GENETIKA ČLOVĚKA. Lekce 10 kurzu GENETIKA Doc. RNDr. Jindřich Bříza, CSc.

Transkript

1 GENETIKA ČLOVĚKA Lekce 10 kurzu GENETIKA Doc. RNDr. Jindřich Bříza, CSc.

2 Lidská genetika se zabývá variabilitou a dědičností lidských jedinců. Klinická genetika se zabývá aplikací genetiky v diagnostice a léčebně preventivní péči. Hlavním úkolem genetiky v klinické praxi je zjišťování vlivu genetické variability a mutací v etiologii rozsáhlého počtu onemocnění. Tři typy onemocnění: i) Monogenní onemocnění (mutace jednotlivých jaderných nebo mitochondriálních genů; většinou vzácné, max. 1:500; jako skupina postihují tato onemocnění v určitém věku až 2 % jedinců) ii) Chromozómové poruchy (změny počtu nebo struktury chromozómů; poměrně časté 0,7% živě narozených a polovina spontánních potratů je jimi podmíněno) iii) Multifaktoriální onemocnění (podmiňují vývojové poruchy vedoucí k vrozeným malformacím nebo mnoho populačně častých onemocnění dospělého věku; následek kombinovaného působení řady drobných genetických změn predispozice k závažnému defektu často ve spolupůsobení faktorů vnějšího prostředí)

3

4 Lidská gametogeneze a fertilizace -lidské primordiální buňky rozpoznatelné od 4. týdne embryonálního vývoje v endodermu žloutkového váčku mimo vlastní embryo v 6. týdnu migrace do genitálních lišt vytváření primitivních gonád diferenciace v testes nebo ovaria na základě výbavy buněk pohlavními chromozómy i) spermatogeneze - začíná v pubertě a proces trvá kolem 64 dní -za celý život řádově spermií

5 ii) oogeneze -začíná v prenatálním vývoji -vajíčka z oogonií (buněk ovariální kůry), které vznikají z primordiálních zárodečných buněk sérií asi 30 mitóz -oogonie je základní buňkou při vývoji folikulu, během 3. měsíce embr. vývoje se oogonie mění v primární oocyty, které vstupují do profáze meiózy I, kde se vývoj zastaví v době porodu 2,5 mil. oocytů v profázi I -po dosažení pohlavní zralosti jednotlivé folikuly postupně dozrávají: dokončení meiózy I a okamžitý začátek meiózy II, která během ovulace dosáhne stádia metafáze, kde se zastaví a je dokončena pouze v případě fertilizace iii) fertilizace -obvykle ve vejcovodu v den ovulace nebo těsně kolem něj -je následována dokončením meiózy II -chromozómy vajíčka i spermie obklopeny jaderným obalem prvojádra (pronuclei) -do stádia 4-6 buněk (u myší do stádia 2 buněk, u skotu do stádia 8 buněk) rané embryo využívá mrna zděděnou zvajíčka, pak dojde k reaktivaci embryonálního genomu (probuzení genů raného zárodku), a to mechanismem, v němž má zřejmě stěžejní roli mikro-rna, která vyvolává destrukci mateřské RNA procesem RNA-interference

6

7

8 Monogenní dědičnost -4 základní typy dědičnosti: autozomálně dominantní (AD) autozomálně recesivní (AR) gonozomálně dominantní (GD) gonozomálně recesivní (GR) Autozomálně recesivní dědičnost -přenašeče nelze klinicky poznat, vyskytují se však mnohem častěji než postižení homozygotní jedinci -choroba musí být zděděna od obou rodičů P, že dítě bude postižené závisí na frekvenci výskytu heterozygotů (přenašečů) v populaci tato znalost je v genetickém poradenství nezbytná -nejčastější AR chorobou je v kavkazské populaci cystická fibróza (1:2000, frekvence přenašečů 1/22), která je prakticky neznámá v asijských populacích a řídká v afro-amerických populacích -mutace v genu CFTR (chloridový kanál regulující transport iontů přes buněčnou membránu)

9

10 fenylketonurie -porucha metabolismu fenylalaninu, AR, hromadí se fenylalanin, což vede k poruchám centrální nervové soustavy vedoucím k mentálnímu postižení a demenci; tyrosinémie - porucha metabolismu tyrosinu, AR, hromadí se kromě tyrosinu i velmi toxické metabolity (zejména sukcinylaceton), které vedou k poškození a zániku především jaterních buněk a buněk ledvinných tubulů; alkaptunurie -poruchou metabolismu fenylalaninu a tyrosinu, AR, hromadění homogentisové kyseliny, která se ve zvýšené míře vylučuje (do moči a do potu), jednak je zadržována v těle za tvorby pigmentu a jeho ukládání do tkání, klinické symptomy se poprvé objevují až vdospělosti, nejzávažnější se váží k postižení kloubů a pojivových tkání, v pozdějších letech i srdce; homocystinurie porucha metabolismu methioninu, AR, hromadí se methionin i velmi toxický homocystein; postižení oka, skeletu, cévní výstelky a centrálního nervového systému; galaktosémie -poruchou metabolismu galaktosy, AR, hromadí se galaktóza-1-p a galaktitol, jež působí toxicky na játra, mozek, ledviny a oční čočky;

11 albinismus nejčastěji jde o albinismus, při kterém nedochází k produkci tyrozinázy, AR, albíni mají vysoké riziko vzniku kožních nádorů a jejich kůže má sklon k rychlejšímu stárnutí, pokud je zablokována pigmentace v duhovce, objevují se i oční problémy;

12

13 Konsanguinita -situace, kdy oba rodiče jsou navzájem příbuzní a mohli tedy zdědit jednu a tutéž mutantní alelu od společného předka. Tím se výrazně zvyšuje pravděpodobnost, že jejich potomek bude v daném lokusu vlastnit dvě mutantní alely. Studium potomstva incestních párů vede k odhadu, že každý jedinec je přenašečem minimálně 8-10 mutantních alel pro dobře známé a rozpoznatelné AR choroby (celkové množství škodlivých recesivních genových mutací je značně vyšší) křížení nepříbuzných jedinců, z nichž každý je náhodou přenašeč, má na svědomí většinu případů AR chorob. Absolutní riziko abnormálního potomstva (narození mrtvého dítěte, neonatální úmrtí, vrozené malformace) je pro sňatky mezi prvostupňovými bratranci a sestřenicemi 3-5 %, čili zhruba jen 2x větší než pro potomky z nepříbuzenského páru. Příbuznost na úrovni bratranců a sestřenic třetího stupně se už nepovažuje za geneticky významnou (zvýšení rizika je již zanedbatelné).

14

15

16 Autozomálně dominantní dědičnost -více než polovina z asi 6000 mendelovských fenotypů jsou znaky dominantní -výskyt některých AD chorob relativně vysoká, alespoň v určitých geografických oblastech: hypercholesterolémie 1:500 (Evropa, Japonsko), Huntingtonova choroba 1: (severní Evropa) -AD chorob je jednotlivě mnohem méně než chorob běžných, ale díky značnému počtu jejich typů je v úhrnu jejich incidence znatelná -obtíže při zjišťování dědičnosti fenotypu často způsobeny neúplnou penetrancí, variabilní expresivitou a pleiotropií

17

18 -homozygoti pro AD znaky nejsou častí (křížení, která jim mohou dát vzniknout, tj. heterozygot x heterozygot, jsou řídká), většinou je lze odlišit od heterozygotů díky mnohem závažnějším příznakům (achondroplázie homozygoti většinou nepřežijí dětství, familiární hypercholesterolémie závažnější postižení s mnohem kratší očekávanou délkou života); výjimku tvoří např. Huntingtonova choroba, kde kde klinické příznaky jsou u obou genotypů stejné Gonozomální dědičnost -na chromozómu X zjištěno asi 500 genů, 70 % z nich je asociováno s postiženými fenotypy -expresi X-vázaných znaků u heterozygotek ovlivňuje náhodná inaktivace jednoho z X chromozómů: k inaktivaci dochází ve stádiu do 100 buněk podíl buněk s aktivní mutantní nebo normální alelou může být značně variabilní výsledkem je poměrně běžná klinická variabilita v expresi X-vázaných chorob -tato variabilita může být až extrémní, sahající od normálního stavu až po úplnou manifestaci onemocnění

19 -manifestujicí heterozygotka postižená alela je lokalizovaná na aktivním chromozómu X a standardní alela na inaktivním X ve všech nebo velké většině buněk díky asymetrické (nebalancované) inaktivaci X chromozómu -nenáhodná inaktivace chromozómu X pokud se v karyotypu vyskytne strukturně abnormální chromozóm X, není inaktivace jednoho z X náhodná, ale je preferenčně inaktivován chromozóm aberantní (zřejmě projev sekundární selekce působící proti geneticky nebalancovaným buňkám); tato preferenční inaktivace je také příčinou, že aberace chromozómu X jsou tolerovány lépe než aberace autozómů a jsou tedy častěji nalézány u pacientů -X-vázaná mentální retardace na X byla pozorována vysoká frekvence výskytu mutací vedoucích k mentální retardaci (1: narozených dětí); genů, jejichž mutace vede k nesyndromové X-vázané mentální retardaci, bylo nalezeno několik desítek

20

21

22 Mitochondriální mutace -mitochondriální DNA (mtdna) je kruhová molekula velikosti asi 16,5 kb a obsahuje 37 genů pro 2 typy rrna, 22 trna a 13 polypeptidů podjednotek enzymů oxidativní fosforylace (zbylých 74 polypeptidů kódováno v jádře) -většina buněk obsahuje ve stovkách mitochondrií kolem 1000 molekul mtdna, ale zralý oocyt více než kopií -do potomka se dostává jen z matky maternální (matroklinní) dědičnost -první patogenní mutace objeveny poč. 90. let 20. stol., převažují neuromuskulární choroby

23

24

25 Chromozómové poruchy i) změny počtu chromozómů ii) změny struktury chromozómů Změny počty chromozómů Dawnův syndrom -u 95 % pacientů trizomie ch21 (díky nondisjunkci páru chromozómů 21, v 90 % u matky v meióze I) -ve 4 % případů se jedná o Robertsonovu translokaci (R.t. je obecně translokace mezi dvěma akrocentrickými chromozómy fúzí v oblasti centroméry nebo v její blízkosti s následnou ztrátou krátkých ramének) mezi 21q a 14q nebo 22q; zde nebyl prokázán vztah s věkem matky postiženého dítěte Edwardsův syndrom - trizomie ch18, incidence při narození 1:7500 Pataův syndrom - trizomie ch13, incidence při narození 1:

26 Změny počtu gonozómů:

27 Změny struktury chromozómů Syndrom Cri du Chat rozsáhlá delece krátkého raménka ch5 Mikrodeleční syndromy

28 Multifaktoriální dědičnost -u 2/3 jedinců způsobí morbiditu (nemocnost) nebo předčasnou mortalitu nemoci jako jsou vrozené vývojové vady, infarkt myokardu, rakovina, duševní choroby, diabetes mellitus a Alzheimerova choroba -jejich rozvoj je podmíněn komplexní interakcí mezi predisponujícími faktory v jednom nebo více lokusech a faktory vnějšího prostředí -ke zjišťování podílu genetických faktorů na fenotypu slouží např. studium dvojčat, kdy se porovnává výskyt choroby (fenotypu) u MZ a DZ dvojčat konkordance -jev, kdy dva příbuzní jedinci v rodině mají stejné onemocnění (fenotyp) diskordance -jev, kdy dva příbuzní jedinci v rodině nemají totéž onemocnění (fenotyp) -je-li znak podmíněn převážně genet. faktory, pak MZ dvojčata budou v tomto znaku vysoce konkordantní, zatímco u DZ konkordance bude výrazně nižší

29 -pomocí konkordance u MZ a DZ dvojčat lze vyjádřit hodnotu H: H=(K MZ K DZ )/(100 K DZ ), kde K MZ je počet konkord. párů MZ dvojčat v % a K DZ počet konkord. párů DZ dvojčat v % -znaky H=1 jsou podmíněny převážně geneticky, znaky s H=0 převážně faktory prostředí

30 -další možností pro odlišení genetických a negenetických vlivů je měření familiární agregace, tj. porovnání frekvence výskytu znaku (onemocnění) v příbuzenstvu postiženého s frekvencí znaku v populaci; λ r =1 svědčí o převaze faktorů vnějšího prostředí -příklady chorob: ischemická choroba srdeční, vrozené vývojové vady, Alzheimerova nemoc, diabetes mellitus

31 Krevní skupiny a jejich polymorfismy - systém AB0 viz přednáška Nealelické interakce - systém Rh -jméno podle opice makak rhesus používané při pokusech, které vedly k objevení tohoto systému -tvořen faktory C, D a E, z nichž antigenně nejsilnější je D -jedinci Rh + exprimují na svých erytrocytech antigen Rh-D (polypeptid kódovaný genem na chromozómu 1), jedinci Rh - nikoliv -jedinci Rh - jsou homozygotně recesivní, frekvence jejich výskytu se značně liší mezi etniky (Angličani 17 %, Japonci 0,5 %) -hemolytická nemoc novorozenců: během těhotenství proniká malé množství fetální krve do těla matky je-li matka Rh - a plod Rh +, pak matka začne tvořit protilátky ty se dostanou zpět do krve plodu a vedou k poškození fetálních erytrocytů hemolytická nemoc novorozenců; toto nebezpečí je akutní při následných porodech, neboť nejvíce krve plodu se dostane do matky při porodu; prevence injekce anti-rh 0 (D) imunoglobulinu do 72 hod. po porodu, který vychytá Rh + fetální erytrocyty, jež pronikly do oběhu matky při porodu

32 Dědičné poruchy hemoglobinu i) strukturální varianty změna globinového polypeptidu bez změny rychlosti jeho syntézy ii) talasémie snížená syntéza jednoho řetězce nerovnováha v množství řetězců α a β iii) přežívání fetálního hemoglobinu narušeno přepnutí syntézy z γ na β-globin Strukturální varianty hemoglobinů -většinou způsobeny bodovými mutacemi, popsáno jich bylo na 400, asi 200 z nich je klinicky důležitých i) varianty způsobující hemolytické anémie nejznámější jsou Hb S a Hb C Hb S substituce vedoucí k záměně kys. glutamové v pozici 6 za valin (Glu6Val) v β-globinu nezvyklý rigidní tvar molekuly mění tvar erytrocytů, které ztrácejí pružnost díky vysráženému hemoglobinu Hb S ucpávání kapilár lokální ischémie a hemolýza v homozygotní konstituci způsobuje srpkovitou anémii

33 Hb C substituce Glu6Lys v β-globinu, je méně rozpustný než Hb A sklon ke krystalizaci snížení pružnosti a ohebnosti krvinek v kapilárách mírná hemolytická anémie -alela β C častá v západní Africe lze nalézt osoby, které jsou složenými heterozygoty (β C β S, choroba Hb SC), choroba mírnější než srpkovitá anémie ii) varianty s narušeným transportem kyslíku Talasémie -dohromady tvoří nejčastější lidské monogenní onemocnění -heterogenní onemocnění způsobená poruchou tvorby hemoglobinu, kdy mutace narušují syntézu či stabilitu buďto α- nebo β-globinu α- nebo β-talasémie -při relativním přebytku jednoho z řetězců dochází k jeho precipitaci, poškození membrány a předčasné destrukci erytrocytů -svým nositelům také přináší selekční výhodu proti malárii

34 Farmakogenetika -speciální oblast biochemické genetiky, která pojednává o variabilitě odpovědi na léky způsobené genetickou variabilitou (v USA se nežádoucí účinky léků vyskytují v 7 % případů a fatální důsledky podání léků asi v 0,3 %; tyto nepředvídatelné reakce jsou v drtivé většině případů determinovány geneticky) -v užším smyslu jde o genetickou variabilitu měnící schopnost organismu absorbovat, transportovat, metabolizovat nebo vylučovat léky či jejich metabolity -v širším smyslu jde o jakoukoliv geneticky podmíněnou variabilitu lékové odpovědi -př.: maligní hypertermie (AD porucha s dramatickou nežádoucí reakcí na aplikaci běžně používaných inhalačních anestetik a myorelaxancií vysoká horečka, svalová kontrakce a vystupňovaný katabolismus; příčinou smrti při anestézii s frekvencí 1:12000 u dětí a 1: u dospělých)

35 - deficit glukóza-6-fosfátdehydrogenázy (GR defekt, nejběžnější enzymový defekt u člověka 400 mil. lidí; deficit v tomto enzymu vede k léky indukované hemolýze, díky tomu je buňka rovněž daleko citlivější k poškození oxidanty; popsáno na 400 variant deficience; nebezpečné léky sulfonamidová antibiotika, sulfony; favismus těžká hemolytická anémie po požití bobu Vicia faba)

36 Imunogenetika -základním předpokladem vývojové biologie je skutečnost, že každá somatická buňka nese totožnou genetickou informaci a že žádné geny nebyly během vývoje ztraceny -z tohoto pravidla jsou důležité výjimky, z nichž jedna se týká genů imunitního systému obratlovců -imunitní systém chrání organismus před infekcí tím, že rozpoznává a odstraňuje cizí buňky nebo molekuly (musí být schopen odlišit vlastní od cizího ) -imunitní reakce (působení imunitního systému proti cizí jednotce): humorální imunita (B-lymfocyty) a buněčně zprostředkovaná imunita (T-lymfocyty)

37 Antigen je každá struktura schopná vyvolat imunitní odpověď (m.w. obv. > , proteiny nebo polysacharidy). Autoantigen je antigen vlastního těla, proti kterému je zahájena (auto)imunitní reakce. Takto vznikají autoimunitní choroby. Epitop (antigenní determinanta) je část makromolekuly rozpoznávaná imunitním systémem. Imunogenetika se zabývá stavbou, funkcí a genetickou kontrolou struktur uplatňujících se v imunitní ochraně organismu. Jak může imunitní systém rozpoznat téměř neomezený počet antigenů? Odhaduje se, že lidský organismus může produkovat více než 10 8 typů protilátek, což postačuje k tomu, aby byla připravena vazebná místa pro jakýkoliv antigenní epitop (někdy však s nízkou afinitou). Každý zralý B-lymfocyt produkuje protilátku proti jednomu jedinému antigenu, každý zralý T-lymfocyt je schopen se připojit právě jen k jedinému typu antigenu.

38 Klonálně selekční mechanismus imunitní odpovědi: -na základě rekombinací (viz níže) vznikne populace B-lymfocytů lišících se membránovými imunoglobuliny -po vniknutí antigenu dojde k jeho interakci s tím lymfocytem z celé populace, který má na svém povrchu přítomný membránový imunoglobulin právě pro tuto determinantu (důležitý je princip druhého signálu od jiných buněk imunitního systému - pokud není, dochází k funkčnímu útlumu a k apoptóze g obrana proti snadné a potencionálně nebezpečné aktivaci lymfocytů) -tento mitogenní signál vede k rychlé proliferaci za vzniku buněčného klonu se stejnou protilátkovou specifitou (= primární imunitní odpověď)

39 -ve většině případů vede primární imunitní odpověď k eliminaci cizího antigenu s následnou smrtí drtivé většiny klonu; přežívají jen tvz. paměťové buňky (memory cells), a to po mnoho roků či do konce života -jakmile se znovu objeví v organismu stejný antigen, jsou paměťové buňky aktivovány a dají velmi rychle vzniknout novému klonu s příslušnou protilátkou (= sekundární imunitní odpověď, základ pro vakcinaci) -obdobně u T-lymfocytů

40

41 Struktura protilátek (imunoglobulinů) Savci mají 5 strukturních a funkčních tříd Ig, jež se liší v konstantní části těžkého řetězce: IgG, IgM, IgA, IgE a IgD.

42 Struktura protilátek (imunoglobulinů) Vysoký počet typů protilátek (řádově 10 8 ) je produkován na základě stavebnicové organizace struktury protilátek a genů, které je kódují. V lidském genomu je jeden lokus pro těžký řetězec (IGH, chrom. 14), jeden pro kappa (IGK, chrom. 2) a jeden pro lambda (IGL, chrom. 22) lehký řetězec. Uvedené lokusy jsou tvořeny mnoha kopiemi genových segmentů pro jednotlivé části řetězců (V=variabilní segment, C=konstantní segment, J=spojovací segment AA koncové části variabilních úseků, D=segment diverzity 1-15 AA ve variabilní části těžkého řetězce). Např. pro kappa řetězec je v lokusu 40 funkčních segmentů V, 5 J a jeden C. Pro těžký řetězec 44 funkčních segmentů V, 25 D, 6 J a 9 C.

43 Struktura protilátek (imunoglobulinů)

44 Struktura protilátek (imunoglobulinů)

45 Struktura protilátek (imunoglobulinů) K vysoké variabilitě protilátek přispívají: (i) kombinace různých genových segmentů (40 V κ segmentů 5 J κ 1 C κ = 200 různých typů kappa řetězce; analogicky vznikne 120 typů lambda a cca 6600 typů těžkých řetězců) (ii) kombinace různých typů těžkých a lehkých řetězců ([ ] 6600 = různých protilátek) (iii) spojovací diverzita (junctional diversity) rekombinační proces není bezchybný, takže několik nukleotidů v sekvenci segmentů je často ztraceno nebo získáno (iv) v oblasti spojení D a J segmentu dochází často činností terminální transferázy k přidání několika nukleotidů (N region insertion) (v) vysoká frekvence mutací v genech pro imunoglobuliny (somatic hypermutation); příčina nejasná

46 Struktura protilátek (imunoglobulinů)

47 Struktura protilátek (imunoglobulinů)

48 Struktura protilátek (imunoglobulinů)

49 Diverzita receptorů antigenů T-lymfocytů Receptory T-lymfocytů (TCR, T-cell receptor) jsou strukturálně podobné imonoglobulinům. Tvořeny jedním α a jedním β řetězcem, každý řetězec z konstantní a variabilní části. Asi 5 % periferních lymfocytů má TCR tvořeny řetězci γ a δ. Řetězce kódovány geny TCRA, TCRB, případně TCRG a TCRD. Jejich organizace je podobná jako u genů pro Ig, tj. stavebnice segmentů, s využitím somatické rekombinace. Řetězce se kombinují náhodně, vyskytuje se junctional diversity, ale zvýšený výskyt mutací v genech nebyl pozorován. Dimer je umístěn transmembránově s variabilní částí řetězců na vnějším povrchu buňky. Na jednom T-lymfocytu cca TCR.

50

51 HLA systém (histokompatibilní antigeny) HLA antigeny jsou produkty histokompatibilních genů. Jsou umístěny v membráně buněk organismu a rozhodují o přijetí nebo odvržení transplantované tkáně. MHC (hlavní histokompatibilní komplex, major histocompatibility complex) má u všech savců podobnou strukturu. U člověka HLA (human leucocyte antigenes) geny kódují antigeny třídy I a II. HLA antigeny třídy I (kódované geny HLA-A, HLA-B a HLA-C) jsou tvořeny jedním těžkým (α) a jedním lehkým (β) řetězcem, řetězec α je transmembránový. V membráně prakticky všech buněk s výjimkou erytrocytů, spermií a buněk trofoblastu. HLA antigeny třídy II (kódované geny HLA-E, HLA-F a HLA-G) ze dvou (α, β) téměř shodně velkých řetězců. Vyskytují se především na buňkách participujících na imunitní odpovědi (makrofágy, monocyty, B-lymfocyty). Geny HLA patří ke genům s nejvyšším polymorfismem (pro některé lokusy je známo více než 100 různých alel). Tento polymorfismus vede k tomu, že každý lidský jedinec je z hlediska své antigenní struktury unikátní.

52

53 Genová terapie Používá se při léčení chorob způsobených defektními geny (např. cystická fibróza) nebo k expresi vnesených genů pro terapeutické účely (např. exprese transgenů v maligních buňkách k jejich usmrcení). Léčba je vždy velmi individuální záležitostí a zatím je většinou ve stádiu experimentální aplikace a dlouhodobého sledování vyléčených pacientů.

54 Problémy: (i) jak vstoupit do cílových buněk? (ii) jaká část cílových buněk musí nést požadovaný gen? (iii) musí být transkripce vneseného genu regulována? (iv) způsobí zvýšená exprese vneseného genu fyziologické problémy? (v) bude takový zákrok trvalý nebo bude muset být opakován? Geny mohou být vneseny do: (i) generativních buněk (vajíčko, spermie, embryo): zakázáno (ii) somatických buněk Metody vnášení DNA: (i) chemické metody (Ca 2 PO 4, málo účinné) (ii) fyzikální metody (mikroinjekce, elektroporace) (iii) biologické metody (na základě virových vektorů, účinné, ale někdy kontroverzní)

55

56 Genová terapie ex vivo: (1) izolace buněk s genovým defektem (2) pěstování izolovaných buněk v in vitro kultuře (3) oprava genetického defektu vnesením cizího genu (4) selekce geneticky opravených buněk (5) vnesení těchto buněk zpět do pacientova těla

57 Retrovirové vektory -retroviry mohou vést k přeměně buňky normální v buňku maligní g je třeba je této vlastnosti zbavit odstraněním většiny jejich genů a místo nich se vloží gen léčebný a gen selekční -mohou se však integrovat do jaderné DNA jen v buňkách, které se dělí Lentivirové vektory -mohou nahradit klasické retroviry, jelikož jsou schopny infikovat a integrovat svůj genom do nedělících se buněk (neurony, makrofágy, hematopoetické kmenové buňky, buňky svalů) -lentiviry mohou vyvolat AIDS u člověka g delece v LTR a tím není schopen produkovat infekční částice, ale je schopen integrace

58 Genová terapie in vivo: -přímé vnesení potřebného genu do buněk dané tkáně -retroviry potřebují dělící se buňky, řada tkání je již tvořena buňkami postmitotickými g je třeba jiný vektor -byla vyvinuta řada nových virových nebo nevirových vektorů; tato diverzita odráží diverzitu cílových tkání (kůže, svaly, mozek, plíce, játra, krevní buňky ) Ideáln lní vektor: (i) vysoká účinnost příjmu p léčebnl ebného genu buňkami cílovc lové tkáně (ii)) transport genu do jádra j musí být provázen minimáln lní vnitrobuněč ěčnou degradací (iii)dostatečná a dlouhodobá exprese

59 Adenovirové vektory -používají se při genové terapii in vivo, aplikace se po určité době (týdny, měsíce) musí opakovat -použití adenovirů může vyvolat záněty a nespecifickou imunitu g nahrazeny vektory založenými na AAV (adenoasociované viry), které velmi snadno pronikají do svalů a imunitní reakce na ně jsou minimální Vektory založené na Herpes simplex virus (HSV) -HSV I infikuje nedělící se nervové buňky g kandidát na vektor k přenosu transgenů do neuronů pro léčení nervových onemocnění (tumory a neurodegenerativní syndromy jako Alzheimerova nebo Parkinsonova choroba) Vektory na bázi plazmid-lipozomových komplexů -uměle vytvořené lipidové kuličky v emulzi, které v sobě uzavírají DNA v roztoku - málo účinné, pokročilejší formou lipozómů jsou lipoplexy

60 Injekce DNA -injikování izolované vektorové DNA s vhodným genem do svalu g dočasná exprese neintegrovaných kopií DNA a dočasná produkce proteinu, kódovaného genem na plazmidu = DNA vakcíny -využívá se při genové terapii nádorů Genetika rakoviny -rakovina je příčinou 20 % úmrtí v USA, jinde ve vyspělých státech podobné -není to jedna choroba, ale heterogenní skupina patologických stavů charakterizovaných přítomností buněk, které se vymkly obvyklé kontrole buněčného dělení -ke vzniku tumoru dochází díky sledu vzácných událostí (mutací), které postupně pozměňují genetickou výbavu buňky, čímž ji posunují stále blíž k zahájení neomezeného množení (klonální evoluce)

61 Klonální evoluce proces vzniku rakovinné buňky akumulací mutací v jejím genomu. Význam vlivu faktorů vnějšího prostředí a odlišného způsobu života.

62

63 Protože buněčné dělení je regulováno principiálně 2 typy molekul (molekuly stimulující dělení, molekuly inhibující dělení), může rakovina vzniknou mutací v kterémkoli z obou typů signálů. Mutace v stimulačních genech jsou obvykle dominantní (mutace v jedné kopii genu obvykle postačuje ke zvýšení stimulačního efektu); tyto geny se nazývají protoonkogeny. Mutace v inhibičních genech jsou obvykle recesivní (obě kopie genu musí být změněny k tomu, aby byl odstraněn inhibiční efekt); tyto geny se nazývají tumor supresorové geny. Mutace v genech systému DNA reparace zvyšuje pravděpodobnost vzniku mutací v obou skupinách právě popsaných genů.

64

65 Onkogeny -identifikovány ve virech způsobujících určité typy nádorů (virus Rausova sarkomu ) -po infekci se přenesou do hostitelské buňky a způsobí její transformaci na buňku rakovinnou -protoonkogeny jsou zodpovědny za normální buněčné funkce, ale po mutační změně se z nich stávají onkogeny Tumor supresorové geny -hůře se identifikují kvůli recesivitě jejich mutací -heterozygotní konstituce obvykle postačuje na plnou funkci, nicméně její nositelé jsou k rakovině geneticky predisponovaní -jedním z prvních objevených tumor supresorových genů byl RB gen (RB=retinoblastom) v r. 1985

66 -pro některé typy tumorů jsou charakteristické specifické chrom. mutace tyto mutace přispívají ke vzniku těchto tumorů Př.: chronická myeloidní leukémie cca 90 % pacientů má reciprokou translokaci mezi chr. 9 a 22 (obr. 9-31); díky této translokaci vzniká fúzní gen a protein BCR-cABL, který má velmi zvýšenou aktivitu při stimulaci buněčného dělení

67 Mutageny způsobují mutace, které mohou vést až k rakovině všechny mutageny jsou současně i kancerogeny. Ne všechny kancerogeny jsou však mutagenní. Ke kancerogenům patří i látky podporující proliferaci buněk (před dělením buňky replikace DNA s možností vzniku spontánní mutace). Alkohol jako kancerogen: Opakovaná expozice vysokým koncentracím alkoholu zabíjí mnoho buněk výstelky úst a jícnu, zbývající buňky se je snaží nahradit zvýšenou intenzitou svého dělení; navíc replikující se DNA je náchylnější k poškození mutageny než DNA nedělících se buněk kombinace tvrdého alkoholu a kouření zvyšuje riziko rakoviny úst a krku až 30 krát.