Proteomika a peptidomika. Definice+přehled

Transkript

1 Proteomika a peptidomika Definicepřehled

2 OMICS přístupy k analýze buněk a tkání

3 Proteom (Proteome: Protein complement of the genome) je definován jako všechny proteiny, které se tvoří (exprimují) na podkladě informace kódované v genomu daného organismu. Proteom je komplexní a velmi dynamický, jeho skladba se neustále mění. Proteomika je obor, který se zabývá systematickou analýzou proteomu, tj. proteinů z hlediska jejich identity, množství a funkcí. Proteomika je komplikovanější než genomika, protože: 1. zatímco genom je spíše relativně konstantní celek, proteom se liší od buňky k buňce a plynule se mění během jeho biochemických interakcí s genomem a prostředím. 2. každý organismus má radikálně odlišnou expresi proteinů v různých částech těla, v různých stavech jeho životního cyklu a za různých životních podmínek daných prostředím. Hlavním cílem proteomiky je tedy popis a vysvětlení role proteinů v procesech, které probíhají v organismech, což zahrnuje jejich identifikaci (včetně stanovení molekulové hmotnosti, sekvence aminokyselin, kvantitativní stanovení heterogenity, určení vazeb S-S a posttranslačních modifikací), interakce proteinů s jinými látkami, kvalitativní i kvantitativní stanovení změny v proteinovém složení během biologických procesů atd.

4 Komplexnost, dynamičnost a koncentrační rozsah proteomu V buňce jsou tisíce proteinů a přesný odhad je obtížný z důvodů, že řada proteinů po svém vzniku je dále upravována pomocí post-translačních sestřihů a modifikací. u člověka >1 milion proteinů oproti 30 tis. genů na živočišnou buňku >300 tis. proteinů z asi 10 tis. genů Anderson & Anderson, 2002, Molecular & Cellular Proteomics

5 Proteom je dynamická záležitost. Jeho skladba se neustále mění. Proto nevystačíme s analýzou jednoho vzorku, ale musí se provádět řada experimentů, kdy vzorky představují obraz jednotlivých stavů buňky, tkáně, organismů. Proteomika se definuje jako simultánní analýza komplexních proteinových směsí (buněčných lyzátů a tkáňových extraktů) s cílem popsat kvalitativní i kvantitatiní změny hladin exprese. Nejdůležitější jsou aplikace proteomiky v medicíně (studium příčin a mechanismů chorob, nalezení markerů patologických stavů), farmacii (hledání a vývoj léčiv), potravinářství (kvalita a bezpečnost potravin, nové výrobní procesy), průmyslu (technické enzymy), ochraně životního prostředí (likvidace škodlivin enzymy), zemědělství (zvyšování výnosů, pěstování nových odolnějších odrůd s nižším obsahem škodlivých látek) atd.

6 Peptidomika odnož proteomiky nebo samostatný obor Termín peptidomika je užíván k označení studia přirozeně se vyskytujících peptidů. Peptidomika se zabývá systematickou analýzou peptidového obsahu buněk, organel, tkání nebo organismů. Původně se předpokládalo, že většina vyskytujících se peptidů v buňkách je pouze důsledek proteolytické aktivity buněk. Bylo zjištěno, že polypeptidy tvoří významnou skupinu látek, které mají velmi významnou roli v regulaci řady biologických procesů v živočišných buňkách. V současné době se rozvíjí tato oblast ve směrech isolace, purifikace a dělení peptidů s jejich následnou charakterizací jak z hlediska aminokyselinového složení, tak také z hlediska jejich struktury a funkce. Obor peptidomika se zaměřuje na peptidy (látky v rozsahu 2 kda-10 kda) vykazující biologickou aktivitu jako například hormony, cytokiny, toxiny, neuropeptidy. Řada těchto peptidů vzniká řízeným proteolytickým sestřihem z větších prekurzorů. Některé analyzované peptidy generované také z prekurzorů nebo větších proteinů jsou označovány také jako biomarkery tj. typy peptidů bez samotné biologické aktivity, ale se vztahem k určité biologické události (onemocnění).

7 Rozvoj proteomiky a peptidomiky Genomika bioinformatika MS metody Biologický materiál GENOMIKA Databáze genových sekvencí Frakcionace bílkovin štěpení BIOINFORMATIKA Záloha, třídění, zpracování, in-silico translace KHLVDEPQNL IKQNCDQFEK LGEYGFQNAL IVRYTRKVPQ VSTPTLVEVS RSLGKVGTRC CTKPESERMP CTEDYLSLIL NRLCVLHEKT PVSEKVTKCC Identifikace bílkoviny MALDI-MS, MALDI-PSD MS/MS nanolc-esi-ms/ms

8 Vývoj protemických metod Penque, D. Proteomics Clin. Appl. 2009, 3, 155

9 Obrovský rozvoj proteomiky byl umožněn: 1) Genomika. DNA sekvencování, genomové databáze. Pro většinu genů je však neznámá funkce, a to ještě nastává sestřih mrna, posttranslační modifikace. 2) Nové jemné ionizační techniky v hmotnostní spektrometrii (MALDI, ESI) vhodné pro peptidy a proteiny. 3) Separační metody s vysokým rozlišením (2-dimenzionální elektroforetické techniky, chromatografické techniky pro separace a obohacení proteinových a peptidových směsí, nanokapilární chromatografie. 4) Rozvoj bioinformatiky zpracování velkého množství dat. Vyhledávací programy, komplexní proteomické databáze. 5) Biochemie a biomedicína se soustředily na popsání strukturně-funkčních vlastností enzymů klíčových enzymů metabolismu. Sekvencování purifikovaných proteinů (Edman, MS) doplnilo databáze. 6) Techniky značení (fluorescenční značky, stabilní izotopy pro MS). Kvantifikace změn proteomu. 7) Rozvoj doplňující technologie (detekce proteinů, SPR povrchová resonance plazmonů)

10 Strategie analýzy peptidů a proteinů Bottom-up proteomika představuje klasický postup identifikace proteinů, kdy je daný protein nejprve izolován ze směsi, potom enzymově rozštěpen na směs peptidů, které jsou charakterizovány hmotnostní spektrometrií (molekulová hmotnost, případně sekvence). K tomu jsou většinou využívány specifické peptidy, tj. peptidy, které odpovídají specificitě použitého enzymu (zpravidla trypsinu). Shotgun proteomika je postup identifikace proteinů, kdy neseparovaná směs proteinů je nejprve enzymově rozštěpena na komplexní směs peptidů, jenž jsou následně separovány vhodnou vysokorozlišovací metodou (nejčastěji nlc). Rozdělené peptidy jsou následně sekvenovány tandemovou hmotnostní spektrometrií (často jsou využívány i nespecifické enzymy např. elastasa). Často jsou využívány také multidimenzionální technologie dělení peptidů. Top-down proteomika je postup identifikace proteinů, kdy je daný protein nejprve izolován ze směsi, následně charakterizován pomocí nejmodernějších MS analyzátorů. Tento přístup přináší rychlé informace o molekulové hmotnosti, sekvenci aminokyselin a posttranslačních modifikacích.

11 Schéma bottom-up analýzy a identifikace peptidů a proteinů Peptidové fragmenty Biologický materiál Extrakt Proteolytické štěpení Frakcionace bílkovin Bílkoviny Databáze Identifikace bílkoviny nanolc-maldi-ms (MS/MS) nanolc-esi-ms (MS/MS) KHLVDEPQNL IKQNCDQFEK LGEYGFQNAL IVRYTRKVPQ VSTPTLVEVS RSLGKVGTRC CTKPESERMP CTEDYLSLIL NRLCVLHEKT PVSEKVTKCC

12 Klasický přístup bottom-up proteomika vs. Shotgun proteomika

13 Bottom-up vs. Top-down proteomika Bottom-up Štěpení proteinu na peptidy MS, MS/MS peptidů LC-MS(/MS) peptidů DTB search na úrovni peptidů PMFMSMS Top-down Pre-frakcionace proteinů MS proteinu přesná hmotnost MS/MS) proteinu DTB search na úrovni prot. Přesná MW sequence tag

14 Možnosti proteomické analýzy Cíle analýzy Vzorek Hmotnostní spektrometrie (MS) v analýze peptidů a proteinů Jeden protein Jednoduchá směs proteinů Komplexní směs proteinů Charakterizace protein (molekulová Mr) Identifikace proteinů Identifikace a studium PTM proteinů Identifikace a kvantifikace proteinů i jejich PTM. jednoduchá separace vzorků, obohacení PTM LC, gel, IEF a další rozsáhlá frakcionace vzorků komplexní obohacení PTM moderních separační metody LC, gel, IEF a další MALDI-MS ESI-MS PMF MALDI-MS ESI-MS PS LC-MALDI-MS/MS LC-ESI-MS/MS

15 Nobelova cena za chemii 2002 za vyvinutí metod pro identifikaci a strukturní analýzu biologických makromolekul" za vyvinutí jemných desorpčních ionizačních technik pro analýzu biologických makromolekul pomocí hmotnostní spektrometrie " John Fenn Koichi Tanaka

16 Electrospray ionisation (ESI) heated inert gas (N 2 ) v proteomice uspořádání nanospray - malé objemy vzorku

17 MALDI

18 Některé používané matrice Dodáním energie dojde k odpaření matrice, která se nachází v nadbytku; v plynné fázi pak matrice nese analyt. Analyt je tak převeden do plynné fáze nepřímo. Matrice je zároveň donorem či akceptorem protonu, podle modu ionizace. Vůbec první byla kyselina nikotinová.

19 Schéma hmotnostního spektrometru pro proteomiku Pre-Separation Ion Source Mass Analyzer Ion Detector Liquid Chromatography Time-of-Flight (TOF) Quadrupole TOF (QTOF) Ion Trap (IT) Fourier Transform- Ion Cyclotron Resonance (FT-ICR)

20 R. Aebersold and M. Mann, Nature (2003), 422,

21 Hmotnostní spektrometrie (MS) v analýze peptidů a proteinů 1. Charakterizace proteinů stanovení molekulové hmotnosti. 2. Identifikace proteinů pomocí Peptide Mass Fingerprinting (PMF). 3. Identifikace peptidů a následně proteinů pomocí Peptide sequencing (PS) (DDA data dependent analysis).

22 Určení MW proteinu - MALDI 1 Hg-Papain M=23988 Da 2 Dimer (1) Trimer (1) Tetramer (1)

23 Příklad ionizace bílkoviny elektrosprejem M 5 Bílkovina M 10 ESI ionizace Bílkovina obalená rozpouštědlem Solvatovaná bílkovina Desolvatované bílkoviny s několikanásobným nábojem

24 nlc-esi-ms charakterizace proteinu určení Mr proteinů M Mw proteinu z nábojový stav pík X = (Mz)/z pík Y = (Mz1)/(z1) Nábojový stav (z) píku X z x = (Y-1)/(X-Y) M = (X*z x )-z x Označený příklad z x = ( )/( ) z x = 16 M = ( *16)-16 = Da Intens. x (A) pík Y pík X 17 (A) (A) (A) MS, min #( ) (A) (A, D) (A) (A) (A) m/z

25 Identifikace peptidů a proteinů pomocí MALDI-MS (PMF), nlc-ms (PMF) a nlc-maldi (ESI)-MS/MS (DDA) 1. Identifikace proteinů pomocí peptidového mapování (PMF) PEPTIDE MASS FINGERPRINTING identifikace proteinů na základě experimentálně zjištěných molekulových hmot peptidů po štěpení specifickými proteolytickými enzymy. Nejjednodušší cesta identifikace proteinů (1993). V běžném postupu zahrnuje: vyříznutí studovaného proteinového spotu (2-D) či pásu (1D) z gelu, štěpení proteolytickým enzymem ( in-gel digestion ), nejčastěji trypsin, ale i jiné specif. enzymy, extrakce peptidů z gelu, analýza digestu na hmotnostním spektrometru. Využívá se MALDI-TOF instrumentů (ionizací se tvoří převážně jednonásobně nabité ionty, jednodušší obsluha přístroje). 2. Identifikace peptidů a následně proteinů pomocí peptidového sekvenování PEPTIDE SEQUENCING, MS/MS IONS SEARCH porovnávání surových neinterpretovaných MS/MS fragmentačních dat proti spektrům generovaným in-silico z databáze nebo SEQUENCE TAG manuální nebo automatická interpretace krátké části sekvence z experimentálních dat, doplnění hmotnostními zbytky k N- a C-konci peptidu.

26 Použití MALDI-MS technik, identifikace proteinů pomocí PMF a LC-MALDI-MSMS MS MALDI-MS - PMF (MS) PSD Seznam m/z peptidů PSD fragmentace vybraných peptidů MS MS/MS Seznam m/z prekurzorů fragmentace všech analyzovaných prekurzorů nlc-maldi-msms

27 EXPERIMENT IN-SILICO IDENTIFIKACE PROTEINŮ - PMF Sekvence proteinů v databázi 1 MRSLLILVLCFLPLAALGKVFGRCELA AAMKRHGLDNYRGYSLGNWVCAA Teoretické štěpení trypsinem TPGSR GTDVQAWIR GYSLGNWVCAAK... Teoretické spektrum 2 3 AAMKRHGLDNYRGYSLGNWVCAA KFESNFNTQATNRNTDGSTDYGILQI LLSSDITASVNCAKKIVSDGNGMNA WVAWRNRCKGTDVQAWIRGCRL HGLDNYR WWCNDGR NTDGSTDYGILQINSR... FESNFNTQATNR IVSDGNGMNAWVAWR NTDGSTDYGILQINSR... Neznámý protein Štěpení trypsinem Vznik tryptických peptidů Experimentálně změřené MS spektrum

28 PMF identifikace proteinů Slouží k identifikaci proteinů na základě porovnávání experimentálně naměřených molekulových hmotností peptidů s teoretickými hodnotami získanými in-silico štěpením proteinů přítomných v použité databázi. PMF metoda identifikuje přímo protein na rozdíl od MSMS identifikace peptidů, ale neslouží k detailní charakterizaci proteinů. Rychlá a jednoduchá analýza. Vysoká citlivost. Potřeba vycházet z databází s proteinovými sekvencemi (tedy ne EST nebo genomové DNA DB). Proteinová sekvence musí být přítomná v databázi nebo jeho blízký příbuzný homolog. Nevhodné pro směsné vzorky obsahující více než 2-3 proteiny. Ke spolehlivé identifikaci proteinů ze směsi je nutné použít přístup identifikace peptidů pomocí MS/MS spekter.

29 nlc-ms/ms techniky (DDA), identifikace peptidů a proteinů metodou peptidového sekvenování Aminokyselinová sekvence je významnou informací pro jednoznačnou identifikaci proteinu v databázi. Určitý peptid je během měření na hmotnostním spektrometru vybrán a podroben fragmentaci (MS/MS). Fragmentové ionty a jejich hmotnost nesou informaci o aminokyselinové sekvenci. Identifikace peptidů a následně i proteinů v jednoduchých i komplexních vzorcích, umožňuje analýzu posttranslačních modifikací peptidů Kvantifikace peptidů a proteinů (použití izotopových značek, label free) KHLVDEPQNL IKQNCDQFEK LGEYGFQNAL IVRYTRKVPQ VSTPTLVEVS RSLGKVGTRC CTKPESERMP CTEDYLSLIL NRLCVLHEKT PVSEKVTKCC

30 IN-SILICO EXPERIMENT IDENTIFIKACE PEPTIDŮ A PROTEINŮ MS/MS search Sekvence proteinů v databázi Teoretické štěpení trypsinem filtrace peptidů dle m/z prekurzoru Teoretická spektra peptidů MRSLLILVLCFLPLAALGKVFGRCELA AAMKRHGLDNYRGYSLGNWVCAA AAMKRHGLDNYRGYSLGNWVCAA KFESNFNTQATNRNTDGSTDYGILQI LLSSDITASVNCAKKIVSDGNGMNA WVAWRNRCKGTDVQAWIRGCRL NFNTQATNRNTDKIVSDGNGMNA WVAWRNRCKGLDNYRGYSLGNW TPGCASGTDGILNILVLAR GTDVQSTDGNAWIQR WILVLWCNDTDGGFEAR GYSLGDGTDGMNWVAK HGLDNTDGDYGSTDYR NTDGSTDYR FNTQATNR IVSNAWVR NTDGSTGK... Neznámý protein Štěpení trypsinem Vznik tryptických peptidů Experimentálně změřená MS a MS/MS spektra peptidů MS/MS MS

31 Nomenklatura štěpení peptidů y 4 y 3 y 2 y 1 z 4 z 3 z 2 z 1 x 4 x 3 x 2 x 1 R1 H O R3 H O R5 C H 2 N H C N C H C C N H C N C H C C N H O R2 H O R4 H COOH a 4 a 3 a 2 a 1 N-konec c 4 c 3 c 2 c 1 b 1 b 2 b 3 b 4 C-konec Fragmentace vedlejších řetězců AMK fragmenty d, w, v.

32 Molekulové hmotnosti aminokyselinových zbytků po fragmentaci peptidové vazby Aminokyseliny značky Monoisotopic Average Glycine Gly G Alanine Ala A Serine Ser S Proline Pro P Valine Val V Threonine Thr T Cysteine Cys C Isoleucine Ile I Leucine Leu L Asparagine Asn N Aspartic Acid Asp D Glutamine Gln Q Lysine Lys K Glutamic Acid Glu E Methionine Met M Histidine His H Phenylalanine Phe F Arginine Arg R Tyrosine Tyr Y Tryptophan Try W

33 DDA Data dependent analysis Příklad identifikace peptidu na základě MS/MS spektra Intens V 99 F A V QC-BSA 10f VeryLow nl_F8_01_8881.d: MS2( ), eV, 23.80min # F N E M MS/MS fragmentace 2x nabitého iontu TVMENFVAFVDK Y-série DK VDK FVDK AFVDK VAFVDK FVAFVDK NFVAFVDK ENFVAFVDK MENFVAFVDK VMENFVAFVDK m/z

34 MS/MS MS nlc-ms/ms ukázka dělení a sběru MS dat Intens. x nlc-chromatogram Intens. x x MS, 38.41min #2206 MS2( ), eV, 38.42min # x MS2( ), eV, 38.43min # x MS2( ), eV, 38.44min # x MS2( ), eV, 38.45min # x MS2( ), 28.17eV, 38.45min # Time [min] MAX01015 BS_05-11-control_A1_01_5566.d: BPC All MS m/z 2D chromatogram: RT vs m/z 100 min gradient, identifikace 186 proteinů

35 MS/MS search Identifikace peptidů na základě prohledávání neinterpretovaných MS/MS fragmentačních spekter proti databázi, kdy jednotlivá spektra jsou porovnávána s in-silico generovanými spektry a hodnocena na základě detekovaných fragmentačních iontů, fragmentačních sérií iontů včetně intenzit bez jakékoliv předešlé manuální interpretace. Snadno automatizovatelné, umožňuje analýzu velkého množství dat a komplexních směsí proteinů. Umožňuje identifikaci i s použitím méně kvalitních MS/MS spekter. Umožňuje analýzu bez enzymové specifity jak proti komplexním databázím jak nukleotidovým (mrna, EST, genomové), tak proti proteinovým (NCBInr, TrEMBL). Umožňuje prohledávání s variabilními modifikacemi peptidů, včetně určení pozice modifikace.

36 Přehled přístupů k analýze proteomu Expresní proteomika Identifikace všech proteinů (intaktní hmota, peptidové fingerprinty, de novo sekvencování). Proteiny jsou většinou denaturované, ztrácí se informace jak o terciární a kvarterní struktuře, tak o přirozené tvorbě komplexů a funkci. Variantou je studium změn v proteinovém složení (diferenční proteomika). Využívá vysokorozlišovacích technologií jako 1D, 2D-elfo, shot-gun nebo MUDPIT on-line napojených na MS techniky. Cílená proteomika Analýza specifických peptidů nebo proteinů popř. PTM modifikací. Využívá se řada prekoncentračních a obohacovacích technologií pro specifické obohacení vybrané frakce proteinů či peptidů. Využívá kombinací afinitních nebo imunoafinitních obohacení vybraných analytů s následnou cílenou analýzou pomocí µlc nebo nlc a MS detekcí. Funkční proteomika Tvorba komplexů, posttranslační modifikace, interakce mezi proteiny, peptidy, ligandy, funkce proteinů. Použití technik, které nedenaturují proteiny. Využívá moderních MS analyzátorů a data jsou kombinována s dalšími moderními technikami jako RTG, NMR, FT-ICR, CD.

37 Separace proteinových směsí Kombinace postupů používaných při analýze proteinů 2D-elektroforéza (IEFSDS) MALDI-TOF tohoto přístupu se využívá v oblastech expresní a diferenční proteomiky, kdy proteom je rozdělen pomocí vysokorozlišovací 2D-elektroforézy (na základě změn intenzit je získána semikvantitativní informace) a vybrané proteinové zóny jsou analyzovány opět bottom-up přístupem. 1D SDS elfo MALDI-TOF nebo nlc-msms představuje klasický postup identifikace proteinů, který se skládá z prefrakcionace proteinů pomocí SDS-elfo s následnou řízenou proteolýzou a analýzou vzniklých peptidů pomocí MS metod (bottom-up přístup). Shotgun nlc-msms moderní high-throughput přístup, kdy analyzovaný proteom je kompletně proteolyticky naštěpen bez předešlé frakcionace a analyzován pomocí vysokorozlišovací nanokapilární chromatografie na dlouhých kolonách (až cm) spojených online s moderními tandemovými MS analyzátory. MUDPIT analýza IEX-RP nlc (online, offline, 2D nlc, IEF peptidů nlc) moderní přístup kombinující multidimenzionální techniky dělení peptidů pomocí odlišných fyzikálně chemických vlastností peptidů.

38 Separační techniky s vysokým rozlišením 2-dimenzionální elektroforéza kombinuje IEF a SDS elfo.

39 Kombinace technik 1D-SDS elektroforézy a nanokapilární chromatografie s hmotnostní detekcí pro identifikaci proteinů Redukce, alkylace a proteolytické štěpení M 2h 4h 6h M Část gelu obsahující proteiny k 150k 100k 75k 50k 37k 25k 20k 15k 10k Intens. x MAX Sens1 2h 5_A5_01_5725.d: BPC All MS Extrakce peptidových fragmentů Identifikace proteinů Time [min] 4000 Intens. x x x MS, 68.95min #4806 MS2( ), eV, 68.97min #4807 MS2( ), eV, 68.99min #4808 MS2( ), eV, 69.01min #4809 nanolc MS2( ), eV, 69.03min # MS2( ), eV, 69.05min # m/z ESI-Q-TOF-MS Bioinformatická analýza

40 Separační techniky s vysokým rozlišením Shotgun analýza na 100 cm x 25 um koloně spojené s ESI-MSMS Feng Zhou et al. (2012): A Nanoflow Low Pressure High Peak Capacity Single Dimension LC MS/MS Platform for High throughput In Depth Analysis of Mammalian Proteomes. Anal Chem. 84(11):

41 Separační techniky s vysokým rozlišením MUDPIT - Multidimensional Protein Identification Technology Time [min] MAX00338 ICH frakce ph6_a1_01_3446.d: BPC All MS Time [min] MAX00334 ICH frakce ph12_a2_01_3461.d: BPC All MS Time [min] MAX00336 ICH frakce ph9_a1_01_3459.d: BPC All MS Time [min] MAX00340 ICH frakce ph3_a1_01_3460.d: BPC All MS Vícerozměrné (multidimenzionální MuD) separační techniky jsou techniky na bázi kapalinové chromatografie, kapilární elektroforézy nebo jejich kombinace přímo propojené s hmotnostní spektrometrií. Lze kombinovat rozmanité módy HPLC (NP, RP, SEC, IEX, AC), isoelektrickou fokusaci (IEF), chromatofokusaci (CF) a kapilární elektroforézu (CE). ODPAD nlc SCX 5 µm C18 5 µm C18 3 µm 100 µm 50 µm x10 6 Intens. MS 1. Postupná eluce peptidů zachycených na SCX pomocí HCOONH4. 2. Zakoncentrování a odsolení peptidů uvolněných z SCX na C18 předkoloně. 3. Gradientová eluce peptidů zachycených na předkoloně na analytickou kolonu a do MS. x10 6 Intens. x10 6 Intens. x10 6 Intens. 50 mm 100 mm 250 mm 20 mm

42 MS a kvantifikace základní požadavky Ideální standard pro kvantifikaci pro MS fyzikálně a chemicky identický jako analyt Značení - nejlépe stabilními izotopy 2 H, 13 C, 15 N Podobné chování během izolačních biochemických kroků podobné ztráty Koeluce s kvantifikovaným analytem stejné podmínky pro ionizaci matrice/složení mobilní fáze, přítomnost dalších složek ovlivňujících ionizaci Kvantifikace proteinů a peptidů Relativní porovnání hladin dvou nebo více vzorků určení zvýšené/snížené hladiny analytu ve vzorku (běžné využití srovnání vzorků nemocné/zdravé; po aplikaci látky/kontrola) Absolutní stanovení přesné koncentrace proteinů nebo peptidů ; počet kopií v buňce/vzorku.

43 Rozdělení proteomických technik pro kvantifikaci proteinů a peptidů 1. Kvantifikace s použitím izotopicky značených značek a standardů Relativní kvantifikace 1. 2-D gelová elektroforesa 2. Metabolické isotopové značení in vivo ( 15 N značení, 13 C značení, SILAC) 3. Enzymatické značení in vitro ( 16 O/ 18 O inkorporace) 4. Chemické značení in vitro (ICAT, PhIAT, ICPL, ALICE, ITRAQ, N, C- terminální značení) Absolutní kvantifikace AQUA 2. Kvantifikace bez izotopicky značených standardů (labelfree) (MRM, SRM, labelfree kvant spectral counting, empai)

44 Rozdělení proteomických technik pro kvantifikaci proteinů a peptidů In vivo značení Výhody značení již na úrovni buněk; následná analýza již probíhá s oběma vzorky současně Nevýhody možno použít pouze vzorky vycházejících z buněčných kultur, které je možno kultivovat v přítomnosti značených AMK nebo médií obohacených o izotopy 15 N nebo 13 C. In vitro značení Výhody možnost značení jakýchkoliv vzorků (buněčné kultury, tkáně, biochemicky připravené vzorky) Nevýhody značení zahrnuje chemickou nebo enzymatickou reakci; nepokrývá možné ztráty během všech kroků analýzy

45 In vitro vs. In vivo značení Stav 1 Stav 2 Stav 1 Stav 2 Buněčná kultura Normální médium bez značení Extrakce proteinů Značení proteinů chemická reakce Médium z obsahem lehkých izotopů Médium z obsahem těžkých izotopů Spojení kultur Extrakce proteinů Spojení vzorku 1 a 2 proteolytické štěpení analýza nanolc-esi-ms/ms proteolytické štěpení

46 In vitro značení: proteinů vs. peptidů proteinů Chemické značení peptidů Enzymatické značení peptidů Vzorek Vzorek Vzorek Izolace proteinů Izolace proteinů Izolace proteinů Modifikace proteinů značkou Proteolytické štěpení proteinů Proteolytické štěpení proteinů Modifikace peptidů značkou Proteolytické štěpení proteinů v přítomnosti H 2 18 O or H 2 16 O LC-MS analýza LC-MS analýza LC-MS analýza Červeně označeno místa možných ztrát v průběhu přípravy vzorku

47 Schéma uspořádání SILAC experimentu Vzorek 1 Normální AMK Vzorek 2 Izotopově značené AMK Vzorek 3 Izotopově značené AMK Sekvence - identifikace Arg 13 C 6 -Arg (6Da) 13 C 6 15 N 4 -Arg (10Da) Sběr buněk a promíchání všech buněk Izolace proteinů, gelová elektroforéza Nízkotlaká chromatografie, atd. MSMS MS data - Kvantifikace Proteolytické štěpení proteinů, izolace peptidů Hmotnostní analýza (MALDI-MS, LC-MS) LC MS

48 Enzymatické značení 16 O/ 18 O inkorporace Vzorek 1 Vzorek 2 Reakce 1 štěpení proteinu Izolace proteinů 1 Izolace proteinů 2 Proteolytické štěpení proteinů v přítomnosti H 2 16 O izolace peptidů 16 O značených Proteolytické štěpení proteinů v přítomnosti H 2 18 O izolace peptidů 18 O značených Reakce 2 výměna karbonylového kyslíku (Trypsin, GluC, LysC) RC 16 O 18 O - H 2 18 O Smíchání vzorků 1:1 Hmotnostní analýza (MALDI-MS, LC-MS) ph 6.75 Přítomnost proteasy přes noc RC 18 O 18 O - H 2 16 O

49 Chemické značení ICAT - schéma Reduction -S-S- bond cys cys Problémy spojené s původní ICAT značkou: 1.Vysoká hmotnost značky 442 Da 2.Částečná fragmentace v kolizní cele 3.Velmi složité MSMS spektra, obtížná analýza 4.Ztráty na avidinovém nosiči nekompletní eluce biotinylovaných peptidů Problémy překonány pomocí nových typů ICAT reagentů s oddělitelným biotinovým řetězcem (nižší hmotnost, lepší MSMS fragmentace).

50 Chemické značení ITRAQ Isobarická značka Izobarická značka se skládá: Reaktivní skupina (NHS-ester) Balance group izotopově modifikovaná CO skupina u MSMS fragmentace se oddělí jako neutrální molekula. Reporter group izotopově modifikovaný N-methylpiperazin. Intenzita je úměrná koncentraci peptidu v analyzované směsi. Výhoda použití isobarické značky peptidy s různými značkami mají stejnou molekulovou hmotnost, tj. v MS spektru tvoří pouze jeden pík vyšší intenzita píku v MS spektru, žádné problémy překrývání iontů různých peptidů bezproblémová kvantifikace. ITRAQ Applied Biosystems & Bruker Daltonics

51 Schéma experimentu s ITRAQ 4-Plex ITRAQ Applied Biosystems & Bruker Daltonics

52 Multiple (selected) reaction monitoring ke kvantifikaci metabolomika, proteomika

53 Cílená proteomika Hmotnostní analýza proteinových interakcí Analýza sekvenčních vazebných motivů nebo epitopů: Analýza a identifikace neznámého sekvenčního vazebného motivu pomocí kombinace afinitní nebo imunoafinitní chromatografie a MS Vyhledávání nových proteinových nebo peptidových interakčních partnerů: Použití metod izotopového značení proteinů (SILAC, ICAT), afinitní chromatografie a MS k identifikaci interakčních partnerů

54 Analýza a identifikace neznámého sekvenčního vazebného motivu pomocí kombinace afinitní chromatografie a MS RudigerAH, et al, WehlandJ: Anal Biochem 1999, 275:

55 Chemická proteomika afinitní izolace cílených proteinů Chamrád, I. et al. J Proteome Res Sep 6;12(9): doi: /pr400309p. Chemical Proteomic Approach for Target Profiling of Clinical Kinase Inhibitors in Tumor Biopsies

56 SILAC studium interakce peptidů a proteinů Schulze WX, Mann M: J Biol Chem 2004, 279(11):

57 Chemická proteomika afinitní izolace cílených proteinů Chamrád, I. et al. J Proteome Res Sep 6;12(9): doi: /pr400309p. Chemical Proteomic Approach for Target Profiling of Clinical Kinase Inhibitors in Tumor Biopsies

58 Studium makromolekulárních komplexů pomocí kvantitativní proteomiky - ICAT vzorek 1 vzorek 2 isotope-coded affinity tag Ranish JA, etal, Aebersold R: Nat Genet 2003: 33,

59 Následující strategie: Funkční proteomika 1) Cílové proteiny jsou identifikovány, charakterizovány a zařazeny k proteinovým rodinám 2) Další informace se získávají vždy pro menší podmnožinu proteinů, používají se jemné metody separace (gelová a afinitní chrom.). 3) Proteiny s intaktní terciární strukturou nebo komplexy protein-protein se analyzují ESI MS. 4) Funkční proteomika využívá i jiných metod, rekombinantní proteiny, krystalografie, NMR, mikrokalorimetrie a SPR pro studium interakcí.

60 Funkční proteomika analýza proteinového komplexu

61 Chemické zesíťování proteinů a MS pro mapování třídimensionálních struktur proteinů a proteinových komplexů Sinz A: J Mass Spectrom 2003: 38, Pierce Biotechnology, Inc. Aminokyseliny, které mohou být likovány: Lys <> Lys, N-konec Tyr <> Tyr Glu, Asp <> Glu,Asp, C-konec Cys <> Cys Princip využití informací o reakcích jednotlivých funčních skupinách rozmístěných na proteinech. Určení vzdáleností a reaktivity (přístupnost zapojení vodíkových vazeb).

62 Chemické zesíťovací činidla (cross-linker) používané v proteomice Homobifukční zesíťovací činidla HBVS (1,6-Hexane-bis-vinylsulfone) sulfhydryl-reactive reagent DSP (Dithiobis[succinimidylpropionate]) Primary amino-reactive reagent První reaktivní funkční skupina Oddalovací raménko štěpitelné Druhá reaktivní funkční skupina Heterobifunkční zesíťovací činidla GMBS (N-[g-Maleimidobutyryloxy]succinimide ester) SADP (N-Succinimidyl(4-azidophenyl)-1, 3 -dithiopropionate) Primary amino-reactive reagent and photoreactive group

63 Využití izotopových výměn vodíku (1H)/(2H) pro studium dynamických a strukturálních vlastností proteinů Protein D 2 O exchange buffer Značení proteinu zastavení značení ph 2.5, 0 C Globální informace o výměnách H/D na úrovni proteinu ph 2.5, 0 C Lokální informace o výměnách H/D na úrovni peptidů LC-ESI MS Pepsin digest Stanovení hladin deuteria na úrovni proteinu LC-ESI MS Stanovení hladin deuteria na úrovni peptidů Yan X, etal, Deinzer ML: Mol Cell Proteomics 2004: 3, Hoofmagle AN, etal, Ahn NG: Annu Rev Biophys Biomol Struct 2003: 32, 1-25

64 Využití izotopových výměn vodíku (1H)/(2H) pro studium protein-protein interakcí Borch J, Jorgensen TJD, Roepstorff P: Curr Opin Chem Biol 2005: 9, Komives EA: Int J Mass Spectrom 2005: 240,