Chem. Listy 104, (2010)

Transkript

1 POUŽITÍ AUTOMATIZOVANÉ ELEKTROFORÉZY NA ČIPU PRO STUDIUM LAKTOFERINU A MATRIXOVÝCH METALOPROTEINAS ONDŘEJ ZÍTKA,b *, SOŇA KŘÍŽKOVÁ b, VOJTĚCH ADAM b,c, ALEŠ HORNA d,e, JIŘÍ KUKAČKA f, RICHARD PRŮŠA f, VĚRA ŽÍŽKOVÁ g RENÉ KIZEK b Ústv biochemie, Přírodovědecká fkult, Msrykov univerzit, Kotlářská 2, Brno, b Ústv chemie biochemie c Ústv výživy zvířt pícninářství, Agronomická fkult, Mendelov univerzit v Brně, Zemědělská 1, Brno, d Univerzitní institut, Univerzit Tomáše Bti ve Zlíně, T.G. Msryk 275, Zlín, e Rdnl s.r.o., Okružní 613, Prdubice, f Ústv klinické biochemie ptobiochemie, 2. Lékřská fkult, Univerzit Krlov, V Úvlu 84, Prh 5, g Výzkumný ústv pletřský, Šujnovo náměstí 3, Brno kizek@sci.muni.cz Došlo , přeprcováno , přijto Klíčová slov: čipová elektroforéz, gelová elektroforéz, proteiny, lktoferin, metloproteinsy, utomtizce Úvod Kpilární elektroforéz n čipu umožňuje simultánní nlýzu ž několik desítek vzorků během několik minut. Nespornou výhodou mikročipů je minimální objem vzorku potřebný pro nlýzu, obvykle v řádech pikolitrů. Prvním přístrojem zloženým n mikročipech byl integrovný plynový chromtogrf v roce 1979 (cit. 1 ). I přesto, že toto zřízení nebylo komerčně úspěšné, předznmenlo nástup dlších zřízení zložených n mikročipech, především v kpilární elektroforéze nukleových kyselin, nízkomolekulárních látek, le i peptidů proteinů. Seprce nlytů probíhá v knálcích vyleptných do mikročipu z použití mikrofbrikčních technik. Poté, co jsou n čip nneseny všechny roztoky, jsou vzorky elektrokineticky vprveny do injektorové oblsti. Následně probíhá elektroforetická seprce vzorků detekce nejčstěji pomocí lserem indikovné fluorescence 2 4. Komerčně dodávné čipy pro detekci proteinů, RNA DNA jsou ukázány n obr. 1. První systém pro denturční čipovou elektroforézu proteinů v přítomnosti SDS (dodecyl sírn sodný) popsl Yo spol. 5, přičemž první komerční zřízení bylo vyvinuto firmou Cliper Technologies v roce 2001 (cit. 6 ). V součsné době jsou k dispozici utomtizovné systémy pro SDS elektroforézu n čipu npř. od firem Cliper Life Sciences, Agilent Technologies, Bio-Rd, GE Helthcre nebo Shimdzu Biotech. Experion je utomtický systém pro elektroforézu n čipu vyvinutý firmou Bio-Rd. Tento systém je použitelný pro detekci seprci DNA, RNA proteinů. Seprce probíhá tzv. Lb on Chip mikrofluidní technologií (Cliper Life Sciences) n mlém destičkovém čipu s následnou fluorimetrickou detekcí. N jednom čipu je možné provést nlýzu ž 10 proteinových nebo 12 vzorků nukleových kyselin během 30 min. Hlvní výhodou, v porovnání s klsickými elektroforetickými systémy, je jednoduchost provedení, sndná obsluh rychlost provedení celé nlýzy včetně zprcování dt. Při nlýze proteinů oproti klsické SDS-PAGE (polykrylmidová gelová elektroforéz v přítomnosti SDS) odpdjí čsově náročné kroky zhrnující příprvu gelů detekci proteinů pomocí Coomssie Blue, odbrvování gelů, jejich dehydrtci dokumentci. V přípdě nlýzy RNA vzhledem k jejich náchylnosti k degrdci všudypřítomnými RNAsmi je obrovskou výhodou celého procesu jeho rychlost. Výsledky jsou dostupné ihned po nlýze. Dlší výhodou je i utomtická reltivní i bsolutní kvntifikce seprovných biomkromolekul. Při práci s Experionem je nutné mít n pměti určitá omezení, kterými jsou posun molekulových hmotností některých detegovných proteinů ve srovnání s SDS-PAGE, popř. problemtická nlýz polypeptidů s molekulovou hmotností nižší než 10 kd, která je způsoben emisním mximem použitého fluorescenčního brviv 7 9. Obr. 1. Komerčně dodávné čipy pro detekci proteinů, RNA DNA od firmy Bio-Rd * Prezentováno Ondřejem Zítkou n 12. ročníku celostátní soutěže o nejlepší studentskou vědeckou práci v oboru nlytické chemie O cenu firmy Merck. 197

2 Pro své přednosti lze předpokládt upltnění přístroje Experion pro rutinní plikce jko klinická prxe 10, sledování ověřování seprčních procesů 11,12, ověřování odrůdové jkosti 13 15, přesnější reprodukovtelné vyhodnocení restrikční nlýzy DNA 16 kontroly kvlity extrhovných nukleových kyselin 17. Získné závislosti intenzity fluorescence n čse mohou být zhrnuty do dtbází odrůd využity pro ověřování odrůdové jkosti kvlity výrobků 13 15,18. Cílem tohoto článku je shrnutí nšich dosvdních zkušeností s použitím systému Experion pro detekci lktoferinu mtrixové metloproteinsy 9 (MMP-9). Ob proteiny jsou kovy vázjící bez jejich přítomnosti nejsou ktivní. Lktoferin (lktotrnsferin) je metloprotein vyskytující se v grnulích neutrofilů mukózních sekretech, především v mléce. Nižší koncentrce byly nlezeny v slzách, slinách dlších tělesných tekutinách. Biologický význm lktoferinu dosud není zcel objsněn, vzhledem ke své schopnosti vázt železo z okolí vykzuje bktericidní vlstnosti, kromě toho má tké ntiflogistické schopnosti 19. Mimo jiné je schopen modulovt imunitní odpovědi má pozitivní efekt n růst mléčných bkterií, což ještě zesiluje jeho ntimikrobiální působení 20. Mtrixové metloproteinsy jsou enzymy schopné štěpit proteiny extrcelulární mtrix. Tto schopnost je spojuje s mnoh fyziologickými procesy, jko jsou poptóz, děložní cyklus, embryonální vývoj, ovulce nebo zánět, le tké jsou dávány do souvislosti s mnoh onemocněními, npř. rtritid, Alzheimerov chorob, teroskleróz, cévní onemocnění, gstritický vřed, choroby centrální nervové soustvy, jterní cirhóz, metstázy rkovin. Podle substrátové specifity mechnismů štěpení substrátu se dělí n želtinsy, kolgensy, stromelysiny, mtrilysiny, membránově vázné MMP osttní, přičemž MMP-9 se řdí mezi želtinsy, které štěpí především kolgen (IV, V, VII, X XIV) jko zákldní stvební složku pojivové tkáně 21. Bionlytická chemie zhrnuje řdu rozdílných oblstí počínje kvntifikcí cílového nlytu ve vzorku ž po určení struktury či schopnosti interkce biomkromolekuly s dlšími látkmi. Proto je nezbytné hledt nástroje, které by bylo možné využít pro různé plikce s dobrou opkovtelností zároveň nízkou čsovou náročností. V nší práci jsme se změřili n možnost testovt přístroj Experion pro kvntifikci proteinů zároveň pro studium interkce proteinu s dlším proteinem. Experimentální část Chemikálie Lidská MMP-9 byl dodán firmou Chemicon Interntionl (Temecul, USA). Lyofilizovný prsečí kolgen byl získán od Výzkumného ústvu pletřského (Brno, Česká republik). Stndrd lktoferinu byl dodán firmou NU- TRA ingrediens (Nizozemí). Osttní použité chemikálie byly od firmy Sigm-Aldrich (USA) v ACS čistotě. Čipová gelová elektroforéz Experion Pro nlýzy byl použit čipový elektroforetický systém Experion (Bio-Rd, USA). Vzorky byly připrveny podle metodického postupu dodvtele nlytických kitů (Bio- Rd). Všechny nlyzovné vzorky byly ředěny tk, by koncentrce proteinů nepřesáhl 300 g ml 1. Následně byly 4 l nředěného vzorku smíchány s 2 l redukčního pufru (systémový pufr ve směsi s merkptoethnolem (100%) v poměru 30:1 (v/v)). Tto směs byl ponechán 4 min při 100 C poté bylo přidáno 84 l vody (ACS kvlit, Sigm-Aldrich, Německo). Po nplnění čipu gelem příprvě brvicího roztoku byl zředěná směs vzorku, redukčního pufru vody (6 l) nnesen do jednotlivých jmek v čipu. Jko stndrd byl použit Pro260 Ldder (Bio-Rd), který je součástí nlytického kitu. Pro inkubci vzorků před nlýzou byl použit termomixer (Eppendorf 5430, USA). SDS-PAGE Anlýzy vzorků byly ověřeny polykrylmidovou gelovou elektroforézou v přítomnosti dodecylsulfátu sodného (SDS-PAGE). Pro studium metloproteins lktoferinu byl použit 7,5% seprční gel koncentrce zostřovcího gelu byl 5 %. SDS-PAGE probíhl n prtuře Mxigel od firmy Biometr (Německo). Seprce probíhl při npětí 150 V dokud čelo proteinů nedosáhlo dolního konce gelu (~ 2 h). Během seprce byl gel chlzen vodou. SDS-PAGE detekce proteinů stříbrem byly provedeny podle klsických protokolů 22. Purifikce lktoferinu Vzorky krvského kolostr odebrné po 1, 12, 24, hodinách od porodu byly obdrženy ze Školního sttku Mendelovy univerzity v Žbčicích. Vzorky (~ 10 ml) byly po odběru zmrženy n 20 C. Po rozmržení byl vzorek 10 nředěn v 0,2 M fosfátovém pufru, vortexován centrifugován po dobu 30 min při rpm (Hettich centrifugen, Německo). Po centrifugci byl vzorek filtrován přes 0,45 m filtr opět 10 nředěn 0,2 M fosfátovým pufrem. Jeden ml tkto připrveného vzorku byl z použití peristltické pumpy Minipulse 3 (Gilson, Frncie) plikován n monolitickou kolonu tvořenou iontoměničovým diskem CIM (BIA seprtions, Slovinsko). Enzymová rekce Štěpení kolgenu pomocí MMP-9 bylo prováděno v 0,066 M fosfátovém pufru o ph 7,5. Enzymová rekce probíhl po dobu 30 min při teplotě 70 C. Byl použit následující vstupní koncentrce jednotlivých rektntů: 100 ng MMP-9 20 ng kolgenu. 198

3 Výsledky diskuse Kvntifikce proteinů Softwre k přístroji Experion nám umožňuje zobrzit výsledky v podobě elektroforeogrmu, kde sledujeme závislost výšky fluorescenčního signálu n čse. N obr. 2 je zobrzen detekce stndrdů lktoferinu o různých koncentrcích. Klibrční přímk pro lktoferin (y = 0,0126x 1,978, R 2 = 0,994, reltivní směrodtná odchylk 5,5 %) je ukázán n vloženém obrázku v obr. 2. Detekční limit byl stnoven postupným ředěním jko 125 ng proteinu v 90 l (1,4 g ml 1 ). V porovnání s průtokovou injekční nlýzou spojenou s UV detektorem je detekční limit téměř o dv řády vyšší, le pro detekci lktoferinu v mléce dlších biologických vzorcích, které tento protein obshují, je dosttečný. Nvíc nám tto technik nbízí možnosti sledovt rozkld popř. tvorbu složitějších struktur (vícemerů), které bychom nebyli schopni průtokovou injekční nlýzou postřehnout. Izolce lktoferinu z krvského kolostr byl proveden pomocí monolitické kolony postupu převztého z práce Adm spol 23. Průtok mobilní fáze (5 mm fosfátový pufr o ph 7,25) byl po dobu prvních 20 min seprce 0,75 ml min 1. Během této doby došlo k zchycení proteinů o izoelektrickém bodu 7,25. V 21. min seprce byl fosfátový pufr nhrzen 1,3; 1,5 nebo 2,0 M-NCl, čímž došlo k eluci zchycených proteinů. Po uplynutí 35 min byl kolon regenerován pomocí 1 M-NOH po dobu 10 min. N obr. 2b je ukázán optimlizce seprce lktoferinu n monolitické koloně. Dráh číslo 1 zobrzuje stndrd lktoferinu, kde můžeme vidět intenzivní signál v oblsti M r ~ V dráze číslo 2 je vzorek krvského kolostr před purifikcí. Z obrázku je jsně ptrné, že zstoupení lktoferinu v původním vzorku bylo minimální, byly detegovány především blstní proteiny. Proto jsme následně použili pro vymytí z monolitické kolony tři výše zmíněné roztoky NCl o různých koncentrcích (1,3; 1,5 2,0 M). Anlýzu získných frkcí můžeme vidět v drhách číslo 3, 4 resp. 5. Z obrázku je jsně ptrné, že k nejúčinnější eluci nvázných proteinů došlo z použití 1,5 M-NCl (dráh č. 4, obr. 2b). Výsledky byly srovntelné s dty získnými metodou SDS-PAGE (není ukázáno). Množství lktoferinu kvntifikovného ve vzorcích kolostr odebrných po 1, 12, 24, hodinách od porodu byly 0,8; 0,9; 1,2; 0,6 0,4 g l 1. Výsledky kvntifikce lktoferinu byly srovntelné s výsledky obdrženými pomocí UV detekce 23. Protein-protein interkce Dále jsme se změřili n dlší kovy vázjící protein MMP-9. Použili jsme stejnou koncentrční řdu jko v přípdě lktoferinu získli jsme lineární závislost výšky detegovného signálu n koncentrci v podobě y = 0,0112x 2,015, R 2 = 0,990. Reltivní směrodtná odchylk stnovení byl 6,4 %. Detekční limit stnovený postupným ředěním byl 31,3 ng proteinu v 90 l (350 ng ml 1 ). V předchozí práci jsme studovli elektrochemickými technikmi interkci MMP-9 s kolgenem prokázli jsme, že jsme schopni tento děj citlivě detegovt 24. Rozhodli jsme se použít čipovou elektroforézu pro studium štěpení kolgenu pomocí MMP-9 ověřit tk schopnost této techniky nejen kvntifikovt proteiny, le tké postih- b Obr. 2. Detekce lktoferinu čipovou gelovou elektroforézou. Elektroforeogrm 62,5, 125, 250, 500, 1000, ng lktoferinu (množství proteinu je vztženo n objem 90 µl) (), ve vloženém obrázku je zobrzen klibrční křivk.virtuální gel, L: stndrd Pro- 260, dráh 1: stndrd lktoferinu, 500 ng, dráhy 2 5: kolostrum získné 24 h po porodu izolovné z různých experimentální podmínek, dráh 2: vzorek surového kolostr 10 nředěný v 5 mm fosfátovém pufru o ph 7,25, dráh 3: 1,3 M-NCl, dráh 4: 1,5 M-NCl, dráh 5: 2,0 M-NCl, šipk ukzuje systémové píky (b) 199

4 b Obr. 3. Použití přístroje Experion studium štěpení kolgenu pomocí MMP-9. Virtuální gelový výstup z přístroje Experion: L: stndrd Pro260, dráh 1: 100 ng MMP-9, dráh 2: 100 ng MMP-9 20 ng kolgenu po 30 min při 70 C, dráh 3: 20 ng kolgenu (). SDS- PAGE dráh 1: 100 ng MMP-9, dráh 2: 100 ng MMP-9 20 ng kolgenu po 30 min při 70 C, dráh 3: 20 ng kolgenu (b) nout jejich vzájemné interkce. V dráze číslo 1 n obr. 3 je zobrzen detekce 100 ng MMP-9. V přípdě nlýzy kolgenu (dráh č. 3) není n virtuálním gelu zchycen žádný signál, což odpovídá kompktnosti velké molekulové hmotnosti vláken kolgenu. Interkce obou proteinů přinesl výsledek v podobě směsi frgmentů o různé molekulové hmotnosti, která je zobrzen v dráze číslo 2. Tento výsledek nejen potvrzuje štěpení kolgenu pomocí MMP-9, le tké fkt, že jsme schopni tuto interkci detegovt utomtickou elektroforézou n čipu. Celý experiment jsme tké uskutečnili n SDS-PAGE (obr. 3b). V drhách číslo 1 3 můžeme vidět stndrdy MMP-9 resp. kolgenu. Pomocí této techniky jsme byli schopni detegovt přítomnost frgmentu kolgenu o molekulové hmotnosti přeshující M r , kterou jsme díky přístrojovému omezení nebyli schopni rozlišit pomocí Experionu. V přípdě nlýzy směsi obou proteinů jsme získli řdu frgmentů o různých molekulových hmotnostech s nejsilnějším pásem mezi M r ž , což zcel odpovídá záznmu z utomtické elektroforézy n čipu (obr. 3, b). Dlší frgmenty již nejsou dobře kvntifikovtelné, n rozdíl od čipové elektroforézy, která je citlivější. Závěr Automtizovná čipová elektroforéz je lterntivou klsické SDS-PAGE, kde vyjm několiknásobného zrychlení nlýzy jsou její dlší výhodou výstupy v elektronické podobě ve formě virtuálních gelů závislostí intenzity fluorescence n čse, což umožňuje spolehlivou kvntifikci sledovných proteinů zvyšuje spolehlivost opkovtelnost nlýz. Tto práce byl finncován ze zdrojů MPO 2A- 1591/122 GA AV KAN Dále utoři děkují Ing. Mrii Blbánové z poskytnutí vzorků krvského kolostr. LITERATURA 1. Terry S. C., Jermn J. H., Angell J. B.: IEEE Trns. Electron Devices 26, 1880 (1979). 2. Dolnik V., Liu S. R., Jovnovich S.: Electrophoresis 21, 41 (2000). 3. Dolnik V.: Electrophoresis 29, 143 (2008). 4. Dolnik V., Liu S. R.: J. Sep. Sci. 28, 1994 (2005). 5. Yo S., Anex D. S., Cldwell W. B., Arnold D. W., Smith K. B., Schultz P. G.: Proc. Ntl. Acd. Sci. U.S.A. 96, 5372 (1999). 6. Bousse L., Mourdin S., Minll A., Yee H., Willims K., Dubrow R.: Anl. Chem. 73, 1207 (2001). 7. Zhu K., Nguyen M., Strong W., Whitmn-Guliev C.: Bio-Rd bulletin 2005, Zhu K., Strong W.: Bio-Rd bulettin 2006, Wu F., Strong W.: Bio-Rd bulletin 2007, Debugnies F., Gulbis B., Cotton F.: Act Clin. Belg. 64, 179 (2009). 11. He X., Strong W.: Mol. Cell. Proteomics 4, S365 (2005). 12. Gingrich J., Freeby S., Pulus A.: Mol. Cell. Proteomics 4, S364 (2005). 200

5 13. Sirimornpun S., Suttjit M., Uthykumrn S., Wrigley C. W.: Food Aust. 57, 448 (2005). 14. Uthykumrn S., Btey I. L., Wrigley C. W.: J. Cerel Sci. 41, 371 (2005). 15. Uthykumrn S., Listiohdi Y., Brtt M., Btey I. L., Wrigley C. W.: J. Cerel Sci. 44, 34 (2006). 16. Minucci A., Delibto E., Cstgnol M., Concolino P., Ameglio F., Zuppi C., Girdin B., Cpoluongo E.: J. Sep. Sci. 31, 2694 (2008). 17. Pfffl M. W., Fleige S., Riedmier I.: Biotechnol. Biotechnol. Equip. 22, 829 (2008). 18. Butikofer U., Meyer J., Rehberger B.: Milchwiss.- Milk Sci. Int. 61, 263 (2006). 19. Jenssen H., Hncock R. E. W.: Biochimie 91, 19 (2009). 20. Gonzlez-Chvez S. A., Arevlo-Gllegos S., Rscon- Cruz Q.: Int. J. Antimicrob. Agents 33, 8 (2009). 21. Puente X. S., Snchez L. M., Overll C. M., Lopez- Otin C.: Nt. Rev. Genet. 4, 544 (2003). 22. Krizkov S., Hrdinov V., Adm V., Burgess E. P. J., Krmer K. J., Msrik M., Kizek R.: Chromtogrphi 67, S75 (2007). 23. Adm V., Zitk O., Dolezl P., Zemn L., Horn A., Hublek J., Sileny J., Krizkov S., Trnkov L., Kizek R.: Sensors 8, 464 (2008). 24. Husk D., Adm V., Zitk O., Kukck J., Prus R., Kizek R.: Electronlysis 21, 536 (2008). O. Zítk,b, S. Křížková b, V. Adm b,c, A. Horn d,e, J. Kukčk f, R. Průš f, V. Žížková g, nd R. Kizek b ( Deprtment of Biochemistry, Fculty of Science, Msryk University, Brno, b Deprtment of Chemistry nd Biochemistry, nd c Deprtment of Animl Nutrition nd Forge Production, Fculty of Agronomy, Mendel University, Brno, d University Institute, Toms Bt University, Zlin, e Rdnl Ltd., Prdubice, f Deprtment of Clinicl Biochemistry nd Pthobiochemistry, 2 nd Fculty of Medicine, Chrles University, Prgue, g Reserch Institute for Knitting, Brno): Utilizing Automted Chip Electrophoresis for Study of Lctoferrin nd Mtrix Metlloproteinses Automted chip cpillry electrophoresis ws used in detection nd isoltion of lctoferrin nd humn mtrix metlloproteinse (MMP-9) s well s in investigtion of interctions nd clevge of collgen with MMP-9. The method is sensitive nd simple technique superior to SDS-PAGE. It is useful in proteomic reserch. 201