11. Měření s polarizovaným světlem

Transkript

1 11. Měření s polaizovaným světlem

2 Polaizované světlo E B smě šíření smě šíření λ Světlo el.-mag. vlna Přiozené světlo el. vekto může mít libovolný smě Polaizáto optický pvek, kteý dokáže izolovat jeden smě el. vektou nepolaizované světlo lineáně polaizované světlo

3 Polaizátoy 1) Dichoické pvky, kteé popouštějí pouze jeden smě polaizace (např. natažené fólie polyvinylalkoholu impegnované jódem) ) Dvojlomné kystaly kalcitu (CaCO 3 ), jež lámou světlo s ozdílnou polaizací do ůzných směů (např. Nicolův, Wollastonův, Glan-Foucaultův, Glan- Thompsonův, Glan-Tayloův polaizáto) Použití polaizátoů sahá do dávné minulosti - staří Vikingové používali sluneční kámen (pavděpodobně kodieit) k vyhledávání slunce při zatažené obloze či za mlhy. Rozptýlené světlo je silně polaizované, na ozdíl od papsků jdoucích přímo od slunce, takže pohled přes kámen umožňoval snadné učení polohy slunce. Při znalosti denní hodiny bylo možno takto učit i světové stany.

4 nteakce s lineáně polaizovaným světlem Lakowicz Pinciples of Fluoescence Spectoscopy,.ed., Kluwe/Plenum, 1999 Polaizace P = + Anizotopie = + 1 P 1,5 1 P = 3 P Nejpve uvažujme, že fluoescence může být polaizovaná v libovolném směu. Skutečnou oientaci elektického vektou pak můžeme zjistit měřením emise přes polaizáto otočený v ovnoběžném nebo kolmém směu. Polaizaci pak můžeme vyjádřit jako funkci těchto dvou intenzit. Při měření fluoescence limitních hodnot nedosahujeme.

5 nteakce molekul s lineáně polaizovaným světlem Ve skutečnosti, pokud dopadá na vzoek lineáně polaizované světlo, absobovat ho mohou jen ty molekuly, kteé jsou spávně oientovány. Pavděpodobnost absopce je úměná cos θ, kde θ je úhel, kteý svíá dipólový moment molekuly s ovinou polaizace excitujícího světla. Pokud tedy ozáříme soubo náhodně oientovaných molekul lineáně polaizovaným světlem, do excitovaného stavu přivedeme jen ty, jejichž dipólový moment je oientovaný ovnoběžně s ovinou polaizace dopadajícího světla (tzv. fotoselekce). Pavděpodobnost, že dipól molekuly se nachází v intevalu (θ, θ+dθ), je úměná sin θ dθ. Distibuce molekul excitovaných lineáně polaizovaným světlem je tedy f(θ) dθ = cos θ. sin θ dθ přítomné dipóly excitované dipóly

6 Maximální dosažitelná hodnota anizotopie Předpokládejme, že dipólový moment molekuly má stejný smě v základním i excitovaném stavu a že molekula je nehybná. Excitující papsek přichází ve smeu osy x, je lineáně polaizován ve směu osy z pavděpodobnost vyzáření fotonu s polaizací oientovanou ovnoběžně s polaizací excitujícího světla pavděpodobnost vyzáření fotonu s polaizací oientovanou kolmo na polaizaci excitujícího světla

7 Maximální dosažitelná hodnota anizotopie Počet emitovaných fotonů je úměný počtu absobovaných fotonů ( Φ, θ ) = π / π / f ( θ ) cos θ dθ π ( θ ) sin θ dθ ( Φ, θ ) = f sin Φ dφ Připomeňme, že f(θ) dθ = cos θ. sin θ dθ 1/ π / = cos π 1 / = 4 cos θ sinθ dθ = θ sin θ dθ = 1 5 Maximální hodnota anizotopie = + = 5

8 Fundamentální anizotopie V případě, že dipólové momenty molekuly v základním a excitovaném stavu nejsou ovnoběžné, ale svíají úhel ß, vzoste příspěvek. Po nehybnou molekulu potom platí = 3cos β 1 5 Tato hodnota se označuje jako fundamentální anizotopie. Maximální hodnoty nabývá po β = =,4 Minimální hodnoty nabývá po β = π/ = -, POZOR! Fundamentální anizotopie chaakteizuje nikoli molekulu, ale pouze daný elektonový přechod na molekule!

9 Excitační polaizační spektum V případě, že se absopční pásy několika elektonových přechodů na molekule překývají, může fundamentální anizotopie záviset na vlnové délce excitace.

10 Anizotopie molekul v oztoku V. 19 F.Wieget zjistil, že emise z oztoku fluoescenčních sond je polaizovaná. Konkétně, poměřoval oztoky fluoesceinu, eosinu, hodaminu a dalších sond a pozooval, že na polaizaci měla vliv teplota a vizkozita oztoku. Polaizace ostla s ostoucí viskozitou, naopak s ostoucí teplotou klesala. Wieget z toho vydedukoval, že polaizace klesá s ostoucí pohyblivostí molekuly. Molekula zůstává v excitovaném stavu po dobu τ. Pokud se za tuto dobu otočí o úhel ω, je to další příspěvek k depolaizaci emise. Při měření v oztoku tedy dostaneme anizotopii = 3cos ω 1 Máme tedy příspěvky k depolaizaci vnitřní ( ) a vnější (ω).

11 Peinova ovnice Pein (196) dal do souvislosti vztah anizotopie k době života excitovaného stavu a otačnímu difúznímu koeficientu molekuly (po sféické otoy) 1 1 τ 1 3τ 1 = 1 + = 1 + = θ ρ η V 1 RTτ ( 1 + 6Dτ ) = 1 + τ doba života excitovaného stavu θ otační koelačníčas ρ Debyeův otační koelačníčas (doba za kteou se molekula otočí o úhel daný cos ω = 1/e, ω = 68,4 ) D otační difúzní koeficient R molání plynová konstanta T temodynamická teplota η viskozita V objem otující sféy

12 Výbě optimální fluoescenční sondy po měření anizotopie

13 Rotující sféa - poteiny Nesouhlas mezi teoetickými a naměřenými hodnotami otačního koelačního času Nutno započítat hydatační slupku ηv θ = RT ηm = RT ( v + h) M molekuová váha v specifický objem (po poteiny typicky,73 ml/g) h hydatace Expeimentální učení objemu otující sféy - Peinův gaf Lakowicz Pinciples of Fluoescence Spectoscopy,.ed., Kluwe/Plenum, 1999

14 Lakowicz Pinciples of Fluoescence Spectoscopy,.ed., Kluwe/Plenum, 1999 L-uspořádání Měření anizotopie Mřížka monochomátou může mít ozdílnou účinnost po a G = = HV HH G + G T-uspořádání = VV VV + HV HH HV HH Rychlejší, ale dažší Umožňuje měření kinetiky VH VH

15 Měření anizotopie - atefakty Rozptýlené světlo je vysoce polaizované ( = 1,) i malé množství ozptýleného světla, kteé se dostane do detektou, může podstatně zvýšit naměřenou hodnotu. Naopak, pokud máme vysoce ozptylující vzoek a dojde k excitaci nějaké molekuly ozptýleným světlem, dochází ke snížení (udává se, že na,7 původní hodnoty). Efekty ozptylu možno ověřit tím, že vzoek zředíme. Přenos enegie zářivý (eabsopce) či nezářivý (FRET) snižuje hodnotu. Pokud je signál pozadí sovnatelné intenzity jako signál měřeného vzoku, je nutné ho odečíst.

16 Časově ozlišené měření anizotopie Poskytuje detailnější infomace o pohybu molekul než steady-state měření X Měření je časově náočnější, vyžaduje dažší přístoje a sofistikovanou analýzu dat. Po sféický oto platí θ ( t) e = t Po více otoů nebo systém, kteý koná více pohybů, pak uvažujeme t β j ( ) θ j t = = je e t θ β j fakční amplitudy, Σβ j = 1 j fakční anizotopie Σ j = j

17 Pohyby molekuly poteinu a c b a otace celé molekuly (komplexu) b segmentální pohyby c pohyb fluoofou

18 Měření časová (pulsní) doména dohasínání anizotopie (anisotopy decay) ( t) = ( t) ( t) ( t) + ( t) Sepaátní měření a τ = 1 ns Výbě vhodného fluoofou Více-exponenciální dohasínání Logaitmický gaf Lakowicz Pinciples of Fluoescence Spectoscopy,.ed., Kluwe/Plenum, 1999

19 Molekuly s omezenou pohyblivostí (hindeed otos) Jeden z otačních koelačních časů je (např. omezení pohybu v membáně, přítomnost velkého agegátu ) θ ( t) = ( ) e + Komponenta se pojeví i ve steadystate anizotopii S S S = + 1+ τ θ 1 = cosϕ t S + τ θ = + Jenže ze samotného steady-state měření nepoznám, že tam nějakou komponentu mám. DPH v membáně může otovat jen v kuželu daném úhlem ϕ (paamet uspořádanosti S) ( 1+ cosϕ) = S Altenativní model-fee ovnice = 3cosϕ 1 ( )

20 Měření fázová doména dynamická polaizace (dynamic polaization) Fekvenční anizotopie (fequency-dependent anisotopy) ω Λ = Λ ω ω 1 + Lakowicz Pinciples of Fluoescence Spectoscopy,.ed., Kluwe/Plenum, 1999

21 Měření fázová doména ( ) ( ) ( ) Φ = k k D D k D actg ω ω ( ) [ ] ( ) ( ) [ ] ( ) ω ω D k D k = Λ D otační difúzní koeficient k = 1/τ ω fekvence Více-exponenciální dohasínání Závislost tvau křivky na τ/θ Lakowicz Pinciples of Fluoescence Spectoscopy,.ed., Kluwe/Plenum, 1999

22 Výhody a nevýhody měření v pulsní a fázové doméně Pulsní metoda Pomalejší Potřeba efeence = (t=) Přímá detekce a učení Snazší analýza dat Fázová metoda Rychlá Při měření není potřeba efeence ani nejsou z měření učitelná, musíme je do výpočtu zadat Komplikovaná analýza dat i po jednoduché systémy Teoeticky možné měření kinetiky ( ω )

23 APLKACE

24 Aplikace steady-state Asociace poteinů dime monomey monome se bude otáčet ychleji než dime Měřením anizotopie při postupném ředění vzoku je možné učit disociační konstantu.

25 Aplikace steady-state Asociace poteinů Melittin při vyšších koncentacích NaCl tvoří tetamey. Ve skutečnosti v expeimentu, kde byl označen fluoesceinem, byl pozoován pokles anizotopie po přidání NaCl. Fluoescein má totiž velmi malý Stokesův posuv a docházelo tedy k depolaizaci fluoescence v důsledku FRETu (homotansfe, samozhášení). Očekávaný efekt byl pozoován tepve při velkém přebytku neoznačených molekul. Lakowicz Pinciples of Fluoescence Spectoscopy,.ed., Kluwe/Plenum, 1999

26 Aplikace steady-state Asociace poteinů Vazba poteinů na calmodulin Calmodulin neobsahuje žádný typtofan Pokud zkoumaný potein obsahuje nějaký typtofan, je možné při excitaci > 95 nm, pozoovat pouze jej. Vazba calmodulinu na potein RS Lakowicz Pinciples of Fluoescence Spectoscopy,.ed., Kluwe/Plenum, 1999

27 Aplikace steady-state Asociace poteinu a DNA Vazba typtofanového epesou (TR) na fagment DNA označený fluoesceinem. Závislost na koncentaci typtofanu je v souladu se známou funkcí Tp epesou vypíná geny zodpovědné za syntézu typtofanu, pokud koncentace typtofanu dosáhne požadované úovně. Model ukazuje, že TR se může vázat na DNA ve dvou kocích Lakowicz Pinciples of Fluoescence Spectoscopy,.ed., Kluwe/Plenum, 1999

28 Aplikace steady-state Vazba ligandu na potein Pokud ligand po navázání mění svůj kvantový výtěžek, je třeba učit fakci navázaného ligandu x podle vztahu x = b f + f ( γ 1)( ) b naměřená anizotopie f anizotopie volného ligandu b anizotopie vázaného ligandu γ příůstek kvantového výtěžku po navázání

29 Aplikace steady-state Vazba ligandu na potein Vazba cyaninového analogu ADP na subfagment myosinu. 3 -analog zvyšuje intenzitu fluoescence po navázání, zatímco -analog ne. Ale měření anizotopie ukazuje, že dochází k vazbě obou analogů.

30 Aplikace steady-state muno-detekce poteinů v oztoku (FPA Fluoescence Polaization mmunoassay)

31 Aplikace steady-state Detekce fázového přechodu lipidů Se zvyšující se teplotou se zychluje pohyb molekul při fázovém přechodu skoková změna.

32 Aplikace časově ozlišené měření Pohyby poteinů Vazba ge na ecepto vázaný v plasmatické membáně Lakowicz Pinciples of Fluoescence Spectoscopy,.ed., Kluwe/Plenum, 1999 β 1 θ 1 (ns) β θ (ns) ge v oztoku ge+ecepto Koelační čas 438 ns je příliš dlouhý na to aby příslušel samotnému poteinu odáží tedy otaci ge vázaného na membánu. Skutečný otační ko. čas bude zřejmě ještě delší, je limitován τ fluoofou (7 ns).

33 Aplikace časově ozlišené měření Pohyby poteinů Tetameizace melittinu (typtofanová fluoescence) θ = 1,4 ns θ = 5,5 ns Poznámky: Všechny dohasínací křivky jsou - exponenciální (katší komponenta -4 ps) () < (,3) díky nízkému časovému ozlišení přístoje θ = 1 ns Rotační koelační čas po melittin vázaný na DMPC je učen s velkou chybou díky kátkému τ (~3ns) detekujeme v delších časech málo fotonů. Lakowicz Pinciples of Fluoescence Spectoscopy,.ed., Kluwe/Plenum, 1999

34 Aplikace časově ozlišené měření Pohyby poteinů ozlišení segmentálních pohybů Segmentální pohyby Tp esidua na elongačním faktou Tu se mění po navázání elongačního faktou Ts.

35 Aplikace časově ozlišené měření Pohyby membánových poteinů fosfoescence Muelle B. et al., Biochemisty 4, 43,

36 Aplikace časově ozlišené měření Fázové přechody lipidů Přidání cholesteolu ovlivňuje teplotu fázového přechodu Lakowicz Pinciples of Fluoescence Spectoscopy,.ed., Kluwe/Plenum, 1999

37 Aplikace časově ozlišené měření Dynamika DNA Zahnutá molekula DNA se otáčí pomaleji než ovná. Ohybu je dosaženo vložením 5 nepáových adeninů. -exponencialní dohasínání anizotopie DNA ukazuje segmentální pohyby. Báze je nutno modifikovat, aby emitovaly fluoescenci, např. - aminopuin (AP). Lakowicz Pinciples of Fluoescence Spectoscopy,.ed., Kluwe/Plenum, 1999

38 Polaizovaná konfokální fluoescenční mikoskopie Aplikace Distibuce léčiv (navázané léčivo má vyšší anizotopii) Aktivita poteáz (potein ozštípaný poteázou je menší anizotopie klesá)

39 Shnutí Pincipy Po osvětlení lineáně polaizovaným světlem do excitovaného stavu přejdou jen ty molekuly, jejichž dipólový přechod je oientován ovnoběžně s vektoem elektické složky vlny. Fundamentální anizotopie chaakteizuje vzájemnou oientaci dipólových přechodů při absopci a při emisi (max.,4). Měřením polaizace emise (anizotopie) můžeme získat infomace o celé molekule, popř. její inteakci s okolím. Anizotopie závisí na pohyblivosti fluoofou, tedy na velikosti molekuly (popř. flexibilitě) a viskozitě oztoku (složení, teplota). Anizotopie nezávisí na intenzitě fluoescence. Aplikace Steady-state změny velikosti (inteakce dvou molekul) a pohyblivosti (fázové přechody membán), všechny pohyby jsou způměované. Časově ozlišená expeimentálně náočnější, ale dokáže ozlišit více pohybů, např. konfomační změny či segmentální pohyby molekuly, nebo omezení pohybu fluoofou. Důležitý je spávný výbě fluoofou (τ/θ).