Dooreí ro reí odhad ejistot výsledk meí/kliických test v kliických laboratoích Scháek M. ), Friedecký B. ), Kratochvíla J. ), Bdia M. ), Bartoš V. 3) ) VŠCHT Praha, ) SEKK Pardbice, 3) FN Ostrava Na dokmet solracovali leové racoví skiy: Balíková M., Beáková H., Brdika R., Holec V., Král V., Krýsl S., Kcíová J., Peliková K., Tolarová V., Zima T. Obsah. Nejistota meí ojem, zdroje, odhad a výzam.. Defiice a její vysvtleí.. Nejistota v roces akreditace.3. Nejistota jako itegrálí soást roces meí.4. Nejistota a Smrice IVD 98/79 EC.5. Zsoby vyhodocováí ejistot.6. Stadardí, kombiovaá a rozšíeá ejistota 3.7. Dílí ejistoty v kliických laboratoích 3. Odhad kombiovaé ejistoty výsledk a základ vlastích exerimet 4.. Vztah mezi výtžostí a systematicko odchylko (micí metody) 4.. Odhad odíl kombiovaé ejistoty meí odvozeého ze staoveí systematické 4 odchylky (vychýleí, bias) vlastími exerimety.3. Odhad odíl kombiovaé ejistoty meí odvozeého ze staoveí vitrolaboratorí 6 dlohodobé esosti (rerodkovatelosti) vlastími exerimety.4. Zobecí ost - odhad kombiovaé ejistoty 8 3. Odhad kombiovaé ejistoty a základ údaj výrobc 8 4. Sezam ožitých zkratek 9 5. Literatra 0 6. Píloha: Praktické íklady odhad ejistot Úvod Výsledek meí aalyt i arametr dao metodo je v laboratorí medicí, stej jako výsledek každého micího roces, je odhadem skteé kocetrace (obsah, možství). Teto výsledek meí tedy emže edstavovat vlastí exaktí hodot bez zalosti idržeého údaje, kterým je ejistota výsledk. Nejistota výsledk meí edstavje iterval, ve kterém se achází s deklarovao míro ravdodobosti skteý výsledek meí. Nejistota demostrje metrologicko kvalit výsledk mei, zlešje orozmí aalytickém roces a možje orovávat výsledky meí. Bez zalosti ejistoty eí možé odhadot solehlivost výsledk i jeho ožití v kliické raxi. Cílem dooreí je omoci laboratorím racovíkm i odhad ejistot a odíl jejích složek ro jejich vlastí laboratorí meí do té doby, ež bde ijato a akcetováo dooreí meziárodích odborých soleostí, jejichž racoví komise se toto roblematiko rovž zabývají. Dooreí vychází i ze skteosti, že ormy ISO 705 a ISO 589 rováí odhad ejistot vyžadjí. Pedkládaé dooreí vziklo jako kosezs skiy odborík z rzých obor laboratorí medicíy a vysokých škol a edstavje možý reálý ost reí odhad ejistot. Neí to závazý oky, orma i aízeí a je samozejm vedle vlastího ožití v rtií kliické laboratoi reo i k disksi v odboré veejosti. Pozámka: Všde, kde se v text íše o ejistot, míí se samozejm její kvalifikovaý odhad i odhad jejích odíl. Praha, 6..005 --
. Nejistota meí ojem, zdroje, odhad a výzam.. Defiice a její vysvtleí Nejistota je arametr (idržeý k výsledk meí) charakterizjící roztýleí hodot, jež jso, a základ dostých iformací, iazováy/iszováy meé velii. Nejistota vymezje hraice, v ichž je výsledek s dao (rito) ravdodobostí ovažová za srávý, tj. esý a ravdivý. Nejistota obec zahrje moho složek. Nkteré z ich moho být získáy ze statistických distribcí výsledk sérií meí ovlivjících velii charakterizovaých výbrovo smrodato odchylko. Další složky se odhadjí z dat založeých a zkšeostech ebo z jiých iformací. (vol dle VIM [9]) Z hlediska validace metody/ost meí lze ejistot ztotožit s itervalem, který charakterizje, zda byly sly ožadavky, lyocí z daého úel meí - fit for rose. Z hlediska kliické efektivity by mla ejistota meí odrážet ožadavky kladeé a zkošk-vyšeteí tak, aby byla schoa zajistit solehlivé diagostické rozhodováí a úié sledováí teraie... Nejistota v roces akreditace Každý výsledek meí je dorováze vlastí ejistoto meí (ISO 589 [], ISO 705 []). Tam, kde je to vhodé a možé, msí laborato vyhodotit ejistoty meí (ISO 589, odstavec 5.6. []). Norma ISO 589 obsahje ožadavky ro akreditace rtiích kliických laboratoí. Z obsah ormy lye: Odhad ejistot msí být v laboratoi, cházející se o akreditaci rovede a dokmetováy jeho výsledky (tam kde je to možé). Zsob rovedeí odhad ejistoty eí secifiková. Post, který laborato ro odhad ejistoty kokrétího aalyt zvolí, je soástí ost výot výsledk meí a msí být jako takový dokmetová (odstavec 5.5.3). Na rozdíl od certifikát refereích materiál ejso hodoty ejistot meí ve výsledkových rotokolech vády (odstavec 5.8), avšak laborato by mla být schoa a vyžádáí odat iformace o ejistot meí..3. Nejistota jako itegrálí soást roces meí Obeco, stro a výstižo charakterizaci roces meí lze osat ásledov (dle [3]): K dosažeí výsledk meí o ožadovaé kvalit a srovatelosti je ezbyté: Secifikovat meo velii, racoví rozsah meí a ožadovao ejistot. Vybrat vhodo metod (ost-výoet-odmíky meí). Validovat vybrao metod, tj. rokázat vhodost ro daý úel a dále rokázat, že výoty a odmíky meí zahrjí vše, co mže výzam ovlivit výsledek. Vybrat refereí materiál (s ávazostí a refereci). Odhadot ejistot meí jako mír toho, že bylo dosažeo ožadovaé výovdí hodoty výsledk. Nejistota meí je arametrem, který výzam secifikje charakter mící metody již i jejím výbr a je soástí samotého výsledk meí..4. Nejistota a Smrice IVD 98/79 EC Do eského rávího ád je Smrice 98/79 EC [5] imlemetováa ve form vládího aízeí. 453/004 Sb. Soástí tohoto aízeí (odstavec...), stej jako soástí ormy ISO 8- [6], jso sezamy dat, která msí výrobce IVD oskytot jeho živatelm. Nejistota hodot racovích kalibrátor tam eí exlicit ikde zmía, imlicit je však obsažea v ožadavk, že racoví kalibrátory výrobk IVD msí vykazovat ávazost a refereci vyššího ád (odstavec... NV 453 a odstavec 7.6 ISO 8-). Podle ormy ISO 75 (odstavec 4.4) [] msí však mít kalibrátor iaze hodot kocetrace/obsah aalyt i s ejistoto meí. Norma ISO 75 je ro realizaci Smrice 98/79 EC arosto zásadí, takže ejistot kalibrátor msí výrobce dávat kocovém živateli (to je kliické laboratoi) k disozici, akoliv to ai NV 453, ai ISO 8- výslov evádjí..5. Zsoby vyhodocováí ejistot Zsobem (ostem) ty A jso ejistoty vyhodocováy a odklad vlastích meí s ožitím statistických metod. Zsobem (ostem) ty B jso ejistoty odhadováy z údaj evzatých z dokmetace výrobc, odboré literatry, certifikát refereích materiál, ale také moho být formlováa zkšeostmi. Oba osty oskyto odhady dílích ejistot, které se otom sljí odle statistického zákoa o slovaí ejistot (roagace ejistot). --
Výet dílích ejistot a možé zsoby jejich zracováí jso osáy velmi dobe a základí úrovi (a. ISO-GUM 995 [8], EURACHEM/CITAC 000 [5], ISO 748 [4] a dlohá ada dalších rame). Problémem mže být jejich omr obecý charakter, velmi malá orietace a roblémy laboratorí medicíy, ejedotost jejich alikace v raxi. V kliických laboratoích je vhodé dsled vyžívat i ásledjící zdroje dat: exerimetálí data získávaá v rámci ravidelé a bžé laboratorí iosti (vití kotrola kvality, exterí oszováí kvality, validace a verifikace, aalýz kotrolích /refereích materiál, údaj z ravidelého rovádí kalibrací); ejistoty, oskytovaé výrobci, refereími a kalibraími laboratoemi (údaje z certifikát a racoví dokmetace s tím, že tyto údaje bdo od výrobc dsled vyžadováy)..6. Stadardí, kombiovaá a rozšíeá ejistota Stadardí ejistota Její íselá hodota je vyjádea jako smrodatá odchylka (SD). Kombiovaá ejistota - ravidlo šíeí (roagace) ejistot Podle toho ravidla rovádíme výoet kombiovaé stadardí ejistoty: c... kde až jso odhady dílích stadardích ejistot meí. Rozšíeá kombiovaá ejistota U c Rozšíeí se rovádí s ožitím jedodchého vztah: U c = k. c Obvykle se ožívá hodota k = (odovídá ibliž 95% iterval solehlivosti ro ormálí rozdleí)..7. Dílí ejistoty v kliických laboratoích Dlohodobá esost (rerodkovatelost, itermediate recisio) Základem odhad ejistoty meí v kliické laboratoi je dlohodobá esost (rerodkovatelost) meí. Zdrojem dat jso výsledky vití kotroly kvality. Pokd laborato vede v rámci vití kotroly reglaí diagramy, lze získávat údaje o dlohodobé esosti (rerodkovatelosti) z výsledk tohoto sledováí rbž. asový iterval elze ro všechy laboratoe a všechy metody ochoitel staovit jedot. Krají akcetovatelo mezí je etost x ro avšak 5 ezávislých meí jako arosté miimm. Práv aktalizace hodoty ejistoty meí mže být chááa jako rozhodjící krok eriodické verifikace. Míro dlohodobé esosti (rerodkovatelosti) je relativí smrodatá odchylka (CV, %). Systematická odchylka (vychýleí, bias) a výtžost Vychýleí metody (micího ost) se staovje exerimetál a je to rozdíl mezi rmrem výsledk meí a srávo (refereí) hodoto. Pedmtem meí je vhodý refereí materiál, který msí být vždy dorováze údajem o refereí hodot a její ejistot. Prmr meí se zásad staovje za odmíek oakovatelosti meí (v sérii). Pro oteby kliické laboratoe je možé akcetovat v íad edostosti certifikovaých refereích materiál kotrolí materiály s výrobcem rokázao ávazostí a vyšší metrologický stadard a s reým odhadem ejistoty této hodoty. Pijatelá velikost série sestává z miimál deseti meých vzork ( = 0). Pro výoty celkové ejistoty je asto výhodé vyjadovat systematicko složk ejistoty amísto hodoty vychýleí hodoto výtžosti. Jde je o rzý zsob vyjádeí stejého arametr se stej latými íselými hodotami. Zatímco vychýleí je rozdíl mezi rmrem a refereí hodoto, výtžost je omrem stejých ísel. Nejistota vychýleí a výtžosti Ob hodoty, ze kterých se oítá vychýleí metody ebo výtžost, mají svo ejistot. Prví je ejistota refereí hodoty vedeá v certifikát. Drhá je ejistota hodoty rmr, daá oakovatelostí meí a jejich otem (SD/). Z tchto ejistot lze omocí zákoa o roagaci ejistot vyoítat ejistot hodoty vychýleí metody, o. výtžosti. Nejistoty hodot kalibrátor Nejistota kalibrátor bývá dávaá ejastji formo rozšíeé ejistoty U cal s faktorem rozšíeí k =. V rzých blikacích lze alézt rzé zsoby zahrtí ejistoty kalibrátor do rozot ejistot v závislosti a ožitém model meí. V tomto dooreí edokládáme, že ejistota kalibrátor je v rámci aalytického roces imlicit zahrta do výot jakékoli hodoty obsah/možství/kocetrace, tedy i do vychýleí (bias). Proto zde eí ejistota kalibrátor zahrta jako samostatá složka do rozot ejistot. -3-
Nejistoty certifikovaých refereích materiál Tyto ejistoty jso ovio soástí certifikát refereích materiál. Jso vtšio vády formo rozšíeé kombiovaé ejistoty U ref.. Odhad kombiovaé ejistoty výsledk a základ vlastích exerimet Teto ost vychází z edoklad, že systematická odchylka micí metody i dlohodobá vitrolaboratorí esost (rerodkovatelost) získaá z VKK (vití kotrola kvality) jso kostatí v rovovaém rozmezí hodot obsah, možství i kocetrace. Vzhledem k tom, že rozsah meí v kliických oborech obvykle eí extrém široký, mžeme z kostatosti ejistot vycházet. Pokd tom tak eí, je teba zjistit obsahovo/kocetraí závislost obo hlavích složek ejistoty, tj. systematické odchylky a dlohodobé vitrolaboratorí esosti (rerodkovatelosti). Pozámka: Doorje se rit odhad ejistot a dvo a více hodotách obsah ejlée v mezích refereího iterval a ad jeho horí ebo od jeho dolí mezí (dle výzamosti). Doorje se, ožít rzých matri vhodých kotrolích materiál. Další iformace alezete a. v [7]... Vztah mezi výtžostí a systematicko odchylko (micí metody) Výtžost (recovery) je defiováa rovicí: cmeas R () c ref Systematická odchylka (vychýleí, bias) (v íad, že se jedá o rmr výsledk meí) je defiováa rovicí: B c meas c ref () Relativí hodota téže veliiy: cmeas cref Br (3) c ref Z rovic () a (3) mžeme odvodit vztah: B r = R - (4) ebo i vyjádeí v rocetech: B r = R - 00 [%] (5) Z rovice (4) res. (5) lye ímo vztah ro rovost stadardích ejistot relativí systematické odchylky a výtžosti: Br (6) R Varováí! Rovost (6) elatí ro hodoty relativí stadardí ejistoty r obo velii vyjádeé v %... Odhad odíl kombiovaé ejistoty meí odvozeého ze staoveí systematické odchylky (vychýleí, bias) vlastími exerimety Mžeme ostovat dvma zsoby: a) Máme k disozici refereí materiál s certifikovao hodoto kocetrace (obsah, možství) a odhadem její ejistoty. Podmíko je rokázáí ávazosti certifikovaé hodoty dle ormy ISO 75 []. Refereí materiály msí být tedy oízey od výrobc schoých tto ávazost rokázat (a. NIST, IRMM, LGC, BAM, NIBSC aj.). Za výbr refereího materiál je l odovdá laborato, odrob viz citaci [3]. -4-
b) Metoda ídavk se stadardem. Pro staoveí ožijeme kalibrátor, kterým obohacjeme (sikjeme) vzorek íslšé matrice (a. mo, lá krev, atd.). Vzorek mže obsahovat malé možství ativí sbstace, jejíž hodot obsah, možství i kocetraci emsíme zát. Pozor! Bod b) v sob ese složito oblast obohacováí (sikováí) koloidí sseze jako je lá krev. Je zde oteba dodržovat zásady koloidí chemie. V íad lé krve se ejedá o ravý roztok. Výoet ad a) Dao metodo zmíme sigál (a. absorbaci, loch ík, as, atd.) odovídající zvoleém refereím materiál a z jeho hodoty odvodíme odetem z kalibraí závislosti kocetraci ebo hodot obsah sledovaého aalyt, sbstace i arametr (x i ). Meí oakjeme aleso krát ( = 0) za odmíek oakovatelosti (krátký asový iterval, stejý oerátor, stejý ístroj). Ze získaých hodot meí vyoteme aritmetický rmr x, výbrovo smrodato odchylk SD a ríme stadardí ejistot rmr (kdy se též azývá smrodato chybo odhad rmr) jako: x x xi (7) i SD i ( x i x ) (8) SD x (9) o. relativí stadardí ejistot rmr r,x v %: x 00 [%] (0) x r, x Výtžost R (%) se vyote dle vztah: x R 00 [%] () c ref a relativí systematická odchylka (vychýleí, bias) B r (%) B r = R 00 [%] () Relativí ejistot obsah/kocetrace refereího materiál r,ref (%): ref r,ref. 00 [%] (3) c ref Odhad dílí kombiovaé relativí ejistoty vychýleí v % odovídající kombiaci vliv systematické odchylky, vliv ejistoty obsah/kocetrace refereího materiál a vliv ejistoty rmr zmeých hodot je dá vztahem: B [%] (4) r,br r r,ref r,x -5-
Píklad Mjme tyto údaje: x =,565 a..; SD = 0,09 a..; = 0: odtd dle (9) a (0) 0,006 a.. a 0, 3 % c ref =,50 a..; ref = 0, a..: odtd dle (3) r,ref = 4,0 % Dle () a () vyoteme B r =,6 % a akoec dle (4) vyoteme odhad dílí kombiovaé ejistoty: x r,x r,b, 6 4 0, 3 4,8 % r Nkteí atoi dávají edost tom, že edokládají, že systematická odchylka (vychýleí, bias) má rovomré rozdleí a dosazjí do vztah ro výoet odhad kombiovaé ejistoty hodot Pro áš íklad má ak odhad ejistoty r,br hodot: B. r 3,6 3 r,b 4 0,3 4,3 % r Nejvýzamjší složko odhad ejistoty systematické odchylky (vychýleí, bias) je v tomto íad ejistota refereího materiál (>80%). Výoet ad b) Za edoklad vyžití metody ídavk se stadardem dao metodo zmíme odezv vzork (absorbace, locha ík, as atd.) s ativím obsahem sledovaé sbstace (mže být i tzv. blak matrice, které edokládáme, že kocetrace, obsah sledovaého aalyt se blíží k le) a z kalibraí závislosti ebo omocí zvoleé kalibraí metodiky (a. metoda vitího stadard) ak odeteme odovídající kocetraci c vz a kocetraci vzork obohaceého stejým možstvím isté sbstace c vz+sike. Kocetraci isté sbstace (obohaceí, sike) c sike záme. Výtžost R(%) se vyote odle vztah: cvzsikecvz R 00 [%] (5) c sike Za edoklad lieárí závislosti mžeme výtžost vyoítat z hodot sigál (S): Svzsike Svz R 00 [%] (6) S sike Dále ostjeme ve výot stej, jako v edchozím íad, vet oakovaého meí ro výoet odhad ejistoty rmr (mi. 0 meí za odmíek oakovatelosti). Odhad ejistoty obsah, možství i kocetrace sikjící isté sbstace, ze které se iraví sikovaý vzorek, msíme rit z ejistoty, ktero dává výrobce i dodavatel isté sbstace (a. ro kalibrátor). Pi tomto zsob reí výtžosti a její ejistoty je to také zvážit odlišost kterých matric (krev) a ravit exerimetálí ost kvalifikovaým zsobem..3. Odhad odíl kombiovaé ejistoty meí odvozeého ze staoveí vitrolaboratorí dlohodobé esosti (rerodkovatelosti) vlastími exerimety Teto ost je v solad s ormo ISO 575-3 [4] (doorjeme ožití origiálí aglické verze rotože eský eklad ožívá evhodo termiologii!). Post vychází z validaích údaj laboratoe o daé metod (micím ost). Vitrolaboratorí dlohodobá esost (rerodkovatelost) zahrje i radomizovao systematicko odchylk laboratoe, ikoli radomizovao systematicko odchylk metody ebo ost (vychýleí, bias metody). Exerimetálí lá a výoet -6-
Exerimetálí lá soívá ve zmeí sigál a ásledém výot hodot obsah, kocetrace (omocí rzých kalibraích metodik) ro miimál 5 asov odlišeých meí. Požíváme k tom jede komtabilí matricový vzorek (komtabilita = matrií imeost), který msí být stabilí v rbh asov odlišeých meí. Nemsíme zát obsah (kocetraci) daého aalyt, arametr, sbstace, ebo odhadjeme oze romlivost/variabilit meí. Píklad asov odlišeých meí (a. každý de jedo meí) je kázá v ásledjící tablce: Meí 3 4 5 6 7 8 9 0 3 4 5 Hodota,5,56,54,5,49,48,5,56,54,53,5,57,55,5,49 Vyoteme rmr x (dle vztah (7)), smrodato odchylk SD rero (dle vztah (8)) a variaí koeficiet CV rero (%): SD (7) rero CV rero [%] x x P,54 SD rero 0,085 CV rero,3% Pokd míme dlikát, msíme ro vyhodoceí ožít metody aalýzy roztyl! Exerimetálí lá a vyhodoceí (a. omocí Excel) je atrý z ásledjícího ost. Ot msíme získat 5 asov odlišeých hodot kocetrací (obsah) jedoho stabilího vzork, tetokrát v dlicitím mod. Meí 3 4 5 6 7 8 9 0 3 4 5 Hodota,5,56,54,5,49,48,50,56,54,53,5,57,55,5,49 Hodota,53,5,53,5,50,53,54,57,50,5,54,59,5,5,5 Požitím aalýzy dat v Excel (Aova: jede faktor) dostáváme: ANOVA (aalysis of variace) St Zdroj variability SS volosti *) MS F Hodota P F krit Mezi výbry 0,03987 4 0,000999,36 0,055,4 Všechy výbry 0,00635 5 0,00043 Celkem 0,00337 9 *) V Excel se zobrazí Rozdíl, což je evhodý termí (esrávý eklad i lokalizaci) MSB = arametr výot ANOVA (Mea of Sqares Betwee gros) = mezi výbry MSW = arametr výot ANOVA (Mea of Sqares Withi gros) = všechy výbry MSB MSW 0,000999 0,00043 SDrero MSW 0,00043 0,07 x =,56 CV rero =,07% Pi ožití kteréhokoli z výše vedeých ost získáváme: rero = SD rero a r,rero = CV rero -7-
.4. Zobecí ost - odhad kombiovaé ejistoty Zobecíme-li výše vedeý ost ak odhad relativí kombiovaé ejistoty výsledk meí (%) bde vyjáde omocí zákoa o roagaci ejistot a za ožití odhad jedotlivých složek (dle kaitol.. a.3.) takto: B [%] (8) r,tot r,rero r,b r,rero r r,ref r,x r Neí-li k disozici refereí materiál (ebo aleso materiál s rokázao ávazostí hodoty obsah a vyšší metrologický stadard a s dao ejistoto této hodoty), eí možé rit odhad odíl ejistoty lyocí ze systematické odchylky (vychýleí, bias). Pak je teba vycházet z eoveého edoklad, že systematická odchylka (vychýleí, bias) je rova le. V takovémto íad máme k disozici oze údaje o vlastí dlohodobé esosti (rerodkovatelosti) (viz kaitola.3.). Výsledý vzorec ro odhad relativí kombiovaé ejistoty má otom tvar: [%] (9) r,tot r,rero r,rero Vzhledem k eoveém edoklad lového systematické odchylky (vychýleí, bias) (viz výše) bde teto odhad kombiovaé ejistoty v ad íad ravdodob odhodoceý. Tyickými oblastmi ožití této zjedodšeé, avšak v ad íad zejm jedié možé, variaty výot jso tmorové markery, které hormoy, hematologické arametry, hemokoaglace aj. Rozšíeá kombiovaá ejistota U r,tot se vyote odle obvyklého vztah s ožitím koeficiet rozšíeí k (koeficiet rozšíeí se obvykle volí k = ro ormálí rozdleí, obostraý test, = 5 %): U r,tot = k. r,tot [%] (0) 3. Odhad kombiovaé ejistoty a základ údaj výrobc V tomto text máme a mysli výrobce testovacích sorav a aalytických micích systém, iemž edokládáme, že sorava i aalytický systém vyhovje direktiv IVD MD [5] a orm ISO 8- [6]. Výrobci testovacích sorav a aalytických micích systém ro laboratorí medicí jso ovii vádt které výkoové charakteristiky testovacích sorav a aalytických systém, ze kterých mže být odhadta ejistota výsledk meí. Ze základích charakteristik to moho zejméa být oakovatelost a dlohodobá esost (rerodkovatelost): Oakovatelost Rerodkovatelost Pravdivost Výtžost Pesost za odmíek oakovatelosti [] Pesost za odmíek rerodkovatelosti [] Tsost sohlas mezi rmro hodoto získao z velkého ot výsledk meí a ijato refereí hodoto [] Podíl z možství aalyt, ítomého v aalyzovaém vzork zkošeého materiál ebo idaého k m, který je extrahová a odrobová meí [] Withi laboratory reeatability ebo Withi assay variability ebo Itra assay variability Withi laboratory rerodcibility ebo Betwee assay variability ebo Uiformity Treess Recovery asto ve zaeí výrobc eí jedotost a je teba z kotext ávod a ze zkšeosti zjistit, o jaký drh odhad ejistoty se jedá. V každém íad mžeme ro výoet odhad kombiovaé ejistoty ožít oze ty údaje, které ávod (techická/racoví dokmetace výrobce) obsahje. Pokd jaké chybí a je -8-
v silách laboratoe rovést dodateé validaí exerimety, otom ožijeme vlastí výsledky ro zracováí rozot (bilaci) odhad odíl ejistot. V testovacích soravách a aalytických micích systémech jso rovž vedey hodoty kalibrátor (odhady jejich ejistot), jejich odezvy i ožití v daé metod a kotrolí vzorky s deklarovao odezvo ebo iterretací. Do odhad ejistoty výsledk meí msí být zahrty i odhady ejistot kalibrace. Píklad Semiqatitative detectio of secific IgM atibodies to Mycolasma emoiae Maal Savyo Diagostic Ltd. r (itra assay) certifikát: 3,40 % r (iformity ) certifikát: 3,85 % Podle ávod byla metoda kalibrováa, odhadtá relativí ejistota omocí bracketig kalibrace byla,55 %. Odhad kombiovaé relativí ejistoty je ro teto íad dá vztahem: r, 3,4 3,85,55 tot 5,7 % 4. Sezam ožitých zkratek Zkratka Výzam a.. absorbaí jedotka B systematická odchylka (vychýleí, bias) B r relativí systematická odchylka (vychýleí, bias) c cal je daá hodota možství, obsah ebo kocetrace sledovaého aalyt, arametr, sbstace v kalibrátor c meas zmeá hodota možství, obsah ebo kocetrace sledovaého aalyt, arametr, sbstace c ref je refereí hodota možství, obsah ebo kocetrace sledovaého aalyt, arametr, sbstace CV variaí koeficiet F statistika F (Aova) k koeficiet rozšíeí MS odíl SS/st volosti (Aova) oet P hodota P dává ejmeší hladi, a íž by šlo íslšý test zamítot (Aova) R výtžost (recovery) S hodota sigál SD smrodatá odchylka (výbrová) SD rero smrodatá odchylka získaá z dlohodobé esosti (rerodkovatelosti) (výbrová) SS soet tverc (sm of sqares) (Aova) cal ejistota kalibrátor r,x relativí ejistota veliiy x [%] U r,x rozšíeá relativí ejistota veliiy x [%] ref ejistota refereího materiál x ejistota veliiy x U x rozšíeá ejistota veliiy x x stadardí ejistota rmr x (smrodatá chyba odhad rmr) x i ameá hodota obsah/kocetrace x rmrá hodota Další zkratky vedeé v text jso odrob osáy v literate []. -9-
5. Literatra. Plzák Z, Kora I, Friedecký B, Kratochvíla J.: Metrologická termiologie v aalytické laboratoi. M. Bdia (Ed.), CD ROM blikace. Vydal SEKK ve solráci s Erachem-R v roce 003 (dosté a webové adrese htt://www.sekk.cz). ISO 7 5:003. Measremet of qatities i samles of biological origi Metrological traceability of vales assiged to calibrators ad cotrol materials (ISO Geeve 003) 3. Návazost chemických meí. Požíváí refereích materiál v chemické aalýze. Kvalimetrie 4. M. Scháek (Ed.), EURACHEM-R, Praha 004 4. ISO 575-3:00. Accracy (treess ad recisio) of measremet methods ad reslts -- Part 3: Itermediate measres of the recisio of a stadard measremet method (ISO Geeve 994) 5. Directive 98/79/EC of the Eroea Parliamet ad of the Cocil of 7 October 998 o i vitro diagostic medical devices. Official Joral of the Eroea Commities 998; Dec 7: L 33/-L 33/37 6. ISO/CD TR 8-:004. I vitro diagostic medical devices - Iformatio slied by the mafactrer (ISO Geeve 004) 7. Stöckl D., Va Uytfaghe K., Cabaleiro D.R., Thieot L.M.: Calclatio of Measremet Ucertaity i Cliical Chemistry, Cli.Chem. 005, 5/, 76-77 8. Gide to the Exressio of Ucertaity i Measremet (GUM). ISO Geeva, 993 (995) 9. Iteratioal Vocablary of Basic ad Geeral Terms i Metrology (VIM) 3th Editio, FDIS Aril 004 0. ISO 5 95:003. Cliical Laboratory Medicie Reqiremet for Referece Measremet Laboratories (ISO Geeve 003). SN EN ISO/IEC 705:000. Všeobecé ožadavky a zsobilost zkšebích a kalibraích laboratoí (SNI Praha 000). SN EN ISO 589:004 Zdravotické laboratoe Zvláští ožadavky a jakost a zsobilost (SNI Praha 004) 3. ISO 8 53:00. Measremet of qatities i samles of biological origi Metrological traceability of assiged vale for catalytic cocetratio of ezymes i calibrators ad cotrol materials (ISO Geeve 00) 4. ISO/TS 748:004 Gidace for the se of reeatability, rerodcibility ad treess estimates i measremet certaity estimatio (ISO Geeve 004) 5. Erachem/CITAC Gide. Qatifiig Ucertaity i Aalytical Measremet. Secod Editio 000. Peložeo jako Staoveí ejistoty aalytického meí. Kvalimetrie. M.Scháek (Ed). EURACHEM R, Praha 00 6. White GH, Farrace I. et all.: Ucertaity of Measremet i Qatitative Medical Testig. AACB November 004-0-
Píloha: Praktické íklady odhad ejistot Píklad : Staoveí kocetrace glkózy v krevím sér..odhad odíl dílích ejistot... Dlohodobá esost (rerodkovatelost, itermediate recisio, r,rero ) Byla staovea vyhodoceím výsledk vití kotroly kvality za rok 004. Kotrolí materiál : rmr x = 5,4 mmol.l - CV rero =,3 % Kotrolí materiál : rmr x = 3,4 mmol.l - CV rero =,7 % V dalším výot bde ožita rmrá hodota r,rero : CVrero, i i, 3, 7 r, rero %... Nejistoty hodot certifikovaých refereích materiál Hodota systematické odchylky (vychýleí, bias) byla staovea aalýzo certifikovaého refereího materiál CRM DGKL 070 výrobce Referezistitüt für Bioaalytik DGKL (Bo, DE), který byl ožit v rogramech EQA v Nmeck a esk (v esk byl dostý jako validovaý kotrolí materiál SEKK 36). V certifikát tohoto materiál je vede vedle certifikovaé hodoty kocetrace glkózy (c ref = 8,75 mmol.l - ) i odhad rozšíeé kombiovaé ejistoty U r,ref = 0,6 % ro koeficiet rozšíeí k =. To edstavje kombiovao ejistot r,ref = U r,ref / = 0,3 %..3. Systematická odchylka (vychýleí, bias) Výsledky meí refereího materiál za odmíek oakovatelosti: Poet meí: = 0 Prmr meí: x = 8,79 mmol.l - Refereí certifikovaá hodota: c ref = 8,75 mmol.l - Pak se výtžost R a vychýleí B r vyote dle vztah () a (): x 8,79 R 00 00 00,5 % c 8,75 ref B r = R - 00 = 00,5-00 = 0,5 %..4. Nejistota systematické odchylky (vychýleí, bias) Výbrová smrodaté odchylka a stadardí ejistota rmr se vyote: SD xi x 0,4 mmol.l i SD x 0,036 mmol.l x 0,036 r,x 00 00 0,4% x 8,79.. Kombiace odhad dílích ejistot do relativí kombiovaé a rozšíeé ejistoty ( r,tot a U r,tot ) Kombiací dílích ejistot dle vztah (8) dostáváme: B 0,5 0,3 0,4,% r,tot r,rero r r,ref r,x U. 4, % r, tot r, tot Pro koeficiet rozšíeí (k = ) je tedy kombiovaá rozšíeá ejistota staoveí glkózy v krevím sér: U r,tot = 4, % --
Píklad : Staoveí katalytická kocetrace ezym AST (asartátamiotrasferázy) v krevím sér.. Odhad odíl dílích ejistot... Dlohodobá esost (rerodkovatelost, itermediate recisio r,rero ) Byla staovea vyhodoceím výsledk vití kotroly kvality za rok 004. Kotrolí materiál : rmr x =, µkat.l - CV rero =,7 % Kotrolí materiál : rmr x = 3,4 µkat.l - CV rero = 3, % V dalším výot bde ožita rmrá hodota r,rero : CVrero, i i, 7 3, r, rero, 9 %... Nejistoty hodot certifikovaých refereích materiál Hodota systematické odchylky (vychýleí, bias) byla staovováa aalýzo certifikovaého refereího materiál CRM DGKL 070 výrobce Referezistitüt für Bioaalytik DGKL (Bo, DE), který byl ožit v rogramech EQA v Nmeck a esk (v esk byl dostý jako validovaý kotrolí materiál SEKK 36). V certifikát tohoto materiál je vede odhad hodoty katalytické kocetrace AST (c ref =,54 µkat.l - ) a jeho rozšíeé kombiovaé ejistoty U r,ref = 4, % ro koeficiet rozšíeí k =. To edstavje stadardí ejistot r,ref = U r,ref / =, %..3. Systematická odchylka (vychýleí, bias) Výsledky meí katalytické kocetrace AST v refereím materiál za odmíek oakovatelosti: Poet meí: = 0 Prmr meí: x =,38 µkat.l - Refereí certifikovaá hodota: c ref =,54 µkat.l - Pak se výtžost R a vychýleí B r vyote dle vztah () a (): x, 38 R 00 00 93, 7 % c, 54 ref Br R00 93, 7 006, 3 %..4. Nejistota systematické odchylky (vychýleí, bias) Výbrová smrodaté odchylka a stadardí ejistota rmr se vyote: SD xi x 0,03kat.l i SD x 0,007 kat.l x 0,007 r,x 00 00 0,9 % x,38.. Kombiace odhad dílích ejistot do relativí kombiovaé a rozšíeé ejistoty ( r,tot a U r,tot ) Kombiací dílích ejistot dle vztah (8) dostáváme: B,9 ( 6,3 ), 0,9 7,3 % r,tot r,rero r r,ref r,x U. 4, 6 % r, tot r, tot Pro koeficiet rozšíeí (k = ) je tedy kombiovaá rozšíeá ejistota staoveí AST v krevím sér: U r,tot = 4,6 % --
Píklad 3: Staoveí kocetrace TSH (thyreotroi) v krevím sér Požit aalytický mící systém XYZ, otifikovaý dle Smrice rady 98/79 EC a oateý zako CE. 3.. Odhad odíl dílích ejistot 3... Dlohodobá esost (rerodkovatelost, itermediate recisio r,rero ) Byla staovea vyhodoceím výsledk vití kotroly kvality o dob sledováí jedé výrobí šarže kotrolích materiál: Kotrolí materiál : rmr x = 0,4 mu.l - CV rero =,5 % Kotrolí materiál : rmr x = 3,30 mu.l - CV rero = 4, % Kotrolí materiál 3: rmr x = 9, mu.l - CV rero = 5,4 % Z výsledk meí kotrolích materiál je zejmá omr velká závislost esosti meí a kocetraci. Pro výoet ejistoty meí v oblasti kocetrací ad 3 mu.l - bde v dalším výot ožita rmrá hodota r,rero : CVrero, i i 4, 5, 4 r, rero 4, 8 % 3... Odhad ejistoty hodot certifikovaých refereích materiál Pro TSH existje kolik materiál z ady WHO Iteratioal Biological Stadards ad Referece Materials iravovaých NISBC (a.: d IRP for TSH 80/558, ebo 3 rd IS for TSH, 8/565). Obsah TSH v tchto materiálech je defiová v miu bez další metrologické ávazosti. Nejistota deklarovaého obsah je tak dáa oze romlivostí obsah jedotlivých amlí obsahjících teto materiál. Žádý z tchto materiál ebyl v laboratoi k disozici. 3..3. Systematická odchylka (vychýleí, bias) S ohledem a skteosti vedeé v odstavci 3... lze k získáí odhad odíl systematické chyby ožít oze výsledky meí validovaého kotrolího materiál, který byl ožit v systém EHK. Žádý jiý kotrolí materiál stejé i vyšší metrologické tídy eí dostý (zejm stejo kvalit deklarace obsah TSH by ml i komerí kotrolí materiál s kocetrací TSH deklarovao ro ožitý aalytický systém XYZ). Teto ost lze ožít i z toho dvod, že je k disozici dostatek ezávislých výsledk meí získaých stejým aalytickým micím systémem ( XYZ = 56) a výsledek staoveí TSH získaý tmito aalytickými systémy XYZ c valid = 3,7 mu.l - se výzam eliší od celkového rmr všech výsledk všech meí TSH c ALTM = 3,8 mu.l - získaých v EHK omocí všech aalytických systém (celkový oet aalytických micích systém systém = 0 a celkový oet výsledk výsl = 089). Výsledky meí validovaého kotrolího materiál rovedeého za odmíek oakovatelosti: Poet meí: = 0 Prmr meí: x = 4,0 mu.l - Validovaá hodota: c valid = 3,7 mu.l - Validovaá hodota byla získáa jako rmr CoV výsledk úastík EHK, ožívajících aalytický micí systém XYZ o vyloeí odlehlých hodot (oet výsledk XYZ = 56). Odhad stadardí ejistoty hodoty c valid vedeý ve validaím rotokol r,valid = 4,8 % Pak se výtžost R a vychýleí B r vyote dle vztah () a (): x 4, 0 R 00 000, % c 3, 7 valid Br R00 0, 00, % 3..4. Nejistota systematické odchylky (vychýleí, bias) Výbrová smrodaté odchylka a stadardí ejistota rmr se vyote: SD xi x 0,3 mu.l i SD x 0,07 mu.l x 0,07 r,x 00 00 0,5 % x 4 3.. Kombiace odhad dílích ejistot do relativí kombiovaé a rozšíeé ejistoty ( r,tot a U r,tot ) Vycházíme z toho, co bylo vedeo výše: Certifikovaý ai jiý refereí materiál eí k disozici. Namísto ho byl ožit validovaý kotrolí materiál EHK s dao validovao hodoto c valid a její relativí ejistoto r,valid. Kombiací dílích ejistot dle vztah (8) dostáváme: -3-
B 4,8, 4,8 0,5 7, % r,tot r,rero r r,valid r,x U. 4, 4 % r, tot r, tot Pro koeficiet rozšíeí (k = ) je tedy kombiovaá rozšíeá ejistota staoveí TSH v krevím sér: U r,tot = 4,4 % Teto odhad ejistoty však mže být ožit oze ro kocetrace TSH 3,0 mu.l -. 3.3. Odhad ejistot meí ro kocetrace TSH od hodoto 3,0 mu.l - V tomto íad je jediým solehlivým údajem hodota CV rero =,5 %. Jediým kvalifikovaým závrem je, že odhad celkové kombiovaé ejistoty meí kocetrací TSH od 3,0 mu.l - aalytickým systémem XYZ mže být odhadt a hodot U r,tot. r,rero = 5 %. Takto rovedeý odhad je i tak v daém íad a za daého stav v solad s ormo ISO 589. 3.4. Závr Hodota kombiovaé rozšíeé ejistoty (U r,tot = 4,4 %) je jist je ibližým odhadem ejistoty staoveí TSH. Zejm bde odhodocea, ale vzhledem k omezeým možostem rtií kliické laboratoe elze bohžel jiý zsob výot asi ožít a ai doorit. Kvalifikovaý odhad rozšíeé kombiovaé ejistoty staoveí TSH v kliické laboratoi a výše vedeém aalytickém systém XYZ lze rovést JEN ro hodoty kocetrace TSH > 3 mu.l -! V íad ižších hodot TSH je hodota odhad ejistoty meí výraz vyšší a odovídá tak horší dlohodobé esosti metody v oblasti ízkých kocetrací. V raxi je kdy vhodé vádt kolik údaj o ejistot meí v závislosti a kocetraci. -4-
Píklad 4: Staoveí kocetrace fibrioge v kreví lazm Otický koaglometr, výrobce XY. Požit homogeí aalytický mící systém XY, otifikovaý dle Smrice rady 98/79 EC a oateý zako CE. 4.. Odhad odíl dílích ejistot 4... Dlohodobá esost (rerodkovatelost, itermediate recisio r,rero ) Byla staovea vyhodoceím výsledk vití kotroly kvality za rví ololetí rok 005 Kotrolí materiál : rmr x =,8 g.l - CV rero =,5 % Kotrolí materiál : rmr x =,9 g.l - CV rero =, % V dalším výot bde ožita rmrá hodota r,rero : CVrero, i i, 5, r, rero, 3 % 4... Nejistoty hodot certifikovaých refereích materiál Hodota vychýleí/bias byla staovea aalýzo certifikovaého refereího materiál CRM Iteratioal stadard for fibrioge NIBSC Code 98/6; Versio 04 Dated 07 May 004. V certifikát tohoto materiál je vede vedle certifikovaé hodoty kocetrace fibrioge (c ref =,50 g.l - ) i odhad rozšíeé kombiovaé ejistoty U r,ref = 8 % ( ref = 0, g.l - ) ro koeficiet rozšíeí k =. To edstavje stadardí ejistot r,ref = U r,ref / = 4,0 %. 4..3. Systematická odchylka (vychýleí, bias) Výsledky meí refereího materiál CRM NIBSC 98/6 za odmíek oakovatelosti: Poet meí: = 0 Prmr meí: x =,57 g.l - Refereí certifikovaá hodota: c ref =,50 g.l - Pak se výtžost R a vychýleí B r vyote dle vztah () a (): x, 57 R 00 00 0, 8 % c, 5 ref Br R00 0, 800, 8 % 4..4. Nejistota systematické odchylky (vychýleí, bias) Výbrová smrodaté odchylka a stadardí ejistota rmr se vyote: SD xi x 0,049 g.l i SD x 0,05 g.l x 0,05 r,x 00 00 0,58 % x,57 4.. Kombiace odhad dílích ejistot do relativí kombiovaé a rozšíeé ejistoty ( r,tot a U r,tot ) Kombiací dílích ejistot dle vztah (8) dostáváme: B,3,8 4,0 0,58 5,4 % r,tot r,rero r r,ref r,x U. 0, 8 % r, tot r, tot Pro koeficiet rozšíeí (k = ) je tedy kombiovaá rozšíeá ejistota staoveí fibrioge v kreví lazm: U r,tot = 0,8 % 4.3. Závr Vyšší hodota U r,tot je dáa jedak roblémy s dlohodobo stabilito aalyt a také složitostí reí vlastí refereí hodoty refereí istitcí NIBSC zvoleo refereí metodo. -5-
Píklad 5: Staoveí ot/kocetrace lekocyt (WBC) v krvi Požit homogeí aalytický mící systém (atomatický oíta krviek) XY, otifikovaý dle Smrice rady 98/79 EC a oateý zako CE. Namísto dosd ožívaých jedotek 0 9.l - jso v text vády srávé l - ; íselá hodota arametr je však stejá. 5.. Odhad odíl dílích ejistot 5... Dlohodobá esost (rerodkovatelost, itermediate recisio r,rero ) Byla staovea vyhodoceím výsledk vití kotroly kvality za rví ololetí rok 005 dle dooreí hematologické soleosti Kotrola kvality meí krevích obraz a hematologických aalyzátorech (dosté a webové adrese htt://www.sekk.cz v oddíle Ifoservis ). Kotrolí materiál : rmr x =,9 l - CV rero = 3,3 % Kotrolí materiál : rmr x = 7,5 l - CV rero =,9 % Kotrolí materiál 3: rmr x =,7 l - CV rero =,7 % V dalším výot bde ožita rmrá hodota r,rero : CVrero, i i 3, 3, 9, 7 r, rero 3 % 3 5... Nejistoty hodot certifikovaých refereích materiál Hodota vychýleí/bias byla staovea aalýzo refereího materiál RM 45 DGKL-PTB výrobce/dodavatel Referezistitüt für Bioaalytik DGKL Bo. Refereí rotokol/certifikát vyhotovil Physikalisch-techische Bdesastalt - PTB Braschweig (dle orem DIN 5893 4:004). Teto RM byl ožit v rogramech EHK DGKL Bo (Nmecko). V certifikát tohoto materiál RM DGKL-PTB je vede vedle certifikovaé hodoty ot/kocetrace lekocyt (c ref = 7,66 l - ) i odhad rozšíeé kombiovaé ejistoty U r,ref = 4,% (U ref = 0,3 l - ) ro koeficiet rozšíeí k =. To edstavje stadardí ejistot r,ref = U r,ref / =, % 5..3. Systematická odchylka (vychýleí, bias) Výsledky meí refereího materiál za odmíek oakovatelosti: Poet meí: = 0 Prmr meí: x = 7,45 l - Refereí certifikovaá hodota: c ref = 7,66 l - Pak se výtžost R a vychýleí/bias B r vyote dle vztah () a (): x 7, 45 R 00 00 97, 3 % c 7, 66 ref Br R00 97, 300, 7 % 5..4. Nejistota systematické odchylky (vychýleí, bias) Výbrová smrodaté odchylka a stadardí ejistota rmr se30 vyote: SD xi x 0, 9 l i SD x 0, 06 l x 0, 06 r, x 00 00 0, 8 % x 7, 45 5.. Kombiace odhad dílích ejistot do relativí kombiovaé a rozšíeé ejistoty ( r,tot a U r,tot ) Kombiací dílích ejistot dle vztah (8) dostáváme: B 3 (,7 ), 0,8 4,6 % r,tot r,rero r r,ref r,x U. 9, % r, tot r, tot Pro koeficiet rozšíeí (k = ) je tedy kombiovaá rozšíeá ejistota staoveí ot lekocyt v krvi: U r,tot = 9, % 5.3. Závr Odhad rozšíeé kombiovaé ejistoty hodoty kocetrace/ot lekocyt je zejm reálý. Vývoj referece je v této oblasti zatím v lekách, o metrologické ávazosti ai emlv. Svdí o tom i to, že zatím je jede stát EU má refereí laborato (akreditovao dle ormy ISO 595), která a základ vlastí árodí ormy DIN a za omoci árodího metrologického istitt a jeho orgá vedeo refereci meí ot lekocyt rovádí (její data jsme také ožili v íklad). -6-