TECHNIKY PCR. PCR - polymerase chain reaction -polymerázová řetězová reakce

Transkript

1 TECHNIKY PCR PCR - polymerase chain reaction -polymerázová řetězová reakce Komponenty nukleových kyselin Nukleotid DNA deoxyguanosid monofosfát (dgmp)

2 Koncept párování bazí je striktně konzervativní Cytosine Guanine Deoxyribosa a fosfát dávají DNA řetězci směr konce dsdna nejsou stejné jednotlivé řetězce duplexu jsou k sobě komplementární 5 end 3 end T A G C HO DNA rětězce duplexu mohou být denaturována a znovu spojena T A G C OH 3 end 5 end

3 T m (melting temperature) je teplota při které je dsdna z poloviny denaturována Tm je závislá na: složení bazí rozpouštědle iontové síle ph délce DNA DNA replikace in vivo vyžaduje několik enzymů separace řetězců syntéza krátkých RNA primerů syntéza dvou nových DNA helixů podílí se enzymy: DNA primasa helikasa DNA polymerasa DNA ligasa SSB-proteiny

4 Vlastnosti DNA polymerasy 1. polymerasová aktivita Replikace probíhá vždy ve směru od 5 na 3 konec Nový nukleotid je přidáván á tedy vždy na 3 OH konec. 2. 3'-5' exonukleasová aktivita -opravná funkce proofreading 3. 5 exonukle exonukleas asová aktivita - odštěpuje RNA primer DNA replikace in vitro vyžaduje pouze jeden enzym DNA Polymerasa 1957 Arthur Kornberg dokázal existenci DNA polymerasy - DNA polymerase I in vitro polymerasa vyžaduje pouze: 4 deoxynukleotidy trifosfáty dsdna templát primer - ssdna nebo RNA s volnou 3'-OH FUNKCE OSTATNÍCH PROTEINů JE in vitro NAHRAZENA ZMĚNOU TEPLOT

5 Syntéza obou řetězců specifické dsdna in vitro 5 3 TTGAGAAAGGAATAAGCAGAATTCGTTCCAAAAAGAATGAGCTGTTGTTTGCAGAAATCGAGTATATGC AACTCTTTCCTTATTCGTCTTAAGCAAGGTTTTTCTTACTCGACAACAAACGTCTTTAGCTCATATACG 3 5 Forward primer dntps 5 3 TTGAGAAAGGAATAAGC DNA POL AACTCTTTCCTTATTCGTCTTAAGCAAGGTTTTTCTTACTCGACAACAAACGTCTTTAGCTCATATACG TTGAGAAAGGAATAAGCAGAATTCGTTCCAAAAAGAATGAGCTGTTGTTTGCAGAAATCGAGTATATGC AACTCTTTCCTTATTCGTCTTAAGCAAGGTTTTTCTTACTCGACAACAAACGTCTTTAGCTCATATACG 3 5 Syntéza obou řetězců specifické dsdna in vitro 5 3 TTGAGAAAGGAATAAGCAGAATTCGTTCCAAAAAGAATGAGCTGTTGTTTGCAGAAATCGAGTATATGC AACTCTTTCCTTATTCGTCTTAAGCAAGGTTTTTCTTACTCGACAACAAACGTCTTTAGCTCATATACG TTGAGAAAGGAATAAGCAGAATTCGTTCCAAAAAGAATGAGCTGTTGTTTGCAGAAATCGAGTATATGC DNA POL TCTTTAGCTCATATACG 3 5 dntps Reverse primer 5 3 GCATATACTCGATTTCT 5 3 TTGAGAAAGGAATAAGCAGAATTCGTTCCAAAAAGAATGAGCTGTTGTTTGCAGAAATCGAGTATATGC AACTCTTTCCTTATTCGTCTTAAGCAAGGTTTTTCTTACTCGACAACAAACGTCTTTAGCTCATATACG 3 5

6 PCR: Co to je? Polymerase Chain Reaction: znamená amplifikace (mnohonásobná replikace) relativně krátkých úseků specifické DNA Základní nástroj molekulární biologie se vzrůstájícím významem i v dalších oborech (botanika, kriminalistika) The idea Ghobind Khorana 1971 Kary Mullis 1983 Nobelova cena 1993 poprvé provedená mnohonásobná in vitro replikace ve zkumavce Jak funguje PCR Řetězová reakce vychází z DNA replikace Spočívá v opakování cyklů denaturace (separace dsdna), navázání primerů a elongace primerů (syntéza nového vlákna DNA) pomocí změn teploty potřeba silného enzymu (polymerasy) který je schopen pracovat při vysokých teplotách termofilní organismy objeveny začátkem 70tých let

7 Jak funguje PCR Polymerasa izolovaná z termofilní baktérie (Thermus aquaticus, Pyrococcus furiosus) zkr. TAQ, PFU Polymerasa až s objevem a použitím TERMOSTABILNÍ POLYMERASY získala PCR na významu Praktické provedení PCR Počáteční denaturace 94 o C 3-5 min denaturace 94 o C 30 sec annealing ~55 o C 30 sec prodlužování 72 o C 1min/kilobáze počet cyklů x

8 Praktické provedení PCR agarozová elektroforéza PCR komponenty Templátová DNA vzorek k amplifikaci Primery krátké specifické úseky DNA zaručující specifitu amplifikace datp, dttp, dctp, dgtp volné stavební jednotky DNA Thermostabilní DNA polymerasa (e.g., Taq, Pfu) Pufr a soli (KCl, MgCl2)

9 Proces PCR Velký nadbytek primeru, dntps a Taq POL k DNA templátu Problémy: PCR je velmi citlivá na kontaminace Častý problém - nespecifická amplifikace Polymerasa pracuje i při nízkých teplotách (e.g., během nastavování reakce) Hot start PCR je řešení (protilátka proti Taq) Amplifikace je často možná i pro ne zcela známou sekvenci primerů např. DNA jiného biologického druhu Degenerované primery (multiple verze s různými bázemi v klíčové pozici (tryptofan + methionin): stupeň degenerace: P R E T T Y F L Y CCA CGA GAA ACA ACA TAC TTC CTA TAC prettyfly protein má kód degenerovaný na 11 pozicích G G G G G T T G T C C C C C tzn. (4)(2)(4)(2)(4)(4)(2)(2)(2)(4)(2) = krát T T T T T A T Touchdown PCR s vyšší přesností v prvních cyklech Maximální velikost produktu +/-5000 bazí pro standardní PCR: Long PCR kits mohou amplifikovat až 35 kbazí

10 Navrhování primerů Primery by měly být bazí dlouhé Nutná znalost alespoň části sekvence amplifikované DNA 3 konec primeru je důležitý: vhodné aby zde byla G nebo C báze Procentuální zastoupení G + C by mělo být 50-60% - ovlivňuje Tm (teplota kdy se váže primer na templát) Primery v jedné reakci by měly mít srovnatelné Tm Vyvarovat se repetitivním sekvencím Tm = (G+C)x4 + (A+T)x2 Vyvarovat se komplementaritě uvnitř či mezi primery degenerované primery max. 20 bp ideální do degenerace 250x Navrhování primerů Příklad navržení primerů: Konvence: DNA se vždy zapisuje ve směru od 5 ku 3 konci Cílová sekvence: (priming místo podtrženo): 5 TATAAGCCATAACGATATTGCTGAGTCAAGTCCACATATCATATGGATGAG AAATGCTTGTGGAGCTGATGTTGATTTGGAGAGACTCTCTCTCTCTCTCTCT CTCTCTCTCTCTCTCTCTCAAACCAGTTAAAGAGTGTGCCAGTAGAG 3 Forward Primer: 5 ATG GAT GAG AAA TGC TTG TG 3 Reverse Primer: 5 ACT GGC ACA CTC TTT AAC TGG 3

11 Praktické provedení PCR objem v mikrozkumavce: ųl složení: Templátová DNA ng1000ng Primery pmols 10mM Tris-CL ph 9.0, 50 mm KCl MgCl mm 50 ųm každého nukleotidu datp, dgtp, dttp, dctp 2 jednotky Taq polymerasy Praktické provedení PCR PCR se provádí v termocyklerech kovový blok z ušlechtilého kovu snadné programování vyhřívané víko

12 PCR Optimalizace Složka AnnealingTeplota - Tm MgCl 2 KCl Enzym, Primer ph Formamid specifická amplifikace nízká nespecifická amplifikace vysoká vysoká nízká vysoká nízká vysoká nízká nespecificky nízká vysoká látky ovlivňující kvalitu PCR: formamid, DMSO, betain atd. pro GC-rich templáty Nespecifická amplifikace Základní typy PCR RT PCR (reverse transcriptase PCR) vlastní PCR předchází syntéza cdna z mrna pomocí RT jako primer slouží GSP (gene specific primer) oligo dt random hexamer primer hledání nových genů tvorba cdna knihoven hledání mutací zjišťování síly exprese různých genů

13 RACE PCR (rapid amplification of cdna ends) vychází z RT-PCR používá se k hledání celé sekvence nového genu nutná alespoň částečná znalost sekvence hledaného genu vhodné pro klonování genů a jeho následnou funkční expresi (GMO)

14 inverzní PCR Amplifikace neznámých segmentů DNA asymetrická PCR sekvenace DNA, příprava hybridizačních sond amplifikuje pouze jeden řetězec dsdna SEKVENCOVÁNÍ DNA automatické sekvenátory využívající asymetrické PCR jednozkumavková reakce PCR s jedním primerem a dideoxyribonukleotidy (ddatp, ddgtp, ddctp, ddttp) dideoxyribonukleotidy značené 4 fluorescenčními markery velice citlivé elektroforetické rozdělení v kapiláře fluorometr s automatickým vyhodnocením

15 multiplex PCR více amplifikací v jedné zkumavce lékařská diagnostika nested PCR 2 po sobě jdoucí PCR zvyšování specificity PCR LA-PCR (long and accurate) amplifikace dlouhých úseků, polymerasové kokteily např. Taq + Pfu polymerasa (180:1) Pwo polymerasa z Pyroccocus woesei DeepVent polymerasa z Termococcus litoralis (hlubokomořská baktérie) DNA polymeráza 5-3 exonukleázová aktivita 3-5 exonukleázová aktivita délka produktu frekvence chyby Taq + 3 kb 10-4 Pfu + 3 kb 1.3 x 10-6 Pwo + 3 kb x 10-6 DeepVent + 12 kb 3.0 x 10-5 long PCR koktejl kb 2.0 x 10-6 PROCESIVITA: jak dlouho se enzym udrží na vlákně STABILITA: kolik minut při denaturační teplotě např Taq 9 min při 97.5 C Pwo 2 hod při 100 C DeepVent 8hod při 100 C

16 in situ RT PCR lokalizace translace a exprese genů real time PCR slouží k přesné kvantifikaci amplifikovaného produktu využití fluorescence interkalačních barviv (etbr) fluorimetr je součástí termocykleru Real-time PCR monitoruje fluorescenci uvolňovanou jako odezvu na každý uskutečněný cyklus v PCR (v reálném čase). + daleko přesnější oproti end-point barvení EtBr při konvenční PCR - náročné na optimalizaci a vybavení

17 aplikace REAL-TIME PCR 1) absolutní kvantifikace množství DNA ve vzorku k externímu standardu, detekce virální či bakteriální DNA, forenzní chemie 2) koncová detekce SNP genotypizace, detekce mutací a polymorfismů 3) relativní kvantifikace princip měření vznikající fluorescence po každém cyklu PCR, stanovení křivek tání

18 chemismus 1) interkalační barviva SYBRgreen interkalace barviva na dvoušroubovici vznikající (amplifikované) DNA precizní výběr primerů nesmí vytvářet dimery nutná kontrola amplifikovaného produktu na křivku denaturačních teplot chemismus 2) hybridizační sondy (TAQman) uvolňování fluorescence po degradaci sondy nutná 5-3 exonukleasová aktivita Taq polymerasy fluorescenční značka: VIC, FAM (fluorescein) zhášeč: Tamra (Tetramethyl-6-Carboxyrhodamine) FRET = Förster/fluorescence resonance energy transfer

19 srovnání TaqMan SybrGreen specifita primery proba PCR podmínky primery PCR podmínky flexibilita singleplex multiplex (max.4) singleplex aplikace kvantifikace SNP detekce kvantifikace cena vysoká nízká kontaminace největší problém PCR aerosol, pipety, staré amplikony částečné řešení URACIL N-GLYKOSYLASA štěpí ss a dsdna s inkorporovaným deoxyuracilem (dutp) termolabilní, 0% aktivita nad 55 C nereaguje s templátem (dttp) dutp v qpcr mixu místo dttp pracuje během nastavení PCR reakce

20 chyby v pipetování templát (cdna) premix (primery, y,p proba,,polymerasa, dntp,,p pufr, srovnávací fluorescenční barvivo) částečné řešení - ROX fluorescence se nemění během PCR cyklů a vzrůstající fluorescence v každé zkumavce vzorku je extrapolována na srovnávací CYCLE NUMBER AMOUNT OF DNA , , , , , , , , , , ,048, ,097, ,194, ,388, ,777, ,554, ,108, ,217, ,435, ,870, ,073,741, ,400,000, ,500,000, ,550,000, ,580,000,000 AMOUNT OF DNA A A AMOUNT OF DNA lineární vynesení PCR CYCLE NUMBER logaritmické vynesení PCR CYCLE NUMBER

21 lineární ~20 do ~1500 C T hodnoty threshold treshold je třeba nastavit tak aby u každého vzorku procházel lineární části křivky C T počet cyklů při kterém fluorescence vzorku překročí threshold (prahovou hodnotu)

22 před každou kvantifikací je třeba vždy udělat standardní křivku absolutní kvantifikace threshold templát: 10x ředění buď přímo cdna, nebo plasmid s naklonovaným genem, který stanovujeme C T koncentrace templátu PARAMETRY STANDARDNÍ KŘIVKY směrnice: ideální -3,32 = 100% efektivita reakce %EFF kolik kopii templátu je zkopírováno v každém cyklu R 2 korelační koeficient (tolerovat se dá ještě 0,995)

23 CYCLE AMOUNT OF DNA AMOUNT OF DNA AMOUNT OF DNA AMOUNT OF DNA 100% EFFICIENCY 90% EFFICIENCY 80% EFFICIENCY 70% EFFICIENCY , ,048 1, ,096 2,213 1, ,192 4,205 2, ,384 7,990 3,748 1, ,768 15,181 6,747 2, ,536 28,844 12,144 4, ,072 54,804 21,859 8, , ,127 39,346 14, , ,842 70,824 23, ,048, , ,482 40, ,097, , ,468 69, ,194,304 1,356, , , ,388,608 2,578, , , ,777, ,898, ,338, , ,554,432 9,307,650 2,408, , ,108,864 17,684,534 4,335, , ,217,728 33,600,615 7,804,726 1,667, ,435,456 63,841,168 14,048,506 2,835, ,870, ,298,220 25,287,311 4,819, ,073,741, ,466,618 45,517,160 8,193,466 MOUNT OF DNA AM %EFF 100% = 2.00x 90% = 1.90x 80% = 1.80x 70% = 1.70x 10,000,000,000 1,000,000, ,000,000 10,000,000 1,000, ,000 10,000 1, % EFF 90% EFF 80% EFF 70% EFF PCR CYCLE NUMBER relativní kvantifikace je možná pouze pokud sledovaný gen a referenční gen má srovnatelnou a vysokou efektivitu > 90% ± 3% REFERENČNÍ GEN relativní kvantifikace musí mít stabilní expresi ve všech studovaných vzorcích nejčastěji provozní geny (house-keeping) actin, GAPDH, cyklofilin, 18S RNA

24 TaqMan Human Endogenous Control Plate ΔC T ΔC T = 2 čtyřnásobný rozdíl v expresi změna v jednom cyklu při 100% efektivitě je rovna dvounásobné změně ve výchozí koncentraci cdna 18S ribosomální RNA přepisována jinou RNA polymerasou než mrna byly popsány výkyvy mezi množstvím rrna a mrna nelze použít pokud se vychází z mrna

25 vyhodnocení kalibrátor sample 1 sample 2 izolace celkové RNA (mrna) přepis do cdna navržení primerů a sond pro referenční gen a studovaný (GOI) určení č standardních d křivek k pro oba geny a stanovení efektivity it GAPDH GOI GAPDH GOI GAPDH GOI vyhodnocení kalibrátor sample A kalibrátor sample B sample A sample B GAPDH GOI

26 1 vyhodnocení změny exprese pro sample 1 metoda delta delta cé té 1. určíme C T pro všechny křivky 2. určíme C T GOI -C TGAPDH pro kalibrátor ΔC T kalibrátor 3. určíme C T GOI -C TGAPDH pro sample 1 ΔC T sample 1 4. ΔC Tsample 1 - ΔC Tkalibrátor ΔΔC T výsledek (kolikrát je gen více či méně exprimován) 2 -ΔΔCT 2 vyhodnocení počítá se i s efektivitou Sample A - kalibrátor Sample B - vzorek

27 3 vyhodnocení pomocí standardů o známe koncentraci se spočítají počty kopií ve vzorcích příklad linie živočišných buněk byla podstoupena umlčení (silencing) genu pkg2 s linie transfekované a netransfekované (kalibrátor) byla izolována RNA, přepsana do cdna a provedeno qpcr s primery a probou na gen pkg2 a GAPDH (referenční gen). Snížila se exprese genu pkg2 po umlčení? pkg2 Eff 86% cdna kalibrator C T 22,48 cdna silencing C T 22,3 GAPDH Eff 77% cdna kalibrator C T 20,05 cdna silencing C T 16,97 -ΔΔCT pkg2 cdna 2 kalibrator 2 (5,33-2,43) (1+0,86) 0,18 /(1+0,77) 3,08 1,1x10 4 kopií DNA 123 1,23x kopií cdna silencing GAPDH cdna kalibrator cdna silencing 0,134 0,192 0,194 Gen snížil expresi 7,5x 5,2x 5,2x 1,55x10 4 kopií 8,92x10 4 kopií

28 navrhování primerů velikost amplikonu bp délka primerů ů 20 bp primery se nesmí překrývat s próbou Tm C optimální teplota pro degradaci proby exonukleasovou aktivitou GC obsah 50-70% žádné vlásenky žádné dimery (self-dimery, cross-dimery)

29 délka proby navrhování proby bp primery se nesmí překrývat s próbou Tm C o 10 C vyšší než Tm primerů GC obsah 50-70% žádné G na 5 konci zháší fluorescenci FAM barvy navrhování primerů a proby

30 kontaminace genomickou DNA 1) ošetření vzorků před RT DNasou 2) navržení primerů do dvou exonů mezi nimiž je dlouhý intron 3) navržení primeru nebo proby na přechod intron/exon minor groove binding MGB PROBY stabilizuje vazbu proby na ssdna výrazně zvyšuje Tm můžeme navrhovat krátké proby při zachování vysoké Tm

31 MGB PROBY využití pro alelické diskriminace

32 kolik replikací a kdy replikovat? sample extrakce RNA přepis do cdna qpcr 3X 6X kolik replikací a kdy replikovat? ideální 3x sample extrakce RNA přepis do cdna qpcr 27X

33 instrumentace 7500 Real Time PCR System 7900HT Real Time PCR System StepONE Real Time PCR System halogenová lampa emisní filtry zesilovač ccd kamera excitační filtry zkumavky se vzorky v peltierovém bloku

34 instrumentace

35 Využití REAL TIME PCR pro detekci jednobodové mutace (lékařská diagnostika) HRM ANALYSA (HIGH RESOLUTION MELT) detekce SNP bez specifických sond díky kvalitní instrumentaci Corbett (±0.02 C) a nové generaci interkalačních barviv (LCGreenPlus)

36 HRM ANALYSA pro amplikony do 200bp Aplikace PCR a využití v praxi

37 Aplikace PCR a využití v praxi DIAGNOSTIKA V MEDICÍNĚ detekce virových a bakteriálních onemocnění Aplikace PCR a využití v praxi DIAGNOSTIKA V MEDICÍNĚ detekce geneticky vrozených chorob (mutace DNA) - AS PCR alelicky specifická PCR primer navržen tak, že mutace odpovídá konci primeru fragmenty DNA s nespárovanými konci se pohybují v elektrickém poli pomaleji - Real time PCR pomocí fluorescenční sondy odpovídající mutaci Např. detekce cystické fibrózy, choroba je podmíněná třínukleotidovou delecí v genu CFTR cystic fibrosis transmembrane regulator

38 Aplikace PCR a využití v praxi NEZÁVADNOST POTRAVIN Aplikace PCR a využití v praxi KRIMINALISTIKA VNRT variable number of tandem repeat vyskytují se na různých lokusech chromozomů a v populací kolísají mezi jedinci i v počtu opakování mezi 4-40x 40 např. ř GTGTGTGT

39 Aplikace PCR a využití v praxi ANALÝZA POTRAVIN molekulárně-genetické zhodnocení surovin živočišného a rostlinného původu, ů které byly vyprodukovány klasickým pěstováním (chovem) nebo s použitím genového inženýrství průkaz falšování potravin druhovou záměnou (rostlinného i živočišného původu) identifikace mikroorganismů kontaminující potraviny nebo EVOLUČNÍ BIOLOGIE geneticky změněných mikroorganismů ORNITOLOGIE používaných jako startovací nebo ochranné kultury v produkci potravin. skot ovce prase koza TEST