Přehled postupů v diagnostice nádorových onemocnění technikami molekulární biologe. O.Topolčan, M.Pesta Lékařská Fakulta UK v Plzni a FN Plzeeň

Transkript

1 Přehled postupů v diagnostice nádorových onemocnění technikami molekulární biologe O.Topolčan, M.Pesta Lékařská Fakulta UK v Plzni a FN Plzeeň

2 Témata přednášky Imunoanalýza a onkologie DNA a nádory Parametry molekulární biologie Metody stanovení Využití V diagnostice Volbě a monitoraci léčby Výzkum x rutinní praxe Pespektivy

3 Využití imunoanalytických metod v onkologii Současný stav Screening ne Časná diagnostika Ca prostaty Dif. diagnostika - Ca prostaty, Ca vaječníků, chorioepiteliom, Ca varlat Follow up nádoru Limitace vyšetření Senzitivita a specificita Konkurence zobrazovacích technik Genetika

4 Všechna nádorová onemocnění jsou způsobena abnormalitami v sekvenci DNA Během života je DNA v lidských buňkách vystavena účinku mutagenům a také chybám při replikaci, které způsobují změny v sekvenci DNA buňky Náhodně může jedna z těchto somatických mutací změnit funkci genů spjatých s kontrolou buněčné proliferace, diferenciace a apoptózy Pokud jedinec zdědí mutaci v jedné alele kritických genů od rodičů, nastává nádorové onemocnění dříve a s větší pravděpodobností

5 Genetické změny, způsobující expresi pozměněných proteinů, proteinů v jiném množství, nebo těch, které se již na tomto stupni ontogeneze neexprimují, mohou vest k vzniku nádorového onemocnění Imunoanalýza měří proteiny Molekulární biologie zejména DNA, RNA

6 Dominantní mutace protoonkogenů Změny ve struktuře genu syntéza abnormálního genového produktu (onkoproteinu) bodové mutace, delece genové translokace vznik zkrácených nebo fúzních genů s abnormální funkcí Změny ovlivňující regulaci genové exprese nepřiměřená produkce strukturně nezměněné formy normálního proteinu podporující růst inzerce retrovirů se silnými retrovirovými promotory genové amplifikace abnormální transkripci

7 Recesivní mutace antionkogenů Dvouzásahová teorie pro vývoj nádoru je nutná ztráta funkce obou alel příslušného tumor supresorového genu ztráta heterozygozity (LOH)

8 Metody molekulární biologie se využívají Diagnostika Screeningová vyšetření - kolorektálního karcinomu (K-Ras, SEPT9), karcinom prostaty (DD3) Potvrzení nebo upřesnění diagnózy onkologických onemocnění (karcinom prsu, HNPCC, FAP) Detekci onemocnění u asymptomatických osob umožňuje určení kauzální mutace u hereditárních genetických onemocnění

9 Metody molekulární biologie se využívají Diagnostika Detekce minimální zbytkové choroby (hemotoonkologie) Určení relapsu onemocnění (hematoonkologická onemocnění) Predikce účinnosti léčby (kolorektální karcinom, Kras NSCLC EGFR ) Určení prognózy (Karcinu prsu mamaprint, Oncoprint) Cirkulují nádorové buňky, cirkulující DNA

10 Techniky molekulární genetiky používané k diagnostice Metody přímé diagnostiky SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism ) DGGE (Denaturing Gradient Gel Electroforesis) PTT (Protein Truncation Test) sekvenování ds DNA Metody nepřímé diagnostiky PCR (Polymerase Chain Reaction) PCR RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphismus)

11 Screeningová vyšetření kolorektálního karcinomu multitarget assay panel (MTAP) - detekci mutací v buňkách střevní sliznice uvolněných do stolice probandů

12 Screeningové vyšetření karcinomu prostaty Detekce buněk karcinomu prostaty prostřednictvím mrna genu DD3 PCA3 v moči lnrna obsahuje velké množství stop-codonů nevzniká protein Funkce není známa Zvýšena exprese DD3 se vyskytuje u více jak 95 % případů primárního karcinomu prostaty Neexprimuje se v normální tkáni a u jiných malignit

13 OSNA (One Step Nucleic Acid Amplification) Konvenční peroperační analýza SNLN Nevýhoda cca % falešná negativita OSNA rychlá amplifikace mrna CK 19 Vyšetření trvá minut Rozliší makrometastázu, mikrometastázu a uzlinu bez postižení. Má 95,6 % senzitivitou 96,7 % specificitou.

14

15 Metody molekulární biologie se využívají Léčba Volba a optimalizaci léčby Monitoraci léčby Predikce efektu léčby Prognóza onemocění

16 Cílená léčba blokace EGFR (produktu onkogenu) EGFR (ErbB-1) receptor epidermálního růstového faktoru - Ligandy pro epidermální růstový faktor: EGF nebo TGFα aktivují monomerní molekulu dimer aktivace intracelulární tyrosin kinazové activity - Patologická aktivita: amplifikací EGFR1 nebo vysokou polyzomií chromozómu 7 preferenční odpověď na EGFR1 inhibici Blokace: anti-egfr moab cetuximabu, panitumumab - lečba pokročileho a metastatickeho kolorektalniho karcinomu Prediktor účinnosti: wild type genu KRAS (vyžadován) wild type genu BRAF (doporučen) znalost přítomnosti EGFR receptorů (doporučena)

17 Prediktor účinnosti anti-egfr moab : wild type genu KRAS K-ras (Kirstein rat sarkoma virus) 12p12.1 Proonkogen K-ras kóduje GTPázu Nejčastěji mutace kodonu 12, 13, 61 kontinuální aktivace

18 Prediktor účinnosti anti-egfr moab : wild type genu BRAF BRAF (RAS-associated factor) - Mutován u 5% kolorektálních karcinomů - V600E - Je známo více než 30 mutací aktivujících BRAF

19 Cílená léčba Inaktivace VEGFR neutralizací VEGF Neutralizace ligandu anti-vegf humanizovanou MoAb bevacizumab (Avastin) Prediktor účinnosti: není

20 Cílená léčba nízkomolekulární inhibitor TK - Sorafenib Sorafenib malý nízkomolekulární inhibitor molekul s tyrosin kinázovou aktivitou: VEGFR, PDGFR, Raf kináz (C-Raf a B-Raf) B-Raf inhibice :wild-type B-Raf i mutant B-Raf Prediktor účinnosti: není

21 ADJUVANTNI SYSTEMOVA LEČBA KARCINOMU TLUSTEHO STŘEVA Strategie léčby TNM I operace II operace (v případě Nx následuje chemoterapie) III operace + vždy chemoterapie IV resekce, nebo indukční terapie a pak resekce, nebo paliativní léčba

22 ADJUVANTNI SYSTEMOVA LEČBA KARCINOMU TLUSTEHO STŘEVA Stadium III (jakekoliv T, N1, N2, M0, Dukes C) chirurgie: široka excize s anastomozou adjuvantni chemoterapie: (6 měsiců) kolon: 5-FU+/-LV n. kapecitabin* n. FOLFOX n. FLOX n. XELOX rektum: 5-FU+/-LV + RT n. kapecitabin + radioterapie Testovaní typu K-RAS onkogenu u resekatů s nadorem klinickeho stadia III automaticky, u ostatnich stadii (zejmena st. IV) na vyžadaní onkologa.

23

24

25 Chronická myeloidní leukemie (CML) stanovení fúzního genu BCR-ABL Vzniká na podkladě fúzního genu BCR-ABL Filadelfský chromozóm (Ph) reciproká translokace t(9;22)(q34;q11) molekulární marker (95% případů)

26 Diagnostické vyšetření transkriptu BCR-ABL Provádí se z leukemických buněk periferní krev nebo kostní dřeně RT-PCR: potvrzuje přítomnost fúzního genu BCR-ABL a určuje typ přestavby: major, minor, mikro nebo jiné raritní přestavby Národní referenční laboratoř pro ČR v rámci mezinárodního projektu EUTOS for CML (ELN European LeukemiaNet) vedoucí Mgr. Kateřina Machová Poláková, Ph.D.

27 Molekulární monitorování hladiny transkriptu BCR-ABL Provádí se v pravidelných intervalech z leukocytů periferní krve real-time RT-PCR transkriptu BCR-ABL Potvrzení BCR-ABL negativity - nested RT- PCR

28 Nádorové onemocnění Retinoblastom Li-Fraumeni syndrom Hereditární karcinom prsu a ovarií Neurofibromatóza typ 1 a 2 Wilmsův tumor Familiární adenomatózní polypóza Hereditární nepolyp. kolorektální karcinom Von Hippel-Lindau syndrom Mnohočetná endokrinní neoplázie typ 1 a 2 Ataxia teleangiektasia Mutace v genu Rb1 TP53 BRCA1, BRCA2 NF1, NF2 WT1 APC hmsh2, hmlh1, hpms1, hpms2 VHL MEN1, MEN2 ATM

29 Familiární forma karcinomu prsu V roce 1994 gen BRCA1 (BREAST CANCER 1) Gen kóduje protein o velikosti 1863 AMK locus: 17q21 Defekt významně zvyšuje pravděpodobnost onemocněním nádorem prsu a vaječníků Účastní regulaci buněčného cyklu, reparace DNA a udržování stability genomu Mutace v těchto genech 10x zvyšují riziko onemocnění proti populačnímu průměru Vstupuje do interakce s řadou komplexních proteinů účastnících se reparace poškozené DNA (MRE11/RAD50/Nbs1, SWI/SNF, BACH1).

30 Familiární forma karcinomu prsu 1995 objeven gen BRCA2 (BREAST CANCER 2) locus:13q12.3 Gen kóduje protein o velikosti 3418 AMK Defekt významně zvyšuje pravděpodobnost onemocněním nádorem prsu a vaječníků Účasní regulaci buněčného cyklu, reparace DNA a udržování stability genomu Nádory prsu vzniklé na podkladě zárodečné mutace v BRCA2 genu se fenotypicky neliší od sporadických forem onemocnění, častější je však vznik druhostranného nádoru prsu a nižší věk v době diagnózy onemocnění

31 Rizika vzniku nádorů onemocnění u nosiček a nosičů BRCA1/2 mutací BRCA1 + Riziko vzniku U % BRCA 2 + Riziko vzniku U % Ca prsu do 40 let Ca prsu do 70 let Až Metachromní Ca prsu Ca ovarii Až 27 Ca děložního hrdla 30 Ca prsu muž 6 6

32 Rizika vzniku nádorů onemocnění u Ca žaludku nosiček a nosičů BRCA1/2 mutací Ca žlučníku a žlučových cest BRCA1 + Riziko vzniku BRCA 2 + Riziko vzniku 2,6 x 5 x Ca pankreatu 2,3 x 3,5 x Ca kolorecta 4,0 x 4,0 x Ca prostaty 3,3 x 4,5 x

33 Indikace ke genetickému vyšetření (podezdření na hereditární formu) Jakýkoli lékař poslat pacienta na specializované pr. Genetická konzultace na odd. lékařské genetiky Vytvořen 4 generační rodokmen Lékař se snaží potvrdit údaje z lékařské dokumentace K testování je nutný souhlas pacienta

34 Indikace ke genetickému vyšetření MOÚ Brno opakovaný výskyt nádorů prsu a/nebo vaječníků v rodině (dva a více případů v přímé linii) opakovaný výskyt nádorů tlustého střeva a dělohy v rodině (dva a více případů v linii) opakovaný výskyt jiných typů nádorů, kombinace různých nádorových onemocnění, obzvláště pokud se vyskytly v mladém věku výskyt nádoru prsu u muže

35 Indikace ke genetickému vyšetření MOÚ Brno ženy s ojedinělým výskytem nádoru prsu nebo vaječníků před 35 rokem věku ženy s nádorem prsu a vaječníků v jakémkoliv věku nádor střeva nebo nádor dělohy před 35 rokem věku nádor střeva a dělohy u pacientky v kterémkoliv věku vícečetný výskyt zhoubných nádorů kůže, alespoň jednou pod 50 let

36 Indikace ke genetickému vyšetření MOÚ Brno vícečetný výskyt zhoubných nádorů kůže, alespoň jednou pod 50 let

37 Mikro RNA mirna regulují až jednu třetinu lidských genů. Geny regulované pomocí mirna jsou nejen součástí procesu onkogeneze, podílejí se také na nádorové invazivitě, diseminaci nebo lékové rezistenci Malé (24nt) a stabilní molekuly - časný záchyt - predikce léčby - Prognóza onemocnění

38 Mikro RNA Regulují expresi genů na post-transkripční úrovni a uplatňují se v řadě buněčných procesů. Post-transkripční regulace genové exprese vede buď k degradaci cílové mrna, nebo k represi její translace a následně poklesu hladin jejího proteinového produktu Charakter mikro RNA Onkogen mir-21, mi-155 Nádorový supresor (mir-15a a mir 16-1), let-7

39 IMI webinar on the 11 th Call topic Bloodbased biomarker assays for personalised tumour therapy: value of latest circulating biomarkers. Please note that the topic presentation can be downloaded from 03/imis-11th-call-webinars

40 Dear Colleagues, It is my pleasure to invite you to the third Up Close and Personalized, International Congress on Personalized Medicine, which will take place June, 2014 in Prague, Czech Republic. Following the great success of the previous meetings in Florence and Paris, the main focus of the third Up Close and Personalized Congress is to examine the essential clinical, genomic, proteomic, metabolomic, pharmacogenomic, biomarker data and imaging necessary to predict, prevent and treat major medical conditions concerning metabolism (diabetes and obesity), and cancer. We will be to explore bio-informatic tools, algorithms, artificial intelligence techniques, decision support systems and other new platforms for disease diagnosis, prediction and better tailoring treatment modeling to the individual patient. Furthermore, we will discuss policy issues such as barriers for implementing Personalized Medicine, health and quality assurance. On behalf of the Scientific and Organizing Committee I look forward to welcoming you to what promises to be an exciting and fruitful event. Eddy Karnieli, MD Congress Chairman WWW upcp.org

41 IAD 2014 Plzeň 6-8. dubna 2014 Interpretace imunoanalytických metod Kontrola kvality v imunoanalýza Molekulární biologie Endokrinologie Perzonalisovaná medicina Varia

42 The 9th International Conference of Anticancer Research Porto Carras Grand Resort, Sithonia, Halkidiki, Greece, 6 to 10 October, /conference/

43 Děkuji za pozornost!

44 Kritéria k testování genů BRCA1 a BRCA2 V rodokmenu: U familiárního výskytu nádorů Alespoň 3 příbuzní s karcinomem prsu/ovaria, bez věkové limitace 2 příbuzní s nádorem prsu/ovaria, alespoň jeden dg. pod 50 let. U sporadických forem Bilaterální nádor prsu nebo bilaterální nádor ovaria, první dg. pod 50 let Duplicita nádoru prsu a ovaria bez věkové limitace Unilaterální nádor prsu nebo ovaria do let Nádor prsu u muže bez věkové limitace Medulární karcinom ER-, PR-, ErbB2- karcinom prsu

45 Komerčně dostupné analytické sety APTIMA (Genprobe, USA) PROGENSA PCA3 Schváleno FDA jako test umožňující detekci DD3/PCA3 ve vzorku moči, na základě kterého by měla být v případě pozitivity indikována opakovaná biopsie v případě negativní předešlé. Princip: amplifikace mrna DD3/PCA3 a detekce amplikonu - Transcription Mediated Amplification (TMA) a Hybridization Protection Assay (HPA) upm3 TM (DignoCure, Kanada) Nucleic acid sequence based amplification (NASBA)

46 ADJUVANTNI SYSTEMOVA LEČBA KARCINOMU TLUSTEHO STŘEVA Strategie léčby TNM I operace II operace (v případě Nx následuje chemoterapie); III operace + vždy chemoterapie IV resekce, nebo indukční terapie a pak resekce, nebo paliativní léčba Stadium 0 (Tis, N0, M0) adjuvantni chemoterapie: neni indikovana Stadium I (T1-2, N0, M0, Dukes A) adjuvantni chemoterapie: neni indikovana Stadium II (T3-4, N0, M0, Dukes B) kolon pt3, N0, M0: adjuvantni chemoterapie: není indikována

47 ADJUVANTNI SYSTEMOVA LEČBA KARCINOMU TLUSTEHO STŘEVA Stadium II (T3-4, N0, M0, Dukes B) rektum: pt3, N0, M0: adjuvantni chemoterapie: (6 měsiců) kolon: pt4, N0, M0 a pt3, N0, M0 high risk podskupina*: 5-FU+/-LV n. kapecitabin* n. FOLFOX n. FLOX n. XELOX* Pokud je zvažovana adjuvantni chemoterapie FUFA ve II. klinickem stadiu, je vhodne molekularni vyšetřeni mikrosatelitove instability (MSI), resp. MMR (mismatch repair) v nadorove tkani. Pacienti II. Klinickeho stadia s defektem MMR (dmmr, tedy MSI-high) nemaji prospěch z adjuvantni chemoterapie na bazi 5-FU rektum: chemoterapie 5-FU/LV n.kapecitabin + radioterapie neoadjuvantni chemoterapie + radioterapie: rektum: 5-FU nebo kapecitabin