Evropský sociální fond Praha & EU: Investujeme do vaší budoucnosti LC-NMR 2. Jan Sýkora

Transkript

1 Evropský sociálí fod Praha & EU: Ivestujeme do vaší budoucosti LC-NMR 2 Ja Sýkora

2 RP(C18) HPLC D 2 O-ACN ij. 50 µl isoimperatori 1 2,3 isoimperatori v GC-MS CH Respose_ gal: ROI_11_1.D\ FID1A.CH , me Další hojě zastoupeou látkou v extraktu routy voé je isoimperatori (m/z = 270). Tato látka je citlivá a teplotu a v podmíkách a GC přesmykuje. Idetifikováy jsou tak pouze rozkladé produkty s volým hydroxylem a postraím řetězcem a jedom z vedlejších kruhů. psorale 1 H NMR detekce je ideálí metodou pro určeí strukturích izomerů. Zda je v extraktu přítome psorale ebo agelici (oba m/z = 186 s prakticky stejou fragmetací) se dá sado rozhodout a základě multiplicity aromatických sigálů. Prostředí aromatický kruh psoraleu poskytuje pouze 2 siglety, zatímco u ageliciu jsou tyto sigály vzájemou iterakcí rozštěpey a 2 dublety (podobě jako ve spektru isoimperatoriu vodíky 7 a 8). V extraktu routy voé byl idetifiková psorale ikoli agelici, jak avrhovala kihova MS spekter. agelici

3 Humuloy a isohumuloy Humuloy a od ich odvozeé látky jsou z pivovarského hlediska ejdůležitější složkou chmele. Dodávají pivu charakteristickou hořkost, podílejí se výzamě a stabilitě piví pěy a vyzačují se atimikrobiálími účiky. V hotovém pivu jsou přítomy v kocetraci ~ 50 mg/l. Pro zlepšeí sezorické hořkosti, stability a pěivosti piva se des používají chmelové extrakty. Hlaví výhodou používáí chmelových extraktů, ve srováí s hlávkovým ebo graulovaým chmelem a chmelovými extrakty, je zlepšeí kotroly výsledé hořkosti piva. (D. Matoulková: Účiek hořkých chmelových látek a buňky Lactobacillus brevis, Diplomová práce, MUNI, Bro 2006.) O O Chmelové hořčiy jsou stále předmětem itezivího výzkumu. Jedá se o látky citlivé především a světlo, sado se oxidují. Aalýzy produktůčástečé oxidace jsou prováděy výhradě pomocí HPLC s detekcí MS ebo NMR. Izolace prakticky eí možá. Částečá oxidace isohumuloů byla potvrzea pomocí MS. Molekulový pík obsahoval jede atom kyslíku avíc. Naměřeá 1 H NMR spektra odhalila přesmyk dvojé vazby a jedom z postraích řetězců O O (posu z 5,1 ppm do oblasti kolem 7 ppm), zbytek skeletu zůstal ezměě, k oxidaci muselo dojít a koci tohoto řetězce. R (Doc.Dostálek, VŠCHT). HO OH O HO O R = OH R HO

4 Aalýza volých mastých kyseli Pro staoveí obsahu α- a γ-lioleové kyseliy v hydrolyzátech rostliých olejů byla vyviuta HPLC metoda, kde je zbytek oleje rozpuště v CD 3 a bez dalších úprav astříkut do separace. Možství kyseli se staovuje itegrací podle předchozí kalibrace. Pro růzé kyseliy byly vybráy růzé sigály, podle toho, jestli se eluují samostatě ebo spolu s dalšími složkami. Separace probíhá a základě počtu dvojých vazeb a délky řetězce. α- a γ- izomery se dají v 1 H NMR odlišit a základě chemického posuu kocové CH 3 skupiy, který odráží vzdáleost od ejbližší dvojé vazby. Metoda byla testováa a totálím hydrolyzátu oleje ze semíek čerého rybízu. Výsledky jsou ve shodě s publikovaými daty. C8+C18 koloy zapojeé do serie CH 3 CN CD 3 90:10 (v/v) isokraticky at = 1s, t = 4, d1 = 0s, pad = 1s FA Retetio time [mi] Foud [%] Published [%] α-lioleic γ-lioleic Lioleic Oleic Palmitic Stearic COOH COOH COOH COOH COOH COOH Stearic acid Palmitic acid Oleic acid Lioleic acid γ-lioleic acid α-lioleic acid

5 Kotrola hydrolýzy triacylglycerolů Pro orietačí moitorig průběhu ezymatických hydrolýz rostliých olejů se běžě používá gelová permeačí chromatografie. Pro určeí poměrů mooacylglycerolů (MAG), diacylglycerolů (DAG) a zbylých triacylglycerolů (TAG) je zapotřebí dekovoluce výsledého chromatogramu. Pokud ovšem využijeme 1 H NMR detekci můžeme poměry složek staovit bez dekovoluce, avíc jsme shopi rozlišit i ěkteré sigály izomerů mooacylglycerolů a diacylglycerolů. Můžeme tedy itegrovat i jedotlivé podskupiy 1- a 2- MAG a 1,2- a 1,3-MAG a sledovat, které z pozic glycerolu jsou k hydrolýze pro daý ezym áchylější. Aalýza probíhá bez jakékoli derivatizace vzorku, vzorek se pouze rozpustí v chloroformu a astřikuje do HPLC (GPC). Aalýza olivového oleje hydrolyzovaého v průtočém reaktoru ukazuje výzamé rozdíly v zastoupeí jedotlivých složek oproti vsádkovému reaktoru. TAG 1,2-DAG 1,3-DAG 1-MAG 2-MAG 37% 10,5% 9,3% 39% 4,2% Itegrová je sigál CH- skupiy ve středu glycerolu, jeho chemický posu je citlivý i k hydrolýze okolích CH 2 skupi. Pouze u 1,2-DAG je itegrová sigál CH 2 -OH, který je jako jediý dostatečě izolovaý. gál této skupiy má v 1 H NMR chromatogramu dvojásobou itezitu. GPC-NMR 100% CD 3 ij. 50 µl

6 H6,H9,H10 H12,H13 H3 H19 29, H18 18 Obsah fytosterolů 59 0,9 % sitosteryl lioleat 58 H6 C8+C18, CH 3 CN CD 3 90:10 (v/v) 10:90 (100 mi) H19 29, H Pro staoveí obsahu fytosterolů existuje řada HPLC metod. Všechy se vyzačují růzým stupěm derivatizace vzorku před vlastím měřeím. LC-NMR metoda je opět přímá a avíc je schopá idetifikace i vázaých fytosterolů. Idetita sitosteryl lioleátu byla posléze potvrzea pomocí HR-MS. Pro itegraci jedotlivých fytosterolů byl vybrá siglet H18. Kalibrace byla provedea pouze a stadardu β-sitosterolu, byla ovšem použita i pro kvatifikaci všech dalších volých i vázaých fytosterolů v extraktu. Nuté bylo pouze zkalibrovat odezvu daého sigálu (H18) v závislosti a kocetraci v ástřiku. 36 6,1 % β-sitosterol 34 0,8 % 33 6 campesterol

7 Projekce obsahu fytosterolů; listy (čerě), olej ze seme (červeě) a šlupky ze seme (modrá), FS volé fyt., CS kojugáty fyt. HPLC-NMR měřeí frakce kojugovaých fytosterolů izolovaá z extraktu Listů rakytíku; isokratická metoda (CD 3 :acetoitril, 50:50) GPC-NMR měřeí extraktů z rakytíku; listy (ahoře), olej ze seme (uprostřed) a šlupky ze seme (dole). FFA volé masté kyseliy, TG triglyceridy, FS volé fytosteroly, CS kojugáty fytosterolů.

8 Izomery cyklohexyltolueu Všechy tři izomery cyklohexyltolueu vzikají při heterogeí katalytické alkylaci tolueu cyklohexeem. Reakce probíhá v mikrovlém poli za přítomosti kyselých katalyzátorů. Zastoupeí jedotlivých izomerů se výzamě liší oproti postupům bez použití mikrovl. Izomery se dobře dělí pomocí GC. Který pík ale přísluší kterému izomeru? f1 f2 f3 Při separaci a RP (C18) 100% acetoitrilem eí separace sice úplá, ale z 1 H NMR spekter lze určit jedotlivé izomery (ortho, meta a para, podle vzrůstající retece). Pro potřeby přiřazeí píků v chromatogramu z GC byly a výstupu z HPLC ajímáy postupě 3 frakce. Frakce 1 obsahovala prakticky výhradě ortho izomer. Frakce 2 a 3 obsahovaly směs meta a para izomerů (frakce 2 byla obohacea ve prospěch meta a frakce 3 ve prospěch para isomeru). Jedotlivé frakce byly přeměřey a GC a poskytly retečíčasy jedotlivých izomerů 1 H NMR chromatogram CH 3 H1 H2 para H1 CH 3 H1 RP-HPLC 100% ACN ij. 50 µl f3 f2 f1 H1 H3 H4 H3 H1 H2 H4 H2 meta ortho H2 H4 (d) H3 (t) H2 cyhex H4 (d) H3 (t) CH 3 H2 (t) H1 (d) CH 3 H2 (d) cyhex H1 (s) cyhex

9 LC-NMR heliceů a jejich prekurzorů Prekurzory heliceů i samoté helicey vzikají pomocí cykloizomeračích reakcí, dochází ke vziku produktů s idetickou molekulovou hmotou jako mají reaktaty, produkty ale mají rozdílou strukturu. Stejou hmotou se ale vyzačuje i většia ežádoucích vedlejších produktů, idetifikace pomocí MS je proto epraktická. Daá reakce se proto připravuje v měřítku ~ 20 mg a reakčí směs se aalyzuje pomocí LC-NMR. Gradiet vody s acetoitrilem a reverzí fázi většiou zajistí dostatečou separaci, případě se mohou zapojit dvě koloy za sebe. Podle 1 H NMR se vytipují produkty a reakce se mohou ásledě optimalizovat. Reakce měla poskytout symetrický produkt se 7 aromatickými (3 + 4) a jedím methylový sigálem. Pokud by se apř. z důvodu bráěé rotace porušila symetrie produktu, dalo by se očekávat dvojásobé možství sigálů ( aromatické a 2 methyly). V tomto případě sice byla reakce a produkty bohatá, ale očekávaý produkt evzikl.

10 Jako vedlejší produkt při sytéze heliceů byla připravea sloučeia se zajímavými vlastostmi. Sloučeia obsahuje tři chirálí cetra (obálková koformace středího kruhu E 6 x 6 E, cis tras izomery a dvojé vazbě a částečě bráěá rotace propyylfeylové jedotky). Pomocí RP HPLC se podařilo rozdělit dva izomery, všechy pokusy o izolaci ale selhaly a obě frakce vždy obsahovaly směs obou izomerů v poměru 50:50. Při LC-NMR je možé separaci zastavit a každý z izomerů proměřit zvlášť, čistý. Po určité době se začíají objevovat sigály druhého izomeru a postupě se ustaluje rovováha. Z NMR experimetů vyplyulo, že se jedá o izomerii a dvojé vazbě, pravděpodobě RP HPLC doprovázeou změou obálkové koformace. Izomerace byla C18(250) + C18(150) moitorováa při růzých teplotách, poločas přeměy byl při 25 C 24 hodi, při teplotě 35 C už je 4 hodiy. Z aměřeých dat se podařilo ACN : D2O staovit eergetickou bariéru izomerace ( G 300 ~24,5 kcal/mol). 1 mi 90 :10 40 mi 90 :10 50 mi 100 : 0 60 mi 100 : 0 LC-NMR atropoizomerů LC-NMR ve stop-flow režimu je vhodou metodou pro sledováí relativě pomalých trasformací a/ebo izomerací ( G 300 v rozsahu kcal/mol). Podobě může být moitorováa i bráěá rotace (atropoizomerie), eergetická bariéra musí být ale v daém rozsahu. 3 chirálí cetra8 možých isomerů t h ~ 24 hodi (22 C) t h ~ 4 hodiy (35 C) G 300 =24.5 kcal/mol

11 Hyaluroa - disacharid 1 H NMR směs α a β aomeru α aomer β aomer α aomer po 20-ti hodiách

12 H H H H Fukcioalizovaé karbosilaové dedrimery Karbosilaové dedrimery mají sloužit v heterogeí katalýze pro sadější separaci katalyzátoru od zbytku reakčí směsi. V posledím kroku sytézy se dedrimery fukcioalizují titaoceem. Už samotá separace ezreagovaého titaoceu je problematická, postupy v literatuře se v podstatě omezují a preparativí gelovou permeačí chromatografii. Separace produktů kokurečích reakcí (dimerizace, vzik defektích struktur apod.) je ve větším měřítku prakticky emožá. Charakterizace pomocí LC-MS bývá zpravidla rověž eúspěšá, díky adměré fragmetaci, ásobé ioizaci a substituci chloridových iotů v titaoceu za molekuly rozpouštědla. Pomocí GPC- 1 H NMR se daří ěkteré produkty idetifikovat, u ěkterých alespoň itegrací určit poměr mezi karbosiloovým jádrem a počtem avázaých titaoceů a periferii. + H GPC-NMR start 10 mi 100% CD 3 ij. 50 µl ezreagovaý titaoce (2) dedrimer s avázaým titaoceem (1) dedrimer s avázaým titaoceem Mr(1) > Mr(2)

13 1 H NMR je relativě málo citlivá metoda v porováí s jiými způsoby HPLC detekce. Přiáší ale ceou iformaci o struktuře, proto achází uplatěí tam, kde je potřeba rozlišit a idetifikovat jedotlivé izomery přírodích i sytetických látek. Vhodá je pro aalýzy estabilích sloučei, protože při trasferu látky z HPLC do NMR edochází ke styku s ežadoucími vlivy (světlo, vzdušá vlhkost apod.). LC-NMR se ehodí pro určováí zcela ezámých látek, protože veškerá iformace o struktuře pochází v podstatě je od vodíkových atomů. Jestliže emáme k dispozici další iformace, jsme schopi idetifikovat pouze fragmety daé látky. Vhodou doplňující iformací je sumárí vzorec, který poskytuje hmotostí spektrometrie. LC-NMR epředstavuje vůči LC-MS kokurečí metodu, ale metodu doplňkovou! LC-NMR a LC-MS bývá kombiováo v jediou techiku LC-NMR-MS, která poskytuje všechy důležité iformace pro idetifikaci ezámé látky. Pro zakocetrováí měřeé látky je možé ještě zařadit SPE (pevo-fázovou extrakci), která umožňuje zachyceí látky z opakovaé separace a jedé patroě a ásledé uvolěí vhodým deuterovaým rozpouštědlem, techiku zkracujeme a HPLC-SPE-NMR-MS. Někdy bývá do zkratky zahruta i UV detekce HPLC, potom můžeme arazit a HPLC-UV-SPE-NMR-MS. Metody přiášející iformaci o struktuře jsou ale pouze dvě, NMR a MS.

14 R H H R catalyst R H H + (-1) H2 R O-flow HPLC-1H NMR (RP-HPLC acetoitril-aceto) 9-mers 8-mers liear oligosilaes 7-mers 6-mers 5-mers 4-mers 3-mer 2-mer Ph2H2 cyclic oligosilaes