UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE

Transkript

1 UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ KATEDRA ANALYTICKÉ CHEMIE Stanvení bsahvých látek v lubrikačním gelu metdu plynvé chrmatgrafie Diplmvá práce Veducí diplmvé práce: PharmDr. Ludmila Matysvá, Ph.D. Veducí katedry: Prf. RNDr. Petr Slich, CSc. Hradec Králvé 2009 Pavlína Ryšavá

2 Prhlášení literatury. Prhlašuji, že jsem diplmvu práci zpracvala samstatně a s pužitím uvedené V Hradci Králvé dne Pavlína Ryšavá

3 Pděkvání Ráda bych pděkvala veducí své práce PharmDr. Ludmile Matysvé, Ph.D. za dbrné vedení, cenné rady při vypracvání tét práce a vstřícný přístup. Mé pděkvání také patří PharmDr. Lucii Havlíkvé, Ph.D. za pmc a rady při práci s plynvým chrmatgrafem.

4 Suhrn Tat práce zpracvává téma Stanvení bsahvých látek v lubrikačním gelu metdu plynvé chrmatgrafie a knkrétně se zabývá lubrikačním gelem Tea Tree Fantasy, který bsahuje přírdní substanci tea tree il. TTO má silné antiseptické, antimyktické a prtiplísňvé účinky, a jeh důležitu germicidní aktivní slžku je terpinen-4-l. Práce je rzdělena d smi kapitl, hlavní část tvří kapitly 3 6. Třetí kapitla je věnvána teretické části, ve které je pdrbně ppsána plynvá chrmatgrafie, jak metda vhdná pr stanvení terpinen-4-lu v lubrikačním gelu. Tat kapitla se také zabývá validací analytické metdy a jedntlivými validačními parametry. Dále tat kapitla bsahuje charakteristiku lubrikačníh gelu, tea tree ilu a terpinen-4-lu. Ve čtvrté kapitle je vypracvána rešerše metd již pužitých při stanvení látky terpinen-4-lu. Pátá kapitla se věnuje experimentální části a jsu v ní uvedeny všechny chemikálie, přístrje a pdmínky separace. Šestá kapitla ppisuje výsledky a diskuze nejprve při vývji analytické metdy, a následně při testu vhdnsti chrmatgrafickéh systému a validaci metdy. Smyslem tét práce je tedy validace metdy plynvé chrmatgrafie při stanvení terpinen-4-lu v lubrikačním gelu. Abstract This thesis deals with the tpic The determinatin f cntent substances in lubricatin gel by methd f gas chrmatgraphy and with lubricatin gel Tea Tree Fantasy, which includes natural substance f tea tree il. Tea tree il has strng antiseptic, antimyctic and antifungal effects, and the terpinene-4-l is its imprtant germicidal cmpnent. This thesis is divided int eight chapters; its main part cnsists f chapters 3 6. The third chapter deals with the theretical part, where the gas chrmatgraphy is described. This methd is suitable fr determinatin f terpinene-4-l in lubricatin gel. This chapter als deals with the validatin f analytical methd and with individual parameters and cntains the characteristics f lubricatin gel, tea tree il and terpinene-4- l. In the furth chapter, there are wrked ut the search f used methds. The fifth chapter deals with the experimental part; all chemicals, instruments and cnditins f islatin are written dwn there. The sixth chapter describes results and discussin frm the develpment f analytical methd, frm the system suitability test and frm the validatin. The main gal f this thesis is the validatin f gas chrmatgraphy methd fr the determinatin terpinene-4-l in lubricatin gel.

5 Obsah 1 ÚVOD CÍL PRÁCE TEORETICKÁ ČÁST SEPARAČNÍ METODY Rzdělení separačních metd CHROMATOGRAFICKÉ METODY Dělení pdle pužité techniky Dělení pdle pdstaty separačníh děje Dělení pdle skupenství stacinární a mbilní fáze PLYNOVÁ CHROMATOGRAFIE Princip separace látek Pracvní techniky Schéma plynvéh chrmatgrafu Kvalitativní vyhdncení analýzy Kvantitativní vyhdncení analýzy Vliv distribuční knstanty na separaci Účinnst separace Využití plynvé chrmatgrafie Derivatizace v plynvé chrmatgrafii VALIDACE ANALYTICKÉ METODY Interní (vnitřní) validace Externí (vnější) validace Přesnst (Precisin) Správnst (Accuracy) Selektivita, specifita (Selectivity, Specificity) Linearita (Linearity) Detekční a kvantitativní limit (Limit f Detectin, Limit f Quantitatin) Rbustnst (Rbustness) Směrdatná dchylka s x LUBRIKAČNÍ GEL TEA TREE FANTASY Tea tree il Terpinen-4-l Lékpisná definice gelu REŠERŠE PLYNOVÁ CHROMATOGRAFIE VYSOKOÚČINNÁ TENKOVRSTVÁ CHROMATOGRAFIE STUDIE ABSORPCE TTO KŮŽÍ TERPINEN-4-OL JAKO VNITŘNÍ STANDARD VÝSLEDKY REŠERŠE Výběr metdy Teplta injektru, klny a detektru Rzpuštědl Vnitřní standard Zpracvání vzrku... 36

6 5 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST ANALYTICKÝ POSTUP Vzrek, standardy, chemikálie Přístrje, pdmínky separace VÝSLEDKY A DISKUZE VÝVOJ ANALYTICKÉ METODY Teretický výpčet bsahu terpinen-4-lu v lubrikačním gelu Vlba vnitřníh standardu Stanvení kncentrace vnitřníh standardu Vlba rzpuštědla Výsledné pdmínky Příprava vzrku TEST VHODNOSTI CHROMATOGRAFICKÉHO SYSTÉMU Účinnst chrmatgrafické klny (pčet pater N) Asymetrie chrmatgrafickéh píku (T) Rzlišení chrmatgrafických píků (Rij) Opakvatelnst VALIDACE ANALYTICKÉ METODY Přesnst Správnst Selektivita Linearita Detekční a kvantitativní limit ZÁVĚR SEZNAMY SEZNAM LITERATURY SEZNAM ZKRATEK SEZNAM OBRÁZKŮ SEZNAM TABULEK... 59

7 1 Úvd Plynvá chrmatgrafie je jednu z nejdůležitějších a nejpužívanějších chrmatgrafických metd a její výhdu je jednduchst, vyská citlivst a velmi dbrá separační účinnst. Využívá se při dělení, identifikaci a stanvení všech látek, které lze převést bez rzkladu v plynnu fázi d teplty 400 C. Látky mál těkavé se upravují derivatizací. Plynvá chrmatgrafie je metda pracující s malým mnžstvím vzrku a nachází velmi širké uplatnění v dvětví chemickéh, ptravinářskéh a farmaceutickéh průmyslu a také v elektrprůmyslu, zdravtnictví a eklgii. Ve farmacii služí ke kntrle čistty, mnitrvání bsahu léčiv a také pr stanvení bsahu éterických lejů. Lubrikační gel Tea Tree Fantasy bsahuje velice účinnu přírdní substanci tea tree il, jehž charakteristická vůně vzniká v důsledku přítmnsti asi sta různých samstatných slžek, především mnterpenů, terpenů, alkhlů a seskviterpenů. Pr průkaz těcht slžek je plynvá chrmatgrafie vhdná. Při vývji nvé metdy se prvádí validace, cž je prces, kterým se zjišťují nedůležitější charakteristiky metdy se smyslem demnstrvat, že navržená metda je pr daný účel vhdná. Cílem validace je stanvit pdmínky, při kterých je zkušební pstup pužitelný. Je nutné zajistit stejnu splehlivst při pakvaném pužití v jedné neb i v různých labratřích. Pracvní pstup je chápán jak úplný analytický předpis, který služí k reprdukvání celé analytické metdy, prt musí bsahvat všechny nezbytné instrukce a musí být dstatečně přesný, pdrbný a úplný. 6

8 2 Cíl práce Cílem tét diplmvé práce byl stanvení terpinen-4-lu v lubrikačním gelu Tea Tree Fantasy metdu plynvé chrmatgrafie. Vývj metdy předcházela důkladná rešerše metd již pužitých při stanvení sledvané látky. P zhdncení získaných pznatků následval vývj metdy a pté věření vhdnsti dané metdy pr zamýšlený účel. Pdmínky musí být upraveny tak, aby metda pskytvala správné a přesné výsledky s dstatečnu citlivstí. 7

9 3 Teretická část 3.1 Separační metdy Stanvení jedné slžky ve slžitějším vzrku bvykle není mžné prvést přím p převedení vzrku d rztku. Před vlastní analýzu je většinu nutné ddělit stanvvanu slžku d statních neb ddělit slžky, které stanvení ruší. K tmut účelu služí separace, kteru lze definvat jak peraci, při které se vzrek dělí alespň na dva pdíly různéh slžení. Z užšíh analytickéh hlediska je separace jednu z velmi významných fází analýzy, na které závisí přesnst a splehlivst výsledku celé analýzy. Od separačních metd pžadujeme c nejdknalejší ddělení dané slžky, a aby tat slžka byla ve frmě vhdné k měření [1] Rzdělení separačních metd Metdy zalžené na rzdílech v rvnvážné distribuci slžek mezi dvě fáze chrmatgrafie, destilace, sublimace, extrakce, frakční krystalizace, aj. Metdy zalžené na rzdílech v rychlsti phybu slžek ultrafiltrace, dialýza, elektrfréza, ultracentrifugace, aj. Maximální pčet slžek, které mhu být separvány v jediné peraci, je tzv. frakcinační kapacita. Takvé metdy jak krystalizace, jednduchá extrakce, sublimace mhu rzdělit vzrek puze na dvě části (frakcinační kapacita je 2). Plynvá chrmatgrafie může dsáhnut frakcinační kapacity 100 a více [1]. 8

10 3.2 Chrmatgrafické metdy Chrmatgrafické metdy mají velmi širké využití. Je t především prt, že se jedná metdy separační, umžňující analýzu směsí a zárveň jejich kvalitativní i kvantitativní hdncení [2]. Chrmatgrafie využívá dělení analyzvaných látek mezi dvě fáze, z nichž jedna je stacinární nephyblivá a druhá mbilní phyblivá. V průběhu chrmatgrafickéh prcesu dchází k pstupnému, mnhkrát pakvanému vytváření rvnvážných stavů dělených látek mezi stacinární a mbilní fází. Při styku stacinární i mbilní fáze s dělenými látkami dchází k vzájemným interakcím, které jsu základním předpkladem pr jejich separaci. K separaci tedy dchází na základě různé afinity dělených látek ke stacinární a mbilní fázi [2] Dělení pdle pužité techniky Klnvá: Stacinární fáze je umístěna v trubici. Papírvá: Stacinární fáze je sučástí chrmatgrafickéh papíru. Tenkvrstvá: Stacinární fáze je umístěna na pevném plchém pdkladu (např. skleněné desce neb hliníkvé flii) [3] Dělení pdle pdstaty separačníh děje Adsrpční chrmatgrafie: Pdstatu dělení je různá schpnst slžek putat se na aktivní pvrch srbentu. Rzdělvací chrmatgrafie: O separaci rzhduje dlišná rzpustnst slžek vzrku ve stacinární fázi (kapalina) a mbilní fázi (kapalina neb plyn). Intvě výměnná chrmatgrafie: O separaci rzhdují různě velké elektrstatické přitažlivé síly mezi funkčními skupinami stacinární fáze (intměnič) a inty vzrku. Gelvá permeační chrmatgrafie: Slžky se separují pdle veliksti na pórvité stacinární fázi (gelu); menší mlekuly vzrku se v pórech gelu zdržují déle (mlekulvě sítvý efekt). Afinitní chrmatgrafie: Stacinární fáze je schpna vázat ze vzrku právě určité slžky, ke kterým má úzce selektivní vztah (afinitu) [3]. 9

11 3.2.3 Dělení pdle skupenství stacinární a mbilní fáze Plynvá chrmatgrafie Adsrpční plynvá chrmatgrafie Rzdělvací plynvá chrmatgrafie Zkratka Mbilní fáze Stacinární fáze GSC plyn pevná látka GLC plyn kapalina Tabulka 1 - Dělení plynvé chrmatgrafie pdle skupenství fází Kapalinvá chrmatgrafie Adsrpční kapalinvá chrmatgrafie Rzdělvací kapalinvá chrmatgrafie Intvě výměnná chrmatgrafie Gelvá permeační chrmatgrafie Zkratka Mbilní fáze Stacinární fáze LSC kapalina pevná látka LLC kapalina kapalina IEC kapalina (pufr) intměnič GPC gel kapalina Papírvá chrmatgrafie PC kapalina kapalina Tenkvrstvá chrmatgrafie TLC kapalina pevná látka Tabulka 2 - Dělení kapalinvé chrmatgrafie pdle skupenství fází 10

12 3.3 Plynvá chrmatgrafie Plynvá chrmatgrafie je jednu z nejdůležitějších a nejpužívanějších chrmatgrafických metd. Mezi hlavní výhdy tét metdy patří jednduchst, vyská citlivst a velmi vyská separační účinnst. Přitm je mžné plynvu chrmatgrafií identifikvat a stanvit nejen plyny, ale také látky kapalné a pevné, které je mžné převést bez rzkladu d plynnéh stavu (asi d 400 C) [1] Princip separace látek Rztk vzrku se nastříkne d vyhřívanéh prstru dávkvače, kde se ihned vypaří a je unášen prudem nsnéh plynu d chrmatgrafické klny, která je umístěna v termstatu. Na pčátku klny se dělené látky srbují ve stacinární fázi, tj. rzpuštějí se v zaktvené fázi (GLC) neb se adsrbují na pevný adsrbent (GSC) a pté se desrbují čistým nsným plynem. Tent prces prbíhá mnhnásbně a nsný plyn unáší dělené látky. Látky vycházejí z klny v pměru svých srpčních sil. Nejdříve vystupují látky, které se srbují mál (mají nejkratší eluční časy). Z klny pstupují látky d detektru, kde se registruje signál, který dpvídá změnám kncentrace v nsném plynu vystupujícím z klny [1] Pracvní techniky Eluční metda jejím principem je vymývání jednrázvě dávkvanéh vzrku nsným plynem. První z klny vychází ta slžka, která se nejméně zachycuje na stacinární fázi. Čas, za který slžka vyjde z klny, je pr ni charakteristický a služí k její identifikaci. Výsledkem je chrmatgram tvřený sérií elučních křivek nebli píků. Zaznamenává se signál z detektru v závislsti na čase neb na bjemu pršléh nsnéh plynu. Tat technika je nejběžnější. Stálé pdmínky jsu vhdné pr směsi, jejichž slžky se jen mál liší svými fyzikálními charakteristikami. Při velkých dlišnstech se pužívá prgramvá plynvá chrmatgrafie, v níž se během separace mění teplta neb průtk nsnéh plynu [3]. Frntální metda je zalžena na kntinuálním přivádění vzrku d klny. Nejdříve z klny vychází látka, která se nejméně zachycuje. Pslední z klny vychází směs vzrku s nsným plynem půvdním slžení. Metdu lze pužít pr kntrlu technických prcesů [3]. 11

13 Vytěsňvací metda principem tét metdy je pět jednrázvé dávkvání vzrku d prudu nsnéh plynu před vstupem d klny. Nsný plyn je ale sycen vytěsňujícím činidlem, cž jsu páry látky, která se v klně zadržuje silněji než kterákli slžka vzrku. Vytěsňující činidl knkuruje slžkám vzrku při srpci na stacinární fázi a sune tyt slžky před sebu. V klně se uspřádají zóny d nejméně se zadržující slžky p vytěsňující činidl. Šířka zóny je úměrná kncentraci dané slžky [3] Schéma plynvéh chrmatgrafu Obrázek 1 - Plynvý chrmatgraf [4] Zásbník nsnéh plynu úklem nsnéh plynu je unášet vzrek klnu a vůči jeh slžkám být inertní. Nemá tedy přímý vliv na separaci. Při výběru plynu hraje rli ptřeba netxicity, bezpečnsti práce a nižší ceny. Vlba nsnéh plynu může záležet i na druhu klny a detektru. Nejčastěji pužívanými plyny jsu dusík, helium, argn a vdík. Před vstupem d klny se nsný plyn čistí, suší a reguluje se jeh průtk a tlak [3]. Nástřik vzrku dávkvací zařízení musí umžnit rychlé vpravení vzrku d klny a dbru reprdukvatelnst dávkvání 0,1 5 μl vzrku. Rztky dávkujeme injekčními mikrstříkačkami přes pryžvé septum neb tzv. autsamplerem. Teplta dávkvacíh zařízení musí být 50 C vyšší než je teplta varu nejvýše vrucí slžky bsažené ve vzrku. Zplyněný vzrek je pak nsným plynem unášen d klny [1]. 12

14 Metdy nastřikvání [3]: a) D klny (n clumn) je t základní metda u náplňvých kln a u kapilárních kln větší světlsti (d 0,25 mm) s pužitím jemné nastřikvací jehly. b) Pmcí děliče tku (split injectin) pužívá se u kapilárních kln, prtže mají malu kapacitu. Část vzrku (zejména kncentrvanéh) s nsným plynem se pmcí děliče tku ddělí a d klny se dstává jen definvaný zlmek nastřikvanéh mnžství. c) Bez děliče tku (splitless injectin) tat metda je vhdná pr relativně velké bjemy, které je nutn pužít pr stpvu analýzu. Je zde využit rzpuštědl s vyšší tepltu varu, které kndenzuje a vytváří kapalný film v hlavě klny, a v něm jsu phlceny všechny analyty. d) Kncentrátr na pčátku klny je t metda zachycvání vzrku ze vzduchu neb vdnéh rztku na adsrbent, jak je pórvitý plymer neb grafitizvané saze. Vzrek je pak termicky desrbván přím d klny. Klny a) náplňvé jedná se trubice naplněné srbenty neb nsiči pkrytými kapalnu fází. Tyt klny se zhtvují z nerezvé celi neb ze skla, mají průměr 3-8 mm a délku 1-5 m. Mají vyšší kapacitu než kapilární klny. b) kapilární využívají jak nsiče stacinární fáze svu vnitřní stěnu. Tyt klny jsu bvykle z křemene, jejich vnitřní průměr je menší než 0,5 mm a délka m. V metdě GSC je stacinární fází srbent (aktivní uhlí, silikagel, zelit, aj.) a v metdě GLC je stacinární fází kapalinvý film (plyethylenglykl, plyprpylenglykl, plyester, plysilxan) zaktvený na inertním nsiči (tefln, silikagel, skleněné kuličky, různé druhy křemelin). V případě GSC je distribuce mezi bě hetergenní fáze zalžena na adsrpci neb sítvém efektu, v případě GLC na rzpuštění. V praxi nalézají větší uplatnění kapalné stacinární fáze [5]. Stacinární kapaliny by měly být tepltně stálé a mál těkavé. Měly by pevně ulpívat na nsiči, aby nedcházel k jejich vymývání z klny. Vlba stacinární fáze je bvykle rzhdující pr výběr vhdné klny pr analyzvaný vzrek. Důležitá je plarita separvaných slžek. Neplární slučeniny jsu bvykle slženy jen 13

15 z uhlíkvých a vdíkvých atmů. Pr nejběžnější analýzy směsí alkanů pužijeme neplární kapilární klny. K separacím plárních mlekul, které bsahují na uhlíkvém řetězci jeden neb více atmů Cl, Br, F, N, O, P neb S (alkhly, aminy, karbxylvé kyseliny, estery, ethery, ketny, PCB, thily), a plarizvatelných mlekul, které bsahují jednu neb více násbných vazeb mezi uhlíky (alkeny, areny) pužijeme středně plárních kln [3]. Detektry nsný plyn z klny prtéká detektrem, který reaguje na přítmnst analytu a vysílá signál, který je zaznamenáván v závislsti na čase. Detektr sleduje takvu vlastnst plynu z klny, která závisí na druhu a kncentraci slžek (analytická vlastnst). Musí mít dstatečnu citlivst (nízký detekční limit) a jeh dezva by měla být lineární funkcí bsahu analytu. Důležitým pžadavkem je vyská selektivita pr stanvvané analyty [3]. a) Tepelně vdivstní detektr (TCD) je univerzální detektr. Nsný plyn prudí přes vlákn žhavené stálým elektrickým prudem a chlazuje je na určitu tepltu. Přítmnst slžky změní tepelnu vdivst prstředí klem žhavenéh vlákna, a tím jeh tepltu a elektrický dpr. Pr pužití je důležitá vlba nsnéh plynu. Jeh tepelná vdivst se má c nejvíce dlišvat d tepelné vdivsti analyzvaných slžek. Má nižší citlivst a detekční limity jsu v μg analytu [3]. b) Plamenvý inizační detektr (FID) je velmi citlivý detektr. Mlekuly plynu se inizují v kyslíkvdíkvém plameni a vedu inizační prud mezi elektrdami. Nsný plyn se před vstupem d hřáku mísí s vdíkem, vzduch je přiváděn z vnějšku. Přítmnst slžky zvýší inizaci a elektrický prud se zvětší. Detekční limity jsu v pg analytu [3]. 14

16 Obrázek 2 - Plamenvý inizační detektr [6] c) Hmtnstní spektrmetr (MS) je univerzální detektr s citlivstí až 10 pg. Inty jsu analyzvány kvadrupólvým analyzátrem neb intvu pastí. Principem MS je inizace neutrálníh atmu či mlekuly za vzniku intů a jejich fragmentů, které jsu dále separvány a detekvány pdle m/z (m - hmtnst intu, z nábj intu) [2]. d) Detektr elektrnvéh záchytu (ECD) je selektivní pr elektrnegativní skupiny (halgeny, ppř. nitrlátky). Principem měření je inizace nsnéh plynu β zářením za vzniku inizačníh prudu, tj. knstantníh prudu pmalých elektrnů. Elektrny jsu zachycvány elektrnegativními atmy (halgeny) neb skupinami (nitrskupiny). Tent detektr dsahuje citlivsti 1 pg [2]. e) Terminizační detektr (TID) je selektivní především pr slučeniny bsahující ve své mlekule dusík a fsfr. Dsahuje citlivsti 10 pg pr N a 1 pg pr P. Pracuje na principu inizace rganických látek v kyslíkvdíkvém plameni, který je veden přes prstenec slí alkalických zemin [2]. f) Ftinizační detektr (PID) - je univerzální pr rganické látky a dsahuje citlivsti 10 pg. PID je zalžen na principu inizace rganických látek ftnem a následné detekci uvlněných elektrnů [2]. Termstat Zajišťuje dstatečně vysku tepltu dávkvače, klny a detektru, aby byl vzrek udržen v plynném stavu. Knstantní teplta je využitelná, neliší-li se analyty příliš svými tepltami varu. Je-li přítmn širké spektrum slžek s různými 15

17 tepltami varu, separace by byla časvě nárčná. Teplta klny se prt může prgramvě měnit. Běžně se pracuje při tepltách C [3]. Zapisvač, integrační sftware Zpracvává signál z detektru, zakresluje chrmatgraficku křivku a prvádí její vyhdncení [3]. Chrmatgram Obrázek 3 - Chrmatgrafický záznam [3] inert...látka, která se nezachycuje v klně (phybuje se klnu stejnu rychlstí jak nsný plyn) h...výška píku Y...šířka píku v základně Y 1/2...šířka píku v plvině výšky t R...retenční čas, pr který platí t R = t M + t R t M...mrtvý retenční čas (mlekula setrvává v mbilní fázi) t R...redukvaný retenční čas (mlekula setrvává ve stacinární fázi) Kvalitativní vyhdncení analýzy V R = t R * F V R...retenční bjem t R...retenční čas F...bjemvá rychlst tku mbilní fáze 16

18 Nejvýhdnější pstup identifikace slžky je prvnání retenčních charakteristik danéh píku s údaji standardních látek. Nejvhdnější je metda standardníh přídavku a prvedení druhé chrmatgrafie [1] Kvantitativní vyhdncení analýzy Kvantitativní zastupení slžky ve směsi je za určitých pdmínek dán plchu pd píkem dané slžky. U symetrických píků lze využít způsb příméh srvnání výšek píků standardu (h s ) a stanvvané slžky (h x ): h x : h s = c x : c s Obsah látky ve vzrku se zjišťuje metdu vnějšíh standardu (prvnání plchy píku stanvvané slžky s plchu píku standardu, chrmatgrafvanéh za stejných pdmínek) neb metdu vnitřníh standardu (přídavek přesně známéh mnžství standardní látky d analyzvané směsi před chrmatgrafií; standard i vzrek jsu vystaveny stejným vlivům, prt dchází k jejich eliminaci) [1] Vliv distribuční knstanty na separaci V klně se neustále během separace vytváří a prušuje fázvá rvnváha mezi mbilní a stacinární fází. Tent děj prbíhá nepřetržitě. Slžka má při ustavení rvnváhy ve stacinární fázi kncentraci c s a v mbilní fázi c m. Pměr těcht kncentrací je v ideálním případě knstantní a nazývá se distribuční knstanta K D (charakterizuje distribuci rzdělení slžky mezi bě fáze): K c s D cm Čím je hdnta distribuční knstanty vyšší, tím je slžka více vázána stacinární fází a déle zadržvána v klně. Na následujícím brázku je znázrněna slžka, která má K D větší než jedna [3]. 17

19 Obrázek 4 - Znázrnění phybu zóny slžky v klně [3] Při ddělvání dvu slžek je nutné, aby se jejich distribuční knstanty lišily. Distribuční knstanta je závislá na tepltě. Je-li teplta knstantní, závislst c s na c m se nazývá izterma. U kapalných stacinárních fází bývá čast splněna jednduchá lineární závislst. U tuhých stacinárních fází jsu iztermy běžně nelineární. Tvar iztermy úzce suvisí s tvarem píku, u lineární iztermy je pík symetrický a u nelineární bývá nesymetricky natažen na jednu stranu. Jedná se pak pík s rzmytu frntu neb pík chvstující. V případě chvstujícíh píku se ve stacinární fázi účinněji váže slžka, která má v mbilní fázi nižší kncentraci. D detektru vstupuje pzději, cž se na píku prjeví jak chvst. V případě píku s rzmytu frntu se napak ve stacinární fázi zadržuje slžka s vyšší kncentrací, prt se maximum píku pžďuje. Defrmace píků mívají i jiné příčiny a čast suvisí s pstupem při dávkvání [3]. Obrázek 5 - Suvislst tvaru píku s tvarem iztermy [3] 18

20 3.3.7 Účinnst separace Účinnst klny charakterizuje její schpnst separvat slžky směsi. Čím je klna účinnější, tím lépe dkáže slžky směsi d sebe ddělit. Účinnst klny rste s pčtem teretických pater n, cž je pmyslná část klny, ve které dchází k ustavení rvnváhy mezi mbilní a stacinární fází. Délka tét části se nazývá výškvý ekvivalent teretickéh patra H, pr který platí H = L / n (L je délka klny) [3]. Pčet teretických pater lze určit z šířky píku v základně Y neb z šířky píku v plvině jeh výšky Y 1/2 a retenčníh času t R : t R n = 16 * Y t n = 5,54* Y 2 R 1/ 2 2 K rzšiřvání zóny v klně, a tím k růstu výškvéh ekvivalentu teretickéh patra vedu, pdle van Deemtervy terie, následující děje [3]: Turbulentní difuze (H A ) hlavní vliv má velikst a tvar částic náplně klny a rvnměrnst jejich ulžení. Mlekuly mbilní fáze prtékají klem částic stacinární fáze různu cestu, některé přímější, jiné méně. Dvě prvnávané mlekuly se tedy za určitu dbu dstanu d jiné vzdálensti, a tím se zóna slžky rzšiřuje. Lineární rychlst mbilní fáze nemá na tent děj vliv. Mlekulární difuze (H B ) nastává, když mlekuly slžky prnikají d míst nižší kncentrace, a tím rzšiřují svu zónu. Látky s vyšším difuzním keficientem mají výraznější rzšíření zóny. Příspěvek mlekulární difuze narůstá s časem, který slžka stráví v klně. Lineární rychlst mbilní fáze je nepřím úměrná mlekulární difuzi. Odpr prti převdu hmty (H C ) závisí na hlubce prniknutí mlekuly slžky d stacinární fáze. Mlekula, která prnikne d stacinární fáze hluběji, se v ní zdrží déle než ta, která ulpí na jejím pvrchu, a tím dchází k rzšíření zóny. Lineární rychlst mbilní fáze je přím úměrná dpru prti převdu hmty. Grafem závislsti výškvéh ekvivalentu teretickéh patra na lineární rychlsti mbilní fáze je křivka, v jejímž minimu je ptimální lineární rychlst. Prakticky se vlí takvá rychlst mbilní fáze, při které je separace dstatečně účinná a rychlá, cž je 19

21 rychlst trchu vyšší než dpvídá minimu křivky bez výrazné ztráty na účinnsti separace. Obrázek 6 - Závislst účinnsti klny na lineární rychlsti mbilní fáze [3] Na následujícím brázku jsu zbrazeny závislsti účinnsti klny na lineární rychlsti mbilní fáze pr jedntlivé nsné plyny. Nejvyšší lineární rychlst má vdík a jeh křivka je velmi plchá, prt má změna rychlsti malý vliv na H [3]. Obrázek 7 - Vliv vlby nsnéh plynu na účinnst kapilární klny [3] Využití plynvé chrmatgrafie Plynvá chrmatgrafie se využívá při dělení, identifikaci a stanvení všech slžek, které lze převést bez rzkladu v plynnu fázi d teplty 400 C. Lze tedy analyzvat látky plynné a zplynitelné látky kapalné a pevné relativní mlekulvé hmtnsti d 400. Látky mál těkavé se upravují derivatizací (převedení slžek na těkavé deriváty). Plynvá chrmatgrafie nachází velmi širké uplatnění jak ve výzkumných, tak i prvzních 20

22 labratřích v dvětvích chemickéh, ptravinářskéh a farmaceutickéh průmyslu a také v elektrprůmyslu a zdravtnictví [1]. Významnu aplikací je sledvání kvality vzduší a určení stpvých mnžství pesticidů v půdě, vdách a ptravinách [5] Derivatizace v plynvé chrmatgrafii Je t metda, při které se mění chemické slžení půvdníh vzrku. Aplikuje se tehdy, není-li mžné vzrek přím analyzvat. Účelem derivatizace v plynvé chrmatgrafii je bvykle dstranění aktivních vdíkvých atmů (zlepšení vlastnstí analytů s hledem na GC separační prces). Optimální je dstranit všechny aktivní vdíky (-OH, -NH 2 skupiny) v jednm reakčním krku. Někdy bývá cílem derivatizace v GC zavedení funkční skupiny, využitelné pr selektivní detekci, d struktury separvanéh analytu. Pdle uspřádání můžeme vlit derivatizaci před klnu neb na klně. U derivatizace před klnu je k dispzici velký výběr derivatizačních činidel i pracvních pdmínek, ale nedstatkem je mnhdy pracná a časvě nárčná předúprava vzrku a dluhý reakční čas mezi slžkami vzrku a derivatizačním činidlem. Výhdu derivatizace na klně je rychlst a jednduchst, lze ji však aplikvat puze pr mezené mnžství analytů i derivatizačních činidel [7]. 21

23 3.4 Validace analytické metdy Validace analytické metdy je prces, kterým se zjišťují nejdůležitější charakteristiky metdy se smyslem demnstrvat, že vypracvaná metda je pr daný účel vhdná. Cílem validace je stanvit pdmínky, při kterých je zkušební pstup pužitelný. Je nutné zajistit stejnu splehlivst při pakvaném pužití v jedné neb i v různých labratřích [8]. Validace se prvádí při vývji nvé metdy, při změně metdy, při přensu metdy d jiné labratře, neb při průkazu rvncennsti dvu metd. Zjištěné hdnty se zpracvávají d validačníh prtklu, který musí bsahvat také patřičnu dkumentaci (př. chrmatgramy) [8]. Validace analytické metdy je ddělený úkn. Obecně je pstup vývje metdy takvý, že se nejprve definují pžadavky na zkušební metdu, vyvine se metda, najdu se ptimální pdmínky a psledním bdem je validace [9]. Obrázek 8 - Schéma validačníh prgramu [11] Pracvní pstup (p výběru dané metdy) je chápán jak úplný analytický předpis, který služí k reprdukvání celé analytické metdy, prt musí bsahvat všechny nezbytné instrukce a musí být dstatečně přesný, pdrbný a úplný. Pracvní pstup musí bsahvat [10]: Stručnu charakteristiku blasti pužití metdy, princip, chemické reakce, analyt a matrice, rzmezí bsahů stanvvané slžky, jedntky. Rztky, činidla a pmcné chemikálie jejich čistta, úprava, příprava, stabilita a kncentrace. 22

24 Standardní perační prceduru mechanická a chemická úprava vzrku, kalibrace, měření, výpčty a hdncení. Sučasně je nutné přesně definvat pdmínky, za kterých se má metda pužít. Pkud mají být výsledky splehlivé při každém pužití metdy, musí být buď jednznačně dány všechny pdmínky, neb musí být uvedena kritéria, která musí být splněna, aby byl mžné určitý analytický systém splehlivě pužít. Při každém dalším pužití nvě vyvinuté validvané metdy se už jen testují právě tat kritéria. Tat kritéria se becně nazývají test způsbilsti analytickéh systému. Dvěma hlavními údaji testu způsbilsti jsu pžadavky na reprdukvatelnst chrmatgrafickéh systému a na rzlišení dvu vybraných píků. Dále je mžné udávat pžadavky na další parametry, které jsu důležité pr knkrétní metdu: pčet teretických pater, asymetrie píků, minimální, případně i maximální retenční čas neb kapacitní pměr stanvvané látky neb také mez detekce [9]. Validační prtkl se dvlává na knkrétní validační prgram. D validačníh prtklu se zaznamenávají všechna měření, výpčty i pmcné výpčty, datum jedntlivých zkušek, jmén zdpvědnéh pracvníka a jména dalších pracvníků, které se na validačním prgramu pdíleli. Výsledky a závěry jsu jasně definvané [10]. Pdmínky revalidace systému nejsu becně definvatelné, prtže každá změna v celém analytickém systému vede vždy k jeh revalidaci, musí být však psuzena individuálně, jestli má prkazatelný vliv na knečný výsledek. V kladném případě je nutné prvést revalidaci, která nemusí být kmplexní, ale puze jak dílčí krk validačníh prgramu (např. kalibrace, citlivst) s tím, že musí být zpětně určena směrdatná dchylka. Některé pdmínky, které definují nutnst revalidace, jsu dány již ve validačním prgramu [10] Interní (vnitřní) validace Je t validace metdy v rámci jedné labratře [10]. Průzkumvá validace jejím cílem je stanvit na mezeném pčtu vzrků, zda zvlená analytická metda je vhdnu metdu pr plnu validaci. Zaměřuje se na vyhdncení validačních parametrů jak je selektivita a rbustnst, a na stanvení pakvatelnsti na mezeném pčtu vzrků. 23

25 Plná validace následuje p průzkumvé validaci. Jejím cílem je demnstrvat vhdnst metdy k zamýšlenému pužití vyhdncením všech pžadvaných validačních parametrů. Validace při převdu metdy pužívá se při zavedení publikvané validvané analytické metdy. Zahrnuje stanvení správnsti labratře a pakvatelnsti. Retrspektivní validace pužívá se, pkud existují již dříve naměřená data získaná za stejných pdmínek. Tat validace umžní vyhdntit jeden z nejdůležitějších validačních parametrů, pakvatelnst Externí (vnější) validace Tat validace zahrnuje interní validaci splečně s validací metdy srvnáním výsledků metdy z více labratří (mezilabratrní prvnávací zkušky), a zahrnuje výpčet reprdukvatelnsti metdy [10]. Analytické metdy musí splňvat určité pžadavky, které vyplývají ze zamýšlenéh pužití, a pdle th se věřují následující validační parametry [8]: Přesnst pakvatelnst Mezilehlá přesnst Identifikace Testvání nečistt - kvantitativní Testvání nečistt - kvalitativní Obsah Správnst Selektivita Linearita Rzsah Detekční limit Kvantitativní limit Rbustnst Tabulka 3 - Validační parametry 1 neprvádí se, je-li prvedena reprdukvatelnst 24

26 3.4.3 Přesnst (Precisin) Přesnst je míra shdy mezi jedntlivými výsledky metdy pakvaně získanými s jedním hmgenním vzrkem. Vzrek se nezávisle šestkrát analyzuje kmpletním pstupem včetně přípravy vzrku. Přesnst se vyjadřuje jak relativní směrdatná dchylka. Pdle pdmínek pakvání se rzlišují následující úrvně [8]: Opakvatelnst (Repeatability) metda se pakuje stejným způsbem, se stejnými činidly, jedním pracvníkem a na tmtéž přístrji Mezilehlá přesnst (Intermediate precisin) metda se prvádí s různými činidly, analytiky i přístrji, v různý den, ale se stejným zhmgenizvaným vzrkem a v jedné labratři Reprdukvatelnst (Reprducibility) metda se prvádí stejně jak u mezilehlé přesnsti, ale v různých labratřích Správnst (Accuracy) Správnst je dchylka výsledku metdy d správné hdnty. Správná hdnta se zjistí buď jinu, nezávislu metdu (jejíž správnst je věřena) neb analýzu mdelvéh vzrku (tj. placeb s přidaným standardem neb vzrek s přídavkem standardní látky). Vyjadřuje se jak rzdíl hdnt neb jak výtěžnst (recvery, R): re cvery = nalezená hdnta *100 správná hdnta Metdu standardníh přídavku se nejprve prměří samtný vzrek, a pté vzrek, d kteréh byl přidán známé mnžství standardu (stejnéh jak stanvvaná látka). Zvětšení plchy píku je přím úměrné přidanému mnžství standardu. Výtěžnst se vypčítá: xi xv recvery = *100 x 0 x i...mnžství stanvvané látky p přídavku x v...mnžství stanvvané látky ve vzrku x 0...mnžství stanvvané látky ve standardu přidaném ke vzrku Pkud se analyzuje mdelvý vzrek, přidává se standardní látka v mnžství menším i větším než je deklarvaný bsah. SÚKL pžaduje jen jednu hladinu, tedy stanvení min. 25

27 6 různých mdelvých vzrků s přibližně 100% bsahem stanvvané látky. Standardní látka se přidává méně než 100%, aby se výsledek nedstal mim kalibrační křivku [9] Selektivita, specifita (Selectivity, Specificity) Selektivita je schpnst metdy změřit správně a specificky stanvvanu látku v přítmnsti jiných látek. T jsu např. další účinné slžky u kmbinvaných přípravků, pmcné látky v placebu, nečistty z výrby, rzkladné prdukty, zbytkvá rzpuštědla neb neznámé látky. Metda pr stanvení bsahu nesmí být jinými látkami rušena. U stabilitu indukující metdy musí být dlžen úplné ddělení rzkladných prduktů. Selektivita se vyjadřuje jak rzdíl mezi výsledky analýzy vzrku bez nečistt, a vzrku s přidanými rzkladnými prdukty, slžkami placeba neb různými nečisttami. V případě, že jsu nečistty neb rzkladné prdukty neznámé neb nedstupné, selektivita se prkazuje jak výtěžnst standardníh přídavku čisté látky k materiálu bsahujícímu stálé mnžství jiných látek. SÚKL nepžaduje číselné dlžení selektivity, pžaduje předlžení např. chrmatgramů placeba, známých vedlejších a rzkladných prduktů neb chrmatgramů vzrků p rzkladu teplem, světlem, hydrlýzu, xidací apd. [9] Linearita (Linearity) Linearita je schpnst metdy dávat výsledky přím úměrné kncentraci stanvvané látky ve vzrku. V tét suvislsti se dále uvádí rzsah (range), cž je interval mezi dvěma hladinami kncentrace stanvvané látky (včetně nich), v němž je látka stanvena s takvu přesnstí, správnstí a linearitu, jak dkládají výsledky validace. Linearita analytické metdy se dlží buď graficky (závislst výsledků na kncentraci stanvvané látky) neb matematicky pmcí výsledků lineární regresní analýzy (krelační faktr, směrnice, y-úsek a chyby stanvení všech těcht hdnt). SÚKL pžaduje vyjádření linearity v rzmezí % deklarvanéh bsahu a stanvení minimálně 5 různých kncentrací standardní látky [9]. 26

28 3.4.7 Detekční a kvantitativní limit (Limit f Detectin, Limit f Quantitatin) Tyt limity vyjadřují citlivst metdy. Jsu t parametry nutné u metd pr stanvení nečistt. Detekční limit (LOD) je pr limitní testy, cž jsu testy zjišťující jen, jestli je látka nad neb pd určitu hranicí. Je t nejnižší detekvatelná kncentrace látky nestanvvané kvantitativně. Kvantitativní limit (LOQ) je pr kvantitativní stanvení bsahu nečistt, a je t nejnižší kncentrace látky stanvitelná s přijatelnu přesnstí a správnstí. U neinstrumentálních metd se hledají tyt limity experimentálně, u instrumentálních metd se zjišťují na základě šumu [9]. 3,3* sn LOD = s n...směrdatná dchylka rzpětí šumu S 10 * s LOQ = S n ( r + r ) s n = 5 S...skln kalibrační křivky Rbustnst (Rbustness) Rbustnst je míra reprdukvatelnsti výsledků z analýzy jednh hmgenníh vzrku v různých labratřích, různými analytiky, na různých přístrjích a s různými činidly. Rbustnst vyjadřuje schpnst metdy dávat správné a přesné výsledky i při menších změnách pracvních pdmínek. SÚKL nepžaduje číselné dlžení rbustnsti. Je ale vhdné uvést v dkumentaci pznatky z vývje metdy, tj. upzrnit na pdmínky, které mhu vlivnit výsledky (vliv ph a teplty, stabilita vzrku v rztku, vliv různých šarží činidel, vliv změny klny apd.). Obecně nelze pžadvat všechny parametry u každé metdy, záleží na pužité metdě, jejím cíli i vzrku, jenž je analyzván [9] Směrdatná dchylka s x Směrdatná dchylka charakterizuje rzptýlení jedntlivých hdnt x i kl průměru x : s = 1 n A ( x ) x x i ν i= 1 2 ν...pčet stupňů vlnsti 27

29 Odhad hdnty s x se může pčítat pmcí rzpětí R, které je definván jak rzdíl mezi nejmenší a největší hdntu kvalitativníh znaku. Prtže je směrdatná dchylka náhdná veličina, nemůže být pkládána za becně platnu charakteristiku dané analytické metdy a musí být specifikvána: pr přesně specifikvaný pracvní pstup bez sebemenších dchylek, v hdntě s x musí být zahrnuty všechny zdrje variability, tedy i ty, které plynu z pracvníh pstupu (rzklad vzrku, rzpuštění, extrakce, ředění, knečné instrumentální měření), v případě jakékli změny v pracvním pstupu se musí hdnta směrdatné dchylky revalidvat musí být určena z dstatečně velkéh pčtu vzrků téhž materiálu, směrdatná dchylka platí pr danu kncentrační hladinu a materiál nesmí se určvat z jedné věřvací série, ale z dluhdbéh měření [10] 28

30 3.5 Lubrikační gel Tea Tree Fantasy Výrbce: Herbacs-Bfarma s.r.. Slžení lubrikačníh gelu: Carbpl 940 Glycerin CA 24 (max. 0,20%) Hydrxid sdný Tea Tree Oil (max. 0,10%) Briliant Blue C.I Tartrazin E C.I Vda čištěná Obrázek 9 - Lubrikační gel [12] Tea tree il Obrázek 10 - Melaleuca alterniflia [14] Tea tree il je velice účinná přírdní substance, která se získává destilací listů z australskéh čajvníku Melaleuca alterniflia. Rd Melaleuca patří d čeledi myrtvitých. Esenciální lej se nachází převážně v listech v malých lejvých žlázkách, které při rztírání praskají a uvlňují rychle prchavý lej. Charakteristická vůně vzniká v důsledku přítmnsti asi 100 různých samstatných slžek, především mnterpenů, terpenů, alkhlů a sesquiterpenů. Tyt slžky se prkazují plynvu chrmatgrafií, ale ne všechny byly dsud chemicky definvány. Obsah jedntlivých slžek závisí na dbě sklizně, na kvalitě půdy, na pdnebí a na zkušenstech s destilací [13]. Tea tree il má velmi širké spektrum využití, má silné antiseptické, antimyktické a prtiplísňvé účinky. Pužívá se při radikální léčbě kvasinkvých nemcnění a plísňvých nemcnění nhu, nehtů a kůže. Dále je účinný na akné, pary, afty, záněty dásní, kžní vyrážky, lupy, blesti v krku a různá nemcnění hrních cest dýchacích. 29

31 TTO nedráždí pkžku, není txický, nepškzuje buňky tkání a nemá žádné významné vedlejší účinky. Je ksmeticky velmi vhdný, prtže je bezbarvý a má příjemnu čistu vůni [14]. Důležitá germicidní aktivní slžka Tea tree leje je terpinen-4-l. Jiné slžky leje se chvají jak synergika (usnadňují vstřebání d pkžky), rzpuštědla atd. Obsah terpinen-4-lu v TTO je více než 30% [15] Terpinen-4-l Synnymum: 4-Methyl-1-(1-methylethyl)-3-cyclhexen-1-l Mlekulární vzrec: C 10 H 18 O M = 154,249 Vzhled: bezbarvá neb světle žlutá kapalina Bd varu: 212 C Bd vznícení: C Hustta: 0,929 g/cm 3 Obrázek 11 - Strukturní vzrec terpinen-4-lu [16] Stabilita: stabilní, hřlavý, nemísitelný se silnými xidačními činidly Rzpustnst: velmi mál rzpustný ve vdě; rzpustný v alkhlu, prpylenglyklu a lejích [16],[17],[18] Lékpisná definice gelu Gel je tvřen tekutinami, které gelvatí za přítmnsti vhdných geltvrných látek. Hydrfbní gel (legel) je přípravek, jehž základ je bvykle tvřen tekutým parafilmem s plyethylenem neb mastnými leji tvřícími gel s klidním xidem křemičitým neb hlinitým neb zinečnatým mýdlem. Hydrfilní gel (hydrgel) je přípravek, jehž základ bvykle tvří vda, glycerl neb prpylenglykl tvřící gel s vhdnu geltvrnu látku, jak je škrb, deriváty celulsy, karbmery a křemičitany hřečnat-hlinité [19]. 30

32 4 Rešerše Vývji metdy předchází rešerše metd již pužitých při stanvení sledvané látky a vyhdncení nalezených pdmínek, které mhu být pdle ptřeby upraveny. 4.1 Plynvá chrmatgrafie Pmcí plynvé chrmatgrafie byla prvedena analýza terpinen-4-lu v TTO. Tea tree il je v lubrikačním gelu bsažen v mnžství max. 0,1%. Byla vyvinuta metda pr kvantitativní stanvení terpinen-4-lu s pužitím FID detektru a vdíku jak nsnéh plynu. Dále byla vyvinuta metda pr kvalitativní stanvení s pužitím MS detektru a helia jak nsnéh plynu. V následující tabulce jsu prvnány pdmínky těcht metd [20]. GC Hewlett Packard 5890 Hewlett Packard 6890 Detektr FID MS Nsný plyn vdík helium Průtk 45 cm/s 36 cm/s Typ klny kapilární kapilární Délka klny 60 m 30,3 m Průměr klny 0,25 mm 0,25 mm Tlušťka filmu 0,2 μm 0,25 μm Teplta injektru 250 C 250 C Teplta klny 60 C (1min) 250 C 250 C Teplta detektru 300 C 150 C 280 C Nástřik 1 μl 1 μl Rzpuštědl ethanl ethanl Vnitřní standard n-tridecan n-tridecan Split 1 : 50 1 : 50 Tabulka 4 - Rešerše GC 31

33 4.2 Vyskúčinná tenkvrstvá chrmatgrafie Metda HPTLC byla vyvinuta a validvána pr stanvení TTO v ksmetických přípravcích. Kncentrace TTO byla stanvena analýzu bsahu terpinen-4-lu, cž je hlavní slžka tea tree ilu. Výhdu tét metdy je sučasné stanvení více vzrků v krátkém čase, menší sptřeba rzpuštědel, nižší cena analýzy, nemezený výběr mbilní fáze. Tat metda splňuje jednduchst, citlivst, přesnst a správnst a je vhdná pr stanvení TTO v ksmetických přípravcích [21]. Přístrj CAMAG Rzpuštědl ethanl Stacinární fáze silikagel uktvený na hliníkvém plíšku Mbilní fáze tluen : ethylacetát (85:15) Vizualizace anisaldehydem a následné zahřátí na 105 C p dbu 15 min. Detekce denzitmetrická Vlnvá délka 366 nm Čas analýzy 45 min. Teplta 25 ± 2 C Tabulka 5 - Rešerše HPTLC Příprava vzrku: Byly dváženy 2 g přípravku a přidán 100 ml ethanlu. Směs byla umístěna p dbu 10 minut d ultrazvukvé lázně a následně centrifugvána 5 minut při rychlsti 3000 táček/min. Pté byl 1 ml supernatantu rzpuštěn v 10 ml ethanlu a dávkván na TLC klnu. Stanvení bsahu: V TTO byl stanven bsah terpinen-4-lu 40 ± 1,2%. Přesnst: s R = 4,99% Správnst: Byly prměřeny rztky s přídavkem 25, 50 a 75% bsahu terpinen-4-lu. Výtěžek byl více než 99%. Linearita: Byly prměřeny kalibrační rztky v rzmezí kncentrací ng. Krelační keficient kalibrační křivky byl 0,9949. Limit detekce: LOD = 60ng Limit kvantifikace: LOQ = 100ng 32

34 4.3 Studie absrpce TTO kůží Byla prvedena studie prpustnsti kůže pr rztk TTO, která využívá terpinen-4- l, jak hlavní slžku TTO. Pr kvantitativní stanvení terpinen-4-lu byla využita metda HPLC a pr kvalitativní stanvení metda GC [22]. Kvantita HPLC Merck Hitachi La Chrm Mbilní fáze acetnitril : vda (55:45) Délka klny 150 mm Průměr klny 4,6 mm Nástřik 30 μl Průtkvá rychlst 1,3 ml/min. Teplta 25 C Detektr UV VIS Vlnvá délka 200 nm Tabulka 6 - Rešerše HPLC, absrpce rztku TTO Kvalita GC Agilent 6890 Detektr MS 5973 Délka klny 30 m Vnitřní průměr klny 0,25 mm Tlušťka filmu 0,25 μm Nástřik 1 μl Split 50 : 1 Tabulka 7 - Rešerše GC, absrpce rztku TTO 33

35 Také byla s využitím plynvé chrmatgrafie studvána prpustnst kůží TTO bsaženéh v masti, krému a v gelu [23]. GC Carl Erba MFC 500 Detektr MS Finnigan MAT 4500 Nsný plyn helium Průtk 2 ml/min. Typ klny kapilární Délka klny 30 m Průměr klny 0,25 mm Tlušťka filmu 0,25 μm Náplň silikagel Teplta injektru 250 C Teplta klny 42 C (2,5min.) 300 C Teplta detektru 300 C Nástřik 1 μl Rzpuštědl n-hexan Vnitřní standard tridecan Split 1 : 10 Tabulka 8 - Rešerše GC, absrpce TTO v masti, krému, gelu 34

36 4.4 Terpinen-4-l jak vnitřní standard Dále byla vyvinuta a validvána metda plynvé chrmatgrafie pr stanvení p- cymenu v TTO s pužitím terpinen-4-lu jak vnitřníh standardu. p-cymen je v TTO bsažen v mnžství 0,5 12%. Tat metda splňuje přesnst, správnst, linearitu a citlivst [24]. GC Perkin Elmer Detektr FID Nsný plyn vdík Průtk 36 ml/min Typ klny náplňvá Stacinární fáze aktivní uhlí Délka klny 20 m Průměr klny 6 mm Tlušťka klny 0,25 mm Teplta injektru 220 C Teplta klny 100 C Teplta detektru 220 C Nástřik 1,5 μl Rzpuštědl hexan Vnitřní standard terpinen-4-l Split 6 : 01 Tabulka 9 - Rešerše GC, terpinen-4-l jak vnitřní standard 35

37 4.5 Výsledky rešerše Výběr metdy Při vypracvávání rešerše byl zjištěn, že nejčastěji pužívanu metdu pr stanvení terpinen-4-lu je plynvá chrmatgrafie Teplta injektru, klny a detektru Nejprve byly nastaveny teplty, které byly pužity v GC, která využívá terpinen-4-l jak vnitřní standard, tzn. teplta injektru 220 C, teplta klny 100 C a teplta detektru 220 C. Byla prvedena analýza, která zaznamenala velmi malý pík terpinen-4- lu. Prt byla teplta klny zvýšena na 200 C. Tyt teplty byly vyhvující Rzpuštědl Jak první byl prveden rzpuštění v hexanu. Vzhledem k nevhdným vlastnstem pr rzpuštění gelu (viz níže), a také vzhledem k vyské ceně rzpuštědla, byla vyzkušena i extrakce d jinéh rzpuštědla Vnitřní standard Při studii byl nalezen jak vnitřní standard puze tridecan, a ten nebyl k dispzici. Prt byl testván něklik jiných standardů (viz níže) Zpracvání vzrku Při zpracvání vzrku byl částečně využit pstup, který je uveden u metdy HPTLC, ale kvůli nedstatečnému dstředění byly upraveny centrifugační pdmínky. Čas byl prdlužen na 10 min. a rychlst 6000 táček/min. Výsledné zpracvání lubrikačníh gelu je tedy následující: D centrifugační zkumavky byl dvážen přibližně 1,5 g lubrikačníh gelu a přidán 10 ml rzpuštědla s vnitřním standardem. Směs byla umístěna p dbu 10 minut d ultrazvukvé lázně, p uplynutí tét dby byla směs centrifugvána 10 minut při rychlsti 6000 táček/min. Pté byl supernatant filtrván přes nylnvý filtr a následně dávkván na klnu. 36

38 5 Experimentální část 5.1 Analytický pstup Vzrek, standardy, chemikálie Lubrikační gel Tea Tree Fantasy, Herbacs-Bfarma s.r.. Terpinen-4-l, Herbacs-Bfarma s.r.. Eugenl 99%, Sigma-Aldrich Farnesl 95%, mixture f ismers, Sigma-Aldrich β-citrnelll 99%, Sigma-Aldrich Lavandull, Fluka Brnyl Acetate 97%, Sigma-Aldrich Geranil 98%, Sigma-Aldrich Carvacrl, Fluka Hexan 96%, Riedel de Maën Methanl Chrmaslv, Sigma-Aldrich Přístrje, pdmínky separace Plynvý chrmatgraf GC 17A, Shimadzu: Autinjektr: AOC 20i, Shimadzu Teplta: 220 C Nástřik: 1 μl Klna: Alltech-AT-624 Teplta: 200 C Typ klny: náplňvá Stacinární fáze: ply[(fenyl)(kyanprpyl)dimethyl]silxan Tlušťka filmu: 1,8 μm Nsný plyn: Helium Průtk: 28 cm/s Délka klny: 30 m Průměr klny: 0,32 mm 37

39 Detektr: FID Teplta: 220 C Ultrazvuk Bandelin Snrex Digitec DT 52 Centrifuga Hettich M 10, Scheller EBA 21 Nylnvý filtr Valuprep 0,45 μm 38

40 6 Výsledky a diskuze 6.1 Vývj analytické metdy Teretický výpčet bsahu terpinen-4-lu v lubrikačním gelu v lubrikačním gelu je max. 0,1% Tea Tree...0,1g TTO ve 100g LG navážka lubrikačníh gelu je 1,5g...0,0015g TTO v 1,5g LG v Tea Tree je asi 40% terpinen-4-lu...0,6mg terpinen-4-lu v 1,5g LG Vlba vnitřníh standardu D plynvéh chrmatgrafu byl nastříknut něklik standardů rzpuštěných v hexanu. Pdle retenčníh času byl vybrán nejvhdnější vnitřní standard k terpinen-4- lu. Retenční čas terpinen-4-lu byl 4,11 min. Vnitřní standard Retenční čas [min.] Eugenl 99% 6,86 Farnesl 95% > 10 β-citrnelll 99% 4,33 Lavandull 3,83 Brnyl Acetate 97% 5,23 Geranil 98% 4,67 Carvacrl 5,99 Tabulka 10 - Retenční časy standardů Jak vnitřní standard byl zvlen geranil Stanvení kncentrace vnitřníh standardu Byl připraven kncentrvaný rztk geranilu v hexanu a pstupným zřeďváním byla stanvena vhdná kncentrace (výšky píků se téměř shdvaly). Kncentrace geranilu je 0,8 mg/10 ml. 39

41 6.1.4 Vlba rzpuštědla Byly vyzkušeny extrakce d různých rzpuštědel s pužitím dvu typů centrifugačních zkumavek. Lubrikační gel byl zpracván pstupem, který uvádí kapitla č a následně nastříknut na klnu plynvéh chrmatgrafu. Zárveň byl prměřen standard terpinen-4-lu. Z pměrů plch píků vzrku a standardu byl vypčítán bsah terpinen-4-lu v LG. Je znám, že lubrikační gel bsahuje maximálně 0,1% TTO a tea tree il bsahuje minimálně 30% terpinen-4-lu. Není tedy znám, klik přesně terpinen-4-lu bsahuje lubrikační gel. Nejvhdnější je prt způsb extrakce, kterým byl získán bsah terpinen-4- lu v LG více než 0,030%. Hexan: D centrifugační zkumavky byl dvážen přibližně 1,5 g lubrikačníh gelu, přidán 10 ml vnitřníh standardu geranilu v hexanu a přikryt parafilmem. Směs byla umístěna na 10 minut d ultrazvukvé lázně a následně centrifugvána 10 minut při rychlsti 6000 táček/min. Supernatant byl přefiltrván přes nylnvý filtr a dávkván na klnu. A A c = V IS * m A A S IS s * F *100 * m v * z = 0,0286% A V...plcha píku vzrku A S...plcha píku standardu A IS...plcha píku vnitřníh standardu m s...navážka standardu m s...navážka vzrku F...faktr krekce z...zředění Obrázek 12 - Centrifugační zkumavka [25] Vzhledem k pvaze rzpuštědla dšl k prtržení parafilmu a k úniku látek. Následnu plynvu chrmatgrafií byl prkázán bsah terpinen-4-lu v LG 0,0286%, cž je nízký bsah. Hexan tedy s pužitím tét centrifugační zkumavky není vhdný. 40

42 Hexan: Byly pužity centrifugační zkumavky se šrubvým uzávěrem, pstup přípravy vzrku zůstal stejný. c = AV * ms * F *100 AIS = 0,0244% AS * mv * z A IS Gel se zdržval v kónickém dnu, prt zřejmě prběhla nedstatečná extrakce. Plynvu chrmatgrafií byl prkázán bsah terpinen-4- lu v LG 0,0244%, cž je pět hdncen jak Obrázek 13 - Centrifugační zkumavka se šrubvým uzávěrem [25] nízký bsah. Hexan tedy není vhdný ani s pužitím těcht zkumavek. Methanl: Dále byla vyzkušena extrakce d methanlu s pužitím nrmálních centrifugačních zkumavek. D centrifugační zkumavky byl dvážen přibližně 1,5 g lubrikačníh gelu, přidán 10 ml vnitřníh standardu geranilu v methanlu a přikryt parafilmem. Směs byla umístěna na 10 minut d ultrazvukvé lázně a následně centrifugvána 10 minut při rychlsti 6000 táček/min. Supernatant byl přefiltrván přes nylnvý filtr a dávkván na klnu. AV * ms * F *100 AIS c = = 0,0432% AS * mv * z A IS Plynvu chrmatgrafií byl stanven bsah terpinen-4-lu v LG 0,0432%. Nejvhdnější je způsb extrakce, kterým je získán bsah terpinen-4-lu v LG více než 0,030%. Extrakce d methanlu tut pdmínku splňuje, je tedy pr lubrikační gel vhdná. 41

43 6.1.5 Výsledné pdmínky Detektr: FID Nsný plyn: helium Teplta injektru: 220 C Teplta klny: 200 C Teplta detektru: 220 C Rzpuštědl: methanl Vnitřní standard: geranil Příprava vzrku D centrifugační zkumavky byl dvážen přibližně 1,5 g lubrikačníh gelu a přidán 10 ml vnitřníh standardu geranilu v methanlu kncentraci c = 0,8 mg/10 ml. Směs byla umístěna p dbu 10 minut d ultrazvukvé lázně, p uplynutí tét dby byla směs centrifugvána 10 minut při rychlsti 6000 táček/min. Pté byl supernatant filtrván přes nylnvý filtr a následně dávkván na klnu. 42

44 6.2 Test vhdnsti chrmatgrafickéh systému Účinnst chrmatgrafické klny (pčet pater N) N = 5,545 * (t R /W 0,05 ) 2 t R...retenční čas W 0,05...šířka píku v plvině výšky Analyzvaná látka t R [min] W 0,05 [min] N N Terpinen-4-l 3,993 0, ,993 0, ,993 0, Tabulka 11 - Účinnst chrmatgrafické klny Pžadavek: N > 1500 VYHOVUJE Asymetrie chrmatgrafickéh píku (T) T = W 0,01 /2f W 0,01...šířka píku ve vzdálensti 5% výšky píku f...menší část úsečky W 0,01, která vznikne prtnutím úsečky klmicí spuštěnu z vrchlu píku Analyzvaná látka T T Terpinen-4-l 1,18 1,0 1,0 1,06 Tabulka 12 - Asymetrie chrmatgrafickéh píku Pžadavek: T < 1,2 VYHOVUJE Rzlišení chrmatgrafických píků (Rij) R ij = 2 t Ri - t Rj / (W i + W j ) W...šířka píku na základně 43