PROTEOMIKA Pondělí 10/12. Analýza proteinových komplexů. Zvláštní aplikace izotopových metod. Klinická proteomika. MALDI imaging.

Transkript

1 PROTEOMIKA 2018 Pondělí 10/12 Analýza proteinových komplexů Zvláštní aplikace izotopových metod Klinická proteomika MALDI imaging Protein arrays TOP-DOWN???

2 ANALÝZA PROTEINOVÝCH KOMPLEXŮ Afinitní purifikace komplexů s pomocí protilátky tagované proteiny QUICK- SILAC+RNAi knock-down Nativní vícerozměrné separace Blue native/2d elektroforéza Clear native/2d elektroforéza Nativní LC/nativní elektroforéza Proximity labeling

3 BLUE NATIVE ELECTROPHORESIS

4 BLUE NATIVE ELECTROPHORESIS Coomassie G250 serves as substitute for detergents binds on the surface of all membrane and some soluble proteins negative charge shift. Schägger, H. & von Jagow, G. (1991). Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form. Anal Biochem 199,

5 2D (BN-SDS) PAGE sample : added Coomassie brilliant blue G-250 in aminocaproic acid (0.5 M). cathode buffer: Tricine (50 mm), BisTris (15 mm), and Coomassie brilliant blue G-250 (0.02% w/v). anode buffer : BisTris (50 mm).

6 Arabidopsis thaliana mitochondrial proteome by Blue-native 2-DE

7 BLUE NATIVE ELECTROPHORESIS Interferuje s fluorescenční detekcí a enzymatickými esejemi!!!

8 High-resolution CLEAR NATIVE ELECTROPHORESIS CBB je nahrazena anionickýcm detergentem (např. deoxycholát) Detekce Cy3 2D CN-SDS PAGE Wittig et al. Mol Cell Proteomics 6, 7: (2007)

9 NATIVNÍ CHROMATOGRAFIE - NATIVNÍ ELEKTROFORÉZA- LC/MS-MS Analýza železo (hem)-vážících proteinových komplexů v erytroidních buňkách Metabolic labeling of MEL cells by 59 Fe-hemin Anion exchange liquid chromatography Native electrophoresis in presence of Triton X100 MS analysis (Ion trap - LC-MS/MS) Babusiak et al Proteomics. 5(2):

10 Native electrophoretic separation of radioactive fractions A total 13 protein complexes (bands A-M) were analyzed 33 individual proteins were identified.

11 Radioaktivní frakce z chromatografie děleny ELFO a jednotlivé bandy naštěpeny a analyzovány MS Hb hemoglobin (α, β1, β2, δ chains) Prx I peroxiredoxin I Prx II peroxiredoxin II PPI - peptidylprolyl isomerase B IAP integtrin-associated protein Complex 1

12 Ft ferritin Prx I peroxiredoxin I Prx II peroxiredoxin II Hox heme-oxygenase Complex 2 ATPs ATP synthase

13 Hb hemoglobin (α, β1, β2, δ chains) Prx I peroxiredoxin I Prx II peroxiredoxin II CA II carbonic anhydrase II MD cyt. malate dehydrogenase AAT aspartate amino transferase Complex 3 NDK nucleoside diphosphate kinase

14 Prx II peroxiredoxin II Prx IV peroxiredoxin IV NAC Nascent polypeptideassociated complex HSP 2 heat shock protein 2 HSP 110 heat shock protein 110 PDI protein disulfide isomerase ALAD delta aminolevulinic acid dehydratase ATPs ATP synthase Complex 4

15 ANALÝZA PROTEINOVÝCH KOMPLEXŮ Afinitní purifikace komplexů s pomocí protilátky tagované proteiny QUICK- SILAC+RNAi knock-down Nativní vícerozměrné separace Blue native/2d elektroforéza Clear native/2d elektroforéza Nativní LC proteinů-nativní ELFO Proximity labeling

16 Proximity labeling (BioID) Protein zájmu je exprimován jako fuzní protein s biotin ligázou která v přítomnosti biotinu označí proteiny v nejbližším okolí. Označené proteiny se izolují streptavidinem. Roux KJ et al. J Cell Biol Mar 19;196(6):

17 Proximity labeling (k určení lokalizace proteinů) (APEX) Peroxidáza (APEX) je cílena pomocí signální sekvence do cílového kompartmentu (vnitřní membrána MT) kde v přítomnosti biotinfenolu označí proteiny v okolí. Označené proteiny se izolují streptavidinem. Rhee HW et al.,science Mar 15;339(6125):

19 SILAC Stable Isotope Labeling with Aminoacids in Culture HEAVY 1-2 AA značené stabilním izotopem LIGHT běžné AA 13 C-lysine 13 C-arginine smíchání subcell. frakcionace separace štěpení trypsinem LC-MS/MS Bezsérové systémy nebo dializované sérum! Kvantifikace MS Identifikace MS/MS MW

20 Translace Aktuální koncentrace proteinu Degradace

21 Translace Pulsed SILAC Pulse-chase SILAC Aktuální koncentrace proteinu SILAC Degradace Pulse-chase SILAC

22 SILAC Stable Isotope Labeling with Aminoacids in Culture HEAVY 1-2 AA značené stabilním izotopem LIGHT běžné AA 13 C-lysine 13 C-arginine smíchání subcell. frakcionace separace štěpení trypsinem LC-MS/MS Bezsérové systémy nebo dializované sérum! Kvantifikace MS Identifikace MS/MS MW

23 pulsed-silac (psilac) Naznačení různě těžkými aminokyselinami po kratší dobu, než nezbytnou k úplnému proznačení, umožňuje studovat rychlost translace jednotlivých proteinů mezi dvěma a více vzorky LIGHT Lys-0, Arg-0 MEDIUM Lys-4, Arg-6 HEAVY Lys-8, Arg-10 Schwanhausser et al. Proteomics 2009, 9,

24 pulse-chase SILAC (pcsilac) Metoda umožňující studovat změnu translace i degradace po nějakém zásahu Buňky jsou nejdříve kompletně naznačeny těžkým R a následně přeneseny do média s těžkým K. Používáme však pro obě skupiny 2 různé těžké topoizomery R i K. Úbytek peptidů s těžkým R Příbytek peptidů s těžkým K degradace translace Fierro-Monti I, et al. PLoS One Nov 27;8(11):e80423.

25 Vše kompletně naznačeno R6 nebo R10 Značeno K4 nebo K8 Ubývá značeného R (degradace) Přibývá značeného K (translace) Peptidy s Arg Peptidy s Lys

26 Vše kompletně naznačeno R6 nebo R10 Proveden zkoumaný zásah a přeneseno do nového média S K4 nebo K8 Ubývá značeného R (degradace) Přibývá značeného K (translace) Peptidy s Arg Peptidy s Lys

27 Vše kompletně naznačeno R6 nebo R10 Proveden zkoumaný zásah a přeneseno do nového média S K4 nebo K8 V čase ubývá značeného R (degradace) a přibývá lehkého (translace) Přibývá značeného K (translace) a ubývá neznačeného Peptidy s Arg Peptidy s Lys

28 Vše kompletně naznačeno R6 nebo R10 Proveden zkoumaný zásah a přeneseno do nového média S K4 nebo K8 V čase ubývá značeného R (degradace) a přibývá lehkého (translace) Přibývá značeného K (translace) a ubývá neznačeného Peptidy s Arg Peptidy s Lys

29 Další netradiční využití metod založených na inkorporaci stabilních izoptopů Využití vzorku značeného SILAC jako srovnávacího standardu (Super-SILAC) Stanovení intracelulární lokalizace proteinů (LOPIT) Teplotní profilování (thermal profiling)

30 SUPER-SILAC Expresní proteomika pacientských nádorových vzorků. Jako kontrolní standard slouží homogenát ze směsi buněčných linií odvozených ze stejného typu nádoru naznačených metabolicky heavy Arg a/nebo Lys. IP or other analyses Geiger et al. Nat Methods 2010, 7,

31 LOPIT - Localization of organelle proteins by isotope tagging Metody studia subcelulární lokalizace proteinů 1) Na základě signálních sekvencí a struktury 2) Mikroskopie a imunohistochemie 3) Proteomická analýza jednotlivých izolovaných organel 4) APEX 5) LOPIT - Localization of organelle proteins by isotope tagging

32 Proteins in four gradient fractions corresponding to the peaks of organelle distributions are digested with trypsin and the resulting peptides are derivatized with different itraq reagents. Samples are next pooled and analyzed by LC-MS. Proteins derived from the same membrane have similar quantitation profiles, as they co-fractionate in the density gradient. Sadowski PG, et al. Nat Protoc. 2006;1(4):

33 Vacuolar membrane ER PM Mito/chloro Golgi Filled - known Open - predicted

34 THERMAL PROFILING Vazba ligandu zvyšuje teplotní stabilitu PROTEINU, posouvá se teplota denaturace. Lze monitorovat změnu teploty denaturace (teplota kdy dojde k precipitaci a vypadnutí z roztoku ) Detekce rozpustného proteinu v supernatantu

35 THERMAL PROFILING itraq 8plex Reagents TMT 10 plex reagents N N N N 13 CH 2 13 CH 2 15 N+ N+ N+ 15 N+ 13 CH 2 13 CH CH 3 13 CH 3 13 CH 3 N 15 N 15 N 15 N 13 CH 2 13 CH 2 13 CH 2 13 CH 2 13 CH 2 13 CH 2 15 N+ 13 CH 2 15 N+ 13 CH 2 15 N+ 13 CH 2 15 N+ 13 CH 2 13 CH 2 13 CH 2 13 CH

36 THERMAL PROFILING Huber KV, et al. Nat Methods (11): Savitski MM et al. Science. 2014;346(6205):

37

39 KLINICKÁ PROTEOMIKA PLAZMA A SÉRUM a jiné tělní tekutiny

40 Co je to biomarker? Protein nebo peptid vykazující reprodukovatelné rozdíly v expresi či struktuře specifické pro dané onemocnění. Měl by být přístupný ve snadno získatelné tkání či tělní tekutině.

41 Krevní plazma a sérum Dosud spolehlivě identifikováno zhruba 4000 bílkovin Extrémní rozdíly v koncentracích (10 řádů) Albumin pg/ml Interleukin 6 5 pg/ml

42

43 Krevní plazma a sérum Dosud spolehlivě identifikováno zhruba 3500 bílkovin Extrémní rozdíly v koncentracích (10 řádů) Albumin pg/ml Interleukin 6 5 pg/ml 10 hlavních proteinů představuje cca 90% bílkoviny (Albumin, IgG, IgA, Tf, alpha-2 makroglobulin, haptoglobin ) 22 majoritních proteinů představuje více než 99 % bílkoviny složení séra se mění (nejen) při chorobných stavech

44

45 Afinitní mechanismy deplece majoritních proteinů Imunodeplece nejkoncentrovanějších proteinů Top6 Top10 Top12 Top14 Top20 (albumin, IgG, transferrin, haptoglobin, antitrypsin, IgG,.) Protilátky + Cibacron Blue (albumin)+ Protein A, protein G (IgG, IgA) Ekvalizace knihovna náhodných hexapeptidů sloužících jako ligandy ProteoMiner Při depleci jsou odstraňovány asociované proteiny a peptidy! Cena! Nízká reproducibilita!

46 Knihovna náhodných hexapeptidů sloužících jako ligandy ProteoMiner

47 Další tělní tekutiny: Moč: 0-0,2 mg/ml (roste např. při onemocnění ledvin) Mozkomíšní mok:0,5-1 mg/ml (lumbální punkce) Plodová voda: 3-4 mg/ml (aminocentéza, porod) Sliny: 0,8-1,5 mg/ml Slzy: 4-6 mg/ml Dechový kondenzát: 1mg/ml Pot, hlen, výpotky, synoviální tekutina, nitooční tekutina

49 MALDI IMAGING

50 MALDI IMAGING

51

52 70 µm Image of Rat Cerebellum White matter Grey matter Granule cells 70 μm resolution

53 MALDI Imaging of Breast Cancer 1mm Lymphocyte infiltration

54 MALDI Imaging of Breast Cancer 1mm Carcinoma in situ

55 MALDI Imaging of Breast Cancer 1mm Invasive Tumor

56 Clozapine Drug Imaging MH Th MS/MS 192 Th. Binds to cortical D 1 -like dopamin receptors

57 Clozapine Dosed Rat Brain (100 mg/kg) MS/MS 100 mg/kg control

59 PROTEOMIKA 2017 Pondělí 18/12 Analýza proteinových komplexů Zvláštní aplikace izotopových metod Klinická proteomika MALDI imaging Protein arrays TOP-DOWN

60 Proteinové čipy - Protein arrays Protilátky Rekombinantní (izolované) proteiny Proteiny syntetizované in situ Možnosti studia exprese (přítomnosti), fosforylací a interakcí protein-protein nebo protein ligand forward arrays Zakotvená protilátka nebo specifický protein reverse arrays Zakotvený komplexní analyt. (lyzát, sérum a pod)

61 ProtoArray Human Protein Microarray v5.0 ~9,000 human proteins available on a single array All clones fully sequenced Baculovirus Expression System GST tagged Expressed in Sf9 insect cells BSA Screen: Alexa - Mouse Ab MAPKAP Buffer -Human IgG PKCeta interactions antibodies kinase substrates Alexa - Mouse Ab Calmodulin GST Gradie Alexa - Mouse Ab Anti-GST Image Empty PKCeta -Biotin Ab CamK Biotin Ab V5-CamK Human IgG AutoAntigens

62 Identifikace antigenů proti kerým jsou v séru/plazmě protilátky

63 PISA ARRAY Protein In Situ Array DNA není zakotvená Imobilizace: (His) 6 -Ni 2+

64 NAPPA ARRAY Nucleic Acid Programmable Protein Array DNA je imobilizovaná

66 Protein arrays Cílené metody (aqua, MRM/SRM)

67 Protein arrays Cílené metody (aqua, MRM/SRM) TOP-DOWN

68 TOP-DOWN přístup identifikace intaktních proteinů/proteoforem Kellie et al. Mol.Biosyst 6(9):

69 Kellie et al. Mol.Biosyst 6(9):

70 TOP-DOWN identifikace cca 1000 proteinů/3000 proteoforem Mapping intact protein isoforms in discovery mode using top-down proteomics (GELFrEE) - gel-eluted liquid fraction entrapment electrophoresis Tran et al Nature 2011, 480,

71 (GELFrEE) - gel-eluted liquid fraction entrapment electrophoresis Tran et al Anal. Chem. 2008, 80,

72 TOP-DOWN identifikace cca 1000 proteinů/3000 proteoforem Mapping intact protein isoforms in discovery modeusing top-down proteomics (GELFrEE) - gel-eluted liquid fraction entrapment electrophoresis Tran et al Nature 2011, 480,

73

75 12000 Maximální počet bílkovin identifkovaných MS v jediném experimentu Shot-gun introduced SILAC itraq TMT Label free MRM/SRM 2-DE Shot-gun Závody v počtu ID nebo detailní analýza všech proteoforem??

76 PUBLISH OR PERISH IF 2017 Molecular and Cellular Proteomics (IF 5,2) Journal of Proteome Research (IF 3,9) Journal of Proteomics (IF 3.7) Protomics Clinical Applications (IF 3,6) Proteomics (IF 3,5 ) Clinical Proteomics (IF 3,5 ) Expert Reviews of Proteomics (IF 3.5) BBA Proteins and proteomics (IF 2,6) Proteome Science (IF 1.8) Current Proteomics (IF 0.7)

77 HUPO HUman Proteome Organization EuPa European Proteomic Association Proteomická sekce ČSBMB (

78 PROTEOMICKÁ LABORATOŘ 1. LF UK (Clinical Proteomics)

79 ZKOUŠKA Studijní materiály: Podmínkou připuštění ke zkoušce je vypracování eseje na zadané téma a odevzdaní eseje (jpetr@lf1.cuni.cz) nejpozději 2 dny před zkouškou. Téma obdržíte po přihlášení na zkoušku. Předpokládané zkušební termíny: Zkouška probíhá v B121, V7 LEDEN (V7. B121) budou brzy vypsány (pondělky 9:00-11:00, V7 místnost B121) ÚNOR (BIOCEV - Vestec!) středy (10:00-12:00) PRAKTIKA Z PROTEOMIKY - teoretická praktika duben nebo květen (doc. Stopka)