VLASTNOSTI -GLUKANOVÝCH FILMŮ Z INTAKTNÍCH A DESINTEGROVANÝCH BUNĚK Saccharomyces cerevisiae

Transkript

1 Lortorní přístroje postupy VLASTNOSTI -GLUKANOVÝCH FILMŮ Z INTAKTNÍCH A DESINTEGROVANÝCH BUNĚK Scchromyces cerevisie MIROSLAV NOVÁK, ANDRIY SYNYTSYA, GORDON K. GOMBA, ANNA HEJLOVÁ, JIŘÍ BLAHOVEC c, ONDŘEJ GEDEON d, PETR SLEPIČKA e, JAROSLAV MAIXNER f JANA ČOPÍKOVÁ Ústv chemie technologie schridů, Vysoká škol chemicko-technologická v Prze, Technická 3/5, Prh 6 - Dejvice, Ktedr mtemtiky, c Ktedry fyziky, Česká zemědělská univerzit v Prze, Kmýcká 129, Prh 6 Suchdol, d Ústv skl kermiky, e Ústv inženýrství pevných látek,, f Centrální lortoře, Vysoká škol chemicko-technologická v Prze, Technická 3/5, Prh 6 - Dejvice Došlo , přijto Klíčová slov: β-glukn, kvsinky Scchromyces cerevisie, filmy, struktur, mechnické vlstností Úvod V moderních krytech rn se používjí rozmnité komince iologicky ktivních látek, které plní čsto i funkci kožní náhrdy 1. Zákldní součástí těchto moderních krytů rn jsou ovykle polyschridy lginát 2, chitin neo chitosn 3,4, modifikovná celulos 5, dextrn 6,7, kyselin hylouronová 8,9 dlší. Jednou z význmných složek těchto moderních krytů rn je (1 3,(1 6- -D-glukn (dále: - glukn, používný uď smotný neo v kominci s želtinou 10 či kolgenem 11, neo želtinou kyselinou hylouronovou 12. -Glukn podporuje hojení rn tím, že stimuluje především mkrofágy 13,14, které zjišťují fgocytózu sekreci cytokinů 15 produkují fktory, které npomáhjí hojení rn, npř. epidermální růstový fktor (EGF ngiogenézní fktor. -Glukn rovněž stimuluje tvoru kolgenu, který je hlvní funkční složkou pojivových tkání má zásdní úlohu při tvorě nové kožní tkáně 16,17. Biologický efekt -gluknu při uvžovné plikci jko ktivní kryt rány předstvuje ovšem pouze jednu, yť důležitější, stránku věci. Tou druhou jsou fyzikálněchemické mechnické vlstnosti krytu, které výrzně ovlivňují nejen jeho iologické, le i plikční vlstnosti, mnipulovtelnost stilitu in situ. V této práci jsme změřili pozornost n tyto vlstnosti filmů z -gluknu, izolovného z kvsinek Scchromyces cerevisie. -Glukn z kvsinek je možné izolovt dvěm zásdními postupy, při nichž se vychází uď z intktních uněk neo z uněčného homogenátu. O produkty se určitým způsoem odlišují tké se liší i fyzikálně-chemické mechnické vlstnosti z nich připrvených filmů. Experimentální část Izolční postupy -Glukn yl v přípdě příprvy z intktních uněk izolován způsoem podle Mnnerse spol. 18 z komerčního pekřského droždí (Scchromyces cerevisie, Lessfre Česko,.s., které se v 5% suspensi v 6% NOH digerovlo z chldu poté z vru pelet získný odstředěním se postupně čistil promýváním. V přípdě příprvy -gluknu z desintegrovných uněk yl postup doplněn desintegrcí v lotinovém nerezovém lortorním homogenizátoru s teflonovým rotčním diskem, v 1% NOH při koncentrci kvsinek 2,5 hm.%. K desintegrci se používly kermické lotiny (ZY Premium, Sigmund Lindner GmH; složení 94,7 % ZrO 2 + HfO 2, 5,1 % Y 2 O 3, průměr 0,6 0,8 mm, které nepodléhjí otěru v lklickém prostředí, jk ylo potvrzeno XRF nlýzou. Postup desintegrce yl sledován spektrofotometricky při λ = 260 nm (uvolňování nukleových kyselin. Jko konec desintegrce yl rán okmžik, kdy se sornce odstředěného vzorku homogenizovné suspense již dále nezvyšovl; tto do yl 150 s. -Glukn získný v oou přípdech není zcel čistý, oshuje určitý podíl -gluknů mlé množství proteinů či chitinu (viz or. 1, le svou kvlitou odpovídá komerčně dodávným -gluknům. Izolce čistšího -gluknu je smozřejmě možná, le vzhledem k tomu, že cílem této práce je porovnání filmů ze stejného výchozího mteriálu lišících se pouze způsoem izolce, jeví se nám použitý způso jko dekvátní. Příprv β-gluknových filmů Suspense -gluknu, připrveného jedním neo druhým postupem uvedeným výše, odpovídjící poždovné plošné koncentrci filmu (2,5 10 mg cm 2, oshující glycerol jkožto plstifikátor (25 % hmotnosti použitého -gluknu, yl vylit n hliníkové misky s dokonle rovným dnem se seprční vrstvou silikonového tuku. Filmy yly vysoušeny 3 5 hodin (podle plošné koncentrce filmu při 65 C. Anlytické metody Osh monoschridů v hydrolyzátu vzorku (1 h v 3 mol l 1 kyselině trifluoroctové, 100 C; po hydrolýze TFA odpřen pod N 2 při 40 C yl stnoven niontovou chromtogrfií (HPAEC-PAD n stvenici Dionex BIO LC (Dionex, USA s pulsním mperometrickým detektorem, s nlytickou kolonou mm CroPc PA1. 955

2 Lortorní přístroje postupy 0,5 Asornce 0,4 0,3 0,2 0,1 (OH (CH 2 (CH (CH 2 lipidy (C=O mid I (H 2 O ílkoviny mid II (CH 2, (COO - mid III (CCO (CCH (COH 0, nukleové kyseliny (P=O (COC (CO(CC -glukny polyschridy mnnny -glukny (C1H -glukny -glukny Vlnočet, cm -1 Or. 1. FTIR spektr homogenátu kvsničných uněk ( výchozích β-gluknů připrvených digescí nedesintegrovných ( desintegrovných ( uněk Průtok moilní fáze (16 mmol l 1 NOH při teplotě 25 C yl 0,25 ml min 1. Osh vody ve filmech yl stnoven metodou Krl Fischer n přístroji ThermoOrion AF8 v prostředí směsi methnol:formmid (2:1 oj., relizovnou podle návodu k použitému přístroji. Celkové glukny, -glukn -glukn yly stnoveny n komerční souprvě Megzyme K-YBGL 04/08. FTIR spektroskopie FTIR spektr práškových vzorků filmů yl měřen v KBr tletách n přístroji Nicolet 6700 (ThermoScientific, USA v olsti cm 1 s rozlišením 2,0 cm 1 počtem skenů 64. Zákldní linie yl vyhlzen korigován progrmem Omnic 8.8 (ThermoScientific, USA. Mikroskopická nlýz Rstrovcím elektronovým mikroskopem (SEM s utoemisní tryskou (FEG-SEM, Hitchi S-4700 yl snímkován povrch vzorků lomové hrny získné v kplném dusíku. Vzorky yly pokoveny 10 nm vrstvou slitiny Au/Pd ve vkuové npršovčce Bl-Tec SCD-500. SEM orzy yly zchyceny pomocí sekundárních elektronů se superpozicí topogrfického fázového kontrstu. Hodnoty urychlovcího npětí, prcovní vzdálenosti původního zvětšení jsou uvedeny n jednotlivých snímcích. Profil povrchu morfologie filmů yly měřeny mikroskopií tomárních sil (AFM v kontktním modu sondou n mikroskopu Digitl Instruments CP II se sondou Veeco Silicon P-doped CONT20A-CP (konstnt pružnosti 0,9 N/m. Rentgenová spektrometrie Při rentgenové difrktometrii (XRD yly filmy měřeny při lortorní teplotě n difrktometru X Pert PRO θ-θ (PANnlyticl, s geometrií Brgg-Brentno CuK lmpou (λ = 1,5418 Å, U = 40 kv, I = 30 ma, s detektorem X'Celertor neo scintilčním detektorem s rozshem úhlů 5 60 (2θ, úhlovým rozlišením 0,02 (2θ intervlem pulsů 0,3 s. Dt yl zprcován progrmem HighScore Plus (PANnlyticl. Reltivní krystlinit v rozshu úhlů 8 ž 60 (2θ yl spočten jko poměr intenzity příslušné krystlickému stvu celkové intenzity 19. Anlýz kovových prvků rentgenovou fluorescenční nlýzou (XRF ve filmech proíhl n sekvenčním spektrometru ARL 9400 XP. Dt yl vyhodnocen softwrem Winxrf. Termická nlýz Tepelná stilit filmů yl měřen diferenční skenovcí klorimetrií (DSC v přístroji Setrm DSC 131. Při sledování fázových přechodů se teplot v tmosféře N 2 zvyšovl od 40 C do 200 C rychlostí 5 C min 1 tepelná stilit filmů yl sledován ěhem ohřevu od 20 C do 600 C, opět rychlostí 5 C min 1 v tmosféře N 2. Záznmy yly zprcovány v progrmu Origin 8. Mechnické testy Pro mechnické testy yly folie kondiciovány 5 dní při pokojové teplotě reltivní vlhkosti 43 %; stejné poměry yly udržovány v měřící komoře. Thové testy do přetržení yly provedeny n univerzálním testovcím přístroji Instron TM (typ 33R 4464 s komorou , se softwrem Bluehill (Instron Bluehill TM Mteril Testing 956

3 Lortorní přístroje postupy Softwre, Nmáhná olst vzorku yl 35 8 mm, rychlost příčníku 1 mm min 1. Průměrné hodnoty tloušťky šířky vzorku (měřeny mikrometrem stereomikroskopem sloužily k výpočtu průřezu npětí. Z deformční křivky, tj. závislosti npětí n poměrné deformci, yl vypočten Youngův modul pružnosti, určen mez kluzu jko npětí způsoující nepružnou deformci 0,2 %, pevnost jko npětí při přetržení tžnost jko poměrná deformce při přetržení 20,21. Výsledky diskuse Hydrolýzou -gluknu jk z nedesintegrovných tk desintegrovných uněk kyselinou trifluoroctovou vzniká pouze glukos, což potvrzuje homogenitu jeho monoschridového složení 22. Skutečný osh - -gluknů zjištěný enzymovou metodou yl u nedesintegrovných uněk 4,6 35,7 %, u desintegrovných uněk 3,0 69,0 % (průměr ze tří stnovení. Je ptrné, že po desintegrci c d Or. 2. Elektronoptické snímky povrchu lomů filmů; β-glukn z nedesintegrovných uněk: povrch filmu, lom; β-glukn z desintegrovných uněk: c povrch filmu, d lom Or. 3. AFM snímky povrchu filmu (shding φ 250, θ 50 ; β-glukn z nedesintegrovných uněk, β-glukn z desintegrovných uněk 957

4 Lortorní přístroje postupy 6000 Intenzit, pulzy (2 Or. 4. Rentgenová difrktometrie filmů β-gluknu připrvených digescí nedesintegrovných ( desintegrovných ( uněk Or. 6. Příkldy deformčních křivek pro filmy vyroené z desintegrovných ( 0,046 mm, 0,025 mm intktních (----- glucn: glycerol 5, glucn: glycerol 3 uněk; dt pro filmy vyroené z intktních uněk převzt z cit Tepelný tok, mw Teplot, C Or. 5. DSC filmů β-gluknu připrvených digescí intktních ( desintegrovných (- - - uněk; ohřev 40 C ž 200 C, ohřev 20 C ž 600 C klesá osh -gluknu, což je vysvětlitelné rozvolněním struktury uněčných stěn před následnou lklickou digescí. Vlhkost připrvených filmů se pohyovl kolem 6,4 % při teplotě 25 C reltivní vlhkosti vzduchu 33 %. FTIR spektr výchozích -gluknů připrvených digescí intktních desintegrovných uněk jsou ukázán ve srovnání se spektrem kvsničných uněk po desintegrci n or. 1. Ve spektru desintegrovných uněk jsou ptrné píky ílkovin (1652, cm 1, nukleových kyselin (1240 cm 1 mnnnů (971, cm 1. Pásy kolem 2961, 2873, cm 1 (virce methylových skupin ílkovin mizí neo se výrzně snižují po lklické digesci, nopk virční pásy polyschridů v olsti cm 1 (pásy -gluknů kolem 1109, 1077, 1043, 995, cm 1, cit. 24,25 vykzují výrzný nárůst. Výchozí β-glukn z nedesintegrovných uněk oshovl výrzné pásy -gluknů kolem 1022, 932, 850, cm 1 (cit. 26,27. Dulet vircí mid I při cm 1 pás vircí mid II kolem 1560 cm 1 jsou typické pro -chitin 28, který je součástí polyschridového komplexu uněčných stěn kvsinek. Ze SEM snímků (or. 2 horní plochy filmů lomové hrny je zřejmé, že povrch filmu z intktních uněk je více heterogenní, s vláknitou strukturou, povrch filmu z desintegrovných uněk je více homogenní, s jemnou grnulární strukturou. N snímcích lomových hrn je homogenit filmu z desintegrovných uněk ještě ptrnější. Profil povrchu -gluknových filmů n AFM snímcích vrchní strny filmů (or. 3 je znčně nerovný, s ptrnými zytky uněčných stěn. Film z -gluknu z desintegrovných uněk (or. 3 oshuje větší počet rozměrově menších frgmentů větší podíl morfní mtrix, vznikjící dlší frgmentcí uněčné stěny při lklické digesci. Ostřejší vrcholy jsou ptrně důsledkem vyššího stupně rozvolnění uněčných stěn: menší frgmenty jsou více ovlivněny kontrkcí při vysoušení filmů. N zákldě velkého počtu proměřených míst je rozmezí výšky frgmentů n filmech z nedesintegrovných uněk nm šířky nm, u frgmentů z desintegrovných uněk je rozmezí výšky nm šířky 3250 ž 3400 nm. Výsledky měření XRD odpovídjí látkám s nevýrznou krystlickou spíše výrznou morfní strukturou. Reltivní krystlinit -gluknu ve filmu z intktních uněk yl 27,4 % -gluknu ve filmu z desintegrovných uněk yl 39,4 % (or. 4. Filmy z oou typů β-gluknu mjí hlvní pík kolem 19,5 (2θ, který odpovídá mezirovinné vzdálenosti d = 4,49 nm; u filmů z oou typů - gluknu jsou nevýrzné dlší píky. N DSC křivkách příslušných filmům z oou typů - gluknu jsou dv skelné přechody kolem 29 C 35 C (or široký endotermní pík mezi 40 C 140 C dný štěpením intr- intermolekulárních vodíkových 958

5 Lortorní přístroje postupy Tulk I Mechnické vlstnosti filmů Glukn z uněk -Glukn β-glukn / glycerol n Tloušťk [mm] Modul pružnosti [MP] Mez kluzu [MP] Pevnost [MP] Tžnost [%] [mg/cm 2 ] [g/g] MV SD c MV SD c MV SD c MV SD c Desint. d , ,9 40 2,1 3,2 0,18 2, , ns ns 31 2,4 1,6 0,21 Nedesint. e , ,9 28 2,8 3,9 1, , ,7 17 5,7 14,2 4,3 n počet vzorků, MV průměrná hodnot, c SD směrodtná odchylk, d ns nestnoveno, e dt převzt z cit. 20 vze postupným odpřováním vody. Při teplotě 277 C je n DSC křivce filmu z intktních uněk (or. 5 endotermní pík při teplotě 297 C exotermní pík, n křivce filmu z desintegrovných uněk endotermní píky při 250 C 355 C exotermní píky při 282 C 381 C (or. 5, které odpovídjí teplotám rozkldu polyschridu 22 ; polyschrid z desintegrovných uněk má mírně sníženou teplotu rozkldu. Mechnické vlstnosti filmů z desintegrovných uněk yly testovány vždy n dvou jink stejných filmech s různými plošnými hustotmi, tedy i tloušťkmi (t. I, or. 6. Význmnost rozdílů mezi mechnickými prmetry yl posuzován t-testem n hldině = 0,05. Pro silnější filmy yl ptrná význmně vyšší pevnost (P = 0,0104 vyšší tžnost (P = 0,00013 nežli u tenčích filmů. Nproti tomu Youngův modul pružnosti neyl ovlivněn různou tloušťkou (P = 0,18. N tenčích filmech většinou neyl měřitelná mez kluzu, příp. splývl s přetržením. Pevnost tžnost tenčích filmů se prkticky nelišil od meze kluzu odpovídjící poměrné deformce silnějších filmů (P = 0,85, resp. 0,78, různá tloušťk filmů tedy neovlivnil význmně první část deformčních křivek. K přetržení tenčích filmů přitom docházelo výrzně dříve nežli silnějších filmů. Výsledky pro filmy vyroené z nedesintegrovných uněk 20, které yly skldovány testovány z nlogických teplotních vlhkostních podmínek jsou rovněž v t. I n or. 6. Modul pružnosti, mez kluzu pevnost zjištěné pro filmy z desintegrovných uněk yly výrzně vyšší, filmy jsou tedy i při nižší plošné hustotě výrzně pevnější méně tžné nežli filmy připrvené z nedesintegrovných uněk. Závěr -Glukny z desintegrovných uněk měly nižší osh -gluknů filmy z nich připrvené yly ve srovnání s filmy připrvenými z intktních uněk více homogenní, s jemnou grnulární strukturou. Amorfní stv filmů s mírnou reltivní krystlinitou je spíše vyšší u filmů připrvených z intktních uněk; to je v souldu s mikroskopií tomárních sil. Teplot skelných přechodů se u jednotlivých typů filmů neliší, všk filmy připrvené z -gluknu z desintegrovných uněk mjí nižší teplotu rozkldu, rozkld ovšem nstává vždy ž při teplotách nd 250 C. Z hledisk užitných vlstností filmů je podsttné, že filmy z desintegrovných uněk jsou pevnější méně tžné nežli filmy připrvené z nedesintegrovných uněk. Autoři děkují Dr. Jně Ederové z měření DSC křivek, Ing. Jroslvu Němečkovi z příprvu filmů doc. Ing. Miroslvu Müllerovi z měření rozměrů vzorků k mechnickým testům. Tto práce vznikl z podpory projektů GA ČR 525/09/1133 MŠMT LITERATURA 1. Novák M.: Proceedings of 6 th Interntionl Conference on Polyscchrides - Glycoscience (Čopíková J., Šárk E., Řápková R., ed., str. 17, VŠCHT Prh, Prh Yimin Qin: Polym. Int. 57,171 ( Ching-Hu Su, Chi-Shu Sun, Shm-Wei Jun, Chung- Hong Hu, Wen-Ting Ket, Ming- Thu Sheu: Biomter. 16, 1169 ( Ching-Hu Su, Chi-Shu Sun, Sheng-Wei Jun, Hsiu- O Ho, Chung-Hong Hu, Ming-Thu Sheu: Biomterils 20, 61 ( Bjerová M., Krejčová K., Rišková M., Gjdziok J., Msteiková R.: Adv. Polym. Technol. 28, 199 ( Weng L., Romnov A., Rooney J., Chen W.: Biomterils 29, 3905 ( Chkrvrthy D., Smith D. J.: J. Bioct. Compt. Polym. 10, 313 ( Sng Bong Lee, Hyun Wook Jeon, Young Woo Lee, Seong Kwn Cho, Young Moo Lee, Kng Won Song, Moon Hyng Prk, Sung Hw Hong: Mcromol. Res. 11, 368 ( Cervelli V., De Angelis B., Lucrini L., Spllone D., Blzni A., Pll L., Gentile P., Cerulli P.: Adv. Skin Wound Cre 23, 262 ( Sng Bong Lee, Hyun Wook Jeon, Young Woo Lee, 959

6 Lortorní přístroje postupy Young Moo Lee, Kng Won Song, Moon Hyng Prk, Young Soo Nm, Hee Chng Ahn: Biomterils 24, 2503 ( Deltte S. J., Evns J., Her A., Admson W., Othersen H. B., Tgge E. P.: J. Pedit. Surg. 36, 113 ( Sng Bong Lee, Hyun Wook Jeon, Young Woo Lee, Seong Kwn Cho, Young Moo Lee, Kng Won Song, Moon Hyng Prk, Sung Hw Hong: Mcromol. Res. 11, 368 ( DiLuzio N. R., Trends Phrmcol. Sci. 4, 344 ( Ovington L. G.: Wound Cre 1998, Porter C. A., Love E. J., Memore L., Zhng L., Müller A., Browder W., Willims D. L.: Am. Surg. 63, 125 ( Peterková P., Lpčík L.: Chem. Listy 94, 371 ( Wei D., Zhng L., Willims D. L., Browder I. W.: Wound Rep. Regen. 10, 161 ( Mnners D. J., Msson A. J., Pterson J. C.: Biochem. J. 35, 19 ( Nr S., Komiy T.: Strch/Sterke 35, 407 ( Blhovec J., Hejlová A., Čopíková J., Novák M.: Polym. Eng. Sci., přijto. 21. Hejlová A., Blhovec J.: Proceedings of 6 th Interntionl Conference on Polyscchrides - Glycoscience (Čopíková J., Šárk E., Řápková R., ed., str. 48, VŠCHT Prh, Prh Slvíčková P., Synytys A., Gom G. K., Novák M., Čopíková J.: Proceedings of 6 th Interntionl Conference on Polyscchrides - Glycoscience (Čopíková J., Šárk E., Řápková R., ed., str. 191, VŠCHT Prh, Prh Shi Guorong, Ro Liqun, Xie Qingji, Li Jun, Li Benxing, Xiong Xingyo: Virt. Spectrosc. 53, 289 ( Glichet A., Socklingum G. D., Belri A., Mnfit M.: FEMS Microiol. Lett. 197, 179 ( Šndul J., Kogn G., Kčuráková M., Mchová E.: Crohydr. Polym. 38, 247 ( Zhnkov R. G., Andrinov V. M., Mrchewk M. K.: J. Mol. Struct. 436/437, 637 ( Kčuráková M., Belton P. S., Wilson R. H., Hirsch J., Eringerová A.: J. Sci. Food Agric. 77, 38 ( Biniś D., Wyszomirski M., Biniś W., Boryniec S.: Polish Chitin Soc., Monogrph XII, 95 ( Wng Xio-Gng, Crrington T., McKellr A. R. W.: J. Phys. Chem. 113, 9915 ( Zhng H., Nishinri K., Willims M. A. K., Foster T. J., Norton I. T.: Int. J. Biol. Mcromol. 30, 7 ( Zhng H., Hung L., Nishinri K., Wtse M., Konno A.: Food Hydrocolloids 14, 121 (2000. M. Novák, A. Synytsy, G. K. Gom, A. Hejlová, J. Blhovec c, O. Gedeon d, P. Slepičk e, J. Mixner f, J. Čopíková ( Deprtment of Crohydrte Chemistry nd Technology, d Deprtment of Glss nd Cermics, e Deprtment of Solid Stte Engineering, f Centrl Lortories, Institute of Chemicl Technology, Prgue, Deprtment of Mthemtics, c Deprtment of Physics, Czech University of Life Sciences, Prgue: Properties of β-glucn Films from Intct nd Disintegrted Scchromyces cerevisie Cells Insolule polyscchride frctions contining β- glucns s the min component were isolted from intct nd disintegrted cells of yest Scchromyces cerevisie. Films prepred from oth these crude glucns s well s rw mterils themselves were nlysed y FTIR spectroscopy nd structure, therml nd mechnicl properties of the films were investigted using SEM, AFM, XRD, XRF, DSC nd tensile tests. β-glucn preprtions from disintegrted cells hd less mount of α-glucns thn those otined from intct cells. Films originted from disintegrted cells were more homogeneous, while crystllinity ws more pronounced t films from intct cells. Glss trnsition of the oth types of films underwent t the sme temperture. Films from disintegrted cells were less thermo stle, stronger nd less elstic thn those prepred from intct cells. 960