K = Kooperativní efekty. Hillova rovnice = K ] 1 1. kooperativita - interakce biomakromolekuly (obvykle ené z podjednotek) se 2 a více v.

Transkript

1 ooperativí efekty kooperativita - iterakce biomakromolekuly (obvykle tvoře eé z podjedotek) se 2 a více v ligady vazba prvího ligadu usadí (zesadí) ) vazbu další šího ligadu - pozitiví (egativí) ) kooperativita 90 - objevil Hill pozitiví kooperativitu při p i vazbě kyslíku ku a hemoglobi alosterie - vlastost biomolekuly změit strukturu při i vazbě ligadu do esubstrátov tového místam Hillova rovice upravit: M L ML frakčí saturace Y: [ML ] Y [ML ] [M] [M] [ML ] Y Y a log: log [M] [ML ] Hillův v graf výos log[y/( /(-Y)] proti log jeho směrice Hillův v koeficiet H pozitiví kooperativita H > (. hodota koeficietu udává miimál lí počet iteragujících ch podjedotek ) ) (( a H jsou růzr zé pojmy!) egativí kooperativita H < Y Y log log

2 Rozší šířeí teorie a ezymy [E][S] [E ] 963 Mood: E S ES studium kietiky a základz kladě počáte tečí rychlosti ezymové reakce [ES ] v v Y log [E] 0 V log[s] log V v grafické projevy: Y sigmoidí kietika /Y - - S / MWN model (Mood, Wyma, Chageaux) každá podjedotka ezymu má buď vysokou (R) ebo ízkou (T) afiitu k substrátu tu v molekule ezymu mají vždy všechy podjedotky stejou dvě formy: koformaci (všechy v T, ebo T tesed všechy v R) R relaxed bez substrátu tu převlp evládá T, přejdep ejde-li v přítomosti p substrátu tu jeda z ich a R, tak se staou všechy v R přechody mezi T a R stavy mohou způsobit i jié efektorové molekuly: P S alosterický ihibitor aktivátor tor (heterotropí) 2

3 Příklad alosterie - fosfofruktokiasa fruktosa-6-fosf fosfát t ATP fruktosa-,6,6-bisfosfát t ADP alosterický aktivátor tor - AMP alosterický ihibitor - ATP ukázka přímého p výosu reakčí rychlosti: v AMP ATP [ fruktosa-6-fosf fosfát ] Aalýza pomocí Scatchardova výosu ezym M tvoře z podjedotek m (tj. M ~ m ), každá m mám vazebé místo pro ligad L (substrát, t, ihibitor, aktivátor, tor, ) probíhá postupá iterakce s ligadem: m L m L m L L m L 2 m L - L m L experimetál lí studium: směs s volého ezymu (výchozí kocetrace [E] 0 ) a volého ligadu (( 0 ) echá se ustavit rovováha a určí se kocetrace volého ligadu kocetrace vázav zaého ligadu je pak v 0 - kocetrace zbylých volých vazebých místm za rovováhy: [m] [m] 0 - v [M] 0 - v průměrý rý rozsah vazby r (platí: 0 < r < ), je to vlastě podíl kocetrace obsazeých vazebých míst m a celkové kocetrace ezymu, tj. r v /[M] 0 3

4 Vazebá místa v M se eovlivňuj ují lze uvažovat jediou rovováhu: m L ml a příslup slušou disoc. kostatu: lze upravit pomocí předchozích defiovaých kocetrací aj.: ([M] 0 - v v ) r dále lze modifikovat do tvaru aalogického saturačí kietice ezymové reakce: vyhodocuje se liearizací dle Scatcharda: r [m] [ml] r r/ směrice -/ / r r [0,0] r výsledek: počet podjedotek disociačí kostata Vazebá místa se ovlivňuj ují projevy: sigmoidí kietika r/ - určí se, určit elze r [0,0] r vyhodoceí - použije se Hillova rovice upraví se a tvar: zlogaritmuje: r H r ( α ) r log r H r ( α ) H H log log 4

5 Vliv ph a aktivitu důvod: disociace skupi účastících ch se ezymové reakce obsah BH obsah A - aktivita kombiace disociačích ch závislostí pak určuje uje koečý ý vliv a aktivitu iterpretace a úrovi kietiky pomocí vlivu a parametry m a V Vliv ph a ezymovou reakci molekuly ezymu, substrátu tu i komplexu ezym-substr substrát t obsahují disociující skupiy ve vodém m prostřed edí za daého ph vystupují jako růzr zé formy liší šící se možstv stvím m vázaých v protoů (apř.. ezym je přítome p ve formách EH 2, EH a E) ze všech v daých forem však v pouze jeda forma substrátu tu reaguje s jedou formou ezymu (zde EH) za vziku komplexu ezym- substrát pouze jeda z forem komplexu (zde EHS) pak reaguje a produkt k k - k 2 P 5

6 podíl žádaé formy (apř.. EH) lze vyjádřit jako: f EH [EH] [E] [EH] [EH ] obdobý vztah platí i pro EHS a ebo pro substrát, t, pokud disociuje po zlogaritmováí lze pak uvažovat krají hodoty výsledého výrazu pro růzr zé meze ph: log f EH lze dále d odvodit, že: e: 2 [E] [EH] [H ] 2E log E [H ] V ' V f EHS [EH2] [EH] [H ph log 0 E ph log ' m m f f E ] [H 2E EHS EH ph ízk zké 2E ] ph kolem 7 ph vysoké a dále d po zlogaritmováí: px -logx) lze iterpretovat p závislosti obou parametrů a ph logv' logv ' logv log f m m ' p log f log f EHS EHS EH aproximací závíslostí pak lze určit hodoty p disociujících ch skupi iformace o aktivím místě ezymu p' m -logf EHS logf EH p ES p E p 2E p 2ES ph 6

7 Iterpretace alezeé hodoty pp pro skupiy v aktivím m místm stě se porovají s tabelovaými rozsahy pp pro zámé amiokyseliy při i shodě lze usuzovat, že e v aktivím m místm stě se vyskytuje daá amiokyselia praktický výzam zjištěí ph optima - alezeí ejvhodější ších podmíek pro ezymovou reakci - dosaže eí ejvyšší ššího výtěž ěžku Vliv teploty a ezymovou reakci obecě chemické reakce běžb ěží rychleji při p zvýše eí teploty a druhou strau biomolekuly při p i vyšší teplotě ztrácí aktiví koformaci a deaturují (áhod hodá struktura klubka) výsledkem je existece idividuál lího teplotího ho optima pro každý ezym a zvýšeí aktivity při růstu teploty aktiví deaturace iaktiví t 7

8 Vliv doby ikubace kratší ikubačí čas při i ez. reakci vede k posuu teplotího optima k vyšší šším m teplotám delší čas ikubace za daé teploty mám opačý vliv Vliv teploty a stabilitu při i vyšší teplotě ztrácí ezym aktivitu mohem rychleji pokles je velmi strmý v důsledku d rel. vysoké G 200 aža 300 kj/mol, takže e po překrop ekročeí kritické teploty je deaturace velmi rychlá 8

9 Vliv teploty a ki. kostaty kietické rychlostí kostaty - Arrheiova rovice: k E Aexp RT a rovovážé kostaty - vat Hoffova rovice: l H RT S často v alterativím m tvaru: l 2 H T2 T Praktické aspekty ezymy uchováváme v chladu dlouhodobě zmraže eé,, vyvarovat se opakovaému zmražov ováí a rozmražov ováí přidat kryoprotektiví čiidla (glycerol, polyoly - maitol) přesé (%) měřm ěřeí rychlosti vyžaduje temperaci lepší ež 0. o C teplotí kvociet Q 0 - kolikrát t se zvýší reakčí rychlost, jestliže e teplota vzroste o 0 o C (obvykle kolem 2) 9