. el al. Minllnal residual dlseasc delcclln in ch lldhd pn:cursr-b-cell ac ut lymphhlastl c leukemla: relatin 10 ther risk faclrs. A Chlldren's Onclgy Grup study L. u'em,a 2003; 17(8): 1566-n 4 Pan7...er-Grumaye r fr, Schneider M, Panzer S. Fasching K, Gadner H. Rapid mlecular respnse during earl y inductin che mthernpy predicts a gud utcme in childhd acule Iymphblaslic leukemi a B100d 2000;95(3): Dw'Orm "I N. Frschl G, PrinlZ D. Mann G, Ptschger U. Muhleggcr N, ct al Prgnstic signiti cance.:ind mdahues f nw cytmetric minimal resid ual dl scasc delcctln in childhd acute lymphblastic leukemia Bl d 2002,99(6 ) Bjrklund E, Maz ur J. SderhaJl $. Prwit-MacDnald A Flw cylmctr;c fllw-up fminimal residual discasc in bne m á rr ůw gi.. 'es prgnstic infrmatin in childrcn wilh acule lym phbl1st ic Icukemia Lcukemia 2003, 17( I): Willcmse ' 1J. Serill T, Hetti nger K. ďa ni ell E. Hp \VC. Panzer-Grumayer ER. el a l. Deteclin f min imal resldual dlsease ldentifics diffc:rcnccs ln Ircatmcnl resp nsť' between T-Al..L and precursr B-ALL. Bld 22:99( 12) Pui Cll. Sandlund JT, Pe l D, Campana D. Ri vera GK, Ribeir RC. ct al. Imprved ulcornc fr children wilh acule Iym phblastlc leukcm ia. resuhs ftlal fh-.!rapy Study XIIIB nt St Jude Chddrents R search Il'I'"al Bld (9) CuSIM-Srmth E, Behm FG. Sanchcz J. Byen JM. Hancck ML. Raimndi se, et a l. Immun lgical de tectin f mmimal resldual di sea.se ln children ",ilh acute lymphblaslic leukae mia. Lancet (9 102) van D ngcn JJ, Seriu T. Panzer-Grurnayer ER, Bi ndi A. Pnijc rs-\villcrnsé M J, Crral L, et al Prgnstic... aluc f mi ninwl resldual dl SCasC in acutc!ymphblastic \cukaernia in chi1dhd. Lancel 1998,352(9 I 42) I I Pngers-\Vl1 lemse MJ, Seri u T, St l7. F, d'amcll E, Gameir P. Pi s.::l p. et al. Primers a nd prtcl s f r sla ndard lzcd dc.teclin fm lnlm al resi dua! dlsease in acute Iy mphblastic leukemi3 using immunglbulin a nd T cell receplr s ene r<:arrangcments and TA L I dclelins s PC R largel' reprt f Ihe BIOMED I CONCERT ED ACTION. in\'e.stlgatin fminimal resldllnl dlsease in a.;ute leukemia. LeukemlB 1999: 13(1) van Dngcn JJ. Langernk A\V. Bruggc mann M, EV8nS PA. Hummel M. La\ endc r FL. CI al. DeSIgn í.ind standardizatjn fpcr pflmers and prlcls fr dctectin fcjnal immunglbulin and T-cell rc-ceptr ('n e recmblo3uns 111 suspect Iymphprliferauns: repn fthe B10MED-2 Cncertcd AClin BMH-I- C'T Leukcm,a I 7(1 2).1257 J I i 13. \'8n de r Vddcn Vil, Hchhnu s t\, Cazz.niga G. Szcz.cpanski T, Gaben J. VO Il Dng JJ. DClccti n f minimal residual disease in hemallg ie mali gnanclcs by real-timc quantltollvc PCR: principlcs, apprachcs. ahd I.bralry aspec". I. eukemi (6) Bruggema nn M. "' JI der V. ld.n VH, Raľf T. Drese J, Rilgen M, PO!! C. CI al. Reammged T-cell receptr bela gcnes rcprescnt p\\erfu l Illrgets fr quanufic8lln f minima! residual dlseasc in chlldhd and aduh T-ccll acule Iymphblasuc I.ukem,a Leuk emia 2004; I 8(4) Sra mkv Q. L. lu 2 l kva K, Frankva E. KrcJ ci O. Sedlacek P, Frmankva R. el l DClectable minlln al resldual d iseasc betn.: allgenclc hemalp<,ieue stem cell trunspl::uu3i1n predicts c xtrcmely pr prgnsis in chil dre n \\jth ac ut e Iymphblastl c lcuk cmm PedlO tr B!d Cal1ce r vn der \ elden V H. Cazzamga G. Schrauder A, Hancck J. Bader P. Panzer-Grumaycr ER, CI al Anal)' sis Of mlnhllal resid ual disease by IgffC R gene rearrangements guidchnes fr intcrpre.uuin freal-lime quanthativt per data Lcukm i a Agresti A CaJeg rical Data Analvsis: Jhn \Vlley & Sns \ 3n Lche m EG. \Vlegers Y 1. van den Becmd R. Hahlen K, \'an Dngen JJ. Hljkaas H Regcnc rruin panem f precursr-b-cells in bne maftow f 3cute Iy mphblasllc leukemia pati enls depends n Ihc 'Ype r prcc.<dms chcmlherapy. Leukem (4): Flhr T. Schraudt:r A. Ca n1ga G. Panl.cr-Grumayer R, \'an det Veld<..""n V, Fischer S. CI a l M lnlmal residua! dlsease-directed ri sk sli allti c3ti n using real-ume quanlll3li\'c PC' R analysls f llllmunglbulm and T cell receplr gene rearrnngcme nls ln th c inl C'mtll1 nal mult it.:cnlé'r tnal AIEOP-BFM,\ LI. OOO f r childhd ac utc I)' nlphblastlc le ukem l Leukemia Luci p. Gaipa G, "an Lchem EG. van Wering ER, Prwil-McDnald A. Furt. T, 01.1 BIOMED I cncened actin reprt: n\\' C)'lOm eltlc Imm unphcnlypmg fprecursr B-ALL w lth standardized triplcstai nings. BIO,tED-1 Cnccrt ej Acti n InveSll gi1 n f Mlnlmal Residual Disease in Acute l eukemia Internatlnal Standardiza1ln and Chmca l Evaluatln Lcukerma 200 1, 15(8) Lucic P, Parrcira A. van den Becmd -tw. van Lchem EG. van W<:ring ER. Baar3 E, et al. Flw cytmetric analysis f nrmal B cell d ifterenti atin: a ľrame f reference fr the dctectin f minimal residual di sease in precurs r-b ALL Leukemia (3): N eale GA. CusUln -Smilh E, Pan Q. C hen X, Grhn 8, Stv. P, et al. Tandem applicatin ft1w cytmetry and plymerase c hain reactln fr cmprehen.sl\"e dť..1 é(..'1 10 n f m inimal residual dlsease in chlldhd acule IymphblaSlic I<ukemia. Leukem," 1999,13(8): I Vhrni M, De Zen L. Sanzan MC, 1ugll a O, Dwrzak MN, Ralei R, el al Expressin fcd58 in nrmal, regenerating and leuke mie bne marr\ B cells: implicatins f r Ih e delcctin fminimal residual diseasc in scute Iy mphc)' tic leuke l1ll8 Haematlgica ( II ) Lee RV, Sray lan RC, RimSLa LM. C DS8 expressin decreases as nnmalignant B cells mature in bne marrw and Is frequcntly vercxprcsscd in adult and Pédiatric precursr U-cell acute Iymphblaslic Ic ukemia Am J Clln Palhl 2005; I Z3( I) : Kalina T, Vaskva M. Mcjstrik\"a E. Mad:7.0 J. Trka J, Sta.T)' J, el a1. M)'clid a nligcns in childhd Iymphhlastic le ukcmia: clinical data pint 10 rcgul a tin fcd66c dislinct rrm ther myclid an ti gcns. BMC Canc.r 2005;5( I ):38 26 Dwrzak M N. Frsch! G. Prllll7. D. Zen L D, Gaipa G. Ratei R. el al. CD99 expressin in T-lineage ALt. implic,:uins fr tlw cytmetri c detťctin f minimal n::sidual disease leukernia 2004; 18(4) '0rwII MaDnald A. Bjrklund F Luc i P. van Lchem EG. Mazur J. Parreir. A, el al. BIOMED-I cnccncd aclin repn 110w cytme(ric cha.ractenl :Jtin f CD7+ cell s ubsels in nrmal bne marrv. as a basis fr Ih c d, agnsls and r llw-up ft cell ac ule lynt phblasl'c leuk cmlu (T ALLl LeukcmlO 2000; 14(5): Campana D. Cus tan-smllh E. Ad\"ances in Ihc Im munlgi cal mnitoring a ť chlldhd acule Iymphblasli c Icukaemi. Best PrcI Rc, Clin Haentall 2002; IS( I): Custan-Smlth E, Ribelr RC, St\\.' P, Zhll Y, Pui CH, Ri \ era GK, et aj. J\ simplifled Ow cytmetric assay identifíes ch tldrcn wilh acute lymphblaslic le ukcmia wh have a superi r c1inical utcme Bld ( 1) Re inhardt D, Langcbrake C. C r-.!utllglj. \'rmr J, Brune C, Thf\\testen M. et al. [Minima! resldual disease in aculc myelid leukcml3 in chi!dren--standardi t.atin and evaluatin f immunphenty ping in the AML-BFM-98 st udy). Klln Padia" 200 2:214(4 ): I Langcbrak.e C. Crt:lItzig U. Dwrzak M. Hrusak O. l'-'lcjs!nkva E, GneslIlgc r F, ct al. Residual disease mnitring in childhd acute mye!id leu kemia by multiparameter nw C) tmelry : the MRD-AML-BF I Sludy Grup. J Clin Ol1c l (22d Jl Malcc M, vatl der Vcldcn VH 8Jrklund E. WiJkhuij, JM. Sderh"'l $, Mazur J. et al. Ana lys", f mm lmal residual d l ea s e ln chddhd acute Iymphblast ic leukcmi a cmparisn bct\.. een RQ-PCR annlysis f IgfI' cr gene rearrangemcnt s and Ol ulticl r n\\' cytamclric immunphentyping Lcukcmia 2004; 18{I O} Kerst G. Kr-.!ycnbcrg H. f{ l h C. Wcll C, DielZ K. Custan-Smilh E, Cl al Cncurrenl detcctin f minima! residua! discase (IRD) in childhd acutc lymphblastic leukacmln by n w cytmetry and rea l-l1i nc PCR. Br J Haema!Ol 2005; I 18(6):

172 E. Mejstříkvá, strana 160 Figure 1, SYTO 16/ CO 19/C045 C20/C ID/CO 19/C034 CO I O/C 66c/C 19/C045 C58/C 1 O/CO 19/C034 <5' " c ; Cll -<: d O; Č) CJ ';-J () CJ Úl "'" () CJ 19 Č) CJ ';-J () CJ (11 Č) CJ w '" ' ' - CJ, -bl g :.:; ;,t -;-t () 3 CJ "O ';-J Ol" () 3 CJ w :5' ;,t () n' CJ IQ <ll c W

173 E. Mej s tříkvá, strana 161 O l _I _ <3' e: čd Ci> I 00 q, q <>0 Q) I 9 6) Q(f>cP ' tep./>l COcJl,0 :;:: I Ol I I "- d I 00 «>'0 0 O> '< ::J CI) Ol c CI) "'Tl () : Ci: Dl '< -'" Frequency f day 33 PCRps patients accrding FC RD categries at day 15 A P ;J? p &. ;,\! 'f' ;J? N (J1 ;J? ;J? '" Ul :$! :$!.

174 Table I. BCP ttal BCP SRG BCP IRG BCP HRG prae-b call AHL (calumy+) pr-b Male Female <6 years 6 years Prednisne gd respnse Prednisne pr respnse VVBC at diagnsis luL VVBC at diagnsis <200001uL CR1 achieved at day 33 CR1 achieved late( (till week 12) Death p(ir day 33 Gentype subgrups (BCP ALL) TEUAML1 29 BCRfABL 7 hype(diplidy (DNA index 21.16<1.6) 28 MLLfAF4 O thers 26 Characteristics at diagnsis (n) l' TALL SRG IRG HRG mature T ALL mature T ALL TCR alphal betapo' mature T ALL TCR gammaldeltapo' AH L (mature T ALL TC R gammaldelta" ' IMy+)" inte(mediate T ALL prae-t Prednisne gd respnse Prednisne pr respnse VVBC at diagnsis luL WBC at diagnsis <200001uL CR1 achieved at day 33 CR1 achieved later (lili week 12) Death prir day O O Table 2. A B lineage sytp C045<1''''CD19 CD10 1>l!t I'l':CD34pCD19r '. CD101><"C034\>'O'C019 O ' COl On'IICD20 n-ec034,c 01g0 U CD34 C.CD19;MO C010 bdt"' CD19'" CD10"'CD19- CD1 On CD20MgCD19 CD 1 Ob"' '"C058 WlV Ilf CD34 ' CD19!J<>' C010/l104C058 t.n, CD34 "' C019'" CD10n"'CD58q Il1CD34p'CD19pn CD10 f'pccds8b",!o CD19P'" CD10"" CD58 1 "'.MCD19 P '" C010n' CD5SbdtftlCD19l><>' C010 CD66c'''' CD19P<1 ' CD10 " CD66c " CD19, CD10 PG 'CD66c",tI"" CD19 f10 C04S flttt "'C0101>O'CD66c Q '" CD191>01 CD4S dlm CD10 PO 'C066c;><l'- CD19" u CD4S... CD101l'O.. CD66c""" CD1911'01 CD45MilMCD10 1>:lIll C06ecl'D- CD19"" C04S,m CD10 I.t ltl lt CD66c"" C019 ' C045"'i1CD10 " ",IICCD66(:" CD1g lhl " CD45ri,hlC010 1>O IC066(:"" '" CD19"- ' CD4Sd'"'CD10C066(: WIfAt C019- C045"CD1 O""'"CD66c 01llM C019- CD45<l,mCD1 Oft C066 C01g CU C045n.IICD10 "CD66cH.' CD19 g <,. day 15 cut lf value O N '-D,...-< c: '-< '-' Vl, :> O '... >'-< '-' Vl v B T lineage CD5uCD99 'MC07P.' COSpuC03... COr.. ITdT'., CD7 P "" ITdT ; 'CD3P'iC03 " Cr"" it d-r: sc DJ""'IIiC 03"" CD r s day 15 cut lf value

175 E. Mejstřík v á, strana Přilžené publikace bez impakt faktru P říl h a 12 Imunfentypizace d ě ts ký c h leul<émií Tmáš Kalina, Ester Mej s tříkv á, Martina Váškvá, Ondřej Hrušák Transfúze a hematlgie dnes, 2006, (bez impakt faktru)

176 E. Mejstříkvá, trana 164 Imunfentypizace d ětských leukemií Kalina Tl, 2, 3, Mejstříkvá E.I, 2, 3, Váškvá MJ, 2, 3, Hrušák 0,1,2,3 lústav imunlgie, 2Klinika dětské hematlgie a nklgie UK 2. LF a FN Mtl, 3CLIP Childhd Leukernia Investigatin Prague Suhrn lmunfentypizace je již dnes standardní metdu v diagnstice hemat-nklgických nemcnění. V sučasné d b ě zažíváme rzvj mnhbarevné průtkvé cytmetrie, jak ve výzkumu, tak i v klinické diagnstice. Práce shrnuje diagnstik u a sledvání akutní lymfblastické leukemie pmcí průtkvé cytmetrie. Klí č vá slva: imunfentypizace, mnhbarevná pr ůtkvá cytmetrie, akutní leukemie, expresní prfilvání, minimální reziduální nemc S ummary Kalina T., Mejstříkvá E., Váškvá M., Hrušák O.: lmmunphentyping f childhd leukaemias lmmunphentyping is a standard methd used i diagnstics f hematlgical malignancies. Prgress in number f multiclur cytmetry as well as new targets identified by genrnics bring new pssibilities in research and diagnstics. These aspects are summarized in the article. K ey wrds : immunphentyping, multiclur flw cytmetry, acute leukaemia, expressill prfiling, minimal residua] disease Trans. Hemal. dnes, 12, 2006, N. J, p Úvd lmunfentypizace nebli stanvení pvrchvých znaků b un ěk pmcí průtkvé cytmetrie zažívá v psledlú dekádě hrmný rzmach, jak p stránce dstupnsti, tak p stránce teclmické vyspělsti instrumentů a rzvje technik a pstupů uplatňujících se ve výzkumu i v diagnstice. T vede na jednu stranu k mžnsti získálú mnžství klinicky relevantních infrmací, ale zárve ň je ptřeba tyt infrmace zpracvat a klinicky správně interpretvat. Záměrem prezentvanéh čl ártku je pskytnut přehlednu infrmaci klinickým i labratrním hematnklgů m, která pmůže v uvažvárú bě hem diagnstickéh a léčebn é h prcesu. Výhdu prutkvé cytmetrie je její kmplexlú přístup a její schpnst dát relevantní dpvěď i v situaci, kdy šeul.ijící lékař má více tázek než jasných dpvědí. V hemat-nklgii je cytmetrie centrální metdu, která ře š í tázky diferenciálně diagnstické, typizuje leukemické buňky a má vliv na zařaze rú d léčebných prtklů. Zatím výzkujllilě se cytmetrie pužívá ke sledvárú průběh u l éčby (minimální reziduální nemc) a k hledárú nvých znaků k predikci prgnózy. Leukemické buňky se vyvíjejí v kstní dřerú, v bdbí p lně rzvinuté chrby je nacházíme v perifem hvi nemcných, kudy recirkulují, pdbně jak nezralé krevlú buňky, ze kterých vycházejí. Schpnst zkumat imunfentyp jedntlivých bun ěk ve směsi buněk jaku je kstlú dřeň i pe rifem! krev před s tavuj e hlavní výhdu prutkvé cytmetrie. V psledrú db ě se d diagnstické plůtkvé cytmetrie dstává mžnst mnhbarevné analýzy. Sučasně plicházejí nvé infrmace z genmiky a prtemiky, které mhu vlivnit diagnstické mžnsti imunfentypizace. Ppis metdy Průtkvá cytmetrie pužívá jak zkumaný materiál buněčnu suspenzi (např. kstní dřeň, perifemí krev či likvr). Metda vyžaduje čerstvý materiál (živé a neagregvané buňky, bvykle d 24 hdin p dběru). K detekci jedntlivých pvrchvých neb cytplazmatických mlekul pužívá mnklnální prtilátky knju c gvané s flurescenčlúmi značkami. Suspenze buněk je p navázání flurescenčně značených prtilátek nasáta d průtkvéh cytmetru, kde jsu buňky seřazeny d úzkéh prudu kapaliny a vysku rychlsti prudí kmru a jsu zářeny laservým paprskem. Laservé světl excituje na buňk ác h navázané knjugáty prtilátka-flurescenční zna čka, které emitují svě tl vlnvé délce určené typem flurescenční značky. Suča s né prutkvé cytmetry umžňují zapjením jednh až tří laseru excitvat 3 až 9 různých flurescenční ch značek zárveň. Pr každu buňku je zapsána kvantita každéh flurescenčníh znaku a dva neflurescen č ní parametry ppisující velikst a granularitu buňky. V jednm vyšetření se bvykle pužije simultánní kmbinace znaků (v diagnstice leukemií cca 2S znaků, které jsu vyšetřeny v cca ls ddělených alikvtech zkumané suspenze), během sekund až minut se změří tisíc buněk v každém alikvtu. Ke grafické analýze těcht S až II parametrvých dat se pužívá speciální sftware, kde se prvádí výběr ("gating") pdskupin buněk na základě přítmnsti jedntlivých znaků (br. 1). Kmplexita změřených dat narůstá se zvyšváním pčtu parametru a vhdně zvlená strategie analýzy je velmi důležitá pr ínterpretaci dat. Interpretaci dat mu sí prvád ě t vždy zkušený dbrník- 20

177 E. Mejstříkvá, strana 165 -cytmetris ta. Při pčtech nvých diagnóz v dětském věku klem 80 r č ně je vhdná kncentrace vyšetření na jedn pracvišt ě, cž je v Č R díky splupráci všcch dětských hematlgických center zajištěn. Cytmetrie a akutní lymfblastická leukemie vždy byla dstatečně dluhá dba sledvání (I) neb se hdntili pacienti s BCP-ALL a T- ALL splečně. Vzhledem k léčebnému ú s pěc hu léčiva zalženéh na mnklnální prtilátce anti- D33 a cytstatika calicheamicinu u myelidní leukemie (3) je zajímavý nález krelace CD33 pzitivity u BCP-ALL se špatnu prgnózu (4). Predikce rizika Přítmnst jedntlivých mlekul na blastech ALL je in tenzivně zkumána z phledu ptenciálních predjktrů úspěšnsti terapie. Velká pzrnst byla v ě nvána aberantní expresi myelidních znaků na buňkách ALL. Jedntlivé studie nalezly nepříznivý neb žádný prgnstický význam exprese těcht mlekul při diagnóze. Tat diskrepance byla způsbena ur č itými nedstatky v designu studií. Rů z né myelidní znaky byly čast hdnceny splečně (např. CD13 a/neb CD33) (1, 2). Ne Struktura výběru buněk (gatvántj l munfentypizace při diagnóze Cytmetrie je díky rychlsti prvedení vyšetře ní základním labratrním vyšetřením veducím k diagnóze leukemie. Základní túzky, které diagnstické vyšetření dpvídá jsu: Jedná se leukemii, nemaligní prliferaci prekurzrů neb změnu prcentuálníh zastupení subppulací bun ě k např. při útlumu v kstní dřeni? Vychází leukemie l myelidní neb z Iymfidní řady? Jedná se ALL z B-prekurzrů neb z T-řady? Odpvědi na tyt diagnstické tázky mají význam pr ptvrzení neb vylučení maligníh nemcnění a pr zařazení pacienta d léčebnéh prtklu. se. C 'i----.a.;.;;,,..., u ' J 10-!C' Iq'.T T. '' c J CDI0-2D r (! " :: CDu' ' -I e h) '.,.-,. j ' P '. e-:. 1."t : 5..," Oll) J'.I \ -" ',;... : u 10;.' I I 1,.,: (, ó U' L. c,. H. I Ilr... l I t; 10! \.-.. -,..,,- ' O llr. 1. Piíklad pužití mnhbarevné kmbinace CCD34 FlTC/CD J O PElintra CD I 79a PCS/CD20 A40S/lgM Dy647) znázrřlující vývj B řady v nemaligní KD. Vlev nahře jsu zbrazené CD 19+ huňky ze širkéh lymfmncytarníh gatu pdle exprese CD 10 a CD20 antigenu. Během vývje B (-ady buiíky pstupně získávají antigen C020 a ztrácí an tigen D J O. Zralé B buňky, které jsu CD20ps a CD I Oncg neb jen s l abě + pak p u š tějí KD. Na dalších brázcích je pak rzvedena pdle jedntlivých subppulac í exprese intracellllámíh V preb receptru Cintra CD J 79a II pvrchvéh IgM). Buňky pstupně v průběhu svéh vývje přechdně ex primují Vf'rcB recept r a pstupně více buněk exprimuje na pvrchu IgM. Osy zbrazují intenzilu Ilures 'c nce v grafu jmenvaných zn aků. B-prekurzrvá akutní lymfblastická leukemie (BCP-ALL) Kstru dřeň je plimámírn I1Ústem vývje prekurzrů krevních buněk. Sebebnva a vývj hematpetických kmenvých buněk, vývj prekurzrů B Iymfcytů a myelidních buněk prbíhá puze v kstní dřeni, zatímc prekurzry T lymfcytů dzrávají v thymu. Imunfentyp B prekurzrvých leukemií připmíná imunfentyp nemaligních prekurzrů B řady. Klíčvým úklem je tedy nalézt splehlivé znaky, které dliší nnnální prekurzry d maligních buněk. Kmbinace změn jak např. aberantní exprese, asynchrnní exprese, hyperexprese, útlak nrmálních vývjvých stádií či přítmnst prekurzrů v perijcmí krvi umžní stanvit správný diferenciálně diagnstický závěr. Imunfentypvá klasifikace BCP-ALL pdle návr- --_._

178 E. Mejstříkvá, strana hu skupiny GIL (5) (tab. I), kteru pužíváme v rámci BFM léčebných prtklů i v České republice rzlišuje tři - kategrie: prb ALL cmmnall preb ALL Tat klasifikace vychází z vývjvéh schématu B Iymfpézy. Ačkliv imunfentyp prb ALL je spjen s přestavbu MLL genu a hrší prgnózu, rzdíl v prgnóze či bilgických vlastnstech mezi cmmn ALL a preb ALL nebyl prkázán. Zárveň se z phledu ALL řeší i tázka hybridních leukemií, kdy jedntlivým zn akům, je dán hybridní skóre a pkud je skóre vyšší než 2, je leukemie klasifikvána jak akutní hybridní leukemie (AHL - ALUMy+ neb AML/Ly+). V následujícím přehl edu diskutujeme znaky pužívané v diagnstice ALL (tab. 2), více infrmací jedntlivých D znací h, pkud není uvedena reference, lze dále získat na webvé tránce HLDA (Hu man Cell Differcntiatin Mlecules Antigens Wkshp). Linivě specifické znaky pr B-Iymfcytámí řadu Pr zařazení vyžadujeme přítmnst alespň dvu z následujících tří znaků: CD19 Znak definující příslu š nst k B řadě je především znak CD 19, který se bjevuje záhy p Iirůvém rzhdnuti splečnéh lymfidníh prckurzru směrem k B ř a dě, ve kterém hraje hlavní úlhu transkripční faktr Pax (Nutt, 1998). Tent znak zůstává na pvrchu B bu ně k ve všech stádiích, ztrácí se až na zralé plazmatické buňce. Hraje nepstradatelnu rti jak kreceptr B-bun ěč néh receptru ve fyzilgickém vývji, aktivaci a diferenciaci B buněk. CD79a CD79a (lg-alfa) je signální mlekula, je rvn ě ž B-linivě specifickým znakem, jeh cytplazmatická exprese dknce předchází znak CD19 a je první specificku mlekulu ddělující B-prekurzr d splečnéh Iymfidníh prekurzľu (7). CD22 Tab. I. Přehled klasifikace pdle návrhu skupiny EGIL. Kategrie Kritéria Pdtřída Kritéria 2 neb 3 z následujících: CDI9pl prb ALL CD lneg CD20neg - B prekurlorvá (intra)cd79apl and CD22pl C0 3 n <K intracd3 nc g call CO IO PO >' intralgmneg I--- KnC.S a Ancg preb ALL intralgmpl neb 3 l. následujících: CD19pZ, - --_.- zralá B (intra)cd79apo' and C022PO' CD3neg Bez další subk/asifikace inlrac03neg U LL-- Kpl neb tjx>l ----c---. (intra)c03po' prt ALL C02n eg C05 ne g C08 n cg C07p7- pret ALL CD2pOl. a/neb CD5PO' a/neb CD8pl intermediámí T- ALL CDlapz zralá T-ALL C03PZ CD I aneg TCRa PO l T-ALL TCRyOPOz T-ALL TCRaP Ol TCRyPO' Tab. 2. Panely prtilátek. které pužíváme při diagnstice akutní leukemie v naší lab ratři. zákjadní panel T-ALL BCP -ALL AML i-mpo/i- D79acy/i-3 CD34/3817 CD 10/33119 Syt-16/33/45/34 i-tdt/mcd7 /rn3/i-3 i-c022 C065/2IHLADR CD 19/56/33/34 ;-CD22 COla (PE) C0101I3/19 C02l7/33/ TcRybrrcRa CD34/38/l 9 HLA ORJ38/3 3 C066c/l9 C07/NG2 CD79a i-cdi3 CD4/8/3 CD64/J 3 (pkud CD22/24 C0331l3 C020/l 0/19/34 je AHL skóre2) COI9/NG2 CD41 C099/7/5/3 Je-li TcRyOPOz CD64(pkud C042b CD I5/ 117/33/34 resp. TcRaPz, je AHL skóre 2) C06 1 stanvení DNA cyklu nastaví se V i-lgm/mcd19 glykfrin A (CD235a) res p _ V panel K/CD 19 CD65/33 IJCOl9 C033/NG2 mlgm Vys v ět1i v ky: m AHL sk(,re V runel v punel Syl- ltí pvrchvé značení intl'ucclulúmi značení viz text prtilátky prli jedntlivým typlijll V ň řctč l.cu prtilátky prli jedntlivým Vf) řetě7.c cl nu re scc n č ní barvi č ka, značící buňky bsahující DNA, pumáhá k dlišení drti CD22 je specifický znak pr B Iymfcytárni řadu, v časných fázích vývje je exprimván jen cytplazmaticky, k pvrchvé expresi dchází v nrmálním vývji v pzdních stadiích splu s IgD a CD21 (8, 9). U leukemií z B řady se vyskytuje ve 3/4 případů (bvykle call a preb ALL). Mlekula je příbuzná mlekule CD33. Testuje se terapeutický účinek prtilátky prti CD22 knjugvané s cytstatikem calicheamicinem u různých CD22ps malignit (l0). vývjvá stadia B -prekurzrů Další znaky ppisují v nrmální kstní dřeni vývj (CD 10, CD34, CD20, cytplazmatické TdT, pvrchvé i cytplazmatické IgM). COlO Znak COlO, tzv. CALLA i.lntigen, byl ppsán jak typický znak pr "cmmn

179 E. Me j stříkv,.-.-:s::tra:.:n:.:a=---=1..:: 6.:... 7?l ALL" (11-14). B lymfcyty v periferní krvi tent znak nemají, na rzdíl d většiny B-prekurzrů v kstní dřeni. Leukemické blasty jej nesu ve více než 95 %, velmi čast ve vyských mnžstvích (tzv. hyperexprese CDlO). V periferní krvijsll B buňky většinu CDlO negativní,jen malá subppulace je D 10 slabě pzitivní (tzv. transitinal B buňky). CDIO hyperexprese v perifcmí krvi je tedy specifická pr leukemii (br. 2). Nelú linivě specifický, vyskytuje se také u granulcytú (15) a ve stadiu krtikálníh thymcytu i v rámci vývje T řady. Část T-ALL je rvněž pz.itivllí, intenzita je ale zpravidla nižší než u BCP ALL (1 J). CD3..1 Z nak časných prgenitrů a kmenvých buněk. Není l i nivě specifický. Lm unglbulin M QgM), těž ký řetězec V nm1ální B lymfpéze je p úspě š né VDJ rekmbinaci nejprve exprimván tě ž ký ře t ězec IgM cytplazmaticky, pté je splu s VpreB mlekulu vystaven na 10' -r , některé ( 17). leukemie a lze prt využít pr sledvání MRN Aberantní znaky u B-lymfcytární řady Znaky m zené v nrmálním vývji pr jiné řady, ale vyskytující se čast na leukemických buňkách (18). CD66e CKOR-SA3544 antigen) Aktivačn í znak granulcytů, u nemaligních B prekurzrů se nevyskytuje, prt jej můžeme na B prekurzrech pvažvat za znak malignity (6). CD33. CD l3 Znak mncytů a granulcytů, aberantně se vyskytuje na BCP-ALL. CDl5, CD65 Znak granulcytů, aberantně se vyskytuje na BCP-ALL. NG2 Mlekula chndritin sulfátu, ve fyzilgické hematpéze tat mlekula není exprimvána. NG2 mlekula se aberantně vyskytuje u leukemií (ALL i AML) s přestavbu genu MLL (br. 3). 3 T-akutní lymfblastická 10' 10' leukemie CT-ALU Primárním místem 10' ' T lymfpézy je thymus, Ci Ci leukemické buňky však <.l <.l <.l 'O' 10' 10' cirkulují v periferní krvi a kstní dřeni. Přítmnst nezralých T lymfcytů 10\ 1 10' 10' IO J 10' C020 v periferní krvi či kstní Obr. 2. Obnizek vlev ukazuje nrmálni vývj B řady pdle exprese antigenu C020 a CO 10, uprstřed na dřeni tedy ukazuje na diagnózu pzadí nrmální KD (kntury) je zbrazena COlO negati vní prs ALL a vprav call. kde u většiny blastů T-ALL. Typic- je hyperexprcse CD 10. Všechny grafy j su 7. gam CD 19ps bun ě k S dpvídajícími ptickými vlastnstmi. ku známku malignity u T- ALL je kexprcse CD7 pvrch, cž spuští signalizaci umžňující prliferaci a CD5 na CD3 negativních buňkách neb kcxprese prekurzru s ú s pě š ně přes tavěným antigenním receptrem. CD4 a CD8 v periferní krvi neb kstní dřeni. Klasifikace leukemií pužívá detekci cytplazma tickéh IgM jak marker pr preb ALL, pvrchvé IgM Linivě specifické znaky pr T-lymfcytární řadu definuje zralu B-Ieukemii, která j nejméně bvyklá CD7 a liší se prgnózu i léčbu. CD7 je glykprtein exprimvaný na zralých T lymfcytech, CD20 NK buňkách a thymcytech, ale i na některých se bjevuje zhruba paralelně s dknčením přestavby nediferencvaných prgenitrech. Je t senzitivní martěžkéh řetězce a s jeh cytplazmaticku expresí. U leukemií je čast přítmen, někdy asynchrnně s hyperex 10' I D' presí CD 10. Z pravidla je pzitivní jen na subppulaci 10' 10' blastů, cž. limituje eventuální využ.ítí specifické anti CD20 léčby u BCP-ALL. Zralá B-ALL je typicky vysce pzitivní. (') (') W W ' ' N N z Z Tenninální dexy-nukletidyl transferáza CTdT) Cytplazmatická TdT je typicky přítmna u leukemických bullěk, v nrmální kstní dřeni se vyskytuje jen u malé subppulace pre kurzrů (především CD až ++), lze využít pr dlišení maligní a nemaligní B lyrnfprliferace. CD58 Je znak nespeeifiek)! pr B řadu, ale jeh vyská exprese splu s vysku expresí CD 10 je charaktelistická pr 10' 10' 10' ",',, C019 10' C019 Obr. 3. Aberantní exprese NG2 na BC? ALL blastech u pacientky kjenecku ALL s prkázaným fú zním genem MLUAF4 (vlev). Vprav brázek u téže pacientky 2 rky d diagnózy nem c n ě n í v kmpletní remisi a negati vním různím genem MLUAF4. Je zře t e lné nenulvé pzadí v regenerující KO, které limituje vyui ití při detekci MRN. 10'

180 E. Mejstříkvá, strana 168 ker T-ALL, ale není specifický, jelikž jej exprimují také n ěkteré typy myelidních leukemií. Malá část nezralých prgenitrů ve fyzilgické KD je CD CD3 CD3 je sučástí kmplexu T-bun ěč néh receptru (TCR). CD3 je exprimván v cytplazmě časnými thymcyty. Cytplazmatická exprese CD3 je základním znakem, který zařazuje buňky k T řadě. CDS.í! C02 Znaky CD2 a COS jsu exprimvány na thymcytech a zralých T Iymfcytech. COS také definuje pdskupinu B Iym f cytů (tzv. T independentní BI lymfcyly). CD2 nalézáme také na NK buňk ác h. Oba antigeny jsu exprimvány na více než 90 % T-ALL a pužíváme je jak pdpůrn é znaky. C0 2 je aberantně exprimvána u čás ti AML, typicky u AML M3v (6). Znaky definující vývjvá stadia a fu nkční pdskupiny,04 Znak definující "T-helper" pdskupinu T lymfc y tů v periferní krvi, zárveň je exprimván také mncyty. V thymu se bjevuje nejprve u dvjitě pzitivních thymcytů (splu s COS). Je kreceptrem kmplexu CD3-TCR. Bývá pzitivní u AML s mncytárním vyzráváním. C08 Definuje cyttxické T lymfcyty (antigen specifické z abij eč e). V thymu se bjevuje nejprve u dvjitě pzitivních thymcytů (s plu s CD4). Je kreceptrem kmplexu C0 3-TCR. TCRcd3 TCRyO T-buně č ný receptr, je základním nástrjem T bun ěk při specifickém rzeznávání antigenů. D 1a Je znak exprimvaný nezralými T Iymfcyty v thymu. Definuje intermediární T-ALL (19). Q222 CD99 je exprimván na řadě hematpetických bun ě k i prgenitrů, v případě thymcytů a T-ALL je exprese kvantitativně zvýšená (20). '0' 10' 1O',,' '" u '0 '" u 1O' 1O' '0 Sledvállí prů běhu léčby Sučasný přístup k sestavvání l éčebných prtklů ALL pužívá strategii terapie šité na míru rizika selhání léčby. Jedním z parametru je dpvěď na léčbu. Již přes dvě dekády se hdntí rychlst redukce pčtu blastů při prednisnvé předf ázi. Nyní se zavádí v některých prtklech detekce minimální reziduální nemci (MRN) v průběhu terapie jak kritérium pr přeřazení mezi rizikvými skupinami. K detekci MRN se pužívá metda kvantitativní P R a zatím puze výzkumně také průtkvá cytmetrie. Ne dcela vyřešeným prblémem aplikace cytmetrie ve sledvání MRN je značná pdbnst leukemických buněk a regenerujících B-Iymfcytů, které v některýc h časvých bdech terapie tvří významné pzadí. Pr klinicky pužitelné měření MRN je třeba detekvat leukemicku buňku na pzadí až buněk. Zlepšení specifity čekáváme d zavedení mnhbarevných prtklů (více než 4 flurescenční znaky). Nvé prediktry Studie expresníh prfilvání (EP, expressin prfi!ing, gene chi ps, micrarrays) přinášejí data expresi deseti ti s íců genů. Jejich vyhdncením je mžné hledat skupiny (například ALL pacientů), které mají pdbné expresní vzrce ("expressin patterns"), tzn. je pr n ě charakteristická exprese některých ge nů, neb hledat geny, které jsu typické pr jedntlivé skupiny (a vztahvat je k bilgii, leukemgenezi a prgnóze) (21). Odhady pčtu genů, které jsu kličvé pr idcntifikaci určité skupiny pacientů ( např. gentypvé a rizikvé), se liší. Někteří autři předpkládaji, že ge nů určujících např. gentypvé pskupiny nemusí být více než 20 (např. Dwning (22). Takvý pčet genu, či dpvídajících prteinů je ptm mžné studvat metdami mlekulární bilgie (RT-PCR) či prutkvé cytmetrie. Průtkvá cytmetrie má výhdu simultánníh stanvení více mlekul na jedné buňce a relativní nenárč n s ti na kvalitu, mnžství vzrku a na prvedení. V naší studii využíváme dat z EP k nalezení těc ht klíčvých mlekul. Pda ři l se nám nalézt dvě mlekuly (CD44 a CD27) předpvídající přítmnst fúzníh genu TEL/AMLl (23). Chen et al. (17) navrhli na základě dat z EP detekci mlekuly CDS8 při vyšetřvání minimální residuální nemci. Stále se také intenzivně pracuje na standardizaci EP pr diagnstické účely, ale jak racin á lnější se jeví využití tét metdy pr výzkumné účely a pr nalezení nvých diagnstických a prgnstických znaků. Závěr O br. 4. Srvnání imunfentypu nemaligních T lymfcytll (v kntunich) a intermcdiámí T-ALL (zvýraz.něná ppulace bdélníkem). Na levém brázku (kmbinace CD99/7/S/3, gate CD7p<Jl bez hyperexprese CDSI"'z pr kntury a CD7 ""S,I'Ibé pol CD99++) typicky vyská exprese CD99 a nízká až' negativní pvrchvá CD3. Na pravém brázku kexprese CD4 a CD8 z kmbinace CD4/8/3. Vhdné a metdicky dbře prvedené pužití průtkvé cytmetrie má významnu rli pii diagnstice a diferenciální diagnstice leukemie. lmun[cntypizací dlišíme nemaligní prekurzry d leukemických buněk v aspirátu petifemí krve. Na základě linivě specific- kstní dřeně či

181 E. Mejs tříkvá, strana 169 kých znaků stanvíme typ leukemických buněk. Další znaky definují srupdí zralsti a můžu před pvědět i rizik selhání terapie. Mnhbarevná průtkvá cytmetrie je výzkumn ě pužívána k vyhledávání a stanvení prediktivní hdnty dalších mlekul a ke sledváni MRN. Seznam pužitých zkratek KD Bep MRN TCR ALL AML MLL kstní dřeň B cell precursr minimální reziduální nemc T cell receptr akutní lymfblastická leukemie akutní myelidní leukemie mixed Iineage leukemia Práce byla pdpřena grantem lga MZ CR Pděkváni Výsledky jsu umžněny spluprací všech center v rámci Pracvní skupiny pr dětsk u hematlgii (B. Blažek, Z. Cerná, Y Jabali, V Mihál, D. Prcházkvá, 1. Sta rý, 1. Stěrba, 1. Hak, K. Tušvská). LabrantkLim a labrantům Ústavu imunlgie a Kliniky dětské hematlgie a nklgie za pmc při získávání a analýze dat (1. Ridškvá, K. Pspíšilvá, L. Gndrčínvá, D. Thurner, P Semerák, K. Mužíkvá, L. Řezníčkvá, K. Krejčíkvá, A. Brabencvá). Literatura I. Uekun FM, Sathcr fln, Gaynn PS, Arlhur DC, lligg ME, Tubergen DG, cl a l. Clinical Features and Trentrnent Outcme f Child ren With Myelid Antigen Psitivc Acute Lymphblastic Leukemia: A Reprt Frm the Children's Cancer Grup. Bld 1997; 90( I): Putti MC RndeW R Ccit MG, Aric M, Sainati L, Cnler V, et al. Exp'ressin f MyeliďMarkers Lacks Prgnstic Impact in Children Treated fr Acute Lymphblastic Leukemia: Italian Experience in AIEOP-ALL Studies. Bld 1998; 92(3): iles F, Estey E, O'Bnen S. Ge mtu Lumab zgamicin in the treatment f acutc myelid leukemia. Cancer 2003; 98( I O): Mejstrik\'a E, Kalina T, Trka J, Stary J, Hrusak O. Crrelatin f CD33 with prer prgnsis in childhd ALL implicates a ptential f anti-cd33 frntl ine th erapy. Leukemia 2005; 19(6): cne MC, Castldi G, Knapp W, Ludwig WD, Matutes E, Orfa A, et al. Prpsnls fr thc immunlgical c1assíficatin f acute leukemias. Eurpcan Grup fr the Immunlgical Characte rizatin f Leukemias (EGll..). Leukemia 1995; 9(10): Hrl 'ak 0, Prwit-MacDnald A. Antigen expressin pattems rcflectin gentype f acute Iellkemias. Leukemia 2002; 16(7): Dwrwk MN, l"ritsch G, F rschl G, Printz D, Gadner H. Furclr flw cytmetric investigalin f termi nal dexynucletidyl transferase-psi tive Iymphid precursrs in pediatric bne marrw: CD79a expressin precedcs CD 19 in early B-cell ntgeny. Bld 1998; 92(9): Lken MR, Shah VO, Dattili KL, C i\'in Cl. Flw cytmetric analysis f human bne nwnw. ll. Nrmal B Iymphcyte develpment. Bld 1987; 70(5): Clernan M, Gldenberg DM, Siegel AB, Ketas JC, Ashe M, Fire JM, et a l. Epraruzumab: Targeting B-Cell Malignancies thrugh CD22. Clin Cancer Res 2003; 9(10): DiJseph J l", Armellin D, 8 0ghaert ER, KJlandke K, Dugher MM. Sridharan L, ct al. Antibdy- targeted chel11lherapy with CMC-544: a CD22-targeted immuncnjugale l' calicheamicin f r the treatment f B-Iymphid malignancies. Bld 2004; 103(5) ll. Sbipp MA, Slefan GB, Switzer SN, G riffin r, Reinher.t EL. CD to (CALLA)/neutral endpeptidase mdlllates innarrunatry peptide-induced changes in neutrphil mrphlgy, migrdlin, and adhesin prteins and is it elť regulated by neutrphil activatin. B ld 1991; 78(7): Shipp MA, Slefan GB, D' damí L, Switzer SN, Hward FD, Sinisterra J, et al. Dwru'egulatin f enkephalin-mediated innammatry respnses by CD 10/neutral endpeptidase Narure 1990; 347(629 1) Letarte M, Vera S, Tran R, Addis J8, O nizuka RJ, Quackenbush EJ, et al. Cmmn acute Iymphcytic leukemia antigen is identical t neutral endpeptidase. J Exp Med 1988; 168(4): Brwn G, Greaves MF, Lister TA, Rapsn N, Papamichael M. Expressin f human T and B Iymphcyte cell -surface markers n leukaemic cells. Lancet 1974; 2(7883): Bene Me. lrrununphentyping f acute leukaemias. lmmunl Len 2005; 98(1): Barcena A, Muench MO, Galy AH, Cupp J, Rncarl MG, Phillips JH, et al. Phentypic and functinal analys is f T-cell precursrs in the human fetal liver and thymus: CD7 express in in the early stages f T- and myelid-cell develpment. Bld 1993; 82(11): C hen JS, Custan-Smíth E, Suzuki T, Neale GA, Mihara K, Pui CH, et al. ldentificatin f nvel markers fr mnitring minimal residual disease in acu te Iymphblastic leukemia. Bld 2001; 97(7): Kalina T, Vask\'a M, Mejstrik\'a 1:. Madz J, Trka J, Sl<Iry J, et al. Myelid antigens in childhd IYll1phbla'tic leukemia: clinical data pint t regulatin f CD66c di stinct frm ther myduid antigcns. BMC Cancer 2005; 5( I): Res P, Bim B, Hri T, Weijer K, Spits H. Dwnregulatin f CD I Marks Acquisitin f Functinal Maturat in f Human Thymcytes and Defines a Cntrl Pint in Late Stages f Human T Cell Devclpment. J Exp Med 1997; 185(1): Dwnak MN, Frschl G, Prinlz D, Zen LD, Gaipa G, Ratei R, et al. CD99 expressin in T-lineage ALL: implicatins f r flw cytmetric detectin f minimal residual disease. Leukemia 2004; 18(4): Yeh E-J, Rss ME, Shurtleff SA, Williams WK, Patel D Mahfuz R, el al. Class ificatin, subtype discvery, and predictin f utcme in pediatric acutc Iymphblastic leukemia by gene cxpressin prfiling. Cancer Cell 2002; 1(2): Carrll WL, Bhjwani D, Min DJ, Raetz E, Rdling M, Davies S, et al. Pediatric acute Iymphblastic leukemia. Hematlgy (Am Sc Hematl Educ Prgram) 2003: Vask\'a M, Mejslrik\'a E, Kalina T, Martinkva P, Omelka M, Trka J, et al. Transfer f genmics infrmmin t flw cytmetry: expressin f CD27 and CD44 discriminates subtypes f acute Iymp hblastic leukemia. Leukemia MUD" Tmáš Kali"a. Ph.D. Klinika dě l ské hemarlgie a nklgie LF2UK a FN MOll CLlP-Childhd leukemia In ves/ig(uin pj"{//ur V Úvalu 84, Praha Krespndenční u/r: MUD/: Esrer Mejslríkvá Klinika dětsk,l hemallgie a nklgie LF2 UK a FN MOIOI V Úv,,11I84 /5006 Pr,,110 5 e-m.il: esle/:1i1ejs/rikl'a@!{mll.culli.cz Ddcín: 5. I Nijat: 23. J. 2006