RNA interference - účinný nástroj regulace genové exprese

Transkript

1 BIOLOGICKÉ LISTY 70 (3): , 2005 RNA interference - účinný nástroj regulace genové exprese SOŇA ŠTRUNCOVÁ, ROMANA BORSKÁ, BRANISLAV KUSENDA, PAVEL MEJSTŘÍK, DANA DVOŘÁKOVÁ, JIŘÍ MAYER, ŠÁRKA POSPÍŠILOVÁ * Centrum molekulární biologie a genové terapie, Interní hematoonkologická klinika, Fakultní nemocnice Brno, Černopolní 9, Brno, * sarka.pospisilova@fnbrno.cz Přijato do tisku Úvod a objev RNA interference Mechanismus RNA interference sirna mirna Další způsoby regulace genové exprese Protismyslové oligodeoxyribonukleové kyseliny (ODN) Ribozymy Srovnání RNAi s dalšími metodami utlumování genové exprese Způsoby vnesení sirna do cílových buněk Expresní vektory pro si/shrna RNA interference jako nástroj funkční genomiky Terapie založená na RNAi Úvod a objev RNA interference První zmínky o existenci procesu utlumování až umlčování genové exprese, který se nyní nazývá RNA interference, se objevily koncem 80. let 20. století v publikacích zabývajících se geneticky modifikovanými rostlinami. Pokusy o intenzivnější fialové zabarvení petúnií zvýšením hladiny enzymu zapojeného do syntézy pigmentu neočekávaně vyústily ve vznik velkého množství bílých květů. Vnesení několika dalších kopií genu způsobilo snížení jeho exprese, ačkoliv se předpokládal opak (Napoli et al. 1990, Van der Krol et al. 1990). Použité zkratky: dsrna - dvouvláknová RNA; IFN - interferon; mirna - mikrorna; ODN - protismyslové oligodeoxyribonukleotidy; pre-mirna - ~70 kda mirna prekurzor; pri-mirna - dlouhý primární transkript mirna; RISC (RNA-induced silencing complex) - umlčovací komplex indukovaný RNA; RNAi - RNA interference; shrna - krátké vlásenkové (hairpin-like) dsrna; sirna (small interfering RNA) - malá interferující RNA; strna (small temporal RNA) - malá dočasná RNA; 3 UTR - 3 nepřekládaná oblast; 5 UTR: 5 nepřekládaná oblast. * korespondenční autor 231

2 S. ŠTRUNCOVÁ et al. V roce 1998 se Andrew Fire a Craig Mello se spolupracovníky pokusili indukovat sekvenčně specifickou degradaci cytoplasmatické mrna injekcí dsrna obsahující stejnou sekvenci jako cílová mrna u hlísta Caenorhabditis elegans. Zjistili, že utlumení exprese cílového genu je účinné i při malých dávkách injikované dsrna, avšak pokud má dsrna promotorovou nebo intronovou sekvenci, pak k utlumení nedochází. Vznikl tak nový termín RNA interference (RNAi), jenž popisoval schopnost dvouřetězcové RNA (dsrna), použité ve zmíněných experimentech, degradovat mrna komplementární k jednomu z řetězců vnesené dsrna (Fire et al. 1998, Montgomery et al. 1998). Objev RNAi u hlístů a dalších organismů tedy vysvětlil již dříve popsané posttranskripční umlčování genů (PTGS) u rostlin a hub. Poté, co byl stejný jev pozorován i u prvoků a většiny testovaných vyšších eukaryot, začala být RNAi intenzivně studována jako významný přirozený mechanismus regulace genové exprese i jako obranný mechanismus buňky proti virům a transposonům. Vzhledem k možnosti využití vlastností RNAi k rozpoznání, odlišení a specifické inaktivaci mutantních nebo chimerních molekul mrna se tento jev stal účinným nástrojem funkční genomiky (Kennerdell a Carthew 1998, Ngo et al. 1998, Waterhouse et al. 1998, Cogoni a Macino 1999, Hannon 2002). 2. Mechanismus RNA interference Ačkoliv je mechanismus RNAi v detailech odlišný u různých organismů, jedná se o vysoce konzervovaný a evolučně starý mechanismus. Základním principem je štěpení dlouhé dvouvláknové RNA (dsrna) na krátké nepřekrývající se úseky, které rozpoznávají homologní mrna a indukují utlumení jejich exprese. RNA interference může být realizována dvěma způsoby, a to prostřednictvím tzv. small interfering RNA (sirna) indukujících degradaci cílových mrna nebo microrna (mirna), které ve většině případů inhibují proces translace. Obě tyto dráhy jsou biochemicky a geneticky odlišné sirna sirna vznikají v buňkách většinou štěpením dlouhých exogenních dsrna komplexem enzymů nazývaným DICER obsahujícím RNasu III, která štěpí dsrna na krátké sirna duplexy o délce nukleotidů vyjímečně i delších. Komponenty RNAi procesu specificky rozpoznávají sirna duplex a připojují jednotlivé sirna na proteinový komplex nazývaný RNA-induced silencing complex (RISC). Thermodynamická stabilita několika prvních párů basí sirna může ovlivnit poměr RISC molekul obsahujících jedno z komplementárních vláken sirna. Relativně nízká thermodynamická stabilita na 5 konci protismyslového vlákna ve srovnání s vysokou thermodynamickou stabilitou na 5 konci kódujícího komplementárního vlákna vede k vyšší tendenci začleňovat protismyslová vlákna do molekuly RISC, který na základě striktní komplementarity basí rozezná cílovou mrna a štěpí ji (zpravidla 10 nukleotidů od 5 konce začleněného vlákna sirna). Následně je taková mrna degradována a exprese daného genu utlumena, což se uplatňuje například u antivirové odpovědi buňky (Bernstein et al. 2001, Zeng a Cullen 2002) (obr. 1). 232

3 RNA INTERFERENCE - ÚČINNÝ NÁSTROJ REGULACE GENOVÉ EXPRESE Obr. 1. Mechanismus RNA interference. Dlouhá dvouřetězcová RNA (dsrna) je v buňce štěpena komplexem enzymů nazývaným DICER na krátké sirna duplexy o délce nukleotidů; alternativně mohou být sirna duplexy dodány do buňky uměle. sirna duplexy jsou poté včleněny do multiproteinového komplexu RISC (RNA-induced silencing complex). Tento komplex obsahuje helikasu, která oddělí řetězce sirna duplexu, a ribonukleasu, která po navázání sekvenčně specifické sirna štěpí cílovou mrna. Tím umlčuje expresi daného genu. Objasnění struktury sirna vedlo k hypotéze, že by sirna mohla efektivně redukovat genovou expresi u savčích buněk, aniž by spustila antivirovou interferonovou odpověď, což bylo potvrzeno in vitro na tkáňových kulturách (Bitko a Barik 2001, Caplen et al. 2001, Elbashir et al. 2001). Dlouhá dsrna nemá ve většině savčích buněk požadovaný efekt, protože indukuje nespecifickou interferonovou odpověď, která obvykle vede spíše k programované buněčné smrti (apoptose) než ke specifickému umlčování cílových genů (Stark et al. 1998). Z tohoto důvodu jsou pro cílené utlumení genové exprese využívány syntetické sirna (19-23 nt) nebo expresní vektory nesoucí odpovídající sekvenci, která se přepisuje do krátké vlásenkové (hairpin) RNA (shrna). sirna, resp. shrna může být tedy úspěšně využita ke specifické inhibici funkce vybraných cílových genů způsobujících např. nádorová onemocnění, AIDS nebo hepatitidu (Damm-Welk et al. 2003, McCaffrey et al. 2003, Stevenson 2003). Tato technologie se také uplatňuje jako účinný nástroj funkční genomiky pro identifikaci nových genů zapojených v regulačních drahách. Otázkou zatím zůstává, zda může být využita jako účinná terapeutická strategie (Knopfová a Šmarda 2005). 233

4 S. ŠTRUNCOVÁ et al mirna Dalším popsaným mechanismem regulace genové exprese v buňce, který má mnoho společného s mechanismy působení sirna, jsou mirna (microrna) - malé (~22 nt) nekódující RNA molekuly, které buňky přirozeně používají k negativní regulaci genové exprese na posttranskripční úrovni. Jestliže se setká se zcela komplementární sekvencí, může se mirna molekula chovat jako sirna a spustit degradaci komplementárních mrna (obr. 2). Obr. 2. Regulace genové exprese pomocí mirna. Geny pro mirna jsou transkribovány do primárního transkriptu (pri-mirna), který je rozpoznán komplexem Microprocesor a tímto upraven na mirna prekurzor (pre-mirna). Ten je pomocí exportinu-5 přenesen do cytoplasmy, kde je dále upraven pomocí enzymového komplexu DICER na mirna*/mirna duplex. Následně dojde k oddělení obou řetězců duplexu neznámou helikasou a k inkorporaci mirna molekuly do multiproteinového komplexu mirnp, který umožní vazbu mirna na 3 UTR cílové mrna. Tím je zprostředkována represe translace. Mezi první objevené mirna patří tzv. strna (small temporal RNA) produkty genů lin-4 (lineage-4) a let-7 (lethal-7), které byly identifikovány genetickou analýzou Caenorhabditis elegans (Lee et al. 1993, Reinhart et al. 2000). Jsou to klíčové regulační molekuly, které kontrolují přechod mezi jednotlivými vývojovými stádii prostřednictvím neúplné vazby na 3 UTR mrna příslušného genu (Pasquinelli et al. 2000). lin-4 RNA se specificky váže na 3 UTR mrna lin-14 a lin-28, inhibuje jejich translaci a umožňuje tak přechod z prvního larválního stadia (L1) do druhého (L2) a z druhého do třetího (L3) (Lee et al. 1993, Moss et al. 1997). Podobně let-7 RNA se váže na 3 UTR lin-41 a hbl-1 234

5 RNA INTERFERENCE - ÚČINNÝ NÁSTROJ REGULACE GENOVÉ EXPRESE (lin-57) a kontroluje tak přechod ze čtvrtého larválního stadia (L4) do stadia dospělce (Reinhart et al. 2000, Abrahante et al. 2003, Lin et al. 2003). Geny pro mirna se často vyskytují ve shlucích (cluster) a jsou exprimovány jako jedna transkripční jednotka (Lagos-Quintana et al. 2001). Pomocí dosud neznámé RNA polymerasy (pravděpodobně RNA polymerasa II) jsou transkribovány do dlouhého polycistronního primárního transkriptu (tzv. pri-mirna), který vstupuje do jaderného multiproteinového komplexu zvaného Microprocesor, jehož klíčovými složkami jsou specifická endonukleasa Drosha a RNA vazebný protein Pasha (Partner of Drosha) (Denli et al. 2004, Gregory et al. 2004). Pri-miRNA je upravena pomocí enzymu Drosha na ~70 kda prekurzory, jež jsou tvořeny neúplnou vlásenkou se smyčkou (pre-mirna) a mají na 3 konci charakteristický 2 nt přesah (Lee et al. 2002b, 2003). Tento přesah je pak rozpoznán jaderným exportním faktorem exportin-5 a prekurzor je přenesen do cytoplasmy (Yi et al. 2003, Lund et al. 2004), kde je dále upraven pomocí stejného enzymu DICER, který se podílí na tvorbě sirna molekul. RNasa III štěpí prekurzor ve fixní vzdálenosti ~21-22 nukleotidů od konce vytvořeného enzymem Drosha a vytváří tak mirna/mirna* duplex. V současné době není jednotný názor, zda dojde nejprve k oddělení obou řetězců neznámou helikasou a následně k inkorporaci finální jednořetězcové mirna do multiproteinového komplexu mirnp, nebo tento duplex přímo vstupuje do pre-mirnp komplexu, který se po odvinutí řetězců přemění na hotový mirnp (Schwarz a Zamore 2002, Ke et al. 2003, Mourelatos et al. 2002). Druhý ře tězec duplexu (mirna*) je degradován (Xu et al. 2004). Většina autorů se přiklání k první možnosti, proto i obrázek (obr.2) vychází z této skutečnosti. V obou případech však mirnp umožní vazbu mirna na 3 UTR cílové mrna a zprostředkuje tak sekvenčně-specifickou represi translace. Je tvořený molekulou mirna, komplementární mrna molekulou a členy proteinové rodiny Argonaute (translační iniciační faktor eif2c2), s nimiž u savců společně imunoprecipitují helikasy Gemin3 a Gemin4 (Mourelatos et al. 2002). Jednotlivé geny pro mirna, které nejsou součástí shluku genů, jsou exprimovány jako monocistronní nascentní transkript, který je však delší než polycistronní pre-mirna a musí být tedy upraven na tuto formu, která je důležitá pro rozpoznání a přenos exportními faktory. Většina z dosud identifikovaných molekul živočišných mirna není plně komplementární s cílovými mrna, což naznačuje, že tyto mirna nejsou zapojeny v RNAi, ale inhibují genovou expresi na úrovni translace (Hutvagner a Zamore 2002). Odlišná situace nastává u rostlin, jejichž mirna jsou naopak téměř úplně komplementární s cílovými mrna a mohou tak, podobně jako sirna, zprostředkovat degradaci mrna mechanismem podobným RNAi (Rhoades et al. 2002). K dnešnímu dni bylo popsáno téměř 116 mirna u C. elegans, 79 u C. briggsae, 78 u D. melanogaster, 114 u A. thaliana, 230 myších, 191 krysích a 227 lidských (viz mirna registry avšak pouze u některých z nich je známa jejich biologická funkce. Řada laboratoří se proto věnuje převážně identifikaci cílových genů, která je však (hlavně u živočichů) složitá v důsledku nekompletního párování mezi mirna a cílovými mrna. 235

6 S. ŠTRUNCOVÁ et al. Mezi známé funkce mirna molekul patří např. kontrola proliferace buněk, buněčné smrti a metabolismu tuků u Drosophily (Brennecke et al. 2003; Xu et al. 2003), neuronální patterning u nematod (Johnston a Hobert 2003), modulace diferenciace hematopoetické vývojové linie u savců (Chen et al. 2004) nebo kontrola vývoje listů a květů u rostlin (Aukerman a Sakai 2003, Palatnik et al. 2003). Postupné pochopení celé biogenese mirna umožňuje propojení tohoto procesu s řadou onemocnění a molekuly mirna tak získávají silný terapeutický a diagnostický potenciál. Značné množství experimentů potvrzuje teorii, že se mirna nějakým způsobem podílejí na vývoji řady malignit. Například Calin et al. (2002) prokázali sníženou produkci a/nebo úplnou absenci mir-15a a mir-16a u většiny (68 %) pacientů s chronickou lymfatickou leukemií (B-CLL). Oba odpovídající geny se nacházejí na chromosomu 13q14, což je oblast deletovaná ve více než polovině případů a představuje tak nejčastější chromosomální abnormalitu u B-CLL. Stejně tak je tato oblast deletována u 50 % případů lymfomu plášťové zóny, u % mnohočetného myelomu a u 60 % nádorů prostaty, což naznačuje, že by tyto mirna mohly představovat významné nádorové supresory (McManus 2003, Calin et al. 2004). Sníženou produkci mají také mir-143 a mir-145 u kolorektální neoplasie (Michael et al. 2003) a let-7a u plicních nádorů (Takamizawa et al. 2004). U jiných typů nádorů je naopak exprese genů pro mirna nepřiměřeně zvýšená a mirna tak mohou získat funkci onkogenů. To je případ mir-155, která vzniká ze sekvence přítomné v BIC RNA. Hladina této RNA je zvýšená u Hodgkinova lymfomu (van den Berg et al. 2003), u dětského Burkittova lymfomu (Metzler et al. 2004) a u lymfomu vyvolaného ptačím virem (Tam et al. 1997). 3. Další způsoby regulace genové exprese Ve snaze vytvořit terapeutika, která by specificky ovlivňovala expresi vybraných genů, bylo již před objevením mechanismu RNA interference vyvinuto několik typů molekul (Knopfová a Šmarda 2005). Byly to především chemicky modifikované protismyslové oligodeoxyribonukleové kyseliny a ribozymy, ale i další obdobné molekuly, jako např. peptidové nukleové kyseliny (PNA) a DNAzymy (Scherer a Rossi 2003) (tab.1) Protismyslové oligodeoxyribonukleové kyseliny (ODN) ODN jsou molekuly dlouhé asi 20 nukleotidů, jejichž sekvence je komplementární k cílové mrna. Specificky utlumují genovou expresi různými mechanismy. Buď přímou hybridizací s pre-mrna či mrna vytváří hybridní duplex, který je rozpoznáván ribonukleasou H (Rnasa H), štěpící pouze vlákno mrna, nebo mohou inhibovat posttranskripční úpravu pre-mrna blokováním sestřihu (Kurreck 2003). V některých případech vytváří s cílovou DNA trojšroubovicí (triplex), která brání následné transkripci (Uil et al. 2003). 236

7 RNA INTERFERENCE - ÚČINNÝ NÁSTROJ REGULACE GENOVÉ EXPRESE Tab. 1. Relativní srovnání protismyslových (antisense) technologií (podle Scherer a Rossi 2003) Postup Výhody Nevýhody Protismyslové ODN Ribozymy DNAzymy RNAi Mohou být modifikovány, aby se zvýšila specifita a účinnost Mohou být cíleny do intronů Jednoduchá příprava Mohou rozeznat SNP Mohou být použity pro korekci defektů Lze připojit sekvenci pro změnu cílové RNA Jednoduchá katalytická doména Mohou být cíleny do intronů či buněčných organel Levná výroba Dobré katalytické vlastnosti Mohou být modifikovány pro systémové podávání Účinné i v nízkých koncentracích Obchází interferonovou odpověď Mohou být podány různými způsoby Možnost tkáňové specifity Pravděpodobně nejsou toxické Dlouhodobý efekt Mohou spustit interferonovou odpověď Vážou se na proteiny Dají se podávat pouze exogenně Mají i necílené účinky Potřebují GUC triplet, což limituje výběr potenciálních cílů Vážou se na proteiny Pouze exogenní aktivita Mají i necílené účinky Nemohou utlumit jaderné RNA Nemohou být cíleny do intronů Nemohou být jednoduše optimalizovány Někdy mají nespecifické účinky, které však lze omezit vhodným návrhem sirna sekvencí 3.2. Ribozymy Ribozymy jsou RNA molekuly s katalytickou funkcí a mohou mít více aktivit. Jsou tvořeny v buňce během transkripce nebo do ní mohou být vpraveny experimentálně. Některé ribozymy se vážou na RNA na základě komplementarity basí a degradují cílové mrna katalytickou hydrolýzou fosfodiesterové vazby (Doudna a Cech 2003). Existuje několik různých typů ribozymů, z nichž je nejlépe prozkoumaný kladivový (hammerhead) ribozym, který při hybridizaci s cílovou mrna vytváří specifickou sekundární strukturu. Účinek ribozymu je mimo jiné závislý na struktuře cílové mrna a na její dostupnosti v buňce (Michienzi a Rossi 2001, Kuwabara et al. 2002). Kladivové ribozymy mohou být vytvořeny jak cestou chemické syntézy, tak přepsány z vektorů, které umožňují jejich konstitutivní nebo inducibilní produkci v buňce (Good et al. 1997). 4. Srovnání RNAi s dalšími metodami utlumování genové exprese Několik pracovních skupin srovnávalo rozdílné mechanismy umlčování genů prostřednictvím ODN a sirna na modelech tkáňových kultur (Bertrand et al. 2002, Kretschmer-Ka- 237

8 S. ŠTRUNCOVÁ et al. zemi Far a Sczakiel 2003, Miyagishi et al. 2003, Vickers et al. 2003). Účinnost umlčování genů závisí na koncentraci aktivního agens, technice transfekce, typu buněk, chemické modifikaci a na fázi buněčného cyklu, ve které byla data analyzována - jedná se tedy o multifaktorový proces (Harborth et al. 2003, Schwarz et al. 2003). Bylo zjištěno, že RNA vazebné proteiny a rozsáhlé sekundární a terciální struktury v mrna ovlivňují schopnost hybridizace oligonukleotidů a sirna k cílovým mrna a tím účinnost regulace genové exprese (Harborth et al. 2003, Kretschmer-Kazemi Far a Sczakiel 2003, Vickers et al. 2003). sirna jsou účinnější a působí déle, avšak utlumení mnohdy nastává dříve u oligonukleotidů ODN různých typů (Bertrand et al. 2002, Kretschmer-Kazemi Far a Sczakiel 2003, Miyagishi et al. 2003). Odhaduje se však, že tzv. hodnota IC 50 (tj. 50 % maximální inhibiční hladiny) je u sirna 100 až 1000-krát nižší než u optimálního fosfothionátem modifikovaného oligodeoxynukleotidu směrovaného proti stejnému cíli (Eckstein 2000, Kretschmer-Kazemi Far a Sczakiel 2003, Miyagishi et al. 2003). Ačkoliv systematické a dostatečně rozsáhlé srovnání účinnosti umlčování ribozymy a/nebo DNAzymy a sirna ještě nebylo provedeno, dosavadní experimenty naznačují, že sirna jsou mnohem účinnější než ribozymy a DNAzymy (Lee et al. 2002a). Obecným problémem utlumování genové exprese jsou nespecifické účinky vnesené molekuly, a to především tzv. off-target efekty a interferony (IFN). Nízká koncentrace sirna dostatečná k účinnému umlčení genu a skutečnost, že sirna jsou specificky a rychle začleněny do RISC, však snižuje potencionální možnost nespecifické vazby. Přesto se ukázalo, že aplikace některých sirna u savčích buněk může působit nespecificky na genovou expresi v závislosti na koncentraci, způsobu exprese sirna, typu buněk a dodaném reagentu. Tyto nespecifické účinky mohou vést ke stimulaci skupin genů zapojených do IFN odpovědi buněk. To potvrzují i microarray analýzy HeLa buněk transfekovaných dlouhou dsrna nebo ošetřených IFN či vysokou koncentrací luciferasové sirna (200 nm) (Bridge et al. 2003, Sledz et al. 2003, Presengiev et al. 2004). Jestliže sirna nejsou vhodně vybrány, mohou působit jako endogenní mirna a potlačovat translaci nebo spustit degradaci mrna s neúplnou komplementaritou. Nedávno publikovaná studie srovnávající profily genové exprese tvořené různými sirna cílenými proti stejnému transkriptu odhalily, že v extrémních případech jen 11- až 14-ti nukleotidová komplementarita mezi 5 koncem sirna řetězce a mrna může opakovaně způsobit snížení hladin transkriptů (Doench et al. 2003, Jackson et al. 2003, Saxena et al. 2003, Zeng et al. 2003). Jestliže jsou však protismyslové sekvence pečlivě vybrány, jsou ODN, ribozymy, DNAzymy a sirna schopny selektivně potlačit expresi jednotlivé alely, která se liší od jiné i jen jediným nukleotidem (Harborth et al. 2001, Martinez et al. 2002, Miller et al. 2003). 5. Způsoby vnesení sirna do cílových buněk RNAi je nyní běžně užívána v biologickém a biomedicinském výzkumu k efektivnímu utlumení exprese vybraných genů, avšak hlavním problémem pro terapeutické aplikace je způsob dodání sirna do cílových buněk. Do C. elegans lze sirna vpravit velice jednoduše několika postupy: injekcí, namáčením v roztoku obsahujícím sirna nebo krmením 238

9 RNA INTERFERENCE - ÚČINNÝ NÁSTROJ REGULACE GENOVÉ EXPRESE hlístů bakteriemi nesoucími plasmid exprimující sirna. Dodání sirna do savčích systémů je mnohem obtížnější. Úspěšné vnesení sirna, plasmidů nesoucích sekvence kódující shrna nebo virových vektorů produkujících sirna do savčích modelových organismů bylo provedeno různými metodami, jako např. elektroporací či lokálními nebo systemovými injekcemi (Matsuda a Cepko 2003, Kong et al. 2004). První úspěšnou metodou dodání sirna do vysoce vaskularizované myší tkáně byla vysokotlaká injekce sirna ve fyziologickém roztoku do ocasní žíly, což způsobilo až 90 % redukci exprese cílových genů v játrech, v menší míře v plicích, ledvinách, slezině a pankreatu. Jestliže by se sirna použila pro terapeutické účely, musí být vyvinuty metody tak, aby umožnily postupné dodávání sirna in vivo. Nedávno objevené malé molekuly, které zvyšují transdermální penetraci, by mohly být potenciálně použity pro systemové podání sirna transdermální náplastí (Karande et al. 2004). Alternativou jsou také například aerosolové metody podobné těm, které byly použity pro dodání genů do plic (Gautam et al. 2000). 6. Expresní vektory pro si/shrna Účinným způsobem zavedení sirna do buněk je využití expresních vektorů, jako jsou plasmidy nebo upravené viry, určené k přímé produkci krátkých sirna a/nebo krátkých vlásenkových shrna sekvencí v buňce. shrna díky přítomnosti dvou komplementárních sekvencí oddělených smyčkou (sense-loop-antisense) tvoří vlásenky, které v buňce rozpoznává enzym DICER, jenž odštěpí smyčku, čímž dojde k vytvoření sirna duplexů. Jiným přístupem je použití vektoru exprimujícího ze dvou samostatných promotorů 19-21nt ssrna, které na základě komplementarity hybridizují, a tak vytvoří funkční sirna. Další možností je použití dvou promotorů orientovaných proti sobě a oddělených sekvencí pro sirna, která pak vzniká transkripcí z obou vláken jednoho templátu (obr. 3). Z virových vektorů se nejčastěji používají konstrukty retrovirové, adenovirové a lentivirové (Brummelkamp et al. 2002, Xia et al. 2002, An et al. 2003, Arts et al. 2003, Rubinson et al. 2003, Shen et al. 2003, Zhao et al. 2003). Rekombinantní adeno-asociovaný virus může zprostředkovat vnesení a dlouhodobou expresi transgenu v dělících i nedělících se savčích buňkách. Virus se většinou nachází v episomální formě a v nízké frekvenci i náhodně začleněný do hostitelského genomu. Lentivirové vektory produkující sirna, které jsou schopny transdukovat nedělící se buňky, byly například použity k dodání sirna do embryonálních kmenových buněk k vytvoření knock-down myší. Celkově lze říci, že virové vektory jsou velkým příslibem nejen pro vývoj alternativních metod genové terapie významných lidských onemocnění, ale také pro studium funkce genů v savčích modelových systémech. 7. RNA interference jako nástroj funkční genomiky Schopnost RNAi relativně jednoduše utlumit expresi cílových genů umožnila použít vybrané sirna ke zjištění funkce řady genů i k utlumení těch genů, jejichž zvýšená exprese byla pozorována u různých onemocnění. Tento inhibiční efekt je jen vzácně 239

10 S. ŠTRUNCOVÁ et al. stoprocentní a obecně je nazýván knock-down na rozdíl od knock-out vzniklého delecí genu. RNAi umožňuje funkční analýzy i takových genů, jejichž knock-out by byl embryonálně letální a přípravu knock-down genů u dospělých jedinců. Stále významnější je možnost užití širokého spektra sirna sestrojených na základě znalosti kompletní sekvence genomové DNA jako nástroje pro screening funkce genů. Obr. 3. Exprese sirna v buňce. A - Krátká vlásenková RNA (shrna) obsahuje dvě komplementární sekvence oddělené smyčkou (sense-loop-antisense). Enzym DICER v buňce odštěpí smyčku z shrna, čímž dojde k vytvoření sirna duplexů. B - Vektor exprimuje z jednoho případně ze dvou samostatných promotorů 19-21nt ssrna, které na základě komplementarity hybridizují a tak vytváří funkční sirna. Knihovny RNAi mohou být využity jedním ze dvou způsobů. Prvním účinným způsobem je utlumení genové exprese vybraných genů jednorázově a možnost sledování reakce buněk nebo organismu. Druhý přístup využívá plasmidových nebo virových vektorů pro přípravu stabilních knock-down cílových genů při dlouhodobých studiích. Konstrukcí sady retrovirových vektorů kódujících odlišných shrna proti 7914 různým lidským genům byla vytvořena RNAi knihovna. Tato sbírka zahrnuje sirna cílené proti genům, jež jsou součástí buněčného cyklu, regulace transkripce, stresových signálních drah, důležitých biologických procesů biosyntézy, proteolýzy a metabolismu, a také geny související s nádorovými i jinými onemocněními. RNAi knihovna byla mj. využita k identifikaci jednoho známého a pěti nových modulátorů signální dráhy tumor-supresorového genu p53. Utlumené geny mohou být identifikovány sekvenováním RNAi vektorů vnesených do těchto buněk (Berns et al. 2004) nebo za využití sirna čipů. 8. Terapie založená na RNAi RNA interference je velice slibným nástrojem v biologickém i lékařském výzkumu, ale otázkou zůstává, zda najde využití i v klinické praxi. V principu může být RNAi využita k léčbě různých onemocnění, která jsou spojena se zvýšenou expresí známého 240

11 RNA INTERFERENCE - ÚČINNÝ NÁSTROJ REGULACE GENOVÉ EXPRESE genu - tedy především v boji s virovými, zánětlivými a nádorovými onemocněními. Na modelech tkáňových kultur už byla RNA interference úspěšně použita proti různým nádorovým buňkám či proti HIV, chřipce a poliovirům (Coburn a Cullen 2002, Gitlin et al. 2002, Damm-Welk et al. 2003, Ge et al. 2003, Stevenson 2003) (tab. 2). Tab. 2. Příklady genů utlumených pomocí sirna u savců (podle Dykxhoorn et al. 2003) Cílová mrna Funkce genu/proteinumetoda Fenotyp p24 Rev LTR mrna Poliovirový kapsid HPV E6 mrna RSV P protein Virus hepatitidy C Ras (V12) bcr-abl Fas receptor HIV-1 kapsidový protein HIV-1 regulační protein HIV-1 dlouhá koncová repetitivní sekvence Strukturní kapsidový protein Virový transkript E6 Fosfoprotein, který je součastí malé podjednotky RNAP Nestrukturní protein 5B, mrna virové polymerasy Mutovaný konstitutivně aktivní onkogen ras Onkogen, fúzní gen bcr a abl Proapoptotický Fas receptor Transfekce sirna; in vitro transkribovaná RNA Snížení produkce virových proteinů a virů; inhibice replikace HIV po fúzi, před reverzní transkripcí a transkripcí z intergrovaného proviru Transfekce sirna; Snížení produkce virových proteinů transkripce sirna a virů zprostředkovaná plasmidovým vektorem sirna transfekce; in vitro transkribovaná RNA Transfekce sirna Transfekce sirna Inhibice množení HIV po fúzi, před reverzní transkripcí a transkripcí z integrovaného proviru Snížení titru virových částic, vymizení viru z infikovaných buněk Selektivní degradace E6 mrna, akumulace p53 v buňce, utlumení buněčného růstu Transfekce sirna Inhibice produkce proteinu P, snížení hladiny všech virových proteinů, nedochází k tvorbě syncitia Hydrodynamická injekce sirna Exprese sirna zprostředkovaná retrovirovým vektorem Transfekce sirna Hydrodynamická injekce sirna Snížená hladina NS5B-luciferasového fúzního proteinu v myších hepatocytech CAPAN-1 buňky nebyly schopné tvořit kolonie v měkkém agaru ani nádory u myší po podkožní injekci Specificky snižují hladinu bcr-abl bez vlivu na samotný c-abl či a-bcr, inhibice buněčné proliferace způsobené bcr-abl Snížená hladina Fas receptoru v myších hepatocytech in vivo, zvýšená odolnost k apoptose zprostředkované Fas 241

12 S. ŠTRUNCOVÁ et al. Cílová mrna Funkce genu/proteinu Metoda Fenotyp CD4 Povrchový buněčný receptor, koreceptor HIV-1 Transfekce sirna CD25 IL2 receptor α Exprese sirna zprostředkovaná lentivirovým vektorem p53 Nádorový supresor Exprese sirna zprostředkovaná plasmidovým nebo retrovirovým vektorem Snížení infekce HIV-1, snížení titru volných virů Nižší produkce povrchového CD25, snížená proliferace T-buněk ošetřených IL2 Selekce buněk se stabilně knock-down expresí p53; různé p53 shrna vykazují různý stupeň utlumení exprese korelující s agresivitou lymfogenese indukované c-myc; ztráta senescence navozené Ras, růst v měkkém agaru Několik experimentů ukázalo terapeutické možnosti sirna na myších modelech, jako např. ochranu před fulminantní hepatitidou, virovou infekcí, sepsí, růstem tumoru a oční neovaskularizací způsobující degeneraci makuly (Li et al. 2003, Reich et al. 2003, Song et al. 2003a,b, Sorensen et al. 2003, Verma et al. 2003, Yoshinouchi et al. 2003). Některé pracovní skupiny testovaly možnosti sirna jako terapeutika při různých jaterních onemocněních myším aplikovaly sirna cílenou proti kaspase 8 nebo FAS receptoru, což působilo jako ochranný faktor před akutním selháním jater (Song et al. 2003a, Zender et al. 2003). Jiné skupiny úspěšně demonstrovaly možnosti léčby infekce virem hepatitidy B. Část genomu nezbytného pro replikaci kompetentního viru hepatitidy B byl podán spolu s sirna, čímž došlo k účinnému utlumení replikace viru a tvorby virového proteinu (McCaffrey et al. 2003). Tyto výsledky by měly být podnětem k výzkumu vhodných metod dodání sirna použitelných v klinických experimentech. Práce byla podpořena grantem MŠMT 1K Literatura Abrahante, J.E., Daul, A.L., Li, M., Volk, M.L., Tennessen, J.M., Miller, E.A., Rougvie, A.E Dev. Cell 4: 625. An, D.S., Xie, Y., Mao, S.H., Morizono, K., Kung, S.K., Chen, I.S Hum. Gene Ther. 14: Arts, G.J., Langemeijer, E., Tissingh, R., Ma, L., Pavliska, H., Dokic, K., Dooijes, R., Mesic, E., Clasen, R., Michiels, F., van der Schueren, J., Lambrecht, M., Herman, S., Brys, R., Thys, K., Hoffmann, M., Tomme, P., van Es, H Genome Res. 13: Aukerman, M.J., Sakai, H Plant Cell 15: Berns, K., Hijmans, E.M., Mullenders, J., Brummelkamp, T.R., Velds, A., Heimerikx, M., Kerkhoven, R.M., Madiredjo, M., Nijkamp, W., Weigelt, B., Agami, R., Ge, W., Cavet, G., Linsley, P.S., Beijersbergen, R.L., Bernards, R Nature 428:

13 RNA INTERFERENCE - ÚČINNÝ NÁSTROJ REGULACE GENOVÉ EXPRESE Bernstein, E., Caudy, A.A., Hammond, S.M., Hannon, G.J Nature 409: 363. Bertrand, J.R., Pottier, M., Vekris, A., Opolon, P., Maksimenko, A., Malvy, C Biochem. Biophys. Res. Commun. 296: Bitko, V., Barik, S BMC Microbiol. 1: 34. Brennecke, J., Hipfner, D.R., Stark, A., Russell, R.B., Cohen, S.M Cell 113: 25. Bridge, A.J., Pebernard, S., Ducraux, A., Nicoulaz, A.L., Iggo, R Natur. Genet. 34: 263. Brummelkamp, T.R., Bernards, R., Agami, R Cancer Cell 2: 243. Calin, G.A., Dumitru, C.D., Shimizu, M., Bichi, R., Zupo, S., Noch, E., Aldler, H., Rattan, S., Keating, M., Rai, K., Rassenti, L., Kipps, T., Negrini, M., Bullrich, F., Croce, C.M Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99: Calin, G.A., Sevignani, C., Dumitru, C.D., Hyslop, T., Noch, E., Noch, E., Yendamuri, S., Shimizu, M., Rattan, S., Bullrich, F., Negrini, M., Croce, C.M Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101: Caplen, N.J., Parrish, S., Imani, F., Fire, A., Morgan, R.A Proc. Natl Acad. Sci. USA 98: Coburn, G.A., Cullen, B.R J. Virol. 76: Cogoni, C., Macino, G Curr. Opin. Microbiol. 2: 657. Damm-Welk, C., Fuchs, U., Wossmann, W., Borkhardt, A Semin. Cancer. Biol. 13: 283. Denli, A.M., Tops, B.B., Plasterk, R.H., Ketting, R.F., Hannon, G.J Nature 432: 231. Doench, J.G., Petersen, C.P., Sharp, P.A Genes Dev. 17: 438. Doudna, J.A., Cech, T.R Nature 418: 222. Dykxhoorn, D.M., Novina, C.D., Sharp, P.A Natur. Rev. Mol. Cell Biol. 4: 457. Eckstein, F Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 10: 117. Elbashir, S.M., Harborth, J., Lendeckel, W., Yalcin, A., Weber, K., Tuschl, T Nature 411: 494. Fire, A., Xu, S., Montgomery, M.K., Kostas, S.A., Driver, S.E., Mello, C.C Nature 391: 806. Gautam, A., Densmore, C.L., Xu, B., Waldrep. J.C Mol. Ther. 2: 63. Ge, Q., McManus, M.T., Nguyen, T., Shen, C.H., Sharp, P.A., Eisen, H.N., Chen, J Proc. Natl Acad. Sci. USA 100: Gitlin, L., Karelsky, S., Andino, R Nature 418: 430. Good, P.D., Krikos, A.J., Li, S.X., Bertrand, E., Lee, N.S., Giver, L., Ellington, A., Zaia, J.A., Rossi, J.J., Engelke, D.R Gene Ther. 4: 45. Gregory, R.I., Yan, K.P., Amutham, G., Chendrimada, T., Doratotaj, B., Cooch, N., Shiekhattar, T Nature 432: 235. Hannon, G.J Nature 418: 244. Harborth, J., Elbashir, S.M., Vandenburgh, K., Manninga, H., Scaringe, S.A., Weber, K., Tuschl, T Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 13: 83. Harborth, J., Elbashir, S.M., Bechert K., Tuschl, T., Weber, K J. Cell Sci. 114: Hutvagner, G., Zamore, P.D Science 297: Chen, C.Z., Li, L., Lodish, H.F., Bartel, D.P Science 303: 83. Jackson, A.L., Bartz, S.R., Schelter, J., Kobayashi, S.V., Burchard, J., Mao, M., Li, B., Cavet, G., Linsley, P.S Natur. Biotechnol. 21: 635. Johnston, R.J., Hobert, O Nature 426: 845. Karande, P., Jain, A., Mitragotri, S Natur. Biotechnol. 22: 192. Ke, X.-S., Liu, C.M., Liu, D.P., Liang, C.C Curr. Opin. Chem. Biol. 7: 516. Kennerdell, J.R., Carthew, R.W Cell 95: Knopfová, L., Šmarda, J., Jr, Biol. listy (v tisku). 243

14 S. ŠTRUNCOVÁ et al. Miller, V.M., Xia, H., Marrs, G.L., Gouvion, Kong, X.C., Barzaghi, P., Ruegg, M.A C.M., Lee, G., Davidson, B.L., Paulson, - EMBO Rep. 5: 183. H.L Proc. Natl Acad. Sci. USA Kretschmer-Kazemi Far, R., Sczakiel, G. 100: Nucleic Acids Res. 31: Miyagishi, M., Hayashi, M., Taira, K Kurreck, J Eur. J. Biochem. 270: Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 13: Montgomery, M.K., Xu, S., Fire, A Kuwabara, T., Warashina, M., Taira, K Proc. Natl Acad. Sci. USA 95: J. Biochem. (Tokyo) 132: 149. Moss, E.G., Lee, R.C., Ambros, V Lagos-Quintana, M., Rauhut, R., Lendeckel, W., Tuschl, T Science 294: 853. Lee, N.S., Dohjima, T., Bauer, G., Li, H., Li, M.J., Ehsani, A., Salvaterra, P., Rossi, J. 2002a. - Natur. Biotechnol. 20: 500. Lee, R.C., Feinbaum, R.L., Ambros, V Cell 75: 843. Lee, Y., Ahn, C., Han, J., Choi, H., Kim, J., Yim, J., Lee, J., Provost, P., Radmark, O., Kim, S., Kim, V.N Nature 425: 415. Cell 88: 637. Mourelatos, Z., Dostie, J., Paushkin, S., Sharma, A., Charroux, B., Abel, L., Rappsilber, J., Mann, M., Dreyfuss, G Genes Dev. 16: 720. Napoli, C., Lemieux, C., Jorgensen, R Plant Cell 2: 279. Ngo, H., Tschudi, C., Gull, K., Ullu, E Proc. Natl Acad. Sci. USA 95: Palatnik, J.F., Allen, E., Wu, X., Schommer, C., Schwab, R., Carrington, J.C., Weigel, D Nature 425: 257. Lee, Y., Jeon, K., Lee, J.T., Kim, S., Kim, V.N. 2002b. - EMBO J. 21: Li, K., Lin, S.Y., Brunicardi, F.C., Seu, P. Pasquinelli, A.E., Reinhart, B.J., Slack, F., Cancer Res. 63: Martindale, M.Q., Kuroda, M.I., Maller, Lin, S.Y., Johnson, S.M., Abraham, M., B., Hayward, D.C., Ball, E.E., Degnan, B., Vella, M.C., Pasquinelli, A.E., Gamberi, Muller, P., Spring, J., Srinivasan, A., C., Gottlieb, E., Slack, F.J Dev. Fishman, M., Finnerty, J., Corbo, J., Cell 4: 639. Levine, M., Leahy, P., Davidson, E., Lund, E., Guttinger, S., Calado, A., Dahlberg, Ruvkun, G Nature 408: 86. J.E., Kutay, U Science 303: 95. Persengiev, S.P, Zhu, X., Green M.R Martinez, J., Patkaniowska, A., Urlaub, H., Lührmann, R., Tuschl, T Cell 110: 563. RNA 10: 12. Reich, S.J., Fosnot, J., Kuroki, A., Tang, W., Yang, X., Maguire, A.M., Bennett, J., Tolentino, M.J Mol. Vis. 9: 210. Matsuda, T., Cepko, C.L Proc. Natl Acad. Sci. USA 101: 16. Reinhart, B.J., Slack, F.J., Basson, M., McCaffrey, A.P., Nakai, H., Pandey, K., Pasquinelli, A.E., Bettinger, J.C., Rougvie, Huang, Z., Salazar, F.H., Xu, H., Wieland, S.F., Marion, P.L., Kay, M.A Nature 403: 901. A.E., Horvitz, H.R., Ruvkun, G Natur. Biotechnol. 21: 639. Rhoades, M.W., Reinhart, B.J., Lim, L.P., McManus, M. T Semin. Cancer. Biol. Burge, C.B., Bartel, B., Bartel, D.P : Cell 110: 513. Metzler, M., Wilda, M., Busch, K., Viehmann, S., Borkhardt, A Genes A.V., Sievers, C., Yang, L., Kopinja, J., Rubinson, D.A., Dillon, C.P., Kwiatkowski, Chromosomes Cancer 39: 167. Rooney, D.L., Ihrig, M.M., McManus, Michael, M.Z., O Connor S.M., van Holst M.T., Gertler, F.B., Scott, M.L., Van Pellekaan, N.G., Young, G.P., James, R.J. Parijs, L Natur. Genet. 33: Mol. Cancer Res. 1: 882. Saxena, S., Jonsson, Z.O., Dutta, A J. Michienzi, A., Rossi, J.J Methods Enzymol. 341: Biol. Chem. 278:

15 RNA INTERFERENCE - ÚČINNÝ NÁSTROJ REGULACE GENOVÉ EXPRESE Shen, C., Bucky, A.K., Liu, X., Winkler, M., Van den Berg, A., Kroesen, B.J., Kooistra, K., Reske, S.N FEBS Lett. 539: 111. de Jong, D., Briggs, J., Blokzijl, T., Jacobs, Scherer, L.J., Rossi, J.J Natur. S., Kluiver, J., Diepstra, A., Maggio, E., Biotechnol. 12: Poppema, S Genes Chromosomes Scherer, L.J., Rossi, J.J Natur. Cancer 37: 20. Biotechnol. 21: Van der Krol, A.R., Mur, L.A., Beld, M., Mol, Schwarz, D.S., Hutvagner, G., Du, T., Xu, Z., J.N., Stuitje, A.R Plant Cell 2: 291. Aronin, N., Zamore, P.D Cell Verma, U.N., Surabhi, R.M., Schmaltieg, A., 115: 209. Becerra, C., Gaynor, R.B Clin. Schwarz, D.S., Zamore, P.D Genes Cancer Res. 9: Dev. 16: Vickers, T.A., Koo, S., Bennett, C.F., Crooke, Sledz, C.A., Holko, M., de Veer, M.J., S.T., Dean, N.M., Baker, B.F J. Silverman, R.H., Wiliams, B.R Biol. Chem. 278: Natur. Cell. Biol. 5: 834. Waterhouse, P.M., Graham, M.W., Wang, Song, E., Lee, S.K., Dykxhoorn, D.M., Novina, C., Zhang, D., Crawford, K., Cerny, J., 95: M.B Proc. Natl Acad. Sci. USA Sharp, P.A., Lieberman, J., Manjunath, N., Xia, H., Mao, Q., Paulson, H.L., Davidson, Shankar, P. 2003a. - J. Virol. 77: B.L Natur. Biotechnol. 20: Song, E., Lee, S.K., Wang, J., Ince, N., Xu, P., Vernooy, S.Y., Guo, M., Hay, B.A. Ouyang, N., Min, J., Chen, J., Shankar, P., Trends Genet. 20: 617. Lieberman, J. 2003b. - Natur. Med. 9: 347. Xu, P., Vernooy, S.Y., Guo, M., Hay, B.A. Sorensen, D.R., Leirdal, M., Sioud, M Curr. Biol. 13: J. Mol. Biol. 327: 761. Yi, R., Qin, Y., Macara, I.G., Cullen, B.R. Stark, G.R., Kerr, I.M., Williams, B.R., Silverman, R.H., Schreiber, R.D Yoshinouchi, M., Yamada, T., Kizaki, M., Genes Dev. 17: Annu. Rev. Biochem. 67: 227. Fen, J., Koseki, T., Ikeda, Y., Nishihara, Stevenson, M Natur. Rev. Immunol. T., Yamato, K Mol. Ther. 8: : 851. Zender, L., Hutker, S., Liedtke, C., Tillmann, Takamizawa, J., Konishi, H., Yanagisawa, K., H.L., Zender, S., Mundt, B., Waltemathe, Tomida, S., Osada, H., Endoh, H., Harano, M., Gosling, T., Flemming, P., Malek, T., Yataba, Y., Nagino, M., Nimura, Y., N.P., Trautwein, C., Manns, M.P., Kuhnel, Mitsudomi, T., Takahashi, T F., Kubicka, S Proc. Natl Acad. Cancer Res. 64: Sci. USA 100: Tam, W., Ben-Yehuda, D., Hayward, W.S. Zeng, Y., Cullen, B.R RNA 8: Mol. Cell. Biol. 17: Zeng, Y., Yi, R., Cullen, B.R Proc. Uil, T.G., Haisma, H.J., Rots, M.G Natl. Acad. Sci. USA 100: Nucl. Acids Res. 31: Zhao, L.J., Jian, H., Zhu, H Gene 316: 137. S. Štruncová, R. Borská, B. Kusenda, P. Mejstřík, D. Dvořáková, J. Mayer, Š. Pospíšilová * (Center for Molecular Biology and Gene Therapy, Internal Hematological Clinic, Faculty Hospital, Brno, Czech Republic): RNA interference a powerful tool for regulation of gene expression RNA interference (RNAi) has been discovered as a mechanism of posttranscriptional gene silencing in plants, fungi, Caenorhabditis elegans and other species including mammals. RNAi is an evolutionally conserved mechanism, consisting of cleavage of long 245

16 S. ŠTRUNCOVÁ et al. dsrna, originating for instance from viruses or transposones and thus protecting cells from extracellular parasites. RNAi is mediated by small interfering RNA (sirna) bp long that is able very specifically to recognize and degrade homologous mrna. This mechanism can be therefore successfully used also for targeted silencing of specific genes and became a powerful tool in functional genomics. A related mechanism of regulation of gene expression is based on microrna molecules (mirna). The mechanism of their function is similar to sirna but the requirement of complementarity with a target sequence is not so strict, suggesting their role in translational regulation. It was shown that mirna molecules have many functions in regulatory processes in the cell and could play a significant role in tumor development. In comparison with other mechanisms of the gene expression regulation, such as antisense oligodeoxyribonucleic acids or ribozymes, RNA interference processes display many advantages including higher specificity and efficiency and lower toxicity. Therefore, RNA interference became an essential tool not only in biological research but possibly also a hopeful approach for a targeted therapy. Terminologický slovník antisense RNA (protismyslová RNA): RNA s komplemetárním pořadím basí k cílové mrna; cistron: genetická jednotka kódující jednoduchý polypeptidový řetězec; DICER: komplex enzymů obsahující RNasu III, která štěpí dsrna na krátké sirna duplexy o délce nukleotidů; Drosha: RNasa III, součást jaderného komplexu Microprocesor; exportin-5: jaderný transmembránový protein, umožňuje přenos prekurzoru pre-mirna z jádra do cytoplasmy; knock-down: utlumení exprese určitého genu použitím specifické sirna; knock-out: vyřazení určitého genu z funkce jeho delecí; Microprocesor: jaderný komplex, který se podílí na biogenesi mirna molekul. Pomocí komponent Drosha a Pasha umožňuje úpravu primárního transkriptu pri-mirna na prekurzor pre-mirna; mirna: mikrorna, malé (~22 nt) nekódující RNA molekuly, které buňky přirozeně používají k negativní regulaci genové exprese na posttranskripční úrovni; ODN: antisense (protismyslové) oligodeoxyribonukleotidy, molekuly dlouhé asi 20 nukleotidů, komplementární k cílové mrna, jsou využívány k utlumení genové exprese; Pasha: protein vázající dsrna, součást jaderného komplexu Microprocesor; pre-mirna: ~70 kda mirna prekurzor, vzniká působením specifické endonukleasy Drosha z pri-mirna; pri-mirna: dlouhý primární transkript mirna, který je pomocí endonukleázy Drosha upraven na pre-mirna; 246

17 RNA INTERFERENCE - ÚČINNÝ NÁSTROJ REGULACE GENOVÉ EXPRESE ribozymy: molekuly RNA s katalytickou funkcí; některé se vážou na komplementární mrna nebo jsou její intramolekulární součástí a degradují ji katalytickou hydrolýzou fosfodiesterové vazby; RISC (RNA-induced silencing complex): nukleoproteinový komplex skládající se z DICERu, asociovaných proteinů a sirna, na kterém dochází ke štěpení cílové mrna; RNAi: RNA interference, jev, při němž v buňkách dochází k utlumení exprese cílových genů prostřednictvím krátkých molekul RNA (sirna, mirna), způsobujících sekvenčně specifickou degradaci mrna; sense RNA: smysluplné RNA se stejným pořadím basí jako má cílová mrna; shrna: krátké hairpin-like (vlásenkové) dsrna, obsahují dvě komplementární sekvence oddělené smyčkou (sense-loop-antisense), jejichž štěpením vznikají sirna; sirna (small interfering RNA): vznikají v buňkách většinou štěpením dlouhých exogenních dsrna a indukují degradaci cílových mrna; strna (small temporal RNA): regulační molekuly (do 30nt), které kontrolují přechod mezi jednotlivými vývojovými stádii Caenorhabditis elegans prostřednictvím neúplné vazby na 3 UTR příslušného genu. 247