Směrovaná léčiva a imunostimulace jen experiment nebo nové možnosti?

Transkript

1 Blanka Říhová Směrovaná léčiva a imunostimulace jen experiment nebo nové možnosti? Mikrobiologický ústav AV ČR, v.v.i.

2 FARMAKOLOGICKÝ VÝZKUM

3 Imunitní systém hostitele

4 Kčemu vlastně imunitní systém potřebujeme?

5 STATISTIKA 40 % žen mezi lety má potenciální zhoubné nádory v prsu incidence je 1% 55% mužů mezi lety má potenciální zhoubné nádory v prostatě incidence je 1% 90% populace ve věku let má potenciální zhoubné nádory štítné žlázy incidence je 0.1%

6 Elimination (Cancer Immunosurveillance) Equilibrium γδ NK Genetic instability/ immune selection Protection

7 Effect of pulsed electromagnetic field (BEMER 3000) on the survival of mice bearing EL4 T cell lymphoma (nude mice injected with 15 mg of DOX equiv. of DOX-HPMA HYD ) 100 tum mor size (mm 3 ) days 3,5 µt 10,5 µt 21 µt 35 µt B 732 controls

8 10-12 dní nádorové buňky léčivo+emf nádor Cancer Im mmunoediting Transformed MICA/B ULBP (Human) Elimination (Cancer Immunosurveillance) CD8 + CD4 + CD8 + Mφ Tumor antigens Rae-1 H60 (Mouse) Innate & Adaptive Immunity NKT γδ γδ IFNγ NK NK Perforin TRAIL Protection e.g p53 Danger : uric acid, ECM products Equilibrium γδ CD8 + Rb Ras NKT Carcinogens Radiation Chronic inflammation Inherited Viruses NK Galectin-1 Genetic instability/ immune selection CD8 + NK Escape CD8 + CD4 + CD25 + Treg IDO MHC-I IFNγ resporse CD4 + CD25 + Treg CD8 + smica/b NK Normal 4 měsíce nádor nádorové buňky nádor velikost nádoru (mm 3 ) dny

9 Máme způsoby jak Omezit působení léčiva na zdravé tkáně podávání není doprovázeno nepříjemnými vedlejšími účinky

10 Máme způsoby jak Zvýšit akumulaci léčiva v nádorové tkáni nádor je vystaven agresivnější terapii

11 Máme způsoby jak Zcela nebo podstatně omezit toxicitu vůči imunitnímu systému ten pak může pomoci při konečné likvidaci onemocnění

12

13

14

15 Paul Ehrlich a jeho kouzelná střela Psal se rok 1906 Studies in Immunity, Plenum Press, New York, 1906

16 OD VÝZKUMU K LÉČBĚ nové látky testy in vitro 500 testy in vivo 5 klinické testy 1 použití v klinické praxi

17 POŽADAVKY NA LÉČIVA NOVÉ GENERACE musí se akumulovat v cílové tj. nádorové tkáni - agresivnější léčba vedlejší účinky musí být minimální - podávání ambulantně cirkulace v krevním oběhu musí být prodloužená - podávání nemusí být tak časté léčivo nesmí být během cirkulace toxické - působení je omezeno jen na postiženou tkáň/orgán náklady nesmí být příliš vysoké

18 LÉČIVA NOVÉ GENERACE SE SCHOPNOSTÍ PASIVNÍ NEBO AKTIVNÍ AKUMULACE a b c nerozpustné liposomy rozpustné imunotoxiny vodorozpustné polymerní systémy

19 SMĚROVANÁ POLYMERNÍ LÉČIVA

20 POLYMERNÍ NOSIČE Dextrany Polygalakturonová kyselina Polyglutamová kyselina PEG Poly-L-lysin Blokové kopolymery N-(2-hydroxypropyl)metakrylamid (HPMA)

21 N-(2-hydroxypropyl)metakrylamid HPMA

22 HPMA NOSIČ neimunogenní nemitogenní netoxický neaktivuje komplement neukládá se v organizmu

23 Volné léčivo Směrované léčivo

24 volné léčivo směrované léčivo cílová buňka cílová buňka

25

26 KONFERENCE NIH/NCI-WASHINGTON ZÁŘÍ 2002 a aktivní směrování b pasivní směrování

27 SMĚRUJÍCÍ MOLEKULY Monoklonální i polyklonální protilátky IgG Lektiny Cukry Růstové hormony Transferin

28 STRUKTURA PROLÉČIV PROLÉČIVA PRO AKTIVNÍ SMĚROVÁNÍ PROLÉČIVA PRO PASIVNÍ SMĚROVÁNÍ

29 STRUKTURA DOX-HPMA-Ig DOX Vazba štěpitelná katepsinem B Štěpení katepsinem B

30 STRUKTURA PROLÉČIV PROLÉČIVA PRO AKTIVNÍ SMĚROVÁNÍ PROLÉČIVA PRO PASIVNÍ SMĚROVÁNÍ

31 Struktura nesměrovaného DOX-HPMA (PK1) DOX Štěpení katepsinem B

32 a) Normální tkáň intaktní endotel lymfatická drenáž b) Maligní tkáň diskontinuální endotel omezená lymfatická drenáž

33 TESTOVÁNÍ In vitro prokazuje přímý cytotoxický efekt na nádorové buňky In vivo kromě přímého cytotoxického efektu na nádorové buňky se účastní ještě další systémy (imunitní, nervový, hormonální..)

34 in vivo veritas

35 EXPERIMENTÁLNÍ MODELY

36 A Přežívání myší PRIMÁRNÍ LÉČBA Dox-HPMA HYD B Přežívání myší RETRANSPLANTACE Dox-HPMA HYD Vyléčené myši byly retransplantovány controls 1x75 mg/kg Dox 1x25 mg/kg

37 Immunostimulatory side effects of HPMA-based anticancer drugs Re-transplantation Nu/nu immunocompromized mice Winn s assay DC phagocytosis in vitro DC phagocytosis in vivo Metastatic infiltration of LN Chronic x acute cancer

39 Ochrana před sekundární nádorovou atakou

40 Systemická resistence proti nádoru, kterou navozuje léčba polymerními cytostatiky, záleží na dávce času imunitním systému hostitele

42 Agresivnější léčba nižší protinádorová resistence

44 Přežití po léčbě den 3, 6, 9, 12 nebo počet myší (% %) dny den 3 den 6 den 9 den 12 den 15 kontroly

45 vakcinační okno léčba započatá příliš brzy, příliš agresivně nebo příliš agresivně nebo příliš pozdě vyvolává pouze omezenou protinádorovou resistenci

46 Léčba začíná příliš brzy (nebo příliš gresivně) imunitní system není vystaven dostatečnému množství nádorových antigenů (nádorových buněk) Léčba začíná příliš pozdě efektorové mechanismy imunitního systému jsou vyčerpány

49 Konvenční myši (B/6) mají dokonale vyvinutý imunitní systém s funkční vrozenou i získanou imunitou Imunodefektní (nu/nu) myši nemají, v důsledku vrozeného postižení, získanou imunitu

50 Survival of mice bearing EL4 T cell lymphoma and treated with hyperbranched conjugate B HYD or linear conjugate Dox-HPMA AM - conventional mice su urviving mice (% %) days Hyperbranched B/15mg Hyperbranched B/10mg Linear/15 mg Linear/10 mg Dox Controls

51 Survival of mice bearing EL4 T cell lymphoma and treated with hyperbranched conjugate B HYD or linear conjugate Dox-HPMA AM - nu/nu mice su urviving mice (% %) days Hyperbranched B/15mg Hyperbranched B/10mg Linear/15 mg Linear/10 mg Dox Controls

52 Konvenční myší až stoprocentní resistence Imunokompromitované [(nu/nu) myši] žádná resistence

53 Testování protinádorového léčiva konvenční myši s poškozenou myši imunitou

54 makrofág (APC) dendritická buňka NK buňka (LAK buňka) CD4 Th lymfocyt CD8 CTL plasmatická buňka sekretující protilátky protilátka

56 Winn s assay % surviving mice % surviving mice control day 11, no therapy days control day 21, no therapy day 21, Dox-HPMA-HuIg

57 Winn s assay survival % days. naive cells DOX-HPMA AM -HuIg, tumor progression DOX-HPMA AM -HuIg, tumor regression Doxorubicin, tumor regression

58 Při léčbě vznikají nádorově specifické paměťové buňky, vznikající z populace CD8 + cytotoxických lymfocytů

60 Metastatic infiltration to lymph nodes after treatment with free doxorubicin a HPMA conjugates 70 P+/GFP-cells ratio

62 Acute Acute x chronic cancer chronic mice were injected once with a lethal dose of cancer cells (1x10 5 EL4 mouse T cell lymphoma) mice were injected 5 times with a low dose of cancer cells (1x10 4 EL4 mouse T cell lymphoma) 8 10 days a palpable tumor without palpable tumor 6 th injection of a low dose of cancer cells In days a palpable tumor

63 Survival of mice suffering from acute or chronic cancer (mouse EL4 T cell lymphoma) Dox-HPMA HYD Non-cleavable dendrimer % of surviving mice controls acute cancer 10 mg Dox-HPMA HYD - acute cancer days controls chronic cancer 10 mg Dox-HPMA HYD - chronic cancer

64 Polymerní léčiva na bázi HPMA cytotoxická imunomodulační složka

65 Cytotoxicita a imunomodulace dvojí útok na nádorovou buňku při léčbě polymerními cytostatiky

66 Pacient nevyčerpaný imunitní systém vyčerpaný imunitní systém léčba je účinná účastní se obě složky polymerního léčiva léčba má omezenou účinnost účastní se pouze cytotoxická složka polymerního léčiva

67 VÝHODY SMĚROVANÝCH LÉČIV NA BÁZI HPMA Definovaná vazba léčiva na nosič Kontrolované uvolňování léčiva z nosiče Aktivní akumulace specificky směrovaného léčiva v cílové tkáni Pasivní akumulace léčiva v nádorové tkáni EPR efektem Snížená imunogenicita směrující bílkoviny Prodloužená cirkulace v krevním řečišti Snížená toxicita vůči zdravým orgánům Snížená imunotoxicita

68 Happy tumor cells hidden and growing in defenceless environment Treatment with HPMA-based polymeric conjugates......has not only a direct cytotoxic effect on cancer cells but also causes their unmasking and exposing to effector mechanisms of immune system

69 HPMA polymer Nádorové buňky citlivé S nebo rezistentní R na polymerní proléčivo S S S R R R R SR R S S S S S polymerní proléčivo obsahující doxorubicin Imunogení buněčná smrt a uvolnění nádorových antigenů Navození protinádorové immunity (aktivace dendritických buněk, přirozených zabíječů, T a B lymfocytů) Převzato z: Říhová a spol., Trends in Biotechnology 27, 11-17, 2009

70 Poděkování Ústav makromolekulární chemie AV ČR, v.v.i. Karel Ulbrich Tomáš Etrych Martin Hrubý Petr Chytil Hana Krakovičová Daniela Plocová Robert Pola Jiří Strohalm Martin Studenovský Vladimír Šubr

71 Poděkování Mikrobiologický ústav AV ČR, v.v.i. Jaroslav Betka Jan Bouček Ondřej Hovorka Helena Chmelová Markéta Ibrahimová Martina Kabešová Jiřina Kovářová Marek Kovář Lubomír Kovář Veronika Pakanová Milada Šírová Jakub Tomola David Větvička

72 Děkuji vám!

73 PRVNÍ ZKUŠENOSTI S PODÁNÍM U LIDSKÝCH PACIENTŮ

74 TAA pacientka č. 6 cytokeratin cytokeratin

75 NK A LAK AKTIVITA A ABSOLUTNÍ POČET NK BUNĚK U PACIENTKY Č % zabí íjených cílových buně ěk K 562 Daudi Raji NK abs abs. počet NK dny 1. dávka 2. dávka 3. dávka 1. dávka 2. dávka 3. dávka

76 Aktivita NK buněk u pacientů podání den E.G. J.K. K.R. K.H zdravý dárce NK % zabitých buněk linie K562

77 Koncentrace léčiva v krvi pacientky E.G. po podání Dox-HPMA-HuIg (% injikované dávky) den doxorubicin 1. podání 1 69* podání 1 N.D * % podané dávky

78 PŘEDBĚŽNÉ VÝSLEDKY U PACIENTŮ a podávání není doprovázeno nepříjemnými vedlejšími účinky b není nutná hospitalizace, léčivo se podává ambulantně c léčivo přetrvává v oběhu výrazně déle d je dosahováno dlouhodobé stabilizace onemocnění e kostní dřeň a imunitní systém nejsou poškozeny f část laboratorních testů včetně nádorových znaků je upravena dočasně nebo trvale, další část vykazuje významné zlepšení

79 Apoptosis immunogenic cell death non-immunogenic cell death

80 Imunogenní buněčná smrt

81 CRT is a Ca2+ - binding lectin chaperone that is mostly present in the ER lumen

82 Phagocytosis, processing, maturation, cross-presentation Translocation of CRT to cell surface Anthracyclins, GADD/PP1 inhibitors P elf2α elf2α PS turnover, apoptosis

83 HMGB1 = high mobility group box 1

84 (a) Immature DC (b) TLR4 Engulfed tumor cell in phagosome (c) MHC Class I Phagocytosis Scavenger receptors HMGB1 TLR4 Antigen processing and presentation Binding of HMGB1 to TLR4 MHC Class II Mature DC Tumor cell Released HMGB Cell surface -CRT Anthracyclines Dying tumor cell Anthracyclines

85 Expression of calreticulin (CRT) and heat shock protein (HSP) 110 on mouse EL4 T cell lymphoma a Expression induction local/systemic sample of anti-cancer immune response CRT HSP 110 Dox - HPMA HYD Dox - HPMA AM free Dox c /- d

86 HuIg představuje nejlevnější, nejsnazší a všeobecně použitelné směrování. Proč?

87 HuIg - obsahuje přirozené protilátky, z nichž některé mohou reagovat s receptory nádorů - stimuluje produkci IL-12 a dalších protinádorových a anti-angiogenních cytokinů - zvyšuje aktivitu NK buněk - zvyšuje MW konjugátu (EPR efekt, pasivní akumulace)

88 Apoptóza je fyziologický proces. Předpokládá se, že u lidí takto hyne každý den několik milionů buněk

89 STRUKTURA PROLÉČIV ENZYMATICKY AKTIVOVANÉ PROLÉČIVO ph-senzitivní PROLÉČIVO CH 3 CH 3 H 2 C C H 2 C C C NH O CH 2 HC OH CH 3 x H 3 C HO C O Gly Phe Leu Gly NH y CH 3 CH 3 H 2 C C H 2 C C C NH O x CH 2 HC OH O OH CH 3 C O X NH N C y CH 2 OH O HO O OH O OMe OMe O OH H O O CH 3 OH CH 2 OH CH 2 OH O OH NH 2.HCl

90 Růst nádoru (EL4) po léčbě konjugáty A a B (dávka 5 mg/kg) day velikost nádoru velikost nádoru day velikost nádoru velikost nádoru conjugate A conjugate B conjugate A conjugate B

91 Růst nádoru (EL4) po léčbě konjugáty A a B (dávka 5 mg/kg) day velikost nádoru velikost nádoru day velikost nádoru velikost nádoru conjugate A conjugate B conjugate A conjugate B

92 Růst nádoru (EL4) po léčbě konjugáty A a B (dávka 5 mg/kg) day velikost nádoru velikost nádoru day velikost nádoru velikost nádoru conjugate A conjugate B conjugate A conjugate B ex ex ex ex ex ex ex ex 0 ex 0 ex 0 ex 0 ex 2601 ex 3179 ex ex ex ex ex ex ex ex ex ex

93 Růst nádoru (EL4) po léčbě konjugáty A a B (dávka 5 mg/kg) day velikost nádoru velikost nádoru day velikost nádoru velikost nádoru conjugate A conjugate B conjugate A conjugate B ex 0 ex 0 ex 0 ex 0 ex 0 ex 0 ex 0 ex 6613 ex ex ex ex ex ex ex ex ex ex ex ex ex ex 56 ex 0 59 ex 0 ex 0 ex 0 ex 0 ex 0 ex 0 ex 0 ex ex ex ex ex ex ex ex ex ex ex ex ex ex ex ex

94 Základní pravidla - během dvou - tří dnů po léčbě nádory přestávají růst - první náznaky jejich zmenšení jsou patrné během 5 6 dnů po léčbě - pokud nádory do deseti dnů nezaniknou nebo se alespoň nezmenší, už na léčbu reagovat nebudou a musí se uvažovat o další dávce

95 DC phagocytosis in vitro * * * % of Control EL-4 Spleen

96 DC phagocytosis in vivo % of CFSE+Dendritic Cells