Ústav patlgie a mlekulární medicíny UK 2. LF a FN v Mtle přednsta: Prf. MUDr. R. Kdet, CSc. S v a l v á b i p s i e Jsef Zámečník Labratř neurpatlgie a svalvých bipsií 1. Úvd 2. Indikace ke svalvé bipsii 3. Výběr místa biptickéh dběru svalu 4. Odběr svalvé tkáně 5. Manipulace se svalvu bipsií p dběru, transprt 6. Zpracvání vzrku v biptické labratři 7. METODY BIOPTICKÉHO VYŠETŘENÍ SVALOVÉ TKÁNĚ 7.1. Přehledná tkáňvá barvení 7.2. Tkáňvá histchemie, histchemie enzymů 7.3. Imunhistchemie, imunflurescence 7.3.1. Diagnstika mydystrfií 7.3.2. Detekce antigenů, které nejsu ve tkání za nrmálních klnstí přítmny 7.3.3. Detekce strukturálních prteinů 7.4. Immunblting (Western blt) 7.5. Elektrnvá mikrskpie 8. Literatura 9. Kntakty... 1. Úvd. Svalvá bipsie je integrální sučástí diagnstiky pacientů s neurmuskulárními nemcněními. Mim nečetných výjimek pskytuje základní kámen pr diagnózu pacientů se suspektní mypatií. Navíc může hrát rzhdující rli při psuzvaní pacientů s neurgenní pruchu, zejména při rzlišvání atypicky prbíhajících neurgenních pruch d primárně mypatických. Svalvá bipsie pskytuje v nepslední řadě infrmace pr diagnstiku mnha systémvých nemcnění. Ústav patlgie a mlekulární medicíny UK 2. LF a FN Mtl Labratř neurpatlgie a svalvých bipsií 1
Ačkli je vlastní chirurgická excize svalvé tkáně pr biptické psuzení relativně jednduchá a přináší pr pacienta jen malá rizika, je třeba ji prvést tak, aby byl výtěžek z vyšetření c největší. Indikující lékař musí nejprve racinální diferenciálně diagnsticku rzvahu na pdkladě klinickéh, labratrníh a elektrfyzilgickéh vyšetření dspět k správnému načasvání i určení takvéh místa dběru svalvé tkáně, které by mhl přinést validní diagnstické infrmace. Každý mypatlg má v repertáru sérii příběhů bipsiích, které nebyly prvedeny správně. Mnhé z těcht situací byly zachráněny a diagnóza naknec byla stanvena, bčas však byl nutné celu bipsii zpakvat. Někdy je ale třeba bipsii prvést znvu, aniž by šl pchybení: v případě nrmálníh biptickéh nálezu u pacienta s vyským stupněm klinickéh pdezření na nemcnění s fkální distribucí (hlavně plymyzitida) neb při atypické prezentaci vzácné metablické chrby, na kteru se za daných klnstí nepmýšlel. Není však mluvitelné, pkud nevhdná manipulace s debranu tkání, subptimální neb neadekvátní svalvá excize vzniká z nedstatku kmunikace mezi jedntlivými pracvníky pdílejícími se na celém prcesu svalvé bipsie (neurlg, chirurg, patlg, pracvníci histpatlgické labratře). Sebelepší labratrní technlgie nezmůže nic, pkud svalvá tkáň přichází d labratře znehdncená např. vyschnutím neb nevhdnu fixací. Dále, i precizní a správně načasvaný dběr a zpracvaní tkáně je zbytečným úsilím ve chvíli, kdy má diagnstikující mypatlg mezenu mžnst interpretace nálezu neb je dknce zaveden na diagnstické scestí neadekvátní infrmací klinickém průběhu a dalších labratrních vyšetřeních. Mypatlgie je v rámci celé diagnstické histpatlgie brem s mimřádně nízkým prcentem jednznačných diagnóz s nezaměnitelnými patgnmickými znaky. Napak, nejčastěji je nutn pskládat infrmace pskytnuté jedntlivými histpatlgickými vyšetřvacími metdami d mzaiky, která dává smysl, ladí s pskytnutými klinickými infrmacemi a vede k diagnóze. Nedstatek klinických infrmací vede k jedinému výsledku, kterým je puhý ppis histpatlgickéh brazu, mzaika diagnózy zůstává neslžena a efekt takvé bipsie pr pacienta je sprný. Vždy je třeba, aby mhl patlg interpretací svalvé bipsie zdpvědět diagnstický dtaz klinika, frmulvaný v žádsti vyšetření. C by neměl na žádance ke svalvé bipsii v žádném případě chybět: běžná sbní data pacienta stručný nástin klinickéh průběhu a symptmatlgie svalvých btíží další důležitá nemcnění (hlavně známé systémvé chrby, endkrinpatie, malignity, i pdezření na ně) dluhdbá terapie (zejména imunsupresiva, hrmny atd.) výsledky infrmativních labratrních vyšetření a jejich dynamika zejména kreatinkináza, myglbin, případně AST, ALT, laktát nález při elektrfyzilgických vyšetření (EMG) klinická diagnstická rzvaha (a frmulace diagnstické tázky pr patlga) přesné míst dběru svalvé tkáně kntakt (telefn, e-mail) na šetřujícíh neb indikujícíh lékaře (neurlga), zejména pkud přichází žádanka z chirurgické ambulance. Obecně dpručujeme přilžit ke standardní žádance histlgické vyšetření kpii klinické zprávy není pak ptřeba všechny infrmace d žádanky přepisvat. Důležitý je kntakt na šetřujícíh lékaře telefn a e-mail. Ústav patlgie a mlekulární medicíny UK 2. LF a FN Mtl Labratř neurpatlgie a svalvých bipsií 2
2. Indikace ke svalvé bipsii Při klinickém pdezření na mypatii je se vzácnými výjimkami indikvána svalvá bipsie. Ta je základem diagnózy zánětlivých, metablických a kngenitálních mypatií a většiny svalvých dystrfií. Puze některé zánětlivé mypatie mají v sučasnsti specificku a efektivní terapii. Prvedení svalvé bipsie a stanvení diagnózy před zahájením takvé terapie je důležité z následujících důvdů: - imunsupresivní léčba přináší značnu zátěž pr pacienta, je prt racinální stanvit diagnózu s jisttu před zahájením terapie - imunsupresivní léčba značně alteruje histpatlgický braz; svalvá bipsie prvedená až p zahájení terapie (pr malu neb žádnu dpvěď) může být špatně interpretvatelná neb ji nelze interpretvat vůbec. U pacientů s diagnstikvanu zánětlivu mypatií je indikván pakvané prvedení bipsie, pkud p iniciálním zlepšení klinických btíží při terapii nastupuje další svalvá slabst. Bipsie pak může rzlišit mezi exacerbací půvdníh nemcnění a rzvíjející se steridní mypatií. U statních nemcnění, u kterých zatím není specifická léčba dstupná, je také mnh důvdů ke stanvení přesné diagnózy svalvu bipsií: - v některých případech je indikvána symptmatická léčba - mnhá z těcht nemcnění jsu hereditární a správná diagnóza je pdmínku pr učení typu dědičnsti, stanvení rizikvých členů v rdině, specifikaci jedntlivých rizik a prenatální diagnstiku - pacient může mít prspěch z prgnstické infrmace - pacienti s určitými nemcněními se mhu stát sučástí výzkumných neb terapeutických studií. Častým důvdem ke svalvé bipsii je ptřeba rzlišit primární mypatie d neurgenní svalvé pruchy. Ačkli je jejich typická klinická prezentace rzdílná, v praxi se jejich klinický průběh, symptmy i nálezy při labratrním vyšetření mhu překrývat. Někdy může djít k suběhu mypatie s neurgenním pstižením svalu, cž dělá diferenciální diagnstiku ještě btížnější. Indikací pr primární prvedení svalvé bipsie není v sučasnsti klinické pdezření na dystrfinpatie (DMD/BMD), faciskapulhumerální dystrfii, mytnicku dystrfii, peridicku paralýzu a endkrinní mypatie. Důvdy jsu následující: Dystrfinpatie a faciskapulhumerální dystrfie Recentní pkrky v mlekulární genetice eliminvaly primární nutnst svalvé bipsie u většiny pacientů s dystrfinpatiemi. Mutace dystrfinvéh genu (Xp21.2), nejčastěji delece a duplikace, mhu být dhaleny méně invazivním vyšetřením, cž je pdrbně jinde. Svalvá bipsie je nutná pr stanvení diagnózy asi u 30%, u kterých nebyl genetické vyšetření z krve infrmativní (tzv. nedeleční frmy). Genetická analýza je dstupná i pr faciskapulhumerální dystrfii, a prt svalvá bipsie, která v tmt případě zřejmí jen nespecifické změny, není becně indikvaná. Ústav patlgie a mlekulární medicíny UK 2. LF a FN Mtl Labratř neurpatlgie a svalvých bipsií 3
Mytnická dystrfie Mžnst dhalení expanze trinukletidvých repetic genu prteinkinázy mytnické dystrfie dává při pdezření na tt nemcnění přednst genetickému vyšetření před svalvu bipsií. Histpatlgický nález zde není specifický ani diagnstický, může však být užite čný pr pdpření klinické diagnózy a zejména pr vylučení jiných pruch. Peridické paralýzy Onemcnění způsbená mutacemi mnžství genů pr membránvé intvé kanály (tzv. kanalpatie) mají velmi specifické klinické, bichemické a elektrdiagnstické znaky. Ačkli je mžné ve svalvé bipsii zastihnut vakuly a dilataci T-tubulárníh systému, většina znaků není diagnstická a pskytne jen braz nespecifických mypatických změn. Endkrinní mypatie Mypatie může být také způsbena např. pruchami štítné žlázy, příštítných tělísek a nadledvin. Správná cesta k diagnóze endkrinní mypatie vede přes příslušná sérlgická vyšetření. 3. Výběr místa biptickéh dběru svalu Svalvá bipsie bývá většinu debírána z jednh z následujících knčetinvých svalů: m. biceps brachii a m. deltideus, m. quadriceps femris (vastus lateralis neb rectus femris), m. gastrcnemius neb m. tibialis anterir. Ostatní svaly se biptují vesměs ze speciálních důvdů (např. interkstální sval pr studium pruch neurmuskulární plténky). Žáducí míst dběru je primárně determinván klinickým brazem nemcnění. Výtěžné infrmace většinu pskytne vyšetření symptmatickéh, ale jen středně neb mírně pstiženéh svalu. Při výběru nejpstiženějších míst může být braz změn tak pkrčilý, že úbytek svalvých vláken a jejich náhrada fibradipózní tkání (tzv. end-stage muscle) zcela překryje i reziduální známky nemcnění, které k takvému stavu vedl. Někdy lze v takvých případech jen z přítmnsti svalvých vřetének usuzvat na t, že se půvdně jednal svalvu tkáň. V důsledku lžiskvéh charakteru některých mypatií (např. zánětlivých mypatií, zejména plymyzitidy) nemusejí být vždy v debraném vzrku patlgické změny zastiženy. Při pdezření na myzitidu lze dnes prt s výhdu uplatnit při vlbě místa dběru svalvé tkáně vyšetření magneticku reznancí, která výbrně lkalizuje blasti edému a zánětu v příslušném svalu. Lze tak předejít rebipsii. Nevhdným místem dběru svalvé bipsie je dále blast předešléh EMG vyšetření. 4. Odběr svalvé tkáně Před vlastním biptickým dběrem by měl být samzřejmstí včasné kntaktvání mypatlgické labratře a chirurga (viz níže) a zajištění kamžitéh zpracvání tkáně p dběru. Zpracvání svalvé bipsie vyžaduje zvláštní přístup, který se liší d zpracvání jiných tkání v histpatlgické labratři. Je nemluvitelnu chybu prvést svalvu excizi a až pté začít rganizvat další zpracvání. Dluhý časvý dstup, případně nevhdné ulžení a fixace tkáně, může celý prces svalvé bipsie nevratně znehdntit a bez dmluvy s labratří je lepší svalvé bipsie vůbec neprvádět. Ústav patlgie a mlekulární medicíny UK 2. LF a FN Mtl Labratř neurpatlgie a svalvých bipsií 4
Svalvá tkáň může být získána buď tevřenu bipsií neb punkcí bipticku jehlu. Někteří autři preferují jehlvu bipsii, která je jedndušší, rychlejší a levnější metdu. Není t však nutně metda méně blestivá pr pacienta, získá se jí většinu jen velmi malé mnžství svalvé tkáně s btížnu rientvatelnstí, drbná částka se také rychleji defrmuje a ve tkáni vznikají artefakty. Malé mnžství tkáně většinu umžní jen základní mrflgické vyšetření, na immunblting, izlaci mrna neb případné další analýzy svalvé tkáně u metablických nemcnění se čast nedstává. Pr tyt nedstatky je pak nutné pakvání dběru. Naše labratř dává přednst dběru tkáně tevřenu metdu. Otevřené svalvé bipsie mhu být u většiny starších dětí a dspělých pacientů prváděny v lkální anestézii. U malých dětí a u dspělých lze za určitých klnstí prvést dběr v krátké celkvé anestézii, většinu pdpřené lkální anestézií. Haltan a sukcinylchlin by však neměly být aplikvány u pacientů s pdezřením na nemcnění spjená s maligní hypertermií a u Duchennvy mydystrfie (DMD). U DMD může djít k srdeční arytmii, myglbinurii a dalšímu zvýšení kreatinkinázy v séru. U většiny tevřených bipsií pstačí infiltrace kůže a pdkží lkálním anestetikem (bez adrenalinu). Je však třeba vyhnut se infiltraci debíranéh svalu! Incize 3-5 cm ve směru dluhé sy knčetiny pskytuje dstatečně ple pr dběr svalu, kteréh je třeba pdle mžnstí debrat asi 100 mg (tedy blček rzměrech zhruba 12x7x6 mm). Takvé mnžství tkáně většinu pr pacienta neznamená funkční deficit. Při zachvání vyskéh chirurgickéh standardu jsu kmplikace takvéh výknu (hematm, herniace svalu defektem ve fascii, dehiscence rány neb infekce) zcela výjimečné. Kntakty na chirurgická pracviště, které s naší labratří splupracují na prgramu svalvých bipsií, je na knci statě, v kapitle 9. Při nevyhnutném dběru svalvé bipsie mim FN Mtl je třeba předem se dmluvit s naší labratří a synchrnizvat dběr a rychlé dpravení nativní tkáně d našich labratří! 5. Manipulace se svalvu bipsií p dběru, transprt Je-li svalvá bipsie prváděna v blízksti mypatlgické labratře, vyjmutý vzrek svalu šetrně ulžíme d Petrih misky na mul navlhčený fyzilgickým rztkem a kamžitě jej transprtujeme d biptické labratře. Vlhké prstředí by měl zabránit vysychání tkáně. Sval by však v žádném případě neměl plavat ve fyzilgickém rztku tak djde ve tkáni pměrně rychle k tvrbě artefaktů. V žádném případě by neměl být vzrek vlžen d frmlu! Takt fixvaný a psléze d parafínu zalitý sval je pr standardní mypatlgické vyšetření p krátké chvíli zcela znehdncen velmi rychle dchází ke kntrakčním artefaktům, k extrakci lipidů, vyplavení glykgenu a hlavně k inaktivaci svalvých enzymů. Napak, svalvá tkáň má p určitu dbu (až něklik hdin) p excizi zachvanu enzymaticku aktivitu, která se dá prkazvat enzymvu histchemií ve zmražených řezech. Takvu tkáň lze také pdrbit analýzám ve specializvaných labratřích zkumající metablické či mitchndriální pruchy. Frml v nepslední řadě zničí důležité epitpy svalvých prteinů, které prkazujeme imunhistchemicky; prtilátky pužívané v mypatlgii ttiž zatím téměř výlučně vyžadují nefixvanu mraženu tkáň. Je-li dběr prváděn mim přímý dsah mypatlgickéh centra a svalvu tkáň není mžné na místě dběru příslušným způsbem zmrazit, je vhdné svalvý blček šetrně umístit d uzavřené zkumavky s vlženým navlhčeným tampónem. Uzavřenu zkumavku je Ústav patlgie a mlekulární medicíny UK 2. LF a FN Mtl Labratř neurpatlgie a svalvých bipsií 5
ptm třeba umístit d termsky se směsí vdy a ledu a ihned transprtvat. Dba d dběru p definitivní zpracvání by i při tmt patření neměla přesáhnut dvě až tři hdiny. Pak již ve tkáni pčínají autlytické změny. 6. Zpracvání vzrku v biptické labratři Svalvá tkáň je ihned p převzetí zpracvána, většinu frakcinvaně. Ve většině případů je drbný svazeček z blčku ddělen žiletku, napnut na špejli a fixván v parafrmaldehydu pr ptřebu pltenkých řezů a elektrnmikrskpické vyšetření. Pkud je materiálu dstatek, je drbnější úsek fixván také 10% pufrvaným frmlem a zhtvuje se parafinvý blček. Takt zpracvaný sval pskytuje mžnst lepší identifikace zánětlivých elementů, zejména při pdezření na zánětlivé mypatie. Většina debrané tkáně se ale mrazí v mrazicím mediu, které pskytne dstatečný tepltní spád, ale zárveň nevyvlá ve svalu mrazvé artefakty. Při prstém zmražení svalu v tekutém dusíku, který má velmi nízku tepltu, djde k tvrbě krystalů, které zdestruují svalvu tkáň. V naší labratři prt pužíváme tekutý izpentan, který je umístěn v nádbce pnřené v tekutém dusíku. Dsáhneme tak mírnější, ale dstatečnu tepltu pr zmražení a k tvrbě mrazvých artefaktů nedchází. S úspěchem lze také pužívat směs zkapalněnéh prpanu a butanu; tat směs je však výbušná a v rutinním nemcničním prvzu vyžaduje její pužívání příslušná bezpečnstní patření. Svalvu tkáň je nutn před zmražením zrientvat (lupu neb pmcí preparačníh mikrskpu) tak, aby byl vždy jeden blček rientván klm na dluhu su vláken, druhý je lépe zmrazit pdélně. Zrientvaná tkáň je ulžena na krkvu pdlžku a vlžena na 15-20 sekund d vymraženéh izpentanu. Pté je třeba zmražený blček kamžitě transprtvat d krystatu neb d hlubkmrazícíh bxu (-80 C), kde lze takt upravenu tkáň uchvávat p dluhu dbu. Důležité je, aby jednu zmražená tkáň při další manipulaci a při přípravě histlgických preparátů nerzmrzla. Opětvně zmražení by vyvlal ve tkáni mnžství artefaktů. Ze zmražených blčků se v krystatu krájí 8-10 µm silné řezy pr histchemické reakce a 4-6 µm silné řezy pr ptřeby imunhistchemie. 7. METODY BIOPTICKÉHO VYŠETŘENÍ SVALOVÉ TKÁNĚ 7. 1. Přehledná tkáňvá barvení. Při vyšetřvání svalvé bipsie je prvním krkem vždy vyšetření řezu barvenéh klasicku metdu hematxylinem a ezinem. Tt becné tkáňvé barvení je Ústav patlgie a mlekulární medicíny UK 2. LF a FN Mtl Labratř neurpatlgie a svalvých bipsií 6
nezastupitelné, pskytuje velku řadu infrmací a d značné míry vlivňuje indikaci k prvedení speciálních metd. Základní nálezy a diagnstický příns: velikstní klísání svalvých vláken kulatá atrfická vlákna (spíše mypatie) angulární atrfická vlákna (spíše neurpatie) skupinvá atrfie svalvých vláken (neurpatie) perifascikulární atrfie (dermatmyzitida) hypertrfická vlákna (spíše mypatie) další slžky mypatickéh vzrce přítmnst naštípnutých vláken (tzv. fiber splitting) zmnžení vnitřních jader přítmnst nekrtických a regenerujících vláken (destruktivní mypatie) hyalinní vlákna (dystrfinpatie) přítmnst patlgických vakul (metablické mypatie, peridické paralýzy, myzitida s inkluzními tělísky atd.) přítmnst patlgických inkluzí (myzitida s inkluzními tělísky, kngenitální mypatie atd.) stupeň endmysiální a perimysiální fibrózy až "end-stage muscle" přítmnst, slžení a distribuce zánětlivé celulizace (zánětlivé mypatie) alterace cév (např. fibrinidní nekróza stěny cév při vaskulitidách) alterace nervvých (avšak puze hrubé psuzení struktury) změny svalvých vřetének Trichrm mdifikvaný pdle Gmrih. Klasické barvení trichrmem na průkaz klagenu byl pr vyšetření svalvé tkáně mdifikván. Jeh největší příns je v detekci tzv. ragged red fibers (RRF) se zvýšeným bsahem mitchndrií ukazující na mitchndriální pruchu, dále ve znázrnění patlgických inkluzí ve vláknech, jak u myzitidy s inkluzními tělísky neb u tyčinkvé (nemalinvé) mypatie. 7.2. Tkáňvá histchemie, histchemie enzymů Při každém vyšetření ksterníh svalstva je nutné prvést alespň základní histchemické reakce. Tyt reakce pskytují dpvědi na určité tázky znázrní distribuci a změny jedntlivých typů svalvých vláken, přítmnst xidativních enzymů (mitchndrií), lyszmů, glykgenu, glyklytických enzymů, lipidů atd. Nejčastěji pužívané metdy jsu diskutvané v následujícím textu. 1. Myfibrilární ATPáza. Histchemická reakce na průkaz myfibrilární ATPázy je standardem pr rzlišení jedntlivých typů svalvých vláken. Tyt reakce se prvádějí jednak s preinkubací při ph 9,6 (tmavá jsu pak vlákna 2. typu), jednak při ph 4,3 s reverzním kntrastem (tmavá jsu vlákna 1. typu). T má svůj przaický důvd, vždy se lépe psuzuje t, c má tmavší barvu. Ústav patlgie a mlekulární medicíny UK 2. LF a FN Mtl Labratř neurpatlgie a svalvých bipsií 7
Je-li zaptřebí dále rzlišit subtypy vláken 2. typu (2A, 2B, 2C), je nutné prvést tut reakci ještě s preinkubací s ph 4,6. Pr psuzvání distribuce typů svalvých vláken a jejich změn je zásadní znalst místa dběru. Zastupení jedntlivých typů vláken se v různých svalech velmi liší. Zatímc například v m. tibialis ant. je nrmu až 75% vláken 1. typu, v jiném svalu bychm tt museli hdntit už jak predminanci typu svalvých vláken. Základní nálezy a diagnstický příns: Predminance typu svalvých vláken - u kngenitálních mypatií Selektivní atrfie vláken 1. typu čast zárveň s pčetní predminancí u kngenitálních mypatií, např. CFTD (kngeniální disprprce typů vláken), tyčinkvá mypatie atd.; mytnická dystrfie; Werdnig-Hffmannva chrba Selektivní atrfie vláken 2. typu steridní mypatie a Cushingův syndrm, kachexie, prteinvá malnutrice, léze hrníh mtneurnu, myasthenia gravis Seskupvání typu svalvých vláken a skupinvá atrfie neurgenní změny Fkální defekty v barvení, snížení bsahu neb chybění myzinu (ATPáza je sučástí myzinvé mlekuly) - "cre - mypathies", mypatie se ztrátu mysinu 2. Oxidativní enzymy (dehydrgenázy - NADH-TR, SDH), cytchrm c xidáza (COX) Niktinamid adenin dinukletid-tetrazlium reduktáza (NADH-TR) i sukcinát dehydrgenáza (SDH) jsu enzymy lkalizvané v mitchndriích a jejich detekce tedy služí k psuzení jejich mnžství a distribuce. V těcht reakcích se jak akceptr vdíku pužívá nitr-blue tetrazlium, které dává p své redukci charakteristicku šed-mdru barvu. SDH je přítmna jen v mitchndriích, zatímc NADH-TR je bsažena také v cytzlu, resp. v sarkplazmatickém retikulu. Pmcí reakce na NADH-TR zřejmíme tedy nejen mitchndrie, ale také tubulární agregáty. Všechny pdjedntky SDH jsu kódvány jadernými geny a reakce na průkaz SDH tedy detekuje jak nrmální, tak abnrmální mitchndrie. U mitchndriálních mypatií bývají mitchndrie zmnženy, cž se prjeví akumulací SDH-reakčníh prduktu. Při pdezření na mitchndriální mypatii se dále prvádějí reakce na průkaz cytchrm-c-xidázy (COX), enzymu kódvanéh mitchndriální DNA. U mitchndriálních pruch se čast prjeví deficitem vznikají COX negativní (deficientní) vlákna. Kmbinace nálezu zmnžené reakce SDH a přítmnst COX negativních vláken je tedy nejčastějším ukazatelem mitchndriální pruchy. Izlvané zmnžení SDH reakce subsarklemálně však může sekundárně dprvázet další destruktivní mypatie, nárůst je také zřetelný s rstucím věkem. Definitivní ptvrzení mitchndriální mypatie tak náleží labratři specializvané na diagnstiku mitchndriálních pruch. Vzhledem k rzdílnému bsahu mitchndrií ve vláknech 1. a 2. typu mhu tyt reakce také dplnit představu distribuci jedntlivých typů svalvých vláken. Základní nálezy a diagnstický příns: zvýšená subsarklemální akumulace xidativních enzymů (hlavně SDH) - suspektní mitchndriální prucha COX - negativní vlákna - mitchndriální mypatie terčvitá vlákna ( target fibers ): vlákna s centrálním defektem, kde chybí NADH-TR, SDH i ATPázvá aktivita. Klem defektu bývá zóna vyšší reakce, prt vlákna Ústav patlgie a mlekulární medicíny UK 2. LF a FN Mtl Labratř neurpatlgie a svalvých bipsií 8
terčvitá. Pkud tat zóna chybí, jedná se tzv. targetid fibers známka reinervace central cres, multicres a minicres pdbný defekt, většinu selektivně ve vláknech 1. typu základní kámeny diagnózy příslušných kngenitálních mypatií mth-eaten fibres : mnžství drbných defektů v průkazu xidativních enzymů u faciskapulhumerální dystrfie, pletencvých mydystrfií, kulfaryngeální dystrfie, dermatmyzitidy atd. řada dalších nespecifických brazů je nad rámec tht sdělení. 3. Lyszmální hydrlázy (kyselá fsfatáza ACP, nespecifická esteráza NSE). ACP: v nrmálních svalvých vláknech čast nalezneme drbné pzitivity drážející akumulaci lipfuscinu. Při stárnutí neb denervaci se mnžství lipfuscinu i reakce ACP zvyšuje, stále je však lkalizvána subsarklemálně v blízksti jádra. Difúzní intenzivní reakce jak na periferii tak v centru vlákna bývá znakem lyszmálníh střádavéh nemcnění, avitaminózy E neb dprvází mytnicku dystrfii. Lyszmy jsu přirzeně prminentní i ve fagcytujících makrfázích. NSE: reakce bývá silná v blasti neurmuskulární junkce (pr vyský bsah chlinesterázy). Také může znázrnit lyszmy, má však sníženu specifitu než ACP. 4. Peridic acid - Schiff (PAS) reakce, glykgen-fsfryláza a fsffruktkináza Metdu PAS lze prkázat glykgen, stejně jak glyklipidy a glykprteiny. Znázrní se tak také bazální laminy. Specifitu reakce pr glykgen lze zhdntit kntrlní reakcí s vymizením PAS pzitivity p natrávení diastázu.vymizení neb slabení aktivit určitých glyklytických enzymů ve svalvé tkáni je specifické pr příslušná střádavá nemcnění. Základní nálezy a diagnstický příns: výrazné zmnžení glykgenu u střádavých chrb (glykgenóz) zmnžení glykgenu bývá též v ragged red fibers ztráta glykgenu z vlákna p denervaci mírné snížení aktivity glykgen-fsfrylázy glykgenózy typu II a III chybění aktivity glykgen-fsfrylázy glykgenóza typu V deficit aktivity fsffruktkinázy - glykgenóza typu VII 7.3. Imunhistchemie, imunflurescence Zjedndušený princip metdy: Imunhistchemie umžňuje vizuální detekci a lkalizaci antigenu ve tkáni pmcí vazby se specificku prtilátku. P přípravě tkáňvéh řezu s tepelnu revitalizací antigenů se tkáň inkubuje s primární prtilátku (dnes většinu mnklnální). Na tu se p inkubaci navazuje detekční systém tvřený sekundárními a terciárními prtilátkami, které fungují jednak jak určitý zesilvač, jednak je na nich navázána látka (většinu enzym), která p následné reakci s ddaným chrmgenem vyvlá barevnu reakci. Nejčastěji se pužívá perxidázvá metda na prtilátku je navázána perxidáza, která v reakci s 3,3 - Ústav patlgie a mlekulární medicíny UK 2. LF a FN Mtl Labratř neurpatlgie a svalvých bipsií 9
diaminbenzidinem (DAB) vyvlá ve tkáni hnědé zbarvení příslušnéh místa. P dbarvení hematxylinem lze tedy ve tkáni lkalizvat přítmnst zkumanéh antigenu. Imunflurescence pdbná metdika, detekční prtilátky (někdy rvnu primární prtilátky) jsu však značeny flurescenčně (nejčastěji Cy3 neb flurescein, FITC). Výhdu tét metdy je zvýšená senzitivita a mezení rušivéh efektu klní tkáně. Nevýhdu je nestálst preparátu a nutná dstupnst kvalitníh flurescenčníh mikrskpu. Při hdncení svalvých bipsií nejčastěji přistupujeme k imunflurescenčnímu vyšetření až při nejednznačném nálezu imunhistchemickém. K imunhistchemickému vyšetření přistupujeme k němu až na základě nálezu v základních barveních a histchemických reakcích, přirzeně také pdle klinické diagnózy. Jsu tři základní využití imunhistchemie v diagnstické mypatlgii: 1. detekce prteinů v rámci diagnstiky mydystrfií 2. detekce antigenů, které nejsu ve tkání za nrmálních klnstí přítmny - imunlgické mechanismy a zánětlivé buňky 3. detekce strukturálních svalvých prteinů - sledvání změn v kvantitě neb v distribuci. 7.3.1. Diagnstika mydystrfií Detekujeme prteiny ascivané s jedntlivými svalvými dystrfiemi. Nejčastěji pzrujeme absenci příslušných prteinů, je-li prtein ve tkáni přítmen, sledujeme slabení reakce neb lžiskvé výpadky v jeh imunexpresi. U všech těcht analýz je třeba pečlivě prvádět pzitivní i negativní kntrly a výsledky krelvat. Spektrum kmerčně dstupných prtilátek se neustále rzšiřuje a nelze je všechny v rámci tét statě pstihnut, dpručuji prt sledvat nabídky příslušných firem. Zde se mezíme na prtilátky většinu pužívané v naší labratři s racinálním diagnstickým významem. Tent výčet bude jistě v buducnsti pdle ptřeby upraven. a. Prtilátky prti prteinům dystrfin-glykprteinvéh kmplexu; u příslušnéh prteinu je uveden nemcnění, které je patgeneticky spjen s jeh deficitem: dystrfin tyčinkvá dména dystrfinu (DYS1, aminkyseliny 1181-1388) DMD/BMD C-terminální dména dystrfinu (DYS2, aminkyseliny 11255-11296) DMD/BMD N-terminální dména dystrfinu (DYS3, aminkyseliny 308-351) DMD/BMD dysferlin LGMD 2B Ústav patlgie a mlekulární medicíny UK 2. LF a FN Mtl Labratř neurpatlgie a svalvých bipsií 10
α - sarkglykan (adhalin) LGMD 2D β - sarkglykan LGMD 2E γ - sarkglykan LGMD 2C δ - sarkglykan LGMD2F α - dystrglykan - LGMD 2I β -dystrglykan -? cavelin-3 - LGMD 1C b. Prteiny jaderné membrány emerin X-vázaná frma Emeryh-Dreifussvy svalvé dystrfie c. Prteiny bazální membrány a extracelulární matrix mersin (α2-laminin) mersin-negativní kngenitální svalvá dystrfie d. Prteiny svalvé membrány mim dystrfinvu su spektrin chybí na nekrtických vláken, ale je přítmen na vláknech s deficientním dystrfinem utrphin-n, utrphin-c za nrmálních klnstí jsu exprimvány jen v blasti neurmuskulární junkce, u dystrfinpatií dchází k jejich upregulaci na pvrchu vláken 7.3.2. Detekce antigenů, které nejsu ve tkání za nrmálních klnstí přítmny a. Detekce imunlgických mechanismů útčný kmplex kmplementu (MAC, C5b-9) nrmálně není přítmen, u dermatmyzitidy nalézáme depzita MAC ve stěně kapilár a drbných cév, dknce i v místech bez přítmnsti zánětlivéh infiltrátu HLA antigeny I. třídy nrmální svalvé vlákn je negativní, u jedntlivých zánětlivých mypatií dchází k různému stupni upregulace a pvrch vláken se stává pzitivním. Za nrmálních klnstí je tent antigen exprimván jen endteliálními buňkami, lymfcyty, ale také na pvrchu regenerujícíh vlákna. b. Základní imunfentypizace zánětlivéh infiltrátu hraje důležitu úlhu v rzlišvání jedntlivých zánětlivých mypatií LCA (CD45RB) - leuccyte cmmn antigen exprimván na pvrchu lymfidních buněk L26 (CD20) - B- lymfcyty CD3 - T-lymfcyty CD4 - T-lymfcyty (CD4+) CD8 - T-lymfcyty (CD8+) CD68 (PGM1) - makrfágy Ústav patlgie a mlekulární medicíny UK 2. LF a FN Mtl Labratř neurpatlgie a svalvých bipsií 11
7.3.3. Detekce strukturálních (sarkmerických) prteinů Tyt prteiny jsu ve tkáni nrmálně přítmny, ale u patlgických prcesů může být změněna jejich kvantita neb distribuce. myziny prtilátky prti těžkému řetezci myzinu pdle specificity lze rzlišit jedntlivé pdtypy svalvých vláken (tzv. slw a fast myziny) fetální/embrynální myzin detekuje regenerující svalvá vlákna desmin výrazně zvýšená reakce a změna distribuce u desminpatií laminin selektivní znázrnění kapilár (pr ptřebu kvantitativní analýzy) aktin 7.4. Immunblting (Western blt) Jedná se pdbně jak v případě imunhistchemie průkaz antigenu (prteinu) ve tkáni, avšak nikli s mžnstí lkalizace antigenu ve tkáňvém řezu, ale z tkáňvéh hmgenizátu. Využívá se buď u takvých antigenů (prteinů), které zatím není z technických důvdů mžn prkázat ve tkáni imunhistchemicky (např. calpain-3), neb v případě ptřeby prkázat změnu délky prkazvanéh prteinu neb jeh prušenu kvantitu (dystrfin u Beckervy mydystrfie). Zjedndušený princip metdy: Zmražená svalvá tkáň se hmgenizuje a prvede se izlace prteinů. Ty jsu psléze elektrfreticky rzděleny na plyakrylamidvém gelu a přebltvány na membránu. Membrána je pak inkubvána s primární prtilátku. Kmplex antigen-prtilátka se pté vizualizuje flurescenčně značeným detekčním systémem expzicí na film. P vyvlání filmu jsu patrny pružky v příslušných vzdálenstech dpvídající veliksti prteinů; hdntí se pmcí velikstníh markeru. Můžeme sledvat: přítmnst neb úplnu abscenci sledvanéh prteinu změny v délce prteinu změnu v mnžství prteinu 7.5. Elektrnvá mikrskpie Před zmražením svalvé tkáně se téměř pkaždé fixuje drbná část svalu parafrmaldehydem pr ptřebu prvedení ultrastrukturálníh vyšetření, které však není zahrnut v rutinním diagnstickém schématu. Ústav patlgie a mlekulární medicíny UK 2. LF a FN Mtl Labratř neurpatlgie a svalvých bipsií 12
P penetraci tkáně parafrmaldehydem je blček fixván ještě 3% glutaraldehydem. P fixaci je tkáň rzdělena d zhruba 1 mm 3 velikých blčků, fixvána tetraxidem smia a zalita d pryskyřice. Na ultramikrtmu s diamantvými nži jsu nejdříve krájeny tzv. pltenké řezy síle asi 1 µm, které jsu barveny tluidinvu mdří; ty se prhlížejí ve světelném mikrskpu. Některé mypatlgické škly pužívají tyt řezy jak základ diagnstiky míst přehlednéh barvení hematxylinem a ezinem. V další fázi se vyberu vhdné úseky, které jsu nakrájeny na ultratenké řezy. Ty se následně barví uranylacetátem a citrátem lvnatým, jsu přeneseny na kvvu síťku a mhu se prhlížet, v rzsahu velkých zvětšení pdle mžnstí elektrnvéh mikrskpu. Elektrnvá mikrskpie je nákladná, časvě nárčná a vyžaduje speciální erudici pracvníků labratře. Další nevýhdu tét metdy je mžnst zkumat jen zcela minimální vzrek tkáně. Rzvj mderních technlgií zpracvání tkáně, zejména imunhistchemie, pstupně mezil význam elektrnvé mikrskpie a určil její diagnstický příns jen na mezenu skupinu nemcnění. V mypatlgii zůstávají tyt racinální indikace k jejímu pužití: identifikace inkluzí pzrvaných na úrvni světelné mikrskpie (inclusin bdy mysitis, tyčinkvá mypatie a případně další kngenitální mypatie), viz brazvá přílha, br. 14-15 identifikace střádanéh materiálu a určení jeh intracelulární lkalizace ve sprných případech při pdezření na dermatmyzitidu může ultrastrukturální vyšetření identifikvat tubulretikulární inkluze v endteliálních buňkách elektrnvá mikrskpie může hrát důležitu rli při diagnstice akutní steridní mypatie (ztráta tlustých filament) a může pdpřit diagnózu mitchndriální mypatie (zmnžení mitchndrií, změny v jejich tvaru, intramitchndriální inkluze). 8. Literatura 1. Vgel H., Zámečník J. (2005) Diagnstic immunhistlgy f muscle diseases. J Neurpath Exp Neurl 64(3): 181-193. 2. Zámečník J. (2004) Svalvá bipsie. Speciální mypatlgie. V: Maříkvá T. a klektiv, Neurgenetika svalvých dystrfií a kngenitálních mypatií. Praha: Maxdrf, s. 142-283. 3. S. Carpenter, G. Karpati: Pathlgy f Skeletal Muscle. Oxfrd University Press; 2nd ed., 2001. 4. G. Karpati: Structural and Mlecular Basis f Skeletal Muscle Diseases. ISN Neurpath Press, Basel 2002. 5. A. G. Engel, C. Armstrng: Mylgy. 3rd ed., McGraw-Hill Publisher, 2003. Ústav patlgie a mlekulární medicíny UK 2. LF a FN Mtl Labratř neurpatlgie a svalvých bipsií 13
9. Kntakty Adresa: Ústav patlgie a mlekulární patlgie UK 2. LF a FN Mtl Labratř neurpatlgie a svalvých bipsií V Úvalu 84, 150 06 Praha 5 Lkalizace: Fakultní nemcnice v Mtle, mdrá budva (dspělá část), uzel A, 2. patr Příjem materiálu: P Pá: 7,30-15 hdin; mdrá budva FN Mtl (dspělá část), uzel A, 2. patr, tel. 224 435 615. Nejlépe p dmluvě s p. Cibulu (tel. 224 435 636) neb s dc. Zámečníkem (tel. 224 435 635). Dc. MUDr. Jsef Zámečník, Ph.D. tel. 224 435 635 jsef.zamecnik@lfmtl.cuni.cz Adrian Cibula, veducí labrant tel. 224 435 636 C.Adrian@seznam.cz Svalvé bipsie prvádí splupracující chirurgická pracviště FNM: Dspělí pacienti v rámci jedndenní chirurgie - MUDr. P. Libánský, III. chirurgická klinika UK 1. LF a FN Mtl, kntakt pr dmluvení termínu bipsie: libanskyp@seznam.cz. Další mžnst: prim. MUDr. J. Adámek, I. chirurgická klinika UK 2. LF a FN v Mtle Dětští pacienti - Klinika dětské chirurgie UK 2.LF a FN Mtl, většinu MUDr. J. Trnkvá Pkud je primární pdezření na mitchndriální nemcnění je s výhdu nejdříve zkntaktvat Labratř pr studium metablických pruch UK. 1. LF a VFN (MUDr. L. Wenchich, tel. 224 967 749; wlaca@centrum.cz), kde lze rvněž zajistit dběr svalvé tkáně, která bude frakcinvaně zpracvána v naší i jejich labratři. Některá vyšetření na mitchndriální pruchy ttiž vyžadují čerstvu tkáň. Případně lze dmluvit účast pracvníka mitchndriální labratře při dběru jinde. Puze pkud není mžné prvést dběr tkáně ve FN Mtl, lze dmluvit i dběr na jiném místě. Nutn však dpravit d FN Mtl d dvu hdin d dběru. V Praze 25.2.2007 Dc. MUDr. Jsef Zámečník, Ph.D. Ústav patlgie a mlekulární medicíny UK 2. LF a FN Mtl Labratř neurpatlgie a svalvých bipsií 14