VYSOKÉ UČENÍ TECHNICKÉ V BRNĚ BRNO UNIVERSITY OF TECHNOLOGY TOKOVÉ VLASTNOSTI HYALURONOVÝCH KOLOIDŮ FLOW PROPERTIES OF HYALURONAN COLLOIDS

Transkript

1 VYSOKÉ UČENÍ TECHNICKÉ V BRNĚ BRNO UNIVERSITY OF TECHNOLOGY FAKULTA CHEMICKÁ ÚSTAV FYZIKÁLNÍ A SPOTŘEBNÍ CHEMIE FACULTY OF CHEMISTRY INSTITUTE OF PHYSICAL AND APPLIED CHEMISTRY TOKOVÉ VLASTNOSTI HYALURONOVÝCH KOLOIDŮ FLOW PROPERTIES OF HYALURONAN COLLOIDS BAKALÁŘSKÁ PRÁCE BACHELOR S THESIS AUTOR PRÁCE AUTHOR VEDOUCÍ PRÁCE SUPERVISOR MICHAELA GABRIELOVÁ PROF. ING. MILOSLAV PEKAŘ, CSC. BRNO 2010

2 2

3 ABSTRAKT Cílem této práce je přblížt význam tokových vlastností hyaluronových kolodů vzhledem k fyzologcké funkc. V první část představím fyzkální vyjádření a defnce tokových vlastností a reologe, způsob jejch měření a využtí. V druhé část se čtenář dočte o kyselně hyaluronové a kolodech jejch solí. V této část se zabývám od prvních studí kyselny hyaluronové, přes její výskyt až k chemckým vlastnostem. Během práce se pokusím demonstrovat propojení obou témat. ABSTRACT The purpose of ths study s to zoom n mplcaton of flow propertes of hyaluronan collods wth respect to physologcal role. In the frst part I wll ntroduce physcal formulaton and defnton of flow propertes and reology, process to ts measurement and utlzaton. In the second part you can read about hyaluronc acd and collods of ts salts. In ths part I wll focus on frst studes of hyaluronc acd throught ts occurence to ts chemcal propertes. Wthn ths work I wll try to demonstrate nterconnecton of both subjects. KLÍČOVÁ SLOVA Kyselny hyaluronová, hyaluronové kolody, reologe, tokové vlastnost, vskozta KEYWORDS Hyaluronan acd, hyaluronan collods, reology, flow propertes, vscosty GABRIELOVÁ, M. Tokové vlastnost hyaluronových kolodů. Brno: Vysoké učení techncké v Brně, Fakulta chemcká, s. Vedoucí bakalářské práce prof. Ing. Mloslav Pekař, CSc. 3

4 PROHLÁŠENÍ Prohlašuj, že jsem dplomovou prác vypracovala samostatně, a že všechny použté lterární zdroje jsem správně a úplně ctovala. Bakalářská práce je z hledska obsahu majetkem Fakulty chemcké VUT v Brně a může být využta ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího bakalářské práce a děkana FCH VUT.... podps studenta DECLARATION I declare that the bachelor thess has been worked out by myself and that all the quotatons from the used lterary sources are accurate and complete. The content of the dploma thess s the property of the Faculty of Chemstry of Brno Unversty of Technology and all commercal uses are allowed only f approved by both the supervsor and the dean of the Faculty of Chemstry, VUT.... student s sgnature 4

5 Obsah TOKOVÉ VLASTNOSTI...8 Dsperzní soustavy...8 Dělení podle počtu fází...8 Dělení dle tvaru a velkost částc...8 Tepelný pohyb dsperzních částc Dfúze kapaln Enstenova rovnce Reologcké vlastnost dsperzních soustav Newtonova rovnce Měření vskozty Vskozta dsperzních systémů Vlv koncentrace na vskoztu Vlv tvaru částc na vskoztu Vlv náboje částc na vskoztu Jná ovlvnění vskozty Nenewtonské kapalny STUDIE HYALURONANŮ Počátky výzkumu kyselny hyaluronové v datech Kyselna hyaluronová - výskyt Izolace Významné vlastnost Struktura Reakce Statcký pohled - Rentgenová dfrakce Hydrodynamcký pohled SYNOVIÁLNÍ TEKUTINA A JEJÍ REOLOGICKÉ VLASTNOSTI Chemcké složení synovální tekutny Reologcké vlastnost hyaluronových komplexů a roztoku v synovální tekutně

6 ÚVOD Pod pojmem tokové vlastnost s ne každý je schopen představt něco konkrétní, proto bych v úvodu ráda upřesnla, čím se budu ve své prác zabývat. Chůze pro většnu z nás je tak běžná věc, že j an nevnímáme. Potřebujeme k ní hlavně pohybový aparát a dostatek energe. Součástí pohybového aparátu jsou kost, svaly, šlachy, které ovládají kloubní spojení. Spojení mez jakýmkolv dvěma pevným částm kostry se označuje jako kloub (obr. 1), nebol kloubní spojení. Obor zabývající se studem kloubů se nazývá artrologe a zánět kloubu je artrts. Ta je u domácích zvířat běžnou chorobou, a proto je důležté porozumět základům anatome a fyzologe kloubů a podstatám jejch chorob. 4 Synovální klouby jsou takové klouby, které umožňují jedné kloubní ploše klouzat po druhé. Tento pohyb je usnadněn přítomností kloubní chrupavky na každém styčném kostním povrchu kloubu, a také přítomností synovální tekutny (kloubní maz). Synovální kloub je uzavřen do kloubního pouzdra. V tomto pouzdře je obsažena synovální tekutna, která je vyměšována jeho vntřní membránou synovální membránou. Vnější vrstva kloubního pouzdra je fbrózní, odstupuje z okostce každé kost, a přspívá ke stabltě kloubu. 4 Zralá kloubní chrupavka je obvykle hyalnního typu, bez krevních a mízních cév a nervů. Skládá se z amorfní, bezbuněčné hmoty a relatvně malého počtu buněk, které se označují jako chondrocyty. Je to vysoce specalzovaná pojvová tkáň s takovým bochemckým a bofyzkálním vlastnostm, které jí umožňují plnt dvojí rol: tlumt nárazy a vytvářet nosné plochy pro zátěž. Během svého růstového období představuje kloubní chrupavka růstovou zónu pro chondrogenní typ osfkace v epfýze. Kloubní chrupavka je schopna během své růstové fáze regenerovat, a tak napravovat vznklá poškození. Po skončení růstové fáze se však tato regenerační schopnost téměř ztrácí. Chrupavka je houževnatá, elastcká tkáň, která se př stlačení ztenčuje a po uvolnění se pomalu vrací do původního tvaru. Během stlačování a uvolňování do sebe chrupavka nasává nebo vytlačuje synovální tekutnu. Kloubní maz se díky spongóznímu charakteru chrupavky resorbuje a tekutna dfunduje matrcí chrupavky a zajšťuje tak její výžvu. 4 Tekutny, které zajšťují kluzkost kloubních ploch, jsou dvě: jedna je vytlačována z kloubní chrupavky př její zátěž, a druhá je synovální tekutna nebol kloubní maz. Složky, které v 6

7 kloubním mazu plní mazací (lubrkační) funkc, jsou kyselna hyaluronová a glykoproteny. Obě tyto látky secernuje synovální membrána kloubního pouzdra a zvlhčuje kloubní styčné plochy př lehkých zátěžích kloubu provázených jen mírnou kompresí kloubních chrupavek. Během slné zátěže je synovální tekutna vytlačována z hmoty kloubních chrupavek a vytváří vrstvu v místě styku obou chrupavčtých ploch. Tento typ lubrkace pomocí tekutny vytlačené z chrupavek se označuje jako ronvý typ lubrkace. Kloubní chrupavky se přrovnávají k pevné houbovté hmotě. Odolávají slným tlakům, př zátěž se elastcky deformují a obsahují značný objem extracelulární tekutny, kterou pod tlakem uvolňují (což je pro lubrkac to nejdůležtější). 4 (Obr. 1) Obecná stavba kloubu 7

8 TOKOVÉ VLASTNOSTI Dsperzní soustavy Dsperzní systémy jsou soustavy, které obsahují alespoň dvě různé složky nebo fáze, navzájem rozptýlené. Rozptýlená složka se nazývá dsperzní podíl, složka, ve které je druhá složka rozptýlená se nazývá dsperzní prostředí. Dsperzní soustavy se můžou dělt podle mnoha hledsek, například podle počtu fází, velkost částc, tvar částc a skupenství dsperzního podílu a prostředí. 8 Dělení podle počtu fází Dsperzní podíl a prostředí, které tvoří jednu fáz, se nazývají homogenní systémy. Jedná se o pravé, samovolně vznkající, relatvně stálé roztoky. V homogenním systému jsou dsperzní podíl a dsperzní prostředí odděleny fázovým rozhraním. K jejch vznku a udržení exstence je třeba dodat prác, což z nch dělá nestálé systémy. 8 Dělení dle tvaru a velkost částc Dle tvaru se částce dsperzního systému se dělí na globulárně a lamnárně dsperzní. Globulárně dsperzní částce jsou zometrcké, tj. ve všech směrech mají podobnou velkost, mají kulovtý tvar nebo krychlový. Lamnárně dsperzní částce jsou anzometrcké, tj. mají jeden rozměr o řády větší nebo menší, mají tedy tvar tyčnkovtý nebo destčkovtý. Velkost částce bývá často udávána význačným lneárním rozměrem, jehož recproká hodnota je nazývána stupeň dsperzty nebo hmotností, nebo jných vlastností. Kulovté částce lze jednoduše popsat pomocí jednoho parametru lneárního rozměru. Tuhé částce, které nejsou sce kulovté, ale jsou značně symetrcké, bývají často aproxmovány koulí. Střední hodnota velkost lneárního rozměru se označuje jako průměr částce. Částce nepravdelného tvaru mohou být charakterzovány délkou čáry, která půlí plochu průměru částc (tzv. Martnův průměr) nebo průměrem kruhu o stejné ploše jako porovnávaná částce. U anzometrckých částc je nutno udat dva až tř rozměry (tab. 1). Za dolní hranc se bere rozměr 1-5 nm a za horní hranc bývá považován rozměr částc, odpovídající rozlšovací schopnost nejlepších mkroskopů, as 1 μm. U anzometrckých systémů musí do těchto hodnot zasahovat alespoň jeden z rozměrů částce. Pops jedným parametrem je možný jen u monodsperzních soustav. 8 8

9 (Tab. 1) Rozdělení dsperzních soustav 8 vlastnost Analytcké dsperze Kolodní dsperze Hrubé dsperze velkost d< m 10 < d < 10 m mkro :10 6 makro : d > 10 < d < 5 m vdtelnost č. nejsou vdtelné an vdtelné v ultramkroskopu nebo vdtelné pouhým v elektronovém elektronovém mkroskopu, okem nebo mkroskopu většnou průhledné, často barevné, opaleskují v mkroskopu, způsobují zákal, neprůhledné prostupnost procházejí fltračním procházejí fltračním papírem, ale některým neprocházejí papírem membránam ne papírem an membránam membránam knetka -ntenzvní tepelný -slabý tepelný pohyb -velm slabý pohyb -pomalu dfundují tepelný pohyb -rychle dfundují -pomalu sedmentují -nedfundují -nesedmentují an -vyvolávají malý osmotcký tlak (mění se -rychle v centrfuze stupněm dsperzty a počtem částc) sedmentují -vyvolávají velký -nevyvolává osmotcký tlak osmotcký tlak počet monomolekulární monomolekulár polymolekulární polymolekulární molekul, -vznk samovolným ní (mokromolekuly) -nevznkají stablta a rozpuštěním -samovolném asocatvní heterogenní samovolně způsob - jsou stálé rozpuštěním -samovolné -uměle -nestálé vznku -vždy homodenní -stablní -homogenní rozpuštění a asocace -stablní dspergované -nestálé -heterogenní - heterogenní gelace -nenastává -vznk lyoflních a lyofobních solů -mohou agregovat -výjmečně 9

10 Tepelný pohyb dsperzních částc Pohyb částc v kolodních mkroheterogenních soustavách je ovlvňován nepravdelným nárazy mezmolekulam navzájem. Nárazy jsou různě velké a př větším počtu nárazů v jednom místě dojde k vychýlení (tedy k pohybu v jednom směru). Pravděpodobnost kompenzace nárazu se zvyšuje s rostoucí velkostí a hmotností. Částce relatvně větších rozměru vbrují jen kolem určtého centra. Částce větší než 4 μm jž nevykonávají skoro žádný tepelný pohyb. Malé částce kromě translačního pohybu vykonávají ještě rotační pohyb. Celkový pohyb označujeme jako Brownův pohyb. 8 Knetcká teore deálního plynu zobecněná na kolodní a hrubé dsperze považuje za tzv. fyzkální molekulu každou částc schopnou tepelného pohybu. Nerozlšuje se molekula v chemckém slova smyslu (lyoflní kolody, pravé roztoky) a částce, které jsou agregáty chemckých molekul (lyofobní kolody, suspenze). Střední translační knetcká energe každého druhu fyzkálních molekul musí pak podle požadavků knetcké teore být př dané teplotě stejná a rovnat se (1.1) 8 z toho plyne střední rychlost (1.2) ε = m u 2 u = 2 ε m k = 3 r = k T 2 r 3 k T. m Dfúze kapaln V soustavách s koncentračním gradentem dochází k samovolnému vyrovnávání koncentrace dfúzí. Její rychlost je vyjádřena dfúzním tokem J df (1.1) (1.2), defnovaným jako látkovým množstvím dfundující složky, které za jednotku času projde jednotkovou plochou kolmou ke směru dfúze. Dfúzní tok ve staconárním prostředí je roven součnu střední rychlost toku částc df u j, a jejch koncentrac c : (1.3) 8 J df dn = = u A dτ df c (1.3) 10

11 Př jednorozměrné staconární dfúz se uplatňuje I. Fckův zákon (1.4) 8 J df = D dc dx 1 Dfuzní koefcent nebol koefcent úměrnost D [ ] 2 s (1.4) m je roven látkovému množství dfundující složky, která projde jednotkovou plochou za jednotku času př jednotkovém koncentračním gradentu. Závsí na vlastnostech prostředí a dfundujících částc. Koncentrační gradent dc je změna molární koncentrace se vzdáleností, v lbovolném bodě dx se př staconární dfúz nemění v čase. V nestaconární dfúz se koncentrační gradent df dj dc s časem změní a dfúzní tok se změní s polohou =. Nestaconární dfúze je dx dτ popsána II. Fckovým zákonem (1.5) 8 dc = dτ d c D. dx 2 2. Enstenova rovnce Na základě hydrodynamcké teore byl odvozen vztah mez dfúzním koefcentem, koefcentem tření a absolutní teplotou (1.6) 8 F df 1 = N A µ x T, p r R T = N A ln a x Znaménko mínus znamená snžování koncentrace se rostoucí vzdáleností. Pro deální chování zředěných roztoků lze též psát (1.7) 8 F df r R T = N A ln c x T, p k bt = c c x Síla působící prot pohybu dfúze je třecí síla (1.8), udávaná koefcentem úměrnost nebol frkčním koefcentem f, udávající odpor prostředí prot částc, a rychlost pohybu částc. Závsí na tvaru, rozměrech a koncentrac částc dsperzního podílu a na vskoztě dsperzního prostředí. 8 T, p T, p (1.5) (1.6) (1.7) 11

12 F tř = u f V ustáleném stavu dochází k vyrovnání třecí a dfúzní síly (1.9) 8 (1.8) F df k B c = T F tř c x T, p = u f po vyjádření rychlost pohybu částc (1.10) z I. Fcova zákona 8 (1.9) u D c = c x T, p (1.10) získáme Enstenovu rovnc (1.11) 8 kbt D = f (1.11) Př samodfúz a dfúz kulovtých částc v systému, kde dfundující částce částce dfundujícího prostředí jsou s podobné, je koefcent smykového (1.12) tření β velm malý. Pak platí 8 f = 0r 4 πη (1.12) Je-l kulovtá částce natolk velká, že rozpouštědlo je možno považovat za kontnuum, je koefcent β velký a pro frkční koefcent dostaneme Stokesův vztah (1.13) 8 6 πη f = 0r (1.13) Př dfúz velkých kulovtých částc ve zředěných dsperzích s kapalným dsperzním prostředím, kdy se dsperzní prostředí jeví jako kontnuum, pak pro dfúzní koefcent (1.14) platí 8 D k BT = 6 πη 0 r (1.14) 12

13 Hodnota dfúzního koefcentu (1.15) stoupá se vzrůstající teplotou a klesá ze vzrůstajícího odporu prostředí, tedy jeho vskoztou a poloměrem částc. U systému s nekulovým částcem vede výpočet poloměru ze vztahu 8 k BT D = 6 πη 0 r (1.15) k hodnotě nazývané hydrodynamcký poloměr, tj. poloměr hydrodynamcky ekvvalentní koule, která má za dané teploty ve stejném prostředí stejný frkční koefcent. 8 Reologcké vlastnost dsperzních soustav Reologe jako taková se zabývá tokem a deformací hmoty vlvem vnějších mechanckých sl. Tok je relatvní pohyb sousedících částc materálu. Působí na něj vlv mezatomárních a mezmolekulárních sl, v případě dsperzního systému jak dspergovaných částc, tak dsperzního prostředí. Reologcké chování kolodních dsperzních systémů závsí na vskoztě dsperzního prostředí, koncentrac částc, jejch velkost a tvaru, a nterakcích mez částcem dsperzního prostředí a částcem dspergované složky. 8 Tokové vlastnost dělíme dle chování na elastcké a vskoztní. Elastcké chování je takové, jejíž deformace nebo změny zmzí po odstranění vnější síly. Vskoztní chování je takové, jejíž deformace nebo tok se po odstranění vnější síly nevrátí do původního stavu. Energe pro udržení toku je dspergována jako teplo. 8 A protože nc není bílé a černé mez těmto extrémy se nalézá šedý komproms a to vskoelastcké chování. Řadíme sem řadu kolodně dsperzních systémů. 8 Newtonova rovnce Vskozta tekutn je mírou vntřního odpadu, kladného relatvního pohybu částc tekutn, vznklý důsledkem Brownova pohybu a mezmolekulárních přtažlvých sl. Dle Newtonova zákona tečné napětí (2.1) mez dvěma paralelním rovnam tekutny v relatvním pohybu je přímo úměrná gradentu rychlost mez vrstvam tekutn (obr. 2) 8 13

14 τ xz du = η x dy kde = F x xy 2 τ je tečné napětí udávané v [ N. m ] A (2.1), působící ve směru osy x; u xje rychlost toku ve směru osy x; du x je gradent rychlost; η- dynamcká vskozta dy kg = m s [ Pa s] = P, (P = Pose = 0,1 Pa.s). 8 η m 2 Knematcká vskozta ν, ν =, ρ. Recproká dynamcká vskozta se nazývá s fludta. (Obr. 2.) Rychlostní profl toku v kapalně mez nepohyblvou a pohybující se deskou. Pro mnoho roztoků, dsperzí a plyny čstých kapaln za dané teploty a tlaku je vskozta dobře defnovatelná velčna, která není závslá na tečném napětí a rychlostním gradentu. Je charakterstcká pro každou tekutnu zvlášť. Tyto tekutny jsou nazývány newtonovské. U řady systémů však vskozta není konstantou, ale závsí na hodnotě rychlostního gradentu. Poměr tečného napětí a gradentu označujeme jako zdánlvá vskozta, a platí pro systémy nenewtonovských kapaln. Vskozta závsí na teplotě. Pro deální plyny platí, že s rostoucí teplotou vskozta (2.2) stoupá a je defnována vztahem 8 2 η = 3 N 0,5 ( RT ) 0, 5 A π σ T (2.2) 14

15 kde σ je srážkový průměr molekuly plynu. Vskozta kapaln u rostoucí teploty klesá a je vyjádřena Andradeovou (2.3) rovncí kde A, B jsou konstanty. 8 (2.3) B ln η = A + T Co se týče tlaku, na vskoztu deálních plynů nemá vlv, kdežto u reálných plynů vskozta s tlakem roste. Vlv na vskoztu kapaln je většnou zanedbatelný pokud se nejedná o zvláště vysoké tlaky. 8 Měření vskozty Kaplární vskozmetr Pro průtok kapalny kaplárou platí Poseullova rovnce. Potřebný rozdíl tlaků je vytvořen hydrostatckým tlakem kapalny ve svslé kapláře. Měří se čas, za který proteče určtý objem kaplárou. Je výhodná pro nepřílš vskoztní kapalny. Využívá se srovnávací metoda (2.5) (2.6) pro kterou 8 platí: τ η ρ = τ η ρ (2.5) kde η=π. r. h. ρ. g. t/8v. l (2.6) Aby proudění bylo lamnární je nutno užívat př nízkých vskoztách kaplární trubce. V prax se měření neprovádí absolutně, ale relatvně na základě srovnání s referenční kapalnou mající známou vskoztu ν o např. podle vztahu (2.7), kde t, t o jsou doby výtoku zkoumané a referenční kapalny. 8 ν = (t / t o ).ν o (2.7) 15

16 S nastavtelným tlakovým spádem (Obr. 3) Schéma průtokových (kaplárních) vskozmetrů r - poloměr trubce, l délka trubce, h výška sloupce kapalny, ρ - hustota kapalny, g tíhové zrychlení, t doba toku, V objem vyteklé kapalny Nejznámějším typy jsou vskozmetr Englerův, Ostwaldův, Kohlův a Ubbelohdeův (obr. 3). Pro měření tokových křvek nenewtonských kapaln je nutno používat průtokové kaplární vskozmetry s nastavtelným tlakovým spádem. Přímo měřtelné velčny jsou pak objemový průtok V a tlakový spád p na měrné kapláře s poloměrem R a délkou l. Z těchto hodnot lze vypočítat konzstenční proměnné τ s, D s (2.8 a 2.9) a zdánlvou 8 vskoztu (2.10) podle rovnc τ s = p. R / 2l (2.8) D s = 4V / π. R 3 (2.9) τ s η = D s 2 p. V = 2 π. l. R (2.10) Potřebný tlakový spád se vytváří různou výškou sloupce měrné kapalny, tlakem nterního plynu nebo zatěžovaným pístem. Měří se buď objemový průtok (běžnější, méně náročný způsob) nebo tlakový spád (vyžaduje spolehlvé objemové dávkování se 16

17 stablním výkonem). Přesnost měření závsí především na výběru správné kapláry s dobře defnovaným parametry a na měření tlakového rozdílu. 8 Přímým výsledkem měření na kaplárním reometru je soustava údajů tlakového spádu a k němu příslušného objemového průtoku. Jako první zpracování se provádí výpočet konsstenčních proměnných τ s a D s (případně zdánlvé vskozty) a nakreslení tokové křvky (reogramu). Podle jejího tvaru pak je možno zvolt způsob nterpolace reogramu některou rovncí toku. V případě pseudoplastckých a dlatantních kapaln lze zpravdla uspět s jednoduchou mocnnou rovncí, po jejíž ntegrac pro trubc kruhového průřezu lze odvodt rovnc (2.11), která v logartmckých souřadncích dá lneární závslost mez τ s a D s, jejíž směrnce přímo poskytne ndex toku n. Z úseku na ose pořadnc pak můžeme zjstt hodnotu K. 8 τs = K. ((3n + 1) / 4n ) n. Ds (2.11) Hopplerův (kulčkový) vskozmetr Měření je založeno na Stokesově vztahu, pro pád koule ve vskózním prostředí. Opět se uplatňuje srovnávacím způsobem (2.12) a (2.13) kde ρ o, ρ jsou hustoty kapalny a tělíska, r poloměr tělíska. 10 v = F / 6π. η. r (2.12) F = 3/4π. r 3. (ρ- ρ o ). g (2.13) 17

18 T trubce naplněná zkoumanou kapalnou M1,M2 rysky K kulčka P termostatovací kapalna (Obr.4) Schéma Höpplerova kulčkového vskozmetru Pro stanovení vskozty se používá vztah (2.14) 8 η = 2g. r 2 (ρ - ρ o ) /9v (2.14) Nejjednodušším tělískovým vskozmetrem je vskozmetr Stokesův. Jným přístrojem této skupny je techncký vskozmetr Höpplerův v němž padá kulčka skleněnou trubcí skloněnou od vertkály o 10 o a o průměru málo větším než je průměr koule (obr. 4). V obou případech je měření vskozty převedeno na měření doby pádu kulčky. Výměna kulček umožňuje kvaltatvní zjštění, závsí-l vskozta na gradentu rychlost č nkolv, tj. zda se zkoumaná kapalna chová newtonovsky nebo nkolv. 8 Pro měření velm vskozních kapaln byly vyvnuty reovskozmetry s tlačnou kulčkou, v nchž je kulčka protlačována vzorkem umístěným v nádobě válcovtého tvaru př defnovaném zatížení, které je možno měnt. Lze tedy zjšťovat tokové charakterstky nenewtonských kapaln (2.15) 10 η u ( ρ k ρ) = η u ( ρ ρ ) τ = τ k k ( ρk ρ ) ( ρ ρ ) ρ k hustota kulčky, u a u rychlost pádu kulčky, τ a τ doba pádu kulčky (2.15) 18

19 Rotační vskozmetr Skládá se ze dvou válců s úzkým mezválcovým prostorem, který se plní měřenou kapalnou. Jeden z válců (v tomto případě vnější) se př měření uvede do rotačního pohybu stálou úhlovou rychlostí ω a regstruje se moment síly M působící přtom na vntřní válec V 2. V uvedeném případě se měří stočení torzního vlákna T, na kterém je zavěšen válec V 1 metodou světelného paprsku odráženého zrcátkem Z. V komerčních přístrojích se otáčvý moment měří zpravdla elektrcky, což umožňuje jeho další snadné zpracování, event. záps. Jsou-l poloměry válců r 1, r 2 a výška smýkané vrstvy kapalny h, lze vypočítat vskoztu podle rovnce (2.17) ( 1 / r r ) M. 1 η = 4π. h. ω 2 M = A ω (2.16) kde A je přístrojová konstanta. Rovnce byla odvozena za předpokladu stablního lamnárního toku ve štěrbně (Couetteův tok), a př zanedbání koncových a hranových efektů. Pro elmnac jejch vlvu byla navržena řada korekcí. Určté problémy vyvolává také skutečnost, že v různých bodech měřené kapalny ve válcové mezeře je různá rychlost smykové deformace (běžně 20% mez oběma povrchy). Dále je nutno počítat s ohřevem vzorku během měření, který se zvyšuje s vskoztou a rychlostí otáčení. Rotačním vskozmetrem tedy snadno získáme hodnoty napětí τ M pro různé hodnoty rychlostního gradentu D, jehož hodnota je dána rychlostí otáčení a poloměrem válců (hodnoty jsou pro každé uspořádání tabelovány). 8 Souhrnně je možno o reometrech se souosým válc říc, že je k dspozc řada komerčních přístrojů nejrůznějšího provedení (obr. 5), rozsahů a přednost, z nchž je nutno vybírat vždy podle konkrétních požadavků, vyplývajících hlavně ze struktury a typu vskoztní anomále měřené kapalny. 8 Místo dvou souosých válců se zvláště pro vskoznější kapalny často užívá uspořádání kužel - deska. V obou případech se měřená kapalna dává do úzké štěrbny mez dvě plochy, takže př měření se vystačí s malým množstvím kapalny. V tomto případě je 19

20 celý vzorek podroben konstantní rychlost smykové deformace a jsou potlačeny koncové a krajové efekty. 8 (Obr. 5). Různé úpravy měrného prostoru rotačních vskozmetrů Temperance vzorku je v důsledku velké chladící plochy a tenké vrstvy velm účnná. Nevýhodou je omezená použtelnost tohoto systému pro suspenze a dsperze (větší částce narušují tokové poměry v klínové mezeře). Vztah mez smykovým napětím t a momentem síly M je pro uspořádání kužel deska s poloměrem podstavy kužele R dán rovncí (2.17) τ = 3M / 2π R 3 (2.17) a pro gradent rychlost (2.19) platí D = ω / α (2.18) kde α je úhel štěrbny v radánech. Tokovou rovnc nenewtonských kapaln (2.19) lze tedy tímto vskozmetrem určovat přímo z naměřených závslostí momentu síly na úhlové rychlost. 8 η τ 3M. α = D 2π. R. ω = 3 = K M ω (2.19) Rotačním vskozmetrem lze určovat vskoztu také tím způsobem, že necháme vntřní válec konat torsní kmty uvntř stojícího vnějšího válce, když předtím vhodně upravíme velkost jeho momentu setrvačnost. Mluvíme potom o vskozmetru torzním. Vskozta se určí měřením útlumu kmtů kmtajícího válce. Je vhodný ke studu nenewtonovských kapaln. 8 20

21 Vskozta dsperzních systémů Proudění kolodně dsperzního systému a proudění dsperzního prostředí se lší z důvodu obsahu částc, které převyšují rozměry molekul dsperzního prostředí a tím mění směr drah jednotlvých částc a napomáhá tím promíchávání jednotlvých vrstev. V důsledku toho se v dsperzních soustavách často pozoruje přechod z lamnárního proudění v turbulentní př nžších hodnotách Reynoldsova čísla než v kapalnách neobsahujících dsperzní částce. Kolodní částce zmenšují prostor, který zaujímá v proudu kapalna sama, a tím zvětšuje průměrný gradent rychlost ve směru kolmém na směr proudění. Vskozta dsperzního systému je z toho důvodu větší než vskozta dsperzního prostředí. 8 (Tab. 2) Vyjádření vskozty dsperzních systémů Relatvní vskozta Inkrement relatvní vskozty (dříve specfcká vskozta) Redukovaná vskozta Inherentní vskozta Vskoztní číslo (vntřní číslo) η η η rel = η 0 η η = η 0 = rel η 0 η η = red w 2 lnη η nh = w 2 rel 1 [ η] = lm η red = lmη nh w2 0 w 0 a) b) c) d) e) Kde η = vskozta studovaného systému, η 0= vskozta čstého dsperzního prostředí, mol ). dm w 2=hmotnostní koncentrace (někdy může být nahrazeno koncentrací 3 Inkrementní relatvní vskozta (rovnce b, tab. 2) představuje vzrůst vskozty, vztažené na vskoztu čstého dsperzního prostředí. 8 21

22 Vlv koncentrace na vskoztu Enstenova rovnce (3.1) pro zředěné dsperzní systémy je ( 1+ 2, ϕ ) η = η 5 0 kde ϕ je objemový zlomek dsperzního podílu (3.2) w ϕ =. ρ (3.1) (3.2) Po úpravách Enstenovy rovnce (3.3): η η = 2,5 ϕ η rel red = 1+ 2,5 ϕ 2,5 = = ρ [ η] (3.3) Enstenovu rovnc můžeme použt jen pro velm zředěné roztoky, protože se uplatňují jen nterakce mez dsperzním částcem a prostředním. Př vyšších koncentrací je třeba uvažovat nterakce částc. Pohybují-l se tedy dvě částce v různých hladnách, vzdáleny od sebe méně než dvojnásobek poloměru částce, nastanou deformace směru. Tato změna trajektore vede ke spotřebě energe a to způsobí zvýšení vskozty. Př dalším zvyšování koncentrace musíme uvažovat vlv tří a více okolních částc. Použjeme tedy rozvtou Enstenovu rovnc ve tvaru (3.4) η = 2,5 ϕ + k ϕ + k ϕ (3.4) V úvahu musíme brát mezmolekulární síly. Působí-l tyto síly, jejch vlvem se dráhy mohou změnt a to opět zvyšuje vskoztu. Čím větší mezmolekulové síly tím větší vskozta. Př překročení daného množství síly se mohou vytvářet dublety, které díky charakterstcké rotac též zvyšuje vskoztu. 8 22

23 Vlv tvaru částc na vskoztu U anzometrckých částc se zntenzvňuje rotační pohyb, proto je třeba mnohem větší energe než u zometrckých částc a tím se zvyšuje vskozta. Míra vskozty závsí na ploše, která působí prot proudu kapalny. Například u částc tyčnkovtého tvaru, kdy plocha kolmá na proud kapaln je ta nejmenší, je vskozta dané částce nejnžší. Díky Brownova pohybu dochází k pootočení částce, a tím zvýšení vskozty. Nejvyšší vskozta je u částc s největší plochou kolmou na směr toku. 8 Vlv náboje částc na vskoztu Částce s elektrckým nábojem jsou obklopeny elektrckou dvojvrstvou, a to vede k prmárnímu, sekundárnímu a tercálního elektrovskoztnímu efektu, které zvyšují vskoztu. Prmární elektrovskoztní efekt způsobuje deformac kulovtého tvaru elektrcké dvojvrstvy.. Dále dochází ke změně průměru a objemu částc, což může způsobt změnu trajektore, která dává vznku sekundárnímu elektrovskoztnímu efektu. Sekundární elektrovskoztní efekt způsobuje adsorbovaná vrstva, která zvětšuje její průměr a objem jako v předchozím případě. Jsou-l tvořeny polyelektrolyty má na velkost průměru vlv ph a koncentrace, což způsobuje tercální elektovskoztní efekt. 8 Jná ovlvnění vskozty Vysoký vskoztní charakter vykazují molekuly s lneárním řetězc. Molekul s ohebným lneárním řetězc jsou v kapalnách v různě stočeném tvaru, které ve zředěných roztocích nabývají tvaru deformovaného klubka, stoupá redukovaná vskozta. Vysvětlení plyne z uzamykání molekul rozpouštědla v lneárním řetězc. Zvyšuje se tím tak poloměr a objem molekul. Vskozta závsí dále na dsperztě, molekulární hmotnost a afntě rozpouštědla. Dobrá rozpouštědla zředěných roztoků vytváří mnohem více vazeb v lneárním řetězc, tím se více částc rozpouštědla uzamkne do řetězce a zvýší se objem řetězce, který má vlv na odpor prostředí a tím na vskoztu. U zředěných roztoků špatných rozpouštědel má lneární řetězec snahu se semknou to menšího klubka, tedy snžuje odpor prostředí a tím vskoztu. Koncentrované roztoky způsobují asocac molekul v závslost, čím horší rozpouštědlo tím větší asocace. U 23

24 molekul s méně nebo vůbec ohebným řetězcem se rozpouštědlo neuzamyká a vskozta tím nevzrůstá. 8 Nenewtonské kapalny Jsou to kapalny reologcky složtější, které se Newtonovým zákonem neřídí. Jsou to např. roztoky a tavenny polymerů, suspenze, různé pasty apod.. Platí (3.5) τ = η D (3.5) kde η je ovšem tzv. zdánlvá vskozta, která není látkovou konstantou, ale závsí na rychlost deformace nebo tečném napětí (obr. 6). 8,9 a) orentace b) napřímení c) deformace d) rozmělnění a b c d (Obr. 6.) Vlv toku na uspořádání částc v nenewtonské kapalně. Základní typy nenewtonských kapaln jsou: Pseudoplastcké kapalny, jejchž zdánlvá vskozta se s rostoucím gradentem rychlost zmenšuje. Podle průběhu tokové křvky se někdy rozlšují dvě podskupny: pravé pseudoplastcké kapalny a strukturně vskózní kapalny, u nchž lze stanovt dvě lmtní hodnoty zdánlvé vskozty. Jsou to např. roztoky a tavenny polymerů, roztoky mýdel a detergentů, některé suspenze apod. Z technckého hledska je pseudoplastcta zpravdla vítanou vlastností poněvadž snžuje energetckou náročnost př míchání, toku kapaln potrubím apod. 8 Dlatantní kapalny, jejchž zdánlvá vskozta roste s rostoucím gradentem rychlost. Toto chování je poměrně málo časté. Poněvadž zpravdla komplkuje technologcké procesy, je žádoucí dlatac pokud možno potlačt změnou složení. K vyjádření průběhu tokových křvek (3.6) uvedených nenewtonských kapaln se užívají rovnce emprcké nebo poloemprcké povahy 24

25 n > 1 pro pseudoplastkcé n D = K τ (3.6) n < 1 pro dlatac kde K, n jsou emprcké látkové parametry charakterzující vlastnost toku nenewtonské kapalny a závsejí pouze na teplotě. Parametr K se nazývá součntel (koefcent) konzstence a parametr n je ndex (nebo exponent) toku. 8 Bnghamské kapalny, tj. kapalny s plastckou složkou deformace, u nchž dochází k toku až po překročení určtého prahového smykového napětí, tzv. meze toku τ k. Pro tyto plastcké kapalny platí (3.7) 8 τ τ = η D k 0 (3.7) Patří sem např. koncentrované průmyslové a odpadní kaly, kašovté suspenze křídy a vápna aj. Rovněž u pseudoplastckých a dlatačních kapaln může exstovat varanta s mezním smykovým napětím. Typcké plastcké chování vykazují např. zubní pasty, čokoláda, rtěnky aj. Exstují také kapalny s časově závslou složkou deformace, které mění zdánlvou vskoztu s dobou působení napětí. Jejch tokové křvky jsou hysterezní, průběh př zvyšování napětí se lší od průběhu př jeho snžování. Rozlšují se dva základní typy. 8 Látky txotropní, u nchž zdánlvá vskozta klesá s prodlužující se dobou působení napětí. Tento typ chování je velm výhodný např. pro nátěrové hmoty. Důležtá je znalost txotropního chování např. pro stanovení spouštěcího příkonu míchadel. 8 Látky reopektcké, jejchž zdánlvá vskozta během smykového namáháním s časem roste. Na rozdíl od txotrope se s tímto chováním můžeme setkat jen zřídkakdy (např. u suspenzí bentontu). 8 Anomále vskozty mohou být velm různorodé a v prax se můžeme setkat s různým kombnacem chování vskosního s elastckým (kapalny vskoelastcké nebo elastovskozní). Do této skupny kapaln se řadí např. velm koncentrované suspenze a velm koncentrované roztoky makromolekul. 8 25

26 Závěrem je třeba zdůraznt, že pro nenewtonovské kapalny (které se v průmyslu vyskytují velm často) nemá pojem vskozty jako látkové konstanty fyzkální význam, a je nutno jej nahradt tokovou křvkou v potřebném rozsahu tečných napětí. Vzhledem k možnost různých anomálí nelze přtom spoléhat na hodnoty získané extrapolací. Údaj zdánlvé vskozty změřený na jednoduchém vskozmetru bez udání tečného napětí nebo rychlostního gradentu může sloužt pouze pro orentační srovnání konzstence nenewtonských kapaln stejného druhu měřené na stejných přístrojích za stejných podmínek. 8 STUDIE HYALURONANŮ Počátky výzkumu kyselny hyaluronové v datech Název kyselna hyaluronová pochází z řeckého slova hyalos = skleněný a dle uronové kyselny, kterou obsahuje. 11 Tato slznatá látka se stala objektem bádání z hledska cheme jž před 150 lety. Sherer (1846) byl pravděpodobně první, kdo studoval mucn, jako složku eptelového slzu, který lze vysrážet zředěným roztokem kyselny octové. Stejná látka v pojvové tkán byla zkoumána Vrchovem (1852), který j objevl ve sklvc oka, v gelové látce pupeční šňůry, v kohoutím hřebínku a v kolodních karcnomech. Pozděj bylo zjštěno, že tzv. metachromatcké skvrny byly charakterzovány několka mucny pojvové tkáně. Přítomnost síry v mucnozních látkách pupeční šňůry demonstroval Jernstrom roku Chondrotn-sulfátová kyselna byla zolována z chrupavky vědcem Mornerem roku 1889 a Schmedebergem roku Další podobné mucny byly zolovány z očního sklvce Kornetem roku 1894 a byly zobrazeny jako mucn-sulfátová kyselna. Největší příspěvek studa chemcké struktury látek této povahy byl sepsán Legenem, který mez dalším badatel stanovl, že hexosamnem v chondrotn-sulfátové kyselně je galaktosamn. Mez jeho další zásluhy patří solace mucn-sulfátové kyselny z žaludečního hlenu vepřů a z mucnu pupečníkové šňůry a demonstroval, že všechny tyto substance obsahují glukosamn. Dle jeho názorů se mucn-sulfátová kyselna vyskytuje v oční rohovce, očním sklvc a krevním séru. 5 26

27 Kyselna hyaluronová - výskyt V roce 1934 Meyer and Palmer usloval o přípravu mucn-sulfátové kyselny z očního sklvce. Místo toho se jm podařlo s kyselnou vysrážet polysachard s vyšší vskozotu, který je odlšný od mucn-sulfátové kyselny zolované se zásadou. Tento nový polysachard byl nazván kyselna hyaluronová, obsahoval kyselnu uranlovou, hexosoamn a acetylovou skupnu. Poměr dusíkem (N) mez hexosamnem a kyselnou uranlovou je takřka eqmolární. Jelkož dřívější výzkumy užívají směs kyselny hyaluronové a chondrotn-sulfátové kyselny, je nyní dle jejch názoru glukosamn snadněj demonstrovatelný v hydrolyzátu, díky její vyšší rozpustnost. Oddělení kyselny hyaluronové a chondrotn-sulfátové kyselny byl vytvořen pomocí frakčního srážení s ethanolem v přítomnost octanu barnatého. Od této doby je výskyt kyselny hyaluronové demonstrován hned v několka tkáních (tab. 3). 5 (Tab. 3): Výskyt, objevtel a datum objevení kyselny hyaluronové v žvočšných tkáních 5 Místo nálezu Reference Roku Oční sklvec Meyer ; Palmer 1934 Vodné prostředí Meyer ; Palmer 1936 Rohovka Meyer ; Chaffee 1940 Synovální tekutna Meyer ; Smyth ; Dawson Synovom Meyer 1947 Kůže Meyer ; Chaffee 1941 Kohoutí hřebínek Boas 1949 Myxeodematcká tekutna Watson ; Pearce 1947 Ldská pupeční šnůra Meyer ; Palmer 1936 Pupeční šňůra prasat Follet 1948 Endotheloma Meyer ; Chaffee 1940 Blx 1951 Truedsson 1951 Exudates Campan 1942 Kohoutí nfltrát leukéme Kabat 1939 Rousova sarcoma Pre 1942 Warren ; Wllams; Alburn 1949 Sefter 1949 Vnější obal streptokoků - skupna A Kendall; Hedelberger; Dawson 1937 Vnější obal streptokoků - skupna C Seastone 1939 Aerobaktere Warren

28 Izolace Metody, které se používaly, se lší podle toho, pro jaký účel je látka získávána, například chemcky čsté polysachardy, bologcky aktvní nebo přírodní fyzkálněchemcké formy. Tyto metody se prncpálně přílš nelšly. Pozornost musí být věnována veskrze proceduře vyhýbající se oxdac, které snžují stupeň polymerace. Kyselna hyaluronová byla vysrážena ze solného extraktu s alkoholem nebo acetonem. Elmnace protenů byla provedena adsorpčním procesem s kaolínem. Kaye (1950) dokázal, že kyselna hyaluronová obsahující pouze 6-10 % protenů, může být extrahována př ph 8 z mucnové sedlny vyluhované několk týdnů v acetonu. 5 Mayer (1948) přednesl modfkac, která se vyhýbala vyšším ph než 7,5 a poskytovala velce vskózní preparát. Haddan a Pre (1948) byl názoru, že srážení s alkoholem a acetonem a elmnace protenů adsorpcí, denaturací Sewagovou metodou, nebo proteolytckým enzymy nebyla zcela uspokojvá, protože se během reakcí mohou polysachardové frakce ztratt. Pracoval na vylepšení metody systematcké zolace více frakcí a objevl, že se dá použít srážení sulfátem amonným v přítomnost pyrdnu nebo ethanolu, kdy bylo možné získat frakc s vyšší vskoztou než dřívější zoláty. Frakce s vyšší vskoztou obsahovaly méně glukosamnů. Proteny z rozdrcené pupeční šňůry, které se mohly vyskytovat, byly odstraněny pepsnem a trypsnem a samotný polysachard byl poté zolován frakčním srážením se sulfátem amonným v přítomnost pyrdnu. Odstraněním protenu z komplexu je vskozta redukována 5 Pozdější výzkum směřoval ke studu přírodního stavu kyselny hyaluronové v synovální tekutně. Kyselna hyaluronová ze synovální tekutny byla nejlépe zolována ultrafltrací. Během ní se využívají dvě membrány. Jedna, s průměrem pórů 0,19 μm, která je schopna zadržet všechny komplexy kyselny hyaluronové, a druhá, s póry o velkost 0,52 μm, zadrží částce větší. Během práce však nebylo možné odstrant úplně všechny proteny a získat tak čstou frakc. 5 Významné vlastnost Pro studum struktury se užívaly oxdované kyselny, jejchž výsledky se nadále používaly pro výzkum kyselny hyaluronové s obsahem jných struktur, například pro hexosamnovou kyselnu nebo esterové vazby. Byl potvrzen předpoklad, že kyselna hyaluronová obsahuje jádro s vyšším glukosamnovým vazbam, které napadaly 28

29 strukturu komplkované polyglukuranlové kyselny. Fyzkálně-chemcké výzkumy vedly k přípravě, jak čstých polysachardů, tak přírodních komplexů kyselny hyaluronové. Blx a Snellman pracoval na optckých studích s čstým polysachardem. Jejch zkoumání vedlo k zjštění, že všechny dosud vyzkoušené přípravy vedly k zsku dvojtého lomu světla kapalny. Vskozta chondrotn-sulfátové kyselny byla významně nžší přes to, že vzdálenost částc je stejná. Odhalení skutečné struktury pomocí rentgenologcké zkoušky se zprvu nedařlo. Až pozděj elektronový mkroskop ukázal jemné anatomcké fbrlární, lobulární a hvězdovté tvary. 5 O vymezení sedmentace a dfúzního koefcentu přírodních komplexů kyselny hyaluronové a její vntřní vskoztu v nulovém stupn podílu czích látek se zasloužl roku 1950 Obstoj a Staner. Rozdíly byly způsobeny částcem a exstencí propojených forem neurčté houbovté struktury. První degradablní změny pravděpodobně zahrnovaly redukc vskozty a mezmolekulárních vazeb. 5 Jeanloz a Forchell (1950) popsal stav na základě měření vskozty, ve kterém jsou molekulové řetězce spojeny v neurčté struktury, mcely, a jejch molekulová hmotnost má několk mlonů. Defct vskozty pří vyšší teplotě nebo př působení dazomethanu je důkazem vlvu karboxylových skupn na vazbu. Spousta karboxylových skupn je zabudována v esterových vazbách nebo kryje zbytek molekuly. 5 Synovální mucn v neutrálním prostředí obsahoval dvě elektroforetcky odlštelné sloučenny, v němž rychlejší fáze dokazuje exstenc polysachardů. Glykoproteny, které byly vysráženy z neutrální synovální tekutny pomocí kyselny octové, se týkají pouze umělých produktů. Vskozta roztoku kyselny hyaluronové je velce závslá na ontech a elektrolytech fungující podle Hofmesterovy řady. 5 Struktura Kyselna hyaluronová (obr. 7) je dsachard tvořený kyselnou uronovou a amnosachardem. Vytváří D-glukuronovou kyselnu a D-N-acetlyglukosamn s beta-1,4 a beta-1,3 glykosdckým vazbam tvořící sprálovtá vlákna. 1 29

30 (Obr 7.) Kyselna hyaluronová 1 Hyaluronan je jednoduchý, lneární glukosamnoglykan, vyskytující se hlavně ve vysokých molekulárních hmotnostech v mnoha žvočšných tkáních. Molekulám jsou přpsovány řady bologckých funkcí, které jsou významné z četných fyzologckých, klnckých a dagnostckých postupů. Jeho strukturální jednoduchost, rozsah molekulární hmotnost a jednečná technka syntézy j označuje jako molekulu zřetelného evolučního významu. 2 Hyaluronany mají mnoho rolí. Některé role vyžadují jejch přítomnost v okamžtých množstvích (například jako proteoglykan v chrupavce) zatímco v jných je to domnantní strukturální entta (například jeho přítomnost ve sklvc, Wharthonský rosol nebo synovální tekutna). Funkce hyaluronanu se může lšt v závslost na tom, zda se vzájemně ovlvňují převážně s proteny v tercálních a kvartérních strukturách nebo s vodou a onty tvořící vskózní roztoky nebo gely. 2 Některé buňky, jako např. zralé buňky chrupavky, aktvně syntetzují a katabolzují hyaluronany po celý žvot. Syntéza je obvykle vyvážená katabolsmem, tím udržují konstantní koncentrace v tkán. Studa metabolsmu ukázala, že žvotnost molekul hyaluronanů v chrupavce je normálně 2-3 týdny. 1 Reakce Kyselna hyalurnová se nebarví jodem. Jedná reakce přístupná pro praktckou aplkac je vysrážení s protenem v kyselém prostředí. Kyselna hyaluronová může být obarvena oxdovanou kyselnou chromanovou, Bauerovou reakcí, nebo oxdovanou kyselnou. 2 30

31 Statcký pohled - Rentgenová dfrakce V letech byla provedena řada expermentů s kyselnou hyaluronovou v tuhém stavu. Bylo pozorováno as 6 různých hlavních řetězců struktury a každý z nch by mohl být použt v různém uspořádání. Osm z těchto struktur bylo podrobeno detalní rentgenové dfrakc, z nchž některé daly náhled do řetězců molekulových soustav, ontů a vodních koordnantů. Hyaluronové řetězce jsou obecně nalezené v dlouhých 2 -, 3 - a 4- vlákntých sprálovtých formách. V přítomnost vody byly mez dvojtou šroubovcí nalezeny onty NH 4, Cs, Rb a K o nízkém ph. 3 (Obr. 8) Rentgenová vlákntá dfrakce hyaluronanu draselného 4 31

32 Vláknté dfrakční obrazce byly získány z hyaluronanu draselném v ph 2.0 (a), ph (b, ph 5-8 (c). Rentgenová dfrakce v (a) se shoduje s dlouhým 2- sprálním vlákny s axálním vzestupem 0.98 nm na dsachard. Dfrakce v (b) odpovídá levotočvé 4- vláknté sprále s axálním vzestupem 0.84 nm na dsachard. Tyto řetězce jsou organzované jako dvě antparalelní dvojté sprály v čtyřúhelné elementární buňce. Dfrakce v (c) se shoduje s dlouhým levotočvým, 4vlákntou sprálou axálního vzestupu 0.95 nm na dsachardovou jednotku. Dva z těchto řetězů jsou zabalené v čtverečné elementární buňce. Expermentálně jsou tato data dosažtelná přdáváním roztoku hyaluronanu do požadovaného stavu sol a ph, které po vysušení tvoří tenkou vrstvu. Flm je postupně řezán v pásech a natahován ve vysoké vlhkost k tomu, aby vytvořl polymerní řetězce. Po nějakém čase (dny, týdny) se řetězce organzují a krystalzují. Je zřejmé, že tato procedura bude formována řetězc kolem preferovaných nízkých energetckých struktur. 3 Je důležté, že rentgenová vlákntá dfrakce někdy zachytí pouze malou část celkového tvaru dostupné pro hyaluronové řetězce (obr. 8), a musí být bráno na zřetel, že proces orentování sám vybere další vhodné stablní tvary. Zřetelné změny nastaly př vskozmetr, usazování a dfuzních vlastnostech roztoku hyaluronanu sodného př ttrac s nízkým množstvím vápníku. Tyto údaje důrazně sgnalzují změnu v dynamce polymeru v přítomnost tohoto ontu. 3 Chování orentovaných vláken a flmů ve zředěných roztocích kyseln také přnáší změnu z 3- vláknté nebo 4vláknté konformace na prodloužené 2- vláknté konformace s axálním vzestupem 0.98 nm na dsachardovou jednotku. Tento vzor nkdy nebyl regstrovaný, pravděpodobně kvůl opětovné degradac uspořádání 2- vlákntých řetězců. Tato struktura není stablní nad ph 3.0 a je nahrazena varantou 3- vlákntého a 4- vlákntého stavu, dle katontu. Z údajů vyplývá, že hyaluronan má v roztoku vysoce dynamcký stav a je ctlvý ke specfckým ontovým podmínkám, které mohou vést ke změnám ve velkém objemu rozpouštědla a vytvoří slné nároky v rámc koordnace ontu v mřížce. 3 Hydrodynamcký pohled Hydrodynamcké stude hyaluronanu byly sledovány po mnoho let. S jeho snadnou dostupností jako čsté čndlo exstuje mnoho charakterstckých chování v roztoku 32

33 během šrokého okruhu podmínek. Jak bylo zmňováno, rozsah jeho hustoty je dskutovatelný jako příspěvek ntra- a nter- řetězových můstku. Hyaluronan udržuje stav vyskoelastckého roztoku nebo mazadla, v závslost na koncentrac a velkost řetězců. Nkdy formálně netvoří pevné gely, hyaluronové roztoky rychle chladí, jestlže je přdáno nějaké zesíťovací čndlo. Je dokázáno, že řetězce se mohou sbalt a hromadt stejným způsobem jako agarosové, karagénové a algnátové gely. Ve zředěném roztoku pro hyaluronany je pevné nepravdelné vnutí, s řetězc jevící malé nebo žádné tendence je specfcky ovlvňovat. V koncentracích, ve kterých se řetězce překrývají, dochází ke změně v měřené dynamcké vskoztě. Ncméně stude v polozředěném stavu sgnalzují, že roztok je nejlépe modelovaný jako dynamcká síť prostoupených řetězců. Poukazuje se na to, že řada bologckých vlastností hyaluronanu může závset na velkost řetězce. Olgosachardy byly modelované jako prstencové válce a poměr hmota/délka je v souladu s vysoce prodlouženým strukturam nalezeným v dynamckém modelu pro olgosachardy větší než tetrasachardy. Dynamcký rozptyl světla využíval pro měření součntele rozptylu specálně frakconovaných hyaluronanů s vyšší molekulovou hmotností. Tyto expermenty byly provedené př ph 6.0 (kdy hyaluronan je polyelektrolytem) a v ph 2.0 (kdy je v podstatě neutrálním polymerem). Hyaluronany nízkých molekulárních hmotností se shodují s vysoce tuhnoucím, téměř tyčnkovtým řetězc, zatímco s molekulovou hmotností vyšší než se chování nápadně mění a stávají se sprálovtým molekulam. Toto chování je zvláště znatelné př ph 2.0, kdy jsou elektrostatcké nterakce potlačeny. 3 Dané expermenty jsou však vykonané za zředěných podmínek. Z toho nám vyplývá otázka, jak tedy mohl být tak ostrý přechod objeven? Vezmeme-l vláknté řetězce dsachardu dlouhého 1 nm, tak závslost molekulové hmotnost naznačuje, že řetězce delší než 25 nm mohou měnt své vlastnost. Není známo žádné prokazatelné vysvětlení pro toto pozorování. Jedna teze se zabývala tím, že hyaluronové řetězce kratší než tato délka, nemůžou tvořt ntramolekulární částečné nterakce významného rozsahu, zatímco na druhou stranu, soubor jejch tvarů může zahrnout samo-ovlvňující se formy a tak se jevt v průměru menší. 3 Olgosachardová NMR studa provedená v dmetylsulfoxdu mohou dentfkovat přítomnost specfckých vodíkových vazeb, zatímco ve vodě tyto jednotlvé vodíkové 33

34 vazby nebyly zjštěny. Uskutečnl se molekulové výpočty dynamk na d-, tetra- (obr. 3.) a deka- sachardové jednotky k tomu, aby podpořly naš představu o tom, jak hyaluronové řetězce vytváří jejch prostorový tvar, a jakou mají funkc ntramolekulární nterakce vodíkových vazeb ve stabltě hyaluronanů. Aktvta vodíkových vazeb vody je prot pružnému polysachardu evdentně domnantní. 3 34

35 SYNOVIÁLNÍ TEKUTINA A JEJÍ REOLOGICKÉ VLASTNOSTI Chemcké složení synovální tekutny Synovální tekutna je dalyzovaná krevní plazma obsahující kyselnu hyaluronovou a polysachardy produkované synoválním ltorálním buňkam. Obsah protenu závsí na stavu kloubu (zdravý nemocný). Ve zdravém kloubu je obsah protenů výrazně nžší než v plazmě, kdežto v zánětlvé a degeneratvní synovální tekutně množství protenu roste. Hlavním bílkovnam jsou albumny a γ-globulny, ve velm nízké koncentrac jsou větší proteny fbrnogen, munoglobuln, IgM, metaloprotenázový nhbtor a také cytoknny. Kolagen, enzymy, proteoglykany a fbrnonektn se sce v normální synovální tekutně vyskytuj v malém množství, ale v degenerující tkání nebo př zánětlvé arthrtdě roste jejch koncentrace stejně jako množství lpdů (tab. 4). Ve zdravé tekutně je množství lpdů nžší než v plazmě, kdežto př revmatcké arthrtdě jeho množství značně převyšuje množství krevní plazmy. Nelézají se zde onty Na + a Cl -, malé molekuly jako močovna, buněčné komponenty jako lymfocyty (leukocyty, monocyty) a synovální tkáňové buňky. Klnckému vyšetření synovální tekutny podléhá barva, vskozty, čstota, sraženna a cytologe, které se mění na základě obsahu. 11 (Tab. 4.) Složení synovální tekutny v normálním stavu, osteoartrtdě a revmatcké artrtdě Normální stav Osteoarthrtda Revmatcká arthrtda HA (mg/ml) 0,35-4,22 0,32-3,61 0,19-3,74 Proten (mg/ml) 10,40-30,00 17,00-65,80 19,80-66,20 Fosfolpdy (mg/ml) 0,13-0,15 0,26-0,98 0,40-1,40 Cholesterol (mg/ml) 0,07-0,08 0,04-1,69 0,76-1,30 Tracylglyceroly (mg/ml) 0 0,12-0,59 0,17-1,00 Reologcké vlastnost hyaluronových komplexů a roztoku v synovální tekutně Kyselna hyaluronová, glykosamnoglykan obsahujíc střídavě N-acetyl D-glukosamn a D-glukuronovou kyselnu, je vázána na proteny, tvořící protenový-komplex, který ovlvňuje Nenewtonovský charakter synovální tekutny. Když byl proten dobytčí synovální tekutny hydrolyzován s papanem, proteolytckým enzymem v přítomnost EDTA (ethylendamntetraocotvá kyselna), významně poklesla vskozta výsledného 35

36 komplexu. To bylo také potvrzeno stud, ve kterých delší sezení vedlo též k redukc vskozty akutně traumatzované synovální tekutny. Práce ukázaly, že EDTA samotná degraduje výsledný komplex. Fyzochemcké vlastnost komplexu tedy nezávsely na protenových složkách, které nezměnly vskoztu s nebo bez proteolytckých enzymů, jmenovtě trypsnem a chymotrypsnem. Protenové složky tedy neovlvnly an reologcké vlastnost komplexu. Hyaluronáty jsou vázány na proteny ve velm malém množství, as 2% z celkového množství bílkovn v tekutně. Výskyt protenů neovlvňuje an vskoztu samotných hyaluronanů. Destruktvní efekty na vskoztu vycházejí z proteolýzy proten-polysachardového komplexu, z toho důvodu je hyaluronan určující člen reologckého komplexu. 11 Důležtou rol hrají vskoelastcké vlastnost. Po odseparování protenu z dobytčí synovální tekutny jsou nalezeny dvě různé hodnoty pro vskoztu prot smykové rychlostní křvce, získané pro hyaluronovou kyselnu a pro natvní synovální tekutnu. Po opětovném smísení separovaných protenů a kyselny hyaluronové, an vskozta an křvka smykové rychlost nezískaly hodnotu původní synovální tekutny. Nezvratné změny vskozty prot křvce smykové rychlost nastaly díky použtí separační metody cesum-chlordodensní gradentové ultracentrfugace. Tato metoda vedla k degradac polymeru vedoucí k permanentním změnám vskoelastcty. Ke ztrátám vskozních a elastckých vlastností synovální tekutny dochází díky působení enzymům degradující kyselnu hyaluronovou. Po enzymatcké degradac patologcké synovální tekutny klesají jak vskózní tak elastcké složky smykového napětí vskozty. 11 Kyselna hyaluronová př nízké koncentrac (< 1 mg/ml) ve vodném roztoku exstuje jako rozšířená sprála dovolující volný pohyb polymerních řetězců. Př vyšších koncentracích (> 1 mg/ml) vznká přechodné zesíťování. Tyto sítě jsou stablzovány vodíkovým můstky a nekovalentním mezmolekulárním vazby. Vlastnost sítě hyaluronové kyselny ve vyšších koncentracích způsobuje vskoelastctu roztoku, vedoucí k posílení vskozty a zvýraznění Nenewtonovské chování. Roztok kyselny hyaluronové o molekulové hmotnost Da vykazují rostoucí velkost vskoztních a elastckých složek, v porovnání roztoku s kyselnou hyaluronovou o molekulární hmotnost 0, Da stejné koncentrace. Výraznější nárůst byl zaznamenán u elastcké složky