FLUORIMETRIE Ja Fährch Obecé základ Fluormetre je aaltcká metoda vužívající schopost ěkterých látek vsílat (emtovat) po předchozím převedeí do vzbuzeého (exctovaého) stavu fluorescečí zářeí v ultrafalové ebo vdtelé oblast. K převedeí do vzbuzeého stavu (k exctac vzorku) je zpravdla vužíváa absorpce ultrafalového ebo vdtelého zářeí. Omezíme se zde pouze a fluormetr zředěých roztoků fluoreskujících látek v rozpouštědle, které eabsorbuje a exctačí a emtovaé zářeí. Na obr. je zázorěo zjedodušeé schéma eergetckých hlad v molekule se sudým počtem elektroů. V základím stavu S 0 většou obsazují vžd dva elektro stejý elektroový stav s opačým spem. Jejch sp se vzájemě kompezují, takže celkové spové kvatové číslo molekul je 0. Takový stav molekul je ozačová jako sgletí. I po exctac jedoho valečího elektrou a všší elektroovou hladu mohou elektro zachovat svůj celkový sp, což je vzačeo řadou exctovaých sgletích stavů molekul S, S atd. Po exctac však jž dva elektro ejsou spárová a jejch celkové spové kvatové číslo také může mít hodotu. Molekula se pak achází ve stavu ozačovaém jako trpletí, kterých opět může být celá řada (T, T,...). Přechod molekul mez sgletím a trpletím stavem jsou o ěkolk řádů pomalejší, ež podobé přechod uvtř řad sgletích stavů a uvtř řad trpletích stavů. Každý elektroový stav je v důsledku vbračího pohbu molekul, který zvšuje její celkovou eerg, tvoře sérí vbračích hlad. Hlada elektroového stavu s ejžší vbračí eergí je ozačováa jako základí vbračí hlada elektroového stavu. Ve stavu tepelé rovováh se za ormálích teplot převážá část molekul achází a základí vbračí hladě stavu S 0. Př absorpc zářeí je eerge absorbovaého fotou spotřebováa a převedeí molekul do exctovaého stavu (děj a obr.). Stejě jako př ems fotou musí platt Plackova podmíka hc E h () kde E je rozdíl eergí molekul v cílovém a výchozím stavu, h je Plackova kostata, je frekvece a vlová délka absorbovaého (emtovaého) zářeí. Protože pravděpodobost takového přechodu se pro jedotlvé hlad lší, závsí schopost molekul absorbovat foto a vlové délce absorbovaého zářeí. Tuto --
závslost popsuje absorpčí spektrum látk, ted závslost absorbace roztoku ebo absorpčího koefcetu látk a vlové délce (vz úloha Kapalová chromatografe a absorpčí UV-spektrometre ). E S S 4 3 4 5 6 T T 3 4 S 0 S 0 Obr. : Schéma eergetckých hlad molekul a přechodů mez m S 0 - základí stav, S, S - exctovaé sgletí stav, T, T - exctovaé trpletí stav. - absorpce zářeí, - vtří koverze, 3 - mezsstémový přechod, 4 - vbračí relaxace, 5 - fluorescece, 6 - fosforescece Po absorpc fotou exctovaá molekula velm rchle předává získaou eerg svému okolí a tzv. ezářvým přechod (vtří koverze - obr. děj - a mezsstémový přechod - děj 3) ásledovaým vbračí relaxací (děj 4) se dostává postupě do žších exctovaých stavů. Pomalejší bývá většou až ezářvý přechod ze základí vbračí hlad prvého exctovaého stavu S do základího stavu S 0. Teprve mez těmto hladam se vedle ezářvých přechodů může uplatt přechod spojeý s vzářeím (emsí) fotou. Tato emse zářeí je ozačováa jako fluorescece (děj 5). Její doba dosvtu po přerušeí exctace bývá řádově 0-6 až 0-9 s. Většou až z hlad S se případě uplatí ezářvý mezsstémový přechod do ěkterého z trpletích stavů. Zářvý přechod ze základí vbračí hlad ejžšího trpletího stavu T do základího stavu S 0 má dlouhou dobu dosvtu řádu 0-3 až 0 s a je ozačová jako fosforescece (děj 6). Vzhledem k tomu, že molekula před emsí fotou fluorescečího zářeí ztratí část eerge dodaé fotoem exctačího zářeí, je (až a výjmk) vlová délka fluorescečího zářeí větší, ež vlová délka exctačího zářeí. Pokud fluorescece probíhá tak, jak je zobrazeo a obr., je vlová délka fluorescečího zářeí dokoce větší ebo rova vlové délce ejdlouhovlějšího pásu absorpčího spektra (přechod mez základím vbračím hladam stavu S 0 a S ). Fluorescec látk, jejíž absorpčí spektrum záme, proto hledáme v blízkost prvého absorpčího pásu směrem k větším vlovým délkám. Dobře zámou výjmkou v tomto směru je --
azule a jeho dervát, jejchž fluorescece vchází ze stavu S. Fluorescečí schopost látk popsuje kvatový výtěžek fluorescece Y F, který je defová jako poměr počtu fotoů vzářeých látkou ve formě fluorescece F ku počtu fotoů látkou absorbovaých A F YF () A Kvatový výtěžek umožňuje určt zářvý tok emtovaý vzorkem ve formě fluorescečího zářeí vjádřeý jako počet fotoů za jedotku času p,f ze zářvého toku látkou absorbovaého p,a jako Φ (3) p, F YFΦp,A Kvatový výtěžek je urče podílem rchlost vlastího fluorescečího přechodu a celkové rchlost všech dějů, které vcházejí ze stavu S. Kromě dějů výše zmíěých se může uplatt vlv dalších kompoet přítomých v roztoku, které deaktvují stav S a tak zhášejí fluorescec. Tto látk jsou ozačová jako zhášedla (agl. quechers ). Mez ejběžější zhášedla patří kslík a také látk obsahující prvk s všším atomovým číslem. I samotá fluoreskující látka může př všších kocetracích sžovat kvatový výtěžek. Hovoříme pak o kocetračím zhášeí fluorescece. Mohou se př ěm uplatt růzé mezmolekulárí terakce, jako je tvorba molekulárích asocátů v základím č exctovaém stavu, přeos eerge apod. Velce účě je za běžých podmíek zhášea fosforescece, protože sama probíhá velm pomalu. Proto eí za běžých podmíek pozorováa. Objeví se apř. až v tuhých zchlazeých roztocích (často a teplotu kapalého dusíku 77 K), kd jsou vější zhášecí mechazm potlače. Jak je patro z obr., eí fluorescečí zářeí emtováo př jedé vlové délce, protože cílovým stavem mohou být vbračě exctovaé hlad základího elektroového stavu. Rozděleí zářvého toku mez jedotlvé emtovaé vlové délk em popsuje emsí spektrum. Jeho exaktím vjádřeím je fluorescečí spektrálí zářvý tok p,f, ( em ) udávající zářvý tok vzařovaý vzorkem v jedotkovém tervalu vlových délek v okolí vlové délk em. Celkový fluorescečí zářvý tok je vázá se spektrálím zářvým tokem tegrálem p, F Φp,F, d 0 em em Φ (4) Důležtým závěrem vplývajícím ze schémat a obr. je skutečost, že tvar emsího spektra eí závslý a exctačí vlové délce, protože je urče pouze základí vbračí hladou stavu S a vbračím hladam základího stavu S 0. -3-
Pokud b vbračí hlad stavů S a S 0 měl podobou strukturu, bla b také vbračí struktura emsího fluorescečího spektra podobá vbračí struktuře prvého pásu v absorpčím spektru. Ve frekvečí č vločtové stupc pak bude fluorescečí spektrum přblžě zrcadlovým obrazem prvého absorpčího pásu s osou smetre v blízkost vločtu přechodu mez základím vbračím hladam obou stavů (tzv. pravdlo zrcadlové smetre). Mez látk splňující většou pravdlo zrcadlové smetre patří aromatcké uhlovodík jako apř. athrace (vz dále obr.3 a 4). I kdž tvar emsího spektra eí závslý a podmíkách exctace, měí se celkový fluorescečí zářvý tok. Proto je účelé použít jako charakterstku emsích vlastostí látk spektrálí zářvý tok vztažeý apř. a spektrálí zářvý tok v maxmu této závslost. Takto defovaé emsí spektrum je bezrozměré a v maxmu má hodotu. Jou možostí je vztáhout spektrálí zářvý tok a celkový zářvý tok E c em p,f Φp,F, em (5) Φ Takto defovaé emsí spektrum má rozměr převráceé jedotk vlové délk, apř. m -, a jeho tegrál a tervalu (0,) je rove jedé. Pokud fluoreskující roztok v kvetě čtvercového průřezu obsahuje jedou absorbující složku, která má schopost fluoreskovat, platí pro absorpc exctačího zářeí Lambertův-Beerův záko A b c f (6) kde A je absorbace roztoku, je molárí absorpčí koefcet složk, b je tloušťka kvet a c f je látková kocetrace fluoreskující složk v roztoku. Odtud můžeme absorbovaý zářvý tok p,a vjádřt ze zářvého toku exctačího zářeí dopadajícího a kvetu p,0 jako Φ p,a b cf Φ 0 (7) p,0 Pro ízké hodot absorbace můžeme aproxmovat tuto závslost leárím vztahem Φ p, A. 3 Φ bc (8) p,0 f Z rovce (3) pak pro fluorescečí zářvý tok ple Φ ex. YF Φp,0 ex ex b cf (9) p, F 3-4-
kde argumetem ( ex ) je vjádřeo, které velč závsejí v tomto vztahu a vlové délce exctačího zářeí ex. (Kvatový výtěžek v roztocích většou a exctačí vlové délce ezávsí.) Pro spektrálí fluorescečí zářvý tok pak ple vztah Φ ex, em. YF Ec em Φp,0 ex ex bcf p, F, 3 (0) Fluorescečí spektrálí zářvý tok ted závsí a vlové délce exctačího záře a a emsí vlové délce. Pro málo absorbující roztok obsahující jedu složku se dá vjádřt jako souč dvou faktorů, z chž jede Φ závsí pouze a vlové p,0 ex ex délce exctačího zářeí, a druhý E c em pouze a emsí vlové délce. Závslost fluorescečího zářvého toku a vlové délce exctačího zářeí za kostatích podmíek měřeí emse je ozačováa jako exctačí spektrum. Pokud bchom měl k dsposc zdroj exctačího zářeí s proměou vlovou délkou, jehož zářvý tok b bl a vlové délce ezávslý, blo b exctačí spektrum zředěého roztoku obsahujícího jedou fluoreskující látku až a ásobek totožé s jejím absorpčím spektrem a to ezávsle a proměřovaé emsí vlové délce. Podobě emsí spektrum až a ásobek ezávsí a exctačí vlové délce. Jak exctačí, tak emsí spektrum je vužtelé pro detfkac látk porováím se spektr stadardí látk. Pokud je v roztoku přítomo více fluoreskujících látek a jejch kocetrace je ízká, takže se vzájemě eovlvňují, jejch fluorescečí zářvé tok se sčítají. Pro kvattatví aalýzu vplývá z rovce (0), že př ízkých hodotách absorbace (kocetrace) roztoku vzrůstá zářvý tok fluorescece leárě s kocetrací fluoreskující látk. Přístroj pro měřeí fluorescečího zářeí je ozačová jako fluormetr. Pokud můžeme přístrojem měřt exctačí a emsí spektra, bývá pro zdůrazěí této skutečost používáo ozačeí spektrofluormetr. Základí blokové schéma fluormetru je zázorěo a obr.. Ze zářeí vsílaého tezívím exctačím zdrojem zolujeme prmárím (exctačím) fltrem ebo moochromátorem zářeí těch vlových délek, které chceme použít pro exctac vzorku. Toto zářeí dopadá a vzorek a exctuje v ěm fluorescečí zářeí. Fluorescečí zářeí vstupuje ze vzorku všem směr. Jeom jeho část vstupuje v takovém směru, že prochází přes sekudárí (emsí) fltr ebo moochromátor a dopadá a fotoelektrcký detektor. Zde vvolá elektrcký sgál, který se dále zesluje a měří. Jeho velkost je mírou fluorescečího zářvého toku vsílaého vzorkem a vlových délkách zolovaých emsím fltrem (moochromátorem). Podmík buzeí jsou přtom urče zdrojem exctačího zářeí a prmárím fltrem (astaveím exctačího moochromátoru). Pokud je přístroj v exctačím optckém sstému vbave moochromátorem, můžeme plule mět vlovou délku, a kterou je teto moochromátor astave, a zazameat exctačí spektrum vzorku. Pokud je přístroj vbave moochromátorem v emsím -5-
optckém sstému, můžeme plule mět vlovou délku, a kterou je astave teto moochromátor, a zazameat emsí spektrum vzorku. Obr.: Blokové schéma fluormetru Exctačí a emsí spektra takto přímo měřeá spektrofluormetr jsou zkreslea charakterstkam přístroje a jsou ozačováa jako spektra ekorgovaá. Emsí spektra jsou zkreslea především z toho důvodu, že detektor eí stejě ctlvý a zářeí růzých vlových délek. Protože a exctačí zdroj evzařuje stejě v celém rozsahu vlových délek, jsou zkresleá exctačí spektra. Abchom se přblížl skutečému průběhu spekter ve smslu rovce (0), musel bchom aměřeá spektra ásobt pro každou vlovou délku příslušým korekčím faktorem. Získají se tzv. korgovaá spektra. Tato spektra jsou důležtá, pokud apř. chceme porovávat data změřeá a růzých přístrojích. Z toho důvodu b v lteratuře měla být publkováa pokud možo spektra korgovaá. Korgovaé exctačí spektrum b také mělo být podle rovce (0) až a ásobek totožé s absorpčím spektrem látk. Př vužtí fluorescečí spektrometre pro praktcké aaltcké účel však většou vstačíme se spektr ekorgovaým. Jako příklad ekorgovaých spekter je a obr.3 uvedeo exctačí a emsí spektrum athraceu. V porováí s absorpčím spektrem (obr.4) je v exctačím spektru výrazě slabší pás okolo 5 m, protože zářeí exctačí xeoové výbojk se směrem ke kratším vlovým délkám začě zeslabuje. Jak s jsou s obě spektra celkem podobá dík tomu, že spektrum xeoové výbojk se v této oblast vlových délek měí plule. Pokud má exctačí zdroj čarové spektrum (rtuťová výbojka, do určté mír xeoová výbojka v oblast 450-500 m), má ekorgovaé exctačí spektrum čarový charakter a jeho podobost se spektrem absorpčím se ztrácí. -6-
Za povšmutí stojí také vzájemá poloha exctačího a emsího spektra athraceu splňující poměrě dobře pravdlo zrcadlové smetre s osou smetre okolo vlové délk 377 m (vz str.4). Další zkresleí spekter se uplatňuje u vzorků, které výrazěj absorbují zářeí o exctačí ebo emsí vlové délce. Pokud vzorek absorbuje exctačí zářeí do té mír, že se exctačí paprsek př průchodu vzorkem zeslabuje, hovoříme o tzv. efektu vtřího fltru. V důsledku tohoto efektu eí př všších kocetracích kalbračí závslost leárí. Dále jsou deformováa exctačí spektra, protože je slěj zeslabe sgál v absorpčích maxmech ež v absorpčích mmech. Teto efekt bývá výrazý u přístrojů s tzv. kolmým uspořádáím, ve kterém je pozorováo emsí zářeí vcházející přblžě z oblast okolo středu kvet ve směru kolmém a exctačí paprsek. Nelearta kalbračích závslostí je v tomto uspořádáí ještě výrazější, ež odpovídá rovc (7), a pro všší kocetrace fluoreskující látk klesá měřeý sgál dokoce až a ulu. Pro slě absorbující roztok se totž exctačí paprsek absorbuje hed v povrchové vrstvě vzorku a vůbec eproke do jeho středu. Také emsí zářeí může být př průchodu vzorkem absorbováo. Tato tzv. reabsorpce se projevuje zeslabeím emsího zářeí a deformací emsích spekter. O tom, zda se u ezámého vzorku uplatňuje efekt vtřího fltru ebo reabsorpce, se ejlépe přesvědčíme tak, že změříme předem jeho absorpčí spektrum. Má-l roztok v kvetě o tloušťce absorbující vrstv cm absorbac 0,04, pak se paprsek a vzdáleost 0,5 cm (polova tloušťk kvet) zeslabí téměř o 5 %. Proto b měřeé roztok měl mít jak a exctačí, tak a emsí vlové délce hodotu absorbace žší. Nemáme-l možost změřt absorbac vzorku, můžeme porovat fluorescečí sgál pro růzě aředěý vzorek. -7-
p, 0 3 s - 300 00 00 0 50 300 350 400, m 450 Obr.3: Nekorgovaé exctačí a emsí spektrum athraceu v methaolu Přístroj Fluoromax-, exctačí spektrum ( ) změřeo pro emsí vlovou délku 399 m, emsí spektrum ( - - - - - - ) blo buzeo zářeím o vlové délce 5 m. Kocetrace athraceu 0-7 mol l -. Obr.4: Absorpčí spektrum athraceu v methaolu Kocetrace athraceu 5 0-6 mol l -, kveta cm -8-
Měřeí a přístroj SPEKOL s fluorescečím ástavcem Laboratoře jsou vbave přístrojem SPEKOL (výrobce Carl Zess, Jea). Je to jedopaprskový absorpčí spektrofotometr s mřížkovým moochromátorem astavtelým v rozsahu vlových délek 30 850 m. Pro měřeí fluorescece je vbave ástavcem FK, kterým se ahradí ástavec pro měřeí absorpce. Fukčí schéma tohoto uspořádáí je a obr.5. Jako zdroj exctačího zářeí () může být použta halogeová žárovka, která je běžým vbaveím přístroje. Pro vlové délk 365, 406, 436, 546 a 578 m lze ale dosáhout tezvější exctace rtuťovou výbojkou, která a těchto čarách vzařuje velm slě. Rtuťová výbojka je apájea ze sítě přes tlumvku, jejíž mpedace určuje velkost střídavého proudu, který výbojkou prochází. Zářeí ze zdroje je soustředěo kodezorem () a vstupí štěrbu moochromátoru (4). Exctačí zářeí o zvoleé vlové délce vstupující štěrbou (9) z moochromátoru můžeme v případě potřeb zeslabt štěrbovou clokou. Také může být do dráh paprsku zařaze hraový fltr, který zadržuje zářeí o vlové délce větší ež 390 m, zatímco zářeí o kratších vlových délkách propouští. Fltr je vhodé použít př prác v ultrafalové oblast, protože se jím omezí rušvé rozptýleé zářeí. Toto zářeí v důsledku rozptlu a stěách a optckých prvcích moochromátoru opouští jeho výstupí štěrbu, ačkolv emá vlovou délku, a kterou je moochromátor astave. Fluorescečí ástavec je přdržová dvěma šroub u výstupí štěrb moochromátoru (9). Exctačí zářeí z moochromátoru je soustředěo objektvem (0) do kvet (). Otočý držák dvou kvet umožňuje jejch střídavé přemísťováí do kvetového prostoru. Vbuzeé fluorescečí zářeí vstupující z kvet v kolmém směru z oblast zhruba uprostřed kvet je měřeo fotokou (6). Mez fotoku a kvetu je možo umístt sekudárí fltr (4) buď terferečí s úzkým pásm propustost, ebo hraový, který propouští vlové délk delší ež je vlová délka jeho absorpčí hra. Držák kvet dosedá a kolíček ve spodí část ástavce, který otvírá uzávěrku zabraňující dopadu světla a fotoku během výmě vzorku. Ve fotokové skříňce jsou k dsposc dvě fotok, které je možo zařadt do dráh paprsku táhlem. Př zatlačeém táhlu je používáa modrá fotoka, která je ctlvá a zářeí o vlových délkách od 360 do 650 m. Vtažeím táhla bchom zvoll červeou fotoku, která je ad vlovou délkou 650 m ctlvější ež modrá fotoka. -9-
6 5 4 3 6 5 4 8 0 9 7 7 3 0 99.99 8 Obr.5: Schéma přístroje SPEKOL s fluorescečím ástavcem -exctačí zdroj (halogeová žárovka ebo rtuťová výbojka), -kodezor, 3-odrazé zrcadlo, 4- vstupí štěrba moochromátoru, 5-kolmátor, 6-odrazová dsperzí mřížka, 7-bubíek vlových délek, 8-objektv, 9-výstupí štěrba moochromátoru, 0-objektv, -kveta se vzorkem, -zrcátka, 3-objektv, 4-vmětelý sekudárí fltr, 5-objektv, 6-fotoka, 7-zeslovač a dgtálí zpracováí sgálu, 8-dsplej Sgál fotok je po zesíleí dgtalzová a před zobrazeím a dsplej (8) dále zpracová. Př měřeí fluorescece je odečtea úroveň předem změřeého slepého pokusu. Pak je sgál vděle předem změřeým sgálem srovávacího vzorku a vásobe předem zvoleou hodotou faktoru, který může mít apř. hodotu kocetrace aaltu ve srovávacím vzorku. Bez předchozího proměřeí srovávacího vzorku a zadáí faktoru přístroj měřeí fluorescece eumožňuje. Přístroje v laboratoř používají jako zdroj exctačího zářeí rtuťovou výbojku. Její poloha je jž předem seřízea tak, ab moochromátorem procházel co ejtezvější tok exctačího zářeí. Výbojka se zapálí sama poté, co přpojíme tlumvku a síť 30 V~ a zapeme vpíač a tlumvce. Zářeí výbojk dosáhe stablzovaé úrově as po 5 mutách. -0-
Na obr.6 je vobrazea čelí stěa přístroje SPEKOL se základím ovládacím prvk. Vlastí přístroj uvedeme do chodu ásledujícím způsobem. SPEKOL 4 3 m 5 6 7 Obr.6: Čelí pael fotometru SPEKOL -dsplej, -tlačítka pro volbu tpu měřeí, 3-ástavec FK pro měřeí fluorescece, 4-skříň fotoek, 5-bubíek vlových délek, 6-síťový vpíač, 7-páčka pro zařazeí fltru ebo clo. Přístroj zapojíme síťovou šňůrou a síť 30 V~. Zapeme síťový vpíač (6) a čelí stěě přístroje. Po jeho stskutí se rozsvítí dsplej () a dkačí dod ad tlačítk () blkají.. SPEKOL echáme as 5 mut temperovat. 3. Bubíkem vlových délek (5) astavíme exctačí vlovou délku. Pokud je tato vlová délka žší ež 390 m, přepeme páčku (7) do horí (vodorové) poloh, čímž zařadíme do dráh exctačího paprsku fltr pro potlačeí rozptýleého zářeí. Pokud ebudeme měřt emsí sgál pro vlové délk ad 650 m, zkotrolujeme, zda a fotokové skříňce (4) je táhlo zatlačeo, tj. že je používáa modrá fotoka. 4. Pro měřeí fluorescece stskeme tlačítko FL. Začou blkat tlačítka Z-FL a FAKT. 5. Přřadíme ulovou hodotu fluorescec pozadí tak, že echáme kvetový prostor prázdý a vsueme stolek směrem dolů as o 5 mm, ab bla --
uzavřea uzávěrka před fotokou, a stskeme tlačítko Z-FL. Toto tlačítko přestae blkat, zače blkat tlačítko R. 6. Zadáme hodotu sgálu, kterou chceme přřadt fluorescec ašeho srovávacího vzorku. Může to být jeho kocetrace. Stskeme tlačítko FAKT. Na dsplej se objeví hodota.000, kterou postupým stskem tlačítek POS a INC upravíme a požadovaou hodotu (včetě poloh deseté tečk). Pokud srovávací vzorek má ejtezvější fluorescec z celého měřeého souboru vzorků, volíme hodotu tak, abchom co ejlépe vužl všecha čtř místa dspleje (apř. 9.000). Dalším stskem tlačítka FAKT uložíme tuto hodotu do pamět přístroje. Blká pouze tlačítko R. 7. Změříme sgál srovávacího vzorku. Do kvetového prostoru umístíme srovávací vzorek (ejkocetrovaější roztok kalbračí závslost ebo fluorescečí stadard). Stskeme tlačítko R, přístroj automatck astaví optmálí zesíleí a a dsplej se objeví přblžě hodota zadaá v předchozím kroku. 8. Př měřeí umístíme vzorek do kvetového prostoru a a dsplej odečteme fluorescečí sgál. UPOZORNĚNÍ! Přístroj obsluhujte přesě podle uvedeého ávodu. Poruchu hlaste hed asstetov. Př mapulac s kvetou j držte za horí roh a zacházejte s í šetrě. Plňte j as 3 mm pod horí okraj. Kvet zásadě uvtř evsušujte a ečstěte, sado se rozlomí ebo rozlepí. Př plěí roztokem stačí, kdž kvetu ěkolkrát (m. 3x) vpláchete měřeým roztokem. Př plěí pokud možo esmočte vější stě kvet. Pokud budou vější stě mokré, jemě vsušte pouze kapk hraou fltračího papíru ebo buč. Kvet eotírejte a eleštěte, protože se sado poškrábou, a tím zehodotí. Čstotu kotrolujte prohlédutím kvet prot světlu. I slabě zečštěá okéka (ulpěé kapk, otsk prstů) zkreslují měřeí fluorescece. Př vkládáí kvet (ebo fluorescečího stadardu) s všměte, že kveta emá přesě čtvercový průřez. Její delší straa musí být př vkládáí do držáku a př měřeí rovoběžá se stěou přístroje (tj. kolmá a exctačí paprsek). Jak se může kveta sado poškodt. Př mapulac s držákem pracujte opatrě. Každý prudší pohb aplěé kvet způsobí vltí roztoku do přístroje a potřísěí okéek kvet. --
Návod laboratorí práce Fluormetrcké staoveí chu v ápojích Úkolem práce je staovt ch v předložeém kapalém vzorku a ve vzorku ápoje. Obr.7: Strukturí vzorec chu Ch C 0 H 4 N O (M r =34,4) je alkalod, jehož strukturí vzorec je a obr. 7. Ch se vsktuje v kůře tropckých stromů rodu Cchoa. Stále ještě je výzamým lékem prot malár. Má výrazě hořkou chuť a je proto přdává do ěkterých tpů ápojů. Oba dusíkové atom v molekule chu mohou být protozová. Opětá dsocace těchto vodíkových otů je charakterzováa dsocačím kostatam přblžě pk =4,3 (cholový dusík) a pk =8,3 (chukldový dusík). S kselam tvoří ch sol. Bývá dodává ve formě sírau (C 0 H 4 N O ) H SO 4 H O (M r =78,96), který je ale do určté mír hgroskopcký, takže obsah vod v růzých preparátech může začě kolísat. Jeho roztok za určtých podmíek jasě modře fluoreskují. Jeho emsí spektrum leží v oblast vlových délek ad 400 m s šrokým maxmem okolo 460 m. Fluorescečí vlastost chu jsou poměrě dobře prozkoumá, a proto se často používá př fluorescečích měřeích jako srovávací látka. Jeho fluorescece je do určté mír zhášea apř. chlordovým č bromdovým ot. Absorpčí spektrum plě protozovaé form chu je uvedeo a obr. 8. Z tohoto spektra je vdět, že k exctac fluorescece chu je celkem dobře použtelá skupa čar rtuťové výbojk okolo vlové délk 365 m. Molárí absorpčí koefcet chu pro tuto vlovou délku je 3,6 0 3 l mol - cm -. -3-
A 0,8 0,6 0,4 0, 0,0 00 50 300 350, m 400 Obr.8: Absorpčí spektrum roztoku chu v 0,05 M kselě sírové Kocetrace chu,5 0-5 mol l -, tloušťka kvet cm. Úkol. Nastavte exctačí moochromátor a vlovou délku rtuťových čar okolo 365 m tak, ab fluorescečí sgál chu bl maxmálí.. Proměřte závslost fluorescečího sgálu chu a kselost roztoku přblžě v oblast ph = až ph = 5. 3. Na základě výsledků z bodu zvolte prostředí vhodé pro přípravu kalbračí závslost a aalýzu vzorků. Pro toto prostředí změřte oretačě fluorescečí sgál roztoků aalzovaého vzorku a ápoje. 4. Přpravte kalbračí roztok, aředěé roztok vzorku, ápoje a ápoje s přdaým stadardem a proměřte jejch fluorescečí sgál. 5. Zpracujte kalbračí závslost a určete hmotostí kocetrac chu ve vzorku a v ápoj. Pracoví ávod. Příprava pracovího roztoku chu. Ze základího roztoku chu o kocetrac,5 0-3 mol l -, který je v laboratoř k dsposc, přpravíte do odměrk 50 ml pracoví roztok chu o kocetrac,5 0-5 mol l -.. Příprava roztoků chu s růzou hodotou ph. Do 5 odměrek a 5 ml přpravíte řadu pět roztoků chu o kocetrac,0 0-5 mol l - s růzou hodotou ph podle tabulk I. -4-
Tabulka I: Příprava 5 ml roztoku o přblžém ph Dávkovaý objem roztoku, ml ph 0,5 M H SO 4 a 0,05 M H SO 4 0,4 M octaový tlumč ph=5 5,0 - - - 0,0-3 -,0-4 4, - 5,0 5 - - 5,0 a Octaový tlumč a 0,5 M ksela sírová jsou v laboratoř k dsposc. Zředěá 0,05 M ksela sírová se přpraví aředěím 0,5 M ksel. Pro celou prác vstačíte s 50 ml tohoto roztoku. 3. Spuštěí a astaveí fluormetru. Fluormetr zapete a přpravíte k měřeí způsobem popsaým výše. Moochromátor astavíte a vlovou délku 365 m a zařadíte do exctačího paprsku fltr omezující rozptýleé zářeí (páčka (7) a obr.6 v horzotálí poloze). Přístroj vulujete s prázdým kvetovým prostorem a fluorescec bezbarvého fluorescečího stadardu přřadíte hodotu 9,000. 4. Nastaveí exctačího moochromátoru a maxmum tezt rtuťových čar 365 m. Do kvetového prostoru umístíte kvetu s roztokem chu o ph = a proměříte jeho exctačí spektrum v rozmezí 335 až 375 m s krokem 5 m. V okolí maxma proměříte závslost podroběj s krokem m. (Spektrálí šířka pásma moochromátoru přístroje SPEKOL čí m, hlaví složk multpletu rtuťových čar v okolí 365 m mají vlové délk 365,0, 365,48 a 366,33 m.) Moochromátor astavíte a vlovou délku, pro ž bude fluorescece roztoku ejslější. S tímto astaveím provedete celé další měřeí. 5. Určeí vhodého ph pro staoveí chu. Po astaveí exctačí vlové délk podle předchozího bodu zovu přřadíte bílému fluorescečímu stadardu hodotu sgálu 9,000 a proměříte fluorescečí sgál pro všech roztok chu přpraveé v bodě. Prostředí, které je pro fluormetrcké staoveí chu ejvhodější, použjete ve všech dalších měřeích. 6. Oretačí proměřeí sgálu vzorků. Do odměrek a 5 ml odměříte ml zadaého vzorku a aalzovaého ápoje a upravíte prostředí podle závěrů z bodu 5. Změříte fluorescečí sgál přpraveých roztoků. 7. Příprava kalbračích roztoků. Pro zvoleé prostředí přpravíte kromě roztoku bez chu ještě 5 dalších kalbračích roztoků s rovoměrě rostoucí kocetrací. A pro ejkocetrovaější roztok kalbračí závslost b se eměl zřetelě uplatt efekt vtřího fltru. Proto jeho kocetrac zvolíte tak, ab jeho absorbace pro exctačí vlovou délku 365 m bla v kvetě o tloušťce cm žší ež 0,04. Měla b být ale všší ež as 0,03, ab fluorescečí sgál ebl přílš slabý. Molárí absorpčí koefcet chu pro vlovou délku 365 m je 3,6 0 3 l mol - cm -. 8. Naředěí vzorků. Zadaý vzorek aředíte a základě výsledků z bodu 6 tak, ab jeho kocetrace ležela v ejvšší třetě kalbračí závslost. Přpravíte -5-
paralelě tř stejě aředěé roztok. Př aalýze ápoje budete postupovat metodou přídavku stadardu. Do dvou odměrek a 5 ml odměříte takový objem ápoje, ab kocetrace chu ležela po doplěí po začku zhruba v polově kalbračí závslost. Do druhé odměrk pak avíc přdáte 4 ml pracovího roztoku chu o kocetrac,5 0-5 mol l -. Všech roztok vzorků aředěé pro měřeí musejí mít stejě upraveé prostředí jako kalbračí roztok. 9. Staoveí chu ve vzorcích. Změříte fluorescečí sgál kalbračích roztoků a všech roztoků vzorků. Pro každý roztok odečtete z dspleje áhodě 0 hodot, které zadáte jako vstupí data do jedoho lstu souboru programu Excel, který je k dsposc a počítač v laboratoř. Na tomto předem přpraveém lstu je spočte průměr těchto sgálů a zpracuje se jak leárí, tak kvadratcká kalbračí závslost metodou vážeé leárí regrese (vz Dodatek). Posoudíte, zda vaše měřeí prokazují zakřveí kalbračí závslost, a zvolíte odpovídající tp kalbrace pro určeí kocetrace chu ve vzorcích. Vpočtete kocetrace chu v roztocích vzorků a přepočtete je a hmotostí kocetrac v původích vzorcích. Do protokolu uvedete průměré hodot sgálů pro kalbračí závslost a vzork, parametr použté kalbračí závslost a provedete kotrolí výpočt kocetrací včetě přepočtu kocetrace a původí vzorek. Posoudíte, zda matrce ápoje ovlvňuje fluorescec chu. Výsledk uvedete včetě ejstot, kterou přeesete z výpočtů v Excelu, rozšířeé ejstot a koefcetu rozšířeí s patřčým počtem platých cfer. Kotrolí otázk. Co je to emsí fluorescečí spektrum?. Co je to exctačí fluorescečí spektrum a jaký bude postup př měřeí exctačího a emsího spektra a spektrofluormetru vbaveém exctačím a emsím moochromátorem? 3. Jaké děje probíhají v molekulách fluoreskující látk př buzeí a ems fluorescečího zářeí a jaká erovost proto platí mez vlovou délkou exctačího a emtovaého zářeí? 4. Jak závsí tvar emsího spektra a exctačí vlové délce pro jedu fluoreskující látku a pro směs fluoreskujících látek? 5. Jak závsí tvar exctačího spektra a emsí vlové délce pro jedu fluoreskující látku a pro směs fluoreskujících látek? 6. Co je to pravdlo zrcadlové smetre? 7. Jak závsí fluorescečí sgál a kocetrac fluoreskující látk v roztoku? 8. Jaká je souvslost mez absorpčím a exctačím spektrem? 9. Co je to efekt vtřího fltru a reabsorpce? 0. Co je to korekce fluorescečích spekter a jaké jsou hlaví příč zkresleí ekorgovaých exctačích a emsích spekter? -6-
Pro zpracováí kaptol bla použta práce: M Hejtmáek a K. Volka: Emsí fluorescečí spektroskope ve skrptech Laboratorí cvčeí z strumetálí aalýz. (M. Hejtmáek a kol.), str.0. VŠCHT, Praha 98. -7-
DODATEK: VYHODNOCENÍ KALIBRAČNÍ ZÁVISLOSTI V PRÁCI FLUORIMETRIE V této prác se k vhodoceí dat metodou kalbračí závslost přílš ehodí běžá metoda leárí regrese, protože používá předpoklad homoskedastct, tj. kostatí ejstot závsle proměé v celém jejím rozsahu (obr.9a). Teto předpoklad ale př fluormetrckém staoveí eí zpravdla splě a rozložeí expermetálích bodů v kalbračí závslost se více blíží obr.9b. V takových (heteroskedastckých) případech je obvklé použít metodu vážeé leárí regrese, která bere rozdíl v ejstotě závsle proměé do úvah, vžaduje ale předběžou zalost ejstot závslé proměé pro jedotlvé expermetálí bod. Pokud je k dsposc dostatečě velký počet bodů, jako je tomu a obr. 9, můžeme promělvost ejstot odhadout z těchto dat. V laboratořích je však kalbračí závslost zkostruováa pouze ze 6 bodů. Pak je třeba vcházet z pozatků získaých během valdace metod ebo použít pro ejstot dobře zdůvoděý model... 0.8 0.8 0.6 0.6 0.4 0.4 0. 0. 0 0 0.05 0. 0.5 0. 0.5 x 0 0 0.05 0. 0.5 0. 0.5 x a. b. Obr.9: Leárí závslost s kostatí ejstotou závslé velč (a) a s ejstotou úměrou této velčě (b) Př fluormetrckém měřeí jsou hlaví příspěvk k ejstotě měřeého sgálu přblžě přímo úměré úrov tohoto sgálu. Sem patří faktor jako apř. establta zdroje exctačího zářeí, obsah dalších složek vzorku, které absorbují zářeí, poloha kvet, světelé ztrát odraz a stěě kvet a a ečstotách a částečě také ejstota fotometru měřícího zářvý tok. Do ejstot měřeého sgálu se promítá také ejstota kocetrace kalbračích roztoků. Ta b podle předpokladů, z chž metoda leárí regrese vchází, měla být zaedbatelá, ale ve skutečost tomu tak emusí být. Př ředěí spíše bývá kostatí relatví ejstota kocetrace -8-
výsledého roztoku, a íž se podílí apř. proměá teplota, doplňováí odměrk po začku, ejstota kalbrace odměrého ádobí, u ppet kalbrovaých a vltí podíl kapal ulpělý a stěách a ve špčce ppet, odpařováí rozpouštědla ebo odparek a ečstot, které se opláchou z hrdla ádob př vléváí roztoku. Př ízkých úrovích zářvého toku je ejstota jeho měřeí úměrá druhé odmocě zářvého toku. Je tomu tak v případě, kd sgál vzká zprůměrováím fotoproudu geerovaého ízkým počtem fotoů, protože jejch počet se řídí Possoovou statstkou. Fotometr použtý v této prác ovšem tak ízké úrově měřt emůže. Je meší část ejstot měřeého sgálu a úrov tohoto sgálu ezávsí. K této část přspívá apř. rozptýleé zářeí, fluorescečí zářeí ečstot, paraztí světlo z okolí, které se dostae k detektoru, a částečě ejstota fotometru měřícího zářvý tok. Z těchto důvodů se jako přměřeý model ejstot sgálu jeví leárí závslost mez ejstotou a sgálem. Odhad parametrů závslost a ejstot metodou leárí regrese Metoda leárí regrese předpokládá, že platí leárí závslost mez závsle proměou velčou a jedím ebo ěkolka čle (proměým) x k ve tvaru p k a k x k () kde a k jsou kostat a p je počet čleů. Metoda leárí regrese posktuje odhad koefcetů a k a případě dalších parametrů a základě řad hodot určeých pro kombací čleů x k (=..). Přtom hodot jsou zatíže ejstotou, o íž běžá metoda leárí regrese předpokládá, že je kostatí v celém rozsahu hodot. Nejstota čleů x k se předpokládá ulová. Metoda leárí regrese určuje odhad parametrů â k jako hodot, které posktují mmálí hodotu součtu druhých moc resduálích odchlek, tj. rozdílů hodot a hodot ŷ vpočteých ze vztahů p ˆ aˆ k xk,,.., () k Mmalzace (resduálího) součtu čtverců S res p ˆ aˆ k xk (3) k vžaduje, ab jeho parcálí dervace podle všech koefcetů â l bl ulové, což vede a soustavu leárích rovc pro odhad koefcetů â k ve tvaru -9-
x l p ak ˆ x x l,.., p (4) k k l resp. S l p k aˆ S l,.., p (5) k kl Součt S l x l (6) jsou leárí fukcí, zatímco matce soustav S kl xk, xl, (7) závsí pouze a hodotách x k a a hodotách ezávsí. Zameá to, že a versí matce S v eí a hodotách závslá a řešeí p v aˆ S S k,.., p (8) k l l kl je prostředctvím součtů S l leárí fukcí hodot. Nejstotu odhadů těchto koefcetů je tak možo určt podle jedoduchých pravdel o šířeí ejstot, pokud určíme ejstotu hodot. Pokud eí zámo c jého, pokládá se za tuto ejstotu její odhad s z resduálího součtu čtverců podle vztahu s S res (9) -p Výše popsaý způsob vhodoceí je používá v aaltcké chem k vhodoceí kalbračí závslost aaltckého sgálu a obsahu aaltu x. Tato závslost a obsahu x bývá často leárí, může být ale popsáa apř. polomem vššího stupě, kd sčítac ve fukčím vztahu jsou ásobk moc, x, x,.., x s, kde s je stupeň polomu. Prvý čle určuje úsek a ose. Pro leárí závslost a x vplývá z tohoto postupu zámý vztah (0) pro ejstotu obsahu Xˆ odhadutého z kalbračí závslost pro průměrou hodotu sgálu Y získaou z m měřeí -0-
-- xx Q a Y m a s X u ˆ ) ( ˆ ) ˆ ( (0) kde â je (odhadutá) směrce závslost, velča () je středí hodota sgálů a Q xx je rozptl hodot x okolo středí hodot x : xx x x Q ) ( () Odhad parametrů závslost a ejstot metodou vážeé leárí regrese Metoda vážeé leárí regrese odhaduje koefcet a další velč mmalzací vážeého součtu p k k k x a w w S w res, ˆ ˆ (3) kde w jsou váh přkládaé jedotlvým bodům. Všší váha je přkládáa bodům s meší ejstotou hodot podle vztahu ) ( u K w (4) a koefcet K se volí tak, ab součet vah bl rove počtu bodů. Je ted u K ) ( (5) a platí též ) ( ) ( ) ( j j u w w w u w u K (6)
To zameá, že koefcet K je rove vážeému kvadrátu ejstot, tj. souču kvadrátu ejstot a váh, pro každý bod jejch vážeému průměru a ahrazuje jedu hodotu ejstot př leárí regres s kostatí hodotou ejstot. Stojí za povšmutí, že váh a proto a odhad parametrů závslost ejsou závslé a absolutí velkost ejstot pro jedotlvé bod, ale pouze a jejch vzájemém poměru. Pokud zvětšíme všech ejstot ve stejém poměru, váh a odhad samotých parametrů to eovlví. Nezměí se a mmalzovaý resduálí součet čtverců, změí se ale odhad ejstot ěkterých odvozeých parametrů. Další postup je podobý jako pro metodu leárí regrese s kostatím ejstotam. Parcálí dervace vedou a soustavu leárích rovc pro koefcet â k ve tvaru w x l p ak ˆ w x x l,.., p (7) k k l tj. ve stejém tvaru jaký má soustava rovc (5), kde ale í vstupují vážeé součt Sl, w w xl (8) které jsou opět leárí fukcí, zatímco matce soustav kl, w xk xl (9) S w závsí pouze a hodotách x k a vahách w a ezávsí a hodotách. Zameá to, že výpočet odhadů koefcetů â k je aalogcký jako př evážeé regres (rovce 8). Dokoce př určováí ejstot koefcetů jsou vztah stejé s tím, že kvadrát ejstot hodot se ahradí vážeým kvadrátem ejstot, ted kostatou K, a ta se aalogck vztahu (9) odhade z vážeého resduálího součtu čtverců (3) Sres,w K s, w (0) -p Př určeí ejstot hodot Xˆ odhadutých z regresí závslost je ale třeba použít také ejstotu hodot Y odpovídající příslušé oblast a apř. vztah (0) přejde a ˆ u( Y) s,w s,w ( Y w) u ( X ) () aˆ m aˆ Qxx,w --
Pro určeí ejstot Xˆ ted potřebujeme použít kokrétí ejstotu hodot Y v daé oblast ploucí z použtého modelu s určeou hodotou kostat K. Použtí souboru pro Excel v laboratoř V laboratoř je pro zpracováí kalbračí závslost a počítačích k dsposc předem přpraveý soubor pro Excel. Obsahuje ěkolk stejých lstů, z chž jede epoužtý přejmeujete a své jméo. Nebudete zasahovat do jých lstů s dat vašch kolegů. Po úpravách ukládáte vžd celý soubor pod původím jméem. Vstupí data jsou zadáváa do žlutě podbarveých buěk. Kromě kocetrací kalbračích roztoků v oblast C0:C5 je to pro každý roztok v kalbrac pro vzork 0 hodot odečteých áhodě z kolísajících údajů dspleje fluormetru, které vložíte do oblast D0:M0. K dalšímu vhodoceí jsou použt průměr těchto hodot spočteé v oblast N0:N0. Ppetovaé objem se zadávají do oblast N:N6. Odhad koefcetů kalbračí závslost jsou spočte v oblast N33:N34 (N47:N49) pro leárí (kvadratckou) závslost. Z těchto hodot a ze změřeého sgálu pro vzorek je určea kocetrace chu v měřeém roztoku v buňce N36 (N5) a přepočtea a ředěí a a hmotostí kocetrac v oblast N37:N38 (N5:N53). Kocetrace roztoku ápoje a roztoku ápoje s přídavkem stadardu je spočtea z kalbračí závslost v oblast N39:N40 (N54:N55). Z těchto hodot je spočtea (zdálvá) výtěžost R v buňce N4 (N56) jako podíl jejch rozdílu ku přdaé kocetrac chu. Touto hodotou je vdělea kocetrace roztoku samotého ápoje a přepočtea a ředěí a hmotostí kocetrac v oblast N4:N43 (N57:MN58). V buňce N44 (N59) je pro srováí přímo přepočtea kocetrace chu změřeá v roztoku ápoje a ředěí a hmotostí kocetrac. Tato hodota je výsledkem aalýz, pokud matrce ápoje eovlví fluorescečí sgál chu (R = ). Př odhadu parametrů kalbračí závslost se předpokládá leárí závslost ejstot sgálu a hodotě sgálu. V buňce Q je možo změt hodotu, která udává, kolkrát má být ejstota mmálího sgálu žší oprot ejstotě sgálu maxmálího. (Pokud se sem zadá hodota, přejde vhodoceí a běžou metodu leárí regrese s kostatí ejstotou sgálu.) Na základě této závslost jsou urče v oblast Q0:Q0 relatví hodot ejstot sgálů a z ch jsou v buňkách R0:R5 spočte váh jedotlvých kalbračích bodů. T jsou použt pří vážeé leárí regres a posktou kromě odhadů koefcetů kalbračí závslost také hodotu s,w v buňce N35 pro leárí a v buňce N50 pro kvadratckou kalbračí závslost. Na jejch základě je pak v buňce O6 určea kostata K, a v buňkách O0:O0 je vtvoře model závslost ejstot sgálu a jeho velkost. Zda je model vtvoře pro leárí ebo kvadratckou závslost určuje hodota v buňce O (pro 0 je model spočte pro leárí kalbrac, pro eulovou hodotu je zvolea kalbrace kvadratcká). Z tohoto modelu jsou pak počítá ejstot kocetrací spočteých ze -3-
sgálů pro vzork v oblast O36:O44 (O5:O59). Nejstot objemů jsou zadá v oblast O:O6. V oblast T36:T59 jsou spočte ejstot výsledých hodot s vužtím Kragteova schématu (T7:AK59) a jsou použt u výsledků získaých metodou přídavku stadardu. V oblast A3:H5 je pro srováí provede výpočet parametrů kalbračích závslostí obvklou metodou evážeé leárí regrese. V buňkách Q33:Q34 a Q47:Q49 je ověřováo, zda jsou koefcet kalbračí závslost statstck výzamě odlšé od ul. Jestlže se pro kvadratckou kalbračí závslost (buňka O 0) objeví v buňce Q49 "NEPRAVDA", eí kvadratcký koefcet statstck výzamý a použjeme výsledk z leárí kalbrace poté, co v buňce O astavíme ulovou hodotu. -4-