Témata bakalářských prací pro akademický rok 2010/2011

Transkript

1 Témata bakalářských prací pro akademický rok 2010/2011 Stanovení chemorezistence u pacientů s akutní lymfoblastickou leukemií. Školitel: MUDr. Michaela Špenerová Akutní lymfoblastická leukemie je maligní proliferace klonu lymfoidních prekurzorových buňek B nebo T v různém stádiu jejich diferenciace. Léčba akutní lymfoblastické leukemie je založena na chemoterapii. Prvním cílem léčby je dosáhnout remisi, stávající léčebné protokoly pro dětskou ALL používají v průběhu období indukce remise kortikosteroidy. Na indukční léčbu dále navazuje léčba intenzifikační, která má za úkol znižovat počet leukemických buňek. Existuje však skupina pacientů, která na chemoterapii selhává a většina selhání je následkem primárně rezistentní choroby. Mechanizmy vzniku chemorezistence postihují expresi celé řady genů, regulujících různé buněčné procesy. Analýzou expresních profilů leukemických buněk pacientů s akutní lymfoblastickou leukemií lze predikovat chemorezistenci konkrétního pacienta na GC a individualizovat tak jeho léčbu. Cytogenetické změny u pacientek s karcinomem prsu s polyzomií chromozómu 17. Školitel: Mgr. Vladimíra Koudeláková Amplifikace a/nebo nadměrná exprese genu Her-2/neu bývá nalézána přibližně u 20% pacientek s karcinomem prsu a je spojena s vyšší agresivitou nádoru a špatnou prognózou. Pro léčbu Her-2/neu pozitivních karcinomů prsu byla vyvinuta humanizovaná monoklonální protilátka trastuzumab (Herceptin, Genentech; anti-p185her2) specifická na Her-2/neu extracelulární doménu. Podávání trastuzumabu s sebou přináší zvýšení rizika kardiotoxicity a při adjuvantní léčbě s očekáváním dlouhodobého léčebného výsledku nelze toto riziko podcenit. Identifikace pacientů, kteří mohou z terapie zahrnující trastuzumab významně profitovat, je proto nezbytná. Status genu Her-2/neu je standardně vyšetřován metodou fluorescenční in situ hybridizace (FISH) a imunohistochemicky. K léčbě trastuzumabem lze pacientky indikovat v případě, že je poměr počtu kopií genu Her-2/neu a počtu kopií chromozómu 17 (CH17) vyšší nebo roven 2,2 a/nebo na základě vysoce pozitivních výsledků imunohistochemie 3+. Do zvláštní skupiny karcinomů prsu lze řadit ty případy, u kterých je vyšší počet kopií genu Her-2/neu důsledkem zvýšeného počtu kopií chromozómu 17 (polyzomie CH17), jedná se o takzvanou nepravou amplifikaci. Polyzomie chromozómu 17 bývá nalezena u % případů karcinomu prsu a je spojena s horší prognózou. Díky polyzomii chromozómu 17 není na základě FISH vyšetření k léčbě trastuzumabem indikováno asi 5-7% pacientek, jelikož nesplní kritérium poměru počtu signálů Her-2/neu : CH17 2,2. Účinnost trastuzumabové terapie nebyla dosud u pacientek s polyzomií CH17 dostatečně ověřena, avšak v České republice je na základě konsensu tato terapie indikovaná i u pacientek s polyzomickými nádory, pokud jsou imunohistochemicky vysoce pozitivní (3+). Kromě amplifikace genu Her-2/neu jsou u pacientek s karcinomem prsu často nalézány mutace dalších protoonkogenů a chromozómů. K nejčastěji alterovaným patří protoonkogeny TOP2A (topoizomeráza 2α), C- MYC, CCND1 (cyklin D1). Početní alterace těchto genů se jeví jako velmi zajímavé, a to jak z hlediska prognostického, tak i prediktivního. Například amplifikace C-MYC genu byla u karcinomu tračníku popsána jako příznivý prediktor pro léčbu 5-fluorouracilem; pro karcinom prsu dosud nebyla podobná studie provedena. Cílem bakalářské práce bude příprava přímo značených DNA sond pro detekci genů C-MYC, CCND1 a chromozómů 8 a 11 a následná detekce počtu kopií těchto genů u pacientských vzorků s karcinomem prsu a polyzomiíí chromozómu 17. Výsledkem práce bude cytogenetická charakteristika tohoto souboru, jako součást projektu Stanovení prognosticko-prediktivního významu genů C-MYC a CCND1 u karcinomu prsu. Klener P. (2002): Klinická onkologie. Nakladatelství Galén a nakladatelství Karolinum, Praha. Statistické metody v biomedicínském výzkumu Školitel: Mgr. Lenka Radová, Ph.D. Cílem bakalářské práce je shrnutí nejčastěji užívaných statistických metod pro analýzu biomedicínských dat, predikci a klasifikaci. Metody budou aplikovány na datech z praxe, důraz bude kladen především na praktické využití a interpretaci závěrů.

2 Normalizace a standardizace real-time RT-PCR analýz. Absolutní kvantifikace genové exprese metodikou real-time RT-PCR je široce používaná metoda. V poslední době je v této oblasti kladen velký důraz na normalizaci a standardizaci získaných dat. Lze k tomu využít několika metodických přístupů, od použití referenčních genů po statistické metody. Součástí práce studenta bude ověření vhodnosti používaných referenčních genů při detekci cirkulujících nádorových buněk u pacientů se solidními tumory. Student se naučí pracovat s moderními genovými databázemi, s PCR metodami a se statistickými metodami. Dále si student osvojí práci v molekulárně biologických laboratořích se zaměřením na studium genové exprese. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Bustin SA, Benes V, Garson JA, Hellemans J, Huggett J, Kubista M, Mueller R, Nolan T, Pfaffl MW, Shipley GL, Vandesompele J, Wittwer CT. Clin Chem Apr;55(4): Epub 2009 Feb 26. Nové markery pro detekci minimální reziduální choroby u solidních nádorů. Minimální reziduální choroba u solidních nádorů představuje přítomnost jednotlivých, volných cirkulujících nádorových buněk v těle pacienta po té, co mu byl odstraněn zhoubný nádor. Tyto nádorové buňky, pokud nejsou eliminovány, mohou způsobit vznik metastáz a recidivu onemocnění. K detekci těchto cirkulujících nádorových buněk, potažmo k určení takto rizikových pacientů, je v této práci použito metody real-time RT-PCR. Součástí práce studenta bude nalezení vhodného markeru nádorových buněk a jeho ověření. Student se naučí pracovat s moderními genovými databázemi, s PCR metodami a se statistickými metodami. Dále si student osvojí práci v molekulárně biologických laboratořích se zaměřením na studium genové exprese. Uen Y., Lu Ch., Tsai H., et al. Persistent presence of postoperative circulating tumor cells is a poor prognostic factor for patients with stage I-III colorectal cancer after curative resection. Annals of Surgical Oncology, 2008, 15(8), Allen-Mersh T.G., McCullough T., Patel H., et al. Role of circulating tumor cells in predicting reccurence after excision of primary colorectal carcinoma. British Journal of Surgery, 2007, 94, Využití metody DNA microarrays v experimentální onkologii Metoda DNA microarrays umožňuje stanovit genovou expresi všech genů během jedné analýzy. Dle nastavení systému se jedná o analýzu exprese až známých či predikovaných transkriptů lidského genomu. Velké množství dat, jež uvedená metodika produkuje, je následně zpracováno statistickými metodami. Metody lze využít téměř v jakémkoliv experimentu. V LEM je zamýšleno použití metody pro analýzu mechanismu účinku nových protinádorových léčiv, k identifikaci nových prediktivních a prognostických markerů jak u pacientů se solidními nádory, zejména s nádory tlustého střeva a konečníku, tak u pacientů s hematologickými malignitami. Součástí práce studenta bude zejména osvojení si metodiky DNA microarrays, včetně běžných molekulárně biologických metod (PCR, IVT, PAGE atd.). Student se naučí pracovat s moderními genovými databázemi, s PCR metodami a se statistickými metodami. Dále si student osvojí práci v molekulárně biologických laboratořích se zaměřením na studium genové exprese. Prognosticko-preditivní markery u gliálních nádorů CNS Školitel: RNDr. Radek Trojanec, Ph.D. Současná klinická onkologie usiluje o identifikaci a využití markerů, které by předpovídaly biologické chování nádoru či predikovaly odpověď na léčbu a umožnily tak co nejúčinnější, individuální terapii pacienta. Mezi onkologické malignity náleží i nádory centrálního nervového systému (CNS). V porovnání s jiným typy nádorů lze říci, že léčba nádorů CNS je obtížná především z důvodů charakteru postižené tkáně (CNS řídí celý organismus; chirugické zásahy či použití toxických látek může být velmi kontraproduktivní). Podávání chemoterapeutik rovněž znesnadňuje přirozený obranný mechanismus, hematoencefalická bariéra, bránící průniku toxických látek do CNS. Mezi nádory CNS patří i gliomy. Jedná se o primární nádory mozku vycházející z glie, mezi které patří jak nezhoubné tak i vysoce zhoubné varianty. Pro správnou terapii je rozhodující rozlišení nižšího stupně (low grade) od vysokého stupně (high grade) vývoje onemocnění. Na základě morfologie tohoto nádoru však často není možno spolehlivě stanovit grade onemocnění. Navíc neexistují imunohistochemické ani jiné markery, které by

3 toto rozlišení spolehlivě umožnily. Je však známo, že v průběhu vývoje gliomu vznikají a dále se kumulují chromozomální a genové aberace. Jedním ze způsobů jak jednotlivé grady onemocnění rozlišit je cytogenetiké vyšetření. Určení cytogenetických aberací tedy může napomoci při rozlišování typu gliomu a tím i zpřesnění diagnosticko-léčebné rozvahy. Na našem pracovišti byla již zavedena rutinní diagnostika statusu chromozomálních oblastí 1p36.3, 9p21.3, 19q13, genů p53, EGFR, RB1, MDM2 a chromozómů 7, 10 a 13 u pacientů s glioblastomy. Nicméně, sondy pro detekci těchto cytogenetických markerů byly připravovány postupně a tudíž především starší pacientské vzorky nemají celou sadu těchto markerů vyšetřenou. Celý soubor markerů byl vybrán na základě odborné literatury a konzultace s neurochirirgickým odd. FN Olomouc, avšak prognosticko-prediktivní význam jednotlivých markerů je diskutabilní. Navíc, diagnostika markerů v tomto rozsahu je po ekonomické stránce vysoce nákladná. Cílem bakalářské práce bude dovyšetřit změny statusu chromozomálních oblastí 1p36.3, 9p21.3, 19q13, genů p53, EGFR, RB1, MDM2 a chromozómů 7, 10 a 13 u archivních i prospektivních pacientských vzorků a následně provést statistickou analýzu vyšetřených markerů s klinicko-patalogickými daty pacientů. Smyslem bude určit (ověřit) prognosticko-prediktivní význam stanovovaných markerů, popř. navrhnout vyřazení některých z nich z rutinní diagnostiky. Klener P. (2002): Klinická onkologie. Nakladatelství Galén a nakladatelství Karolinum, Praha. Archivace DNA pro high resolution metody Školitel: doc. Mgr. Jiří Drábek, PhD. DNA je nutné po genetickém vyšetření archivovat pro možnost reanalýzy (pro kontrolu) nebo dalších analýz (pro nové metody). Tradičním způsobem archivace je zamražení zkumavky s roztokem DNA v TrisHCl-EDTA nebo vodě při -20 C nebo -80 C. Pokud se využije jiná možnost a DNA se vysráží ethanolem, tak se dá zachovat pro delší období. Nicméně při větším množství vzorků a větším množství analýz se použitím těchto metod laboratoř dostane do logistických problémů s umístěním mrazniček a s dostupností vzorků. Existuje však ještě jedna možnost, používaná původně pro primární stabilizaci vzorku uchování DNA v pevné fázi při pokojové teplotě na FTA kartách. Tyto karty nebo obdobné systémy jsou v současné době nabízeny několika firmami (např. GenVault, Biomatrica) a zajímavé by bylo srovnat jejich parametry s ohledem na požadavky laboratoře (prostorová náročnost, dostupnost, časové nároky pro převedení do roztoku). Cílem práce je sepsat rešerši na téma archivace DNA (zvláště DNA s důležitou minoritní frakcí, jako je nádorová DNA), vybrat způsob archivace vhodný pro pracoviště LEM a v případě dostatku času otestovat vybranou metodu s ohledem na potenciální ztrátu citlivosti ve srovnání se zamražování TrisHCl roztoku DNA při -20 C. Metody detekce methylace Školitel: doc. Mgr. Jiří Drábek, PhD. Methylace pátého uhlíku cytozinů v oblastech bohatých na cytoziny a guaniny (v CpG ostrůvcích) savčího genomu je základním epigenetickým mechanismem, podílejícím se na regulaci exprese. Methylovaný cytozin zastavuje přepis genů tím, že znemožní navázání transkripčních faktorů na cílová místa v DNA. Podílí se tímto mechanismem také na kancerogenezi a v některých případech (jako u promotoru genu MGMT) methylace není jen obecný prognostický marker nezávislý na terapii, ale je asociována s lepším přežitím pacientů s gliomem, léčených alkylujícími látkami jako je temozolomid s komerčním názvem Temodal. Existuje řada metod, většinou na bázi PCR (např. RLGS, PMAD, MSP, COBRA, MSBE, SnaPshot, MethyLight, Melting curves, Pyrosequencing, MALDI), jejichž parametry dosud nebyly srovnány. Cílem práce je sepsat rešerši na téma možnosti detekce methylace (zvláště u nádorové DNA). Optimalizace laserové mikrodisekce pro přípravu komplexních vzorků z nádorové tkáně pro účely mikrogenomických analýz. Školitel: Mgr. Marta Dziechciarková, Ph.D. Laserová záchytná mikrodisekce (Laser capture microdissection, LCM) je rychlá a spolehlivá metoda, která umožňuje izolaci cílových buněk ze specifického komplexu tkáně pro jejich následnou molekulární, genomickou nebo proteinovou analýzu. Základem LCM je inverzní mikroskop se zabudovaným nízko výkonnostním infračerveným laserem. Nařezané tkáně jsou upevněny na standardní podložní sklo a termoplastická membrána (TM) je umístěna nad dehydratovaný preparát. V ohnisku laserového mikroskopu je umístněna TM, kterou laser

4 roztaví v požadovaném místě a naváže tak cílovou buňku či strukturu k membráně, která se přenese do zkumavky nebo jiným způsobem dále zpracuje. Laserovou mikrodisekci lze použít pro izolaci buněk u řady typů buněčných i tkáňových preparátů, včetně zamražených vzorků, formalínem fixovaných parafinizovaných tkání či cytologických preparátů. V závislosti na použitém materiálu je možno z mikrodisekovaných buněk extrahovat DNA, RNA či proteiny v dobré kvalitě. Kombinací s dalšími technikami, u kterých čistota a homogenita vzorku hraje velkou roli (cdna microarray, mutační analýza atp.)pomáhá LCM identifikovat nové diagnostické a prognostické znaky vedoucí koptimalizaci terapie onkologických onemocnění. Cílem bakalářské práce bude optimalizace laserovémikrodisekce a izolovalace buňěk z cytologických preparátů či parafinizovaných nádorů s následnou mikroizolací DNA/RNA a lineární amplifikací DNA/RNA pro účely dalších genetických analýz jako je např. komparativní genomická hybridizace, expresní profilování, či přímé sekvenování vyšetřovaných genů z biologického materiálu s maximálním obsahem nádorových buněk, či pro studium nádorové heterogenity na jednobuněčné úrovni. Bude provedeno srovnání několika metod izolace genomického materiálu, přičemž optimální metoda bude dále využívána u rutinních, či experimentálních vzorků. Literatura: Dziechciarková M., Berkovcová J., Trojanec R., Srovnal J., Bouchalová K., Hajduch M.: Využití laserové mikrodisekce pro přípravu komplexních vzorků z nádorové tkáně pro účely mikrogenomických analýz. Klinická onkologie, Suplement 2006 (19): Curran S., McKeay J.A., McLeod H.L., Murray G.I.: Laser capture microscopy. J Clin Pathol, 2000; 53: Bonner R.F., Emmert-Buck M., Cole K., Pohida T. et al.: Laser capture microdissection: Molecular analysis of tissue. Science, 1997; 278: Brignole E.: Laser-capture microdissection. Modern Drug Discovery, 2000; 3:69-70, 73 Hodnocení mitochondriálních funkcí na izolovaných mitochondriích po treatmentu triterpenoidními deriváty. Výzkum apoptózy se v posledních letech přesunul od paradigmatu, že pro řízení apoptózy je klíčové buněčné jádro ke tvrzení, že kaspázy a přesněji mitochondrie tvoří centrum buněčné smrti. Permeabilizace mitochondriální membrány (MMP) je jedním z hlavních kontrolních bodů, vedoucích k buněčné smrti. MMP zasahuje obě a to jak vnitřní, tak i vnější mitochondriální membránu, což vede k narušení vnitřního transmembránového potenciálu a/nebo k uvolnění intermembránových proteinů z vnější mitochondriální membrány.v poslední době byla popsána řada foktorů, endogenních, exogenní, virových i xenogenních, které mohou mít přímý vliv na mitochondriální permeabilizaci. Mezi základní mechanismy k tomu vedoucí je přímý vliv na tvorbu Permeability Transition Pore Complex (PTPC), poškození mitochondriální membrány tvorbou kyslíkatých radikálů a nebo transkripční regulace Bcl-2 rodiny proteinů. Mezi zajímavou skupinu s popsaným vlivem na mitochondrie patří deriváty triterpenoidních sloučenin, pro screening těchto derivátů a objasnění mechanismu jejich účinku je důležité zhodnotit jejich vliv na mitochondrie v izolovaném bezbuněčném systému. Cílem bude optimalizace izolace mitochondrií, validace jejich kvality, zavedení testů na izolovaném mitochondriálním systému a hodnocení účinku triterpenoidních sloučenin. Fulda S, Kroemer G. Targeting mitochondrial apoptosis by betulinic acid in human cancers. Drug Discov Today Sep;14(17-18): Kroemer G, Galluzzi L, Brenner C. Mitochondrial membrane permeabilization in cell death. Physiol Rev Jan;87(1): Optimalizace spotování a krystalizace matrice jako součást technologie LC MALDI pro identifikaci komplexních proteinových směsí. LC MALDI (Liquid Chromatography Matrix Assisted Laser Desorption and Ionization) je jedním z nejúčinnějších postupů pro identifikaci komplexních proteinových směsí. Technologie MALDI spočívá v tom, že analyt (směs trypticky naštěpených peptidů) je smíchán s nadbytkem matrice (obecně aromatická karboxylová kyselina) na kovovém terčíku. Kapička matrice s analytem se nechá na terčíku uschnout a při vysychání dochází inkorporování analytu do krystalické struktury matrice. Matrice hraje důležitou roli při ionizaci analytu a zároveň chrání analyt před nežádoucí fragmentací. Spojení kapalinové chromatografie s MALDI (LC MALDI) je postup využívaný zejména pro analýzu komplexních směsí. Směsný vzorek peptidů nejprve zachycen na koloně (C18) a je postupně vymýván gradientem se zvyšujícím obsahem organických rozpouštědel (metanol, acetonitril). Jednotlivé peptidy vychází z kolony podle

5 polarity a jsou postupně nakapány na celý terčík v podobě jednotlivých spotů. Celý proces je automatizován přístrojem Proteineer, jenž v definovaných intervalech několika sekund spotuje (nakapává) analyt vycházející z kolony na jednotlivé spoty a zároveň k nim přidává matrici. Výhody LC MALDI spočívají zejména v separaci peptidů do mnoha frakcí, což zvyšuje počet měřených MSMS, sekvenční pokrytí jednotlivých proteinů a citlivost celého měření. Optimalizace krystalizace matrice, tedy poměr matrice, rozpouštědla a analytu je klíčová složka celého procesu. Správná krystalizace je podmínkou pro optimální ionizaci peptidů a tedy i pro měření přesné hmotnosti v analyzátoru hmotnostního spektrometru. Poměr jednotlivých komponent je do jisté míry empirickou záležitostí, proto bude cílem této práce: 1. Výběr vhodné matrice pro měření komplexních proteinových směsí. 2. Optimalizace koncentrace vybrané matrice v daném rozpouštědle. 3. Optimalizace poměru analytu a matrice. 4. Optimalizace rekrystalizačního roztoku. Hillenkamp F, Peter-Katalinic J, MALDI MS: A Practical Guide to Instrumentation, Methods and Applications Summary, Wiley-VCH, 2007, 362, ISBN: Mueller DR, Voshol H, Waldt A, Wiedmann B, Van Oostrum J. LC-MALDI MS and MS/MS--an efficient tool in proteome analysis. Subcell Biochem. 2007;43: Hodnocení mitochondriálních funkcí na buněčných liních po treatmentu triterpenoidními deriváty. Výzkum apoptózy se v posledních letech přesunul od paradigmatu, že pro řízení apoptózy je klíčové buněčné jádro ke tvrzení, že kaspázy a přesněji mitochondrie tvoří centrum buněčné smrti. Permeabilizace mitochondriální membrány (MMP) je jedním z hlavních kontrolních bodů, vedoucích k buněčné smrti. MMP zasahuje obě a to jak vnitřní, tak i vnější mitochondriální membránu, což vede k narušení vnitřního transmembránového potenciálu a/nebo k uvolnění intermembránových proteinů z vnější mitochondriální membrány.v poslední době byla popsána řada foktorů, endogenních, exogenní, virových i xenogenních, které mohou mít přímý vliv na mitochondriální permeabilizaci. Mezi základní mechanismy k tomu vedoucí je přímý vliv na tvorbu Permeability Transition Pore Complex (PTPC), poškození mitochondriální membrány tvorbou kyslíkatých radikálů a nebo transkripční regulace Bcl-2 rodiny proteinů. Mezi zajímavou skupinu s popsaným vlivem na mitochondrie patří deriváty triterpenoidních sloučenin, pro screening těchto derivátů a objasnění mechanismu jejich účinku je důležité zhodnotit jejich vliv na mitochondrie v buněčném systému. Cílem bude optimalizace buněčných testů, které budou zaměřeny na hodnocení funkce mitochondrií v komplexním buněčném systému a následné hodnocení účinku triterpenoidních sloučenin. Fulda S, Kroemer G. Targeting mitochondrial apoptosis by betulinic acid in human cancers. Drug Discov Today Sep;14(17-18): Kroemer G, Galluzzi L, Brenner C. Mitochondrial membrane permeabilization in cell death. Physiol Rev Jan;87(1):