Laboratorní praktikum z půdní ekotoxikologie. Doc. RNDr. Jakub Hofman, Ph.D. Mgr. Jana Vašíčková

Transkript

1 Labratrní praktikum z půdní ektxiklgie Dc. RNDr. Jakub Hfman, Ph.D. Mgr. Jana Vašíčkvá Centrum pr výzkum txických látek v prstředí Masarykva Univerzita, Přírdvědecká fakulta Brn, Česká Republika 2012

2 Obsah 1 CÍLE PRAKTIKA BEZPEČNOST PRÁCE V LABORATOŘI MATERIÁL A POMŮCKY ORGANIZACE CVIČENÍ PŘÍPRAVA ARTIFICIÁLNÍ PŮDY, PŘÍDAVEK TESTOVANÝCH LÁTEK OVĚŘENÍ PH MĚŘENÍ WHC MAX A OVLHČENÍ PŮDY PŘÍDAVEK KONTAMINANTŮ DO PŮDY CHOV A TEST S ROUPICÍ ENCHYTRAEUS CRYPTICUS ZALOŽENÍ CHOVU POSTUP TESTU VYHODNOCENÍ TESTU ZPŮSOB Č VYHODNOCENÍ TESTU ZPŮSOB Č CHOV A TEST S CHVOSTOSKOKEM FOLSOMIA CANDIDA ZALOŽENÍ CHOVU POSTUP TESTU TEST INHIBICE KOŘENE SALÁTU LACTUCA SATIVA PŘEDKLÍČENÍ SEMÍNEK POSTUP TESTU CHOV A TEST S HLÍSTICÍ CAENORHABDITIS ELEGANS ZALOŽENÍ CHOVU POSTUP TESTU VYHODNOCENÍ ZÍSKANÝCH VÝSLEDKŮ, KŘIVKY DÁVKA-ODPOVĚĎ

3 1 Cíle praktika Cílem tht praktika je naučit vás pstupy pěti půdních ektxiklgických testů, které se dnes stávají nenahraditelné při hdncení chemických látek, pesticidů, hnjiv, dpadů, kalů, kntaminvaných půd a sedimentů. Pstupy, s nimiž se seznámíte, vychází z následujících standardů a reflektují dsavadní zkušensti výzkumníků centra RECETOX s nimi. ISO (1993): Sil quality. Effects f pllutants n earthwrms (Eisenia fetida) - Part 1: Determinatin f acute txicity using artificial sil substrate. Internatinal Organizatin fr Standardizatin, Geneve, Switzerland. ISO (1998): Sil quality. Effects f pllutants n earthwrms (Eisenia fetida) - Part 2: Determinatin f effects n reprductin. Internatinal Organizatin fr Standardizatin, Geneve, Switzerland. OECD Test N. 222 (2004): Earthwrm reprductin test (Eisenia fetida/andrei). OECD Guidelines fr the Testing f Chemicals. Organisatin fr Ecnmic Cperatin and Develpment, Paris, France. ISO (1999): Sil quality. Inhibitin f reprductin f Cllembla Flsmia candida) by sil pllutants. Internatinal Organizatin fr Standardizatin, Geneve, Switzerland. ISO (2004): Sil quality. Effects f pllutants n Enchytraeidae (Enchytraeus sp.) - Determinatin f effects n reprductin and survival. Internatinal Organizatin fr Standardizatin, Geneve, Switzerland. OECD Test N. 220 (2004): Enchytraeid reprductin test. OECD Guidelines fr the Testing f Chemicals. Organisatin fr Ecnmic Cperatin and Develpment, Paris, France. ISO (1993): Sil quality: Determinatin f the effects f pllutants n sil flra Methd fr the measurement f inhibitin f rt grwth. Internatinal Organizatin fr Standardizatin, Geneve, Switzerland. ASTM Standard E (2001): Standard guide fr cnducting labratry sil txicity with the nematde Caenrhabditis elegans. Annual Bk f ASTM Standards 11: Prstudujte si všechny návdy a také pkyny k bezpečné práci v labratřích před zapčetím vlastníh praktika. Materiál a metdy si před jedntlivými cvičeními prjděte. Během praktika si dělejte pznámky a zapisujte zejména všechny detaily k prváděným pstupům a výsledkům. Kdykliv něc nevíte, zeptejte se vyučujících a pamatujte na úslví dvakrát měř a jednu řež. Některé části uvidíte puze demnstrativně, avšak hlavní část vlastní testy txicity - budete p zašklení d jedntlivých metd prvádět samstatně. Na knci cvičení devzdáte prtkly z celéh cvičení, na základě nichž a na základě vaší dcházky d praktik dstanete zápčet. Prtkly devzdá každá skupina (ne jedntlivci) pr všechny prváděné testy. Prtkl musí bsahvat: 1) název, seznam studentů ve skupině, krátku úvdní část, 2) stručný ppis pstupu, kde dát důraz zejména na rzdíly prti pstupům v těcht návdech, 3) všechny výsledky skupiny přehledně uspřádané d tabulek, 4) zpracvané výsledky (skupiny, či případně i výsledky statních skupin) průměry, SD, RSD, grafy dávka-dpvěď, dhad NOEC, LOEC, LC50 a EC50, 5) Interpretace výsledků, mžné příčiny chyb, dchylek, závěr. 3

4 2 Bezpečnst práce v labratři Následující pkyny nenahrazují pkyny závazné v rámci Univerzity a Fakulty ( zejména část věnvaná BOZP a chemickým látkám), jste pvinni si je prstudvat a ddržvat je. V labratři se smíte phybvat puze, jste-li blečeni v labratrním děvu (tj. plášť a při delším pbytu i labratrní kalhty a kšile). S půdu, chvnými substráty a chemickými látkami pracujte puze v pryžvých rukavicích. D labratře si nenste blečení ani zavazadla, nechte je k tmu určené šatně. V labratři nesmíte knzumvat jídl, pít nápje a kuřit. Před zapčetím prací v labratřích budete seznámeni, kde jsu prstředky první pmci a hasicí přístrje. Tat místa si zapamatujte. Před vlastní manipulací s chemickými látkami a kntaminvanu půdu budete upzrněni vyučujícím na případná rizika, způsb manipulace a sbní chrany zdraví. I přest si můžete prstudvat bezpečnstní pkyny k těmt látkám v některé z internetvých databází (např extxnet.rst.edu; txnet.nlm.nih.gv) Se všemi chemikáliemi nakládejte tak jak t uvádí pkyny na etiketách látek plus pkyny vyučujícíh a údaje získané z txiklgických databází. Studentky v jiném stavu nesmí navštěvvat praktika. Při pipetvání využívejte mikrpipet či skleněných pipet s násadci a nikdy nepipetuje ústy. Odpady ze cvičení bsahující chemické látky likvidujte způsbem dle pkynů vyučujícíh. Nikdy je nevylévejte d výlevky a nedhazuje d kše. Kntaminvanu půdu ukládejte d určených nádb. C nejdříve p práci umyjte veškeré pužívané skl náležitým způsbem (např. detergent lázeň, hrká vda, destilvaná vda, sušárna) a vraťte je na své míst. Plasty dle pkynů vyučujícíh buď vyhazujte d dpadů, neb umývejte. Stejně tak další materiál a pmůcky p práci vracejte na své míst. Při úrazu jste pvinni jej nahlásit vyučujícímu. S přístrji zacházejte patrně a pdbně také se sklem - vždy lépe pmalu a prmyšleně, než rychle a bez uvážení. Při práci s ptenciálními patgenními mikrrganismy (E. cli v kultuře hlístic a hnůj v chvech žížal - tetanus) věnujte zvýšenu pzrnst své chraně frmu rukavic a mytí ruku p práci. Při rzsypání neb rzlití škdlivé látky ihned infrmujte vyučujícíh a kamžitě zajistěte její zneškdnění. Při ptřísnění kůže žíravými látkami c nejdřív začněte plachvat pstižené míst dstatkem teplé vdy (asi 30-35º C) p dbu min. Infrmujte vyučujícíh. Při zasažení čí chemickými látkami, zejména žíravými, vyplachujte či min prudem vdy či fyzilgickéh rztku. V labratři jsu k dispzici ční sprchy pr tent případ nehdy. Infrmujte vyučujícíh. Při náhdném pžití chemikálií vyvlejte zvracení, vypijte dstatečné mnžství vdy a pět vyvlejte zvracení (nesmí se pužít při pžití žíravin či tenzidů). Následně užijte aktivní uhlí z lékárničky pužijte desetinásbek předpkládanéh pžitéh mnžství chemikálie. Infrmujte vyučujícíh. 4

5 3 Materiál a pmůcky vysušená rašelina (zahradnická tř. 1, vrchvištní, ph 3,5 5,0, Agr CS) - defaunizvaná kalinvý jíl s bsahem kalinitu minimálně 30% (Sigma - Aldrich, Kat. č ) křemenný písek s minimálně 50% zrn 0,05-0,2 mm (Filtrační písky s.r.., Chlum) hnůj kravský suchý granulvaný (Agr CS) či suchý nekntaminvaný kňský hnůj zahradní substrát (Agr CS) - defaunizvaný vhdné nádby na přípravu a uchvání artificiální půdy válečky s fritu vespd na WHC; ftgrafická miska destilvaná vda; CaCO 3 ; rztk 1M KCl na měření ph a pufry CdCl 2 ; nerezvé mísy a lžíce na kntaminaci půd; sklenice na kntaminvané půdy plastvé bxy na chvy žížal (10-20 litrů); krabičky s víčky na testy s žížalami a na chvy rupic ( ml); plastvé petrih misky Ø 10 cm a 8 cm; skleničky s víčky na testy s rupicemi a chvstskky (cca 150 ml); plastvé zkušební nádby s víčky na testy s rstlinami (plcha minimálně 150 cm 2, výška minimálně 5 cm) háček z mikrbilgické kličky; agar (Rth); vlčky mleté; Bengálská červeň; etanl; bílá akrylvá barva sádra, aktivní uhlí, sušené kvasnice, exhaustr, štěteček, miska s mřížku na vyhdncvání testu s chvstskky LB médium: 10 g tryptn + 5 g yeast extrakt + 10 g NaCl + 1 ml 1M NaOH dplnit vdu d 1 litru a autklávvat NGM agar: 3 g NaCl + 17 g bactagar + 2,5 g bactpeptne + 1 ml chlesterl (5 mg/ml EtOH) ml H 2 O a autklávvat; následně přidat sterilní rztk slí: 1 ml 1M CaCl ml 1M MgSO ml 1M KH 2 PO 4 Kultura E. cli OP 50 kónické zkumavky plastvé 50 a 15 ml; platinvý drátek; klidní rztk Ludx sada mikrpipet různých bjemů; váhy s váživstí d něklika kg; přesné analytické váhy; ph metr; vrtačka s míchadlem; třepačky; inkubační místnst; termstat; sušárna; binkulární mikrskp; autkláv; flw bx; sušárna; kahan běžné labratrní skl - dměrné baňky, válce a kádinky různých bjemů; nálevky; uzavíratelné sklenice různých bjemů; prcelánvé phárky, různě velké Petrih misky, mikrbilgická hkejka filtrační papíry archy a kruhvé výseče; labratrní papírvé ubrusky běžné labratrní pmůcky lžičky, kpistky, pinzety, váženky, albal, ptravinářská fólie, parafilm, špičky na pipety; pasteurky; fixy, lepící páska, nůžky, střičky s vdu a lihem pryžvé rukavice latexvé a vinylvé; respirátry 5

6 4 Organizace cvičení Filsfií praktika je maximálně samstatná práce studentů. Z pvahy a délky jedntlivých metd vyplývá, že cvičení nemůže prbíhat jak pravidelná týdenní výuka. Studentům je vyučujícím předvedena péče chvy, za asistence si vlastní chvy hned na začátku semestru zalží a pté se celý semestr mdelvé rganismy starají sami. Kntaminvaná půda je připravena vyučujícím, avšak studentům je demnstrativně předvedena jak příprava artificiální půdy, tak metdika kntaminace půd. C se týká testů, jsu studentům demnstrvány všechny klíčvé krky pstupů v něklikahdinvých blcích na začátku semestru a pté již studenti prvedu samstatně všechny testy s připravenu kntaminvanu půdu. Vyučující puze kntrluje stěžejní krky a je během celéh semestru k dispzici při prblémech či dtazech. Na knci semestru je hrmadný blk věnvaný vyhdncení získaných výsledků včetně představení statistických pstupů. Průběh praktika lze tedy shrnut d rámcvéh plánu: Enchytraeus crypticus Flsmia candida Lactuca sativa Caenrhabditis elegans Příprava artificiální půdy a příprava kntaminvané půdy (začátek semestru) Blk 5 Samstatná část Blky 1,2,3,4 Blk 1 ukázka rašeliny, písku a jílu ukázka artificiální půdy suché a mkré, ukázka standardní půdy LUFA 2.2 ukázka měření WHC a ph ukázka přídavku txické látky d artificiální půdy (Cd jak CdCl 2 ) Zalžení chvu (začátek semestru) ukázka a pkyny k péči chvy ukázka substrátů a jejich přípravy ukázka manipulace s rganismy studenti si zakládají svůj chv a pečují něj během semestru není Předvedení důležitých krků z pstupů testů (začátek semestru) manipulace s rupicemi zalžení testu c kntrlvat během testu barvení, Ludx, ftgrafvání manipulace s chvstskky zalžení testu c kntrlvat během testu fltační metda ftgrafvání zalžení semínek na naklíčení zalžení testů pdmínky testu uknčení testu měření délky křínků vyhdncení výsledk Realizace testů (nutn začít d plviny semestru), studenti sami: není apd. manipulace s hlísticemi zalžení testu Ludx extrakce pčítání pd mikrskpem navažují připravenu kntaminvanu půdu d nádb na test přidávají rganismy a ptravu během testu kntrlují ptravu a úbytek vlhksti d testů s E. fetida a E. crypticus nasazují rganismy přím z chvu, u testu s F. candida je ptřeba pčítat s cca 20 dny před testem na synchrnizaci p 28 dnech d zalžení testů vyhdncují mrtalitu a reprdukci E. crypticus a F. candida, p 14 dnech váhvé změny a mrtalitu u E. fetida někdy během semestru prvádí test s rstlinami Lactuca sativa Vyhdncení výsledků u PC (knec semestru) křivky dávka dpvěď, mdely a vyhdncení NOEC, LOEC, LC a EC 50/10 6

7 5 Příprava artificiální půdy, přídavek testvaných látek Artificiální půda dle OECD a ISO nrem má slžení: 10% vysušená rašelina přesátá a hmgenizvaná přes 2 mm sít, 20% kalinvý jíl s bsahem kalinitu minimálně 30% a 70% křemenný písek s minimálně 50% zrn 0,05-0,2 mm. CaCO 3 se přidává tak, aby výsledné ph (KCl) byl 6 ± 0,5. Většinu v mnžství klem 0,5%. Připravte 20 kg tét půdy tak, že d vhdné nádby (bjem litrů) navažte 14 kg písku, 4 kg jílu a 2 kg rašeliny. Všechny kmpnenty za sucha důkladně prmíchejte, nejlépe vrtačku s míchací násadu. K jednmu kilgramu směsi přidejte 4 g CaCO 3, zamíchejte, vlhčete destilvanu vdu na 50% WHC (jak zjistit WHC půdy viz níže) a pět důkladně prmíchejte. Ovlhčenu půdu nechte d druhéh dne ustát a změřte ph půdy pstupem níže. Pkud je ph nižší než 5,5, přidejte k tmut kilgramu další 1 g CaCO 3, důkladně zamíchejte, nechte d druhéh dne ustát a pět změřte ph. Pkud ph stále nevyhvuje, přidejte další 2 g a pakujte pstup. Zjištěný přídavek dstačující na dladění ph(kcl) mezi 5,5 a 6,5 pužijte pr celu várku půdy. Ve výjimečných případech je ph s 0,4 % CaCO 3 vyšší než 6,5 a pak nezbývá než pstup s jedním kilgramem pakvat a přidat tentkrát méně CaCO 3, např. puze 3 g. 5.1 Ověření ph D kónické zkumavky s bjemem 50 ml přidejte 5 ml půdy a dplňte na 30 ml rztkem 1M KCl. Suspenzi důkladně třepte p dbu 5 minut. Vzrek nechte stát nejméně 2 hdiny a dle návdu ph metru měřte ph suspenze p důkladném prtřepání. U ph metru je také kntaktní elektrda přím na měření ph vzrku půdy. Můžete změřit ph dstatečně vlhké půdy pmcí tét elektrdy. Pzr na t, že hdnty ph měřené kntaktní elektrdu jsu 0,5 1 jedntku ph vyšší. 7

8 5.2 Měření WHC max a vlhčení půdy Labratrní praktikum půdní ektxiklgie Maximální vdní kapilární kapacita půdy (MVK či WHC max dle angl. Maximum Water Hlding Capacity) je stav, kdy je půda schpna v přirzeném ulžení udržet v kapilárních pórech největší mnžství vdy. Vyjadřuje se v jedntkách bjemu vdy na gram suché zeminy. Při takvémt nasycení se vzduch nachází jen v nekapilárních pórech, tedy zemina bsahuje největší mnžství vdy hygrskpické, balvé a kapilární. Prcentuální vyjádření WHC znamená klik prcent nasycení půdy vdu - maximální WHC max (100% WHC) - je pžadván. Padesát g suché artificiální půdy umístěte d předem zváženéh a vysušenéh válečku s fritu vespd, zeminu pklepte, aby sesedla. Válec umístěte d nádby s vdu tak, aby hladina vdy byla asi ve výšce slupce vzrku. Ve vdní lázni válec pnechte 3 hdiny, pté jej přemístěte na misku s pískem (s tkaninu na pvrchu). Miska s pískem a vzrky musí být přikryta, aby se zabránil vysušení vzrků. P 3 h zvažte váleček i s půdu. Vážení pakujte p 30 min, a pkud se tat 2 vážení liší, nechte váleček další hdinu na misce s pískem. Vzrek se i s válečkem p zvážení vysušte d knstantní hmtnsti při 105 ± 5 C a pět zvažte. WHC max vypčtěte dle vztahu: WHC max (ml.g -1 ) = (M vz M k 50) / 50, kde M vz je hmtnst nasycené zeminy i s válcem (g) a M k je hmtnst válce (g). Vlhkst artificiální půdy d testů je ideální cca 50 % WHC. Vzhledem k tmu, že výchzí artificiální půda je zcela suchá směs stačí WHC max pdělit dvěmi a vynásbit mnžstvím vlhčvané půdy v gramech a víte, klik destilvané vdy musíte přidat. 5.3 Přídavek kntaminantů d půdy Testvaná látka rzpustná ve vdě (v tmt případě kadmium jak CdCl 2. 2H 2 O) se přidává d půdy suché jak rztk ve vdě ptřebné pr vlhčení půdy na pžadvané prcent WHC. Vyučující připraví rztky pžadvané kncentraci a aplikujte je d suché půdy. Následně půdu s rztky důkladně prmíchá. Připraven je 2 kg čerstvé váhy pr každu z 8 kncentrací 32, 63, 125, 250, 500, 1000, 2000, 4000 mg Cd/kg suš. Dstatečné mnžství nekntaminvané artificiální půdy je vlhčen na pžadvané prcent WHC destilvanu vdu a služí jak kntrla. Každá skupina studentů testuje dvě kncentrace a kntrlu, vše ve třech pakvání pr každý test. Na knci cvičení si skupiny navzájem vymění výsledky. 8

9 6 Chv a test s rupicí Enchytraeus crypticus 6.1 Zalžení chvu Rupice druhu Enchytraeus crypticus chváme na 1% agaru v plastvých Petrih miskách (před zalžením testu jsu rupice přemísťvány pr aklimatizaci d artificiální půdy). Rupice přeneste háčkem ze půvdníh chvu na nvě připravený agar. Misky uchvávejte v termstatu neb v klimatizvané inkubační místnsti při 18 ± 2 C. Každý týden rupice zkntrlujte a přidejte špetku ptravy na pvrch agaru. 6.2 Pstup testu D každé testvací skleničky navažte 20 g půdy a přimíchejte ptravu - pmleté autklávvané vesné vlčky. Na daný bjem půdy stačí malá kpistka vesných vlček. Ptravu vmíchejte d půdy. Před zalžením testu byly rupice aklimatizvány v artificiální půdě. Naberte část artificiální půdy kvvu lžičku a přeneste ji d skleněné Petrih misky naplněné vdu. Artificiální půdu jemně rzmíchejte ve vdě a pmcí háčku vyberte dspělé rupice (velcí červíci s paskem - bílá ztluštěnina ve střední části jejich těla). D každé skleničky dejte 10 dspělců. Pté skleničky uzavřete a zvažte (hmtnst zaznamenejte na nádbku či d labratrníh deníku). Skleničky umístěte d inkubační místnsti d 18 ± 2 C. Každý týden d skleniček přidejte špetku namletých vlček. Pkud jsu patrné zbytky předchzí ptravy, musí být nejprve dstraněny háčkem. P 28 dnech expzice uknčete test. D každé testvací nádby přidejte 5 ml etanlu a vdvdní vdu tak, aby dsahvala cca 3 cm nad pvrch půdy. Pté přidejte µl rztku Bengálské červeně (0,01 g v 1 ml etanlu). Skleničky zavřete víčky a směs něklik vteřin prtřepejte. Skleničky se vzniklu suspenzí nechte d druhéh dne stát při labratrní tepltě. 9

10 Další den vyhdnťte pčet rupic v testvacích skleničkách. P barvení jsu dspělé rupice červené, jednznačně větší než velké mnžství přítmných juvenilů a mají viditelný pasek. Všechny nalezené rupice jsu pvažvány za přeživší, mrtvé rganismy se rychle rzkládají. 6.3 Vyhdncení testu způsb č.1 Nachystejte si velku skleněnu Petrih misku, d které slijte trchu barvené tekutiny ze skleničky. Na dně jsu vidět barvené rupice. Pmcí plastvéh kapátka nabírejte rupice, dávejte je bkem a zaznamenávejte jejich pčet. P debrání všech rupic přilijte další část suspenze ze testvací skleničky. Zvlášť hdnťte pčet přežívajících dspělců, kteří byli na začátku nasazeni d testu, a pčet narzených mláďat pznáte je dle veliksti. 6.4 Vyhdncení testu způsb č.2 D skleničky si vymačkejte trchu bílé akrylvé barvy (veliksti říšku) a přilijte vdu Míchejte tak dluh, dkud nevznikne mléčně bílý rztk. D 400 ml kádinky si nalijte klidní rztk Ludx, přilijte část (30 ml) bíléh rztku a pět pečlivě zamíchejte. D plastvé misky přilijte bsah skleniček s barvenými rupicemi a pté přilijte asi 50 ml bíle barvenéh Ludxu. Mírně s plastvu nádbu phybujte, aby se prmíchaly vrstvy Ludxu s bsahem skleničky s rupicemi. Plžte misku na stůl a nechte chviličku ustát. Při správném prmíchání djde k vynesení barvených rupic na pvrch. Přeneste misku d ftgrafické kmry a pvrch vdní hladiny s rupicemi vyftgrafujte. Natavení ftaparátu: p zapnutí nastavte fcení na aut (zelený nápis shra), v přední části aparátu zmáčkněte tlačítk pr makr (symbl kytičky) a ftgrafvání bez blesku (symbl přeškrtnutéh blesku) Na ftkách spčítejte pčet dspělců a juvenilů. 10

11 7 Chv a test s chvstskkem Flsmia candida 7.1 Zalžení chvu Kultura F. candida se chvá v plastvých krabičkách neb na Petrih miskách. Smíchejte sádru a aktivní uhlí v pměru cca 9 :1. Tent prášek nasypte d misek zhruba d 1 cm vrstvy. Následně patrně přidávejte destilvanu vdu až d úplné saturace. Nechte připravené misky něklik hdin zaschnut. D substrátu vytvřte strým předmětem něklik rýh (pr kladení vajíček). Optimální vlhkst pznáte tak, že černý substrát je lehce matný ne lesklý a p pkapání vdu se tat pmalu vsakuje. Dprstřed misky přidejte špetku sušených kvasnic (drždí) a pkapte destilvanu vdu. Ze starších chvů přidejte na misku pmcí exhaustru cca 40 středně velkých chvstskků. Misku dbře uzavřete a ppište. Chv uchvávejte při 20 ± 2 C. Chv je nutné kvůli pevně uzavřeným nádbám větrat minimálně dvakrát týdně, kdy také kntrlujte vlhkst substrátu a přidávejte špetku kvasnic vlhčených kapku vdy. D testů se pužívají dní staří juvenilní chvstskci. Tut synchrnní kulturu připravte tak, že 10 dspělých chvstskků dáte d nvé misky se substrátem a pté c nakladu vajíčka (cca 2 dny, ale zkntrlujte mikrskpem vajíčka jsu malé kuličky v tvrech v substrátu) je dstraňte. Pčkejte na vylíhnutí vajíček a pté, c se bjeví první juvenilvé, dpčítejte dní. 7.2 Pstup testu D skleněných nádbek na test navažte p 30 g půdy. Na pvrch půdy dejte špetku kvasnic. Ze synchrnizvanéh chvu pmcí exhaustru deberte 10 juvenilů dávejte zejména pzr na správný pčet a vyklepte je d testvací nádbky s půdu. Nádbky uzavřete a pté zvažte. 11

12 Nádby umístěte d temna a teplty 20 ± 2 C. Každý týden nádby zvažte a prvnejte váhu s půvdní. V případě úbytku dplňte vdu. Každý týden taky dsypte špetičku kvasic. P 28 dnech vyhdnťte mrtalitu a reprdukci pmcí fltační metdy. D testvací nádbky nalijte vdu z khutku a patrně prmíchejte d rvnměrné suspenze pmcí štětečku. Pté beze zbytku přelijte suspensi d pčítací nádby (zbytky půdy můžete vypláchnut něklikerým vymytím vdu). K suspenzi kápněte pár kapek inkustu a pět patrně zamíchejte štětečkem. Pčítací misku vlžte d ftgrafické kmry a vyfťte vdní hladinu digitálním ftaparátem. Natavení ftaparátu: p zapnutí nastavte fcení na aut (zelený nápis shra), v přední části aparátu zmáčkněte tlačítk pr makr (symbl kytičky) a ftgrafvání bez blesku (symbl přeškrtnutéh blesku) Na ftkách spčítejte pčet dspělců a juvenilů. 12

13 8 Test inhibice křene salátu Lactuca sativa 8.1 Předklíčení semínek Před zahájením testu se musí nechat semínka předklíčit. Na dn velkých skleněných Petrih misek plžte vatu neb filtrační papír a vlhčete tak, aby v misce nestála vda. Rvnměrně rzprstřete semínka na pvrchu a přikryjte misku víčkem. Nechte semínka klíčit při labratrní tepltě p dbu hdin. D testu vybírejte puze semínka s křínkem veliksti maximálně 2 mm. 8.2 Pstup testu D plastvých krabiček navažte 300 g půdy Dvlhčete půdu tak, aby výsledná vlhkst dpvídala 60 % WHC Pvrch půdy v krabičkách trchu uhlaďte a skleněnu tyčinku si vytvřte pravúhlu síť jamek např. 3 x 5 bdů. D vytvřených jamek pinzetu rvnměrně rzmístěte p 15 předklíčených semenech salátu. Semena saďtě křínkem vždy dlů, jemně přitlačtě k substrátu. Pzr, semínka půdu nezakrývejte. Misky se zasazenými semínky přikryjte víčkem a pnechejte v termstatu p dbu 120 ± 2 h při 24 C. P uplynutí tét dby vyndejte misky z termstatu a změřte délku křínků salátu. Každu rstlinku patrně vyndejte nejlépe pmcí lžičky, při vytahvání rstlinek ze substrátu buďte patrní, křínky jsu velmi jemné a hrzí přetržení. Délku všech křínků si zaznamenejte a z výsledků vypčítejte výslednu inhibici růstu křene. 13

14 9 Chv a test s hlísticí Caenrhabditis elegans 9.1 Zalžení chvu Hlístice C. elegans chváme na 2-3 mm NGM agaru s nárůstem E. cli (OP50) v Petrih miskách při tepltě 18 ± 2 C. Nad plamenem žehněte platinvý drátek a ze staréh chvu přeneste něklik jedinců na nvu misku získanu d vyučujícíh. Hlístice nabírejte pd binkulárním mikrskpem. Jednu týdně chv kntrlujte pd binkulárním mikrskpem, kntaminvané misky zrušte. Jedenkrát za měsíc kultury přesaďte na čerstvý agar. Před vlastními testy ppulaci synchrnizujte. Vyberte gravidní jedince (pd binkulárem jsu patrná vajíčka uvnitř těla jedince) na nvu misku, p nakladení vajíček (nejpzději druhý den) dspělce dstraňte a vajíčka nechte inkubvat v termstatu při 20 C. Z vajíček se vylíhnu dspělci p 3-4 dnech. 9.2 Pstup testu D 40 mm Petrih mističek navažte 2,3 g půd a vlhčete 1,5 ml destilvané vdy. Pté pmcí platinvéh drátku přeneste 10 synchrnizvaných jedinců d půdy na mističce. Inkubujte mističky v termstatu při 20 C p dbu 3 dnů. P sknčení expzice izlujte hlístice pmcí klidníh rztku Ludx. Půdu z mističky beze zbytku pláchněte d 50 ml centrifugační zkumavky velmi pečlivě tak, aby žádná část půdy nezůstala na mističkách. Celkem na tt pužijte maximálně ml Ludxu. Zkumavky uzavřete uzávěrem, prtřepáním vytvřte suspensi a centrifugujte při 2000 rpm cca 3 min. Pté supernatant slijte d velké Petrih misky a pd binkulárním mikrskpem pčítejte hlístice. Jedinci, kteří jsu vyextrahváni, jsu zapčítáni jak živí, mrtví jedinci se v půdě rychle rzlží. 14

15 10 Vyhdncení získaných výsledků, křivky dávka-dpvěď Výstupem většiny ektxiklgických testů jsu parametry LOEC (lwest bserved effect cncentratin = nejnižší z testvaných kncentrací, která už způsbila statisticky významný efekt), NOEC (n bserved effect cncentratin = nejvyšší z testvaných kncentrací, která ještě nezpůsbila žádný statisticky významný efekt), LC 10 a LC 50 (kncentrace při níž je pzrvána mrtalita 10% či 50%), EC 10 a EC 50 (kncentrace při níž je pzrvána inhibice reprdukce neb růstu prti kntrle 10% či 50%). Kncentrace u těcht parametrů se vyjadřují jak nminální (= mnžství látky půvdně nadávkvané d půdy) kncentrace v mg/kg suš. Následující dstavce ppisují jak pstupvat s výsledky půdníh testu ektxicity. Vytvřte ze získaných dat přehlednu tabulku, kde slupce zleva dprava jsu jedntlivé kncentrace včetně kntrly (v pdstatě kncentrace 0 mg/kg). Řádky jsu jedntlivá pakvání (v našem případě 3 řádky). U mrtality zapište tzv. survival (= přežívání) pčet živých rganismů na knci testu. Důvdem je, že v tét pdbě parametr s narůstající kncentrací klesá, stejně jak u reprdukce. U reprdukce zapište pčet juvenilů na knci testu. V prgramu MS Excel vypčítejte průměrnu hdntu, směrdatnu dchylku (SD) a relativní směrdatnu dchylku (RSD, tj. keficient variance, CV, SD dělená průměrem v prcentech) pr každu kncentraci pr ba parametry. Výsledky vyneste d grafu, kde na se X jsu kncentrace a na se Y průměrná hdnta parametru s chybvými úsečkami. Z těcht grafů dhadněte kmetricky jaké budu asi hdnty parametrů NOEC, LOEC, LC 50 a EC 50. Upravte data pr statisticku analýzu. V případě prgramu GraphPad Prism stačí tabulku tčit tak, že řádky jsu kncentrace a slupečky výsledky jedntlivých pakvání. Takt data imprtujte d statistickéh prgramu např. Statistica fr Windws neb GraphPad Prism. V případě prgramu Statistica fr Windws tak, že první slupec bsahuje kncentrace, druhý kód kncentrace (kntrla = 1, první kncentrace = 2, druhá = 3 atd.), třetí čísl pakvání, čtvrtý a pátý výsledné hdnty přežívání a reprdukce. Jedntlivá pakvání jsu tedy psána pd sebu a první a druhý slupec vlastně fungují jak kódvací. Vlžte za první slupec ještě jeden slupec, d nějž vypčítejte přirzené lgaritmy kncentrací. V prgramu Statistica fr Windws v mdulu ANOVA zjistěte, zda je celkvě významný efekt kncentrací na výsledný parametr (tj. zda ANOVA vychází s P < 0,05). Ověřte, zda je v jedntlivých kncentracích hmgenní rzptyl např. Levenvým testem (musí vyjít s P > 0,05). Následně prveďte test vzájemných kntrastů (např. Dunnetův test) mezi kncentracemi a první kncentrace, která se liší významně (P < 0,05) d předchzí je LOEC a na předchzí je NOEC. Pr určení LC 50 pužijte prbitvu regresi. Data vyjádřete tak, že v prvním slupci budete mít přirzený lgaritmus kncentrace, v druhém slupci jedničku či nulu (jak přežili / nepřežili) a ve třetím klika prcent 15

16 rganismů se přežili / nepřežili u dané kncentrace týká. Pr každu kncentraci jsu tedy uvedeny dvě čísla, klik prcent přežil (např. 20 ze 30 = 67 v řádku s jedničku) a klik prcent nepřežil (např. 10 ze 30 = 33 v řádku s nulu). Data imprtujte d statistickéh sftwaru např. Statistica fr Windws. V mdulu nelineární regrese zvlte prbitvu regresi a prveďte ji. Zde je nutn mdelvat jen suměrnu část křivky, začněte až d NOEC/LOEC kncentrací. Výsledek regrese ptm v Excelu vlžte d mdelu a namdelujte regresní křivku. Hdntu EC 50 vypčítejte na stejných datech jak byly připraveny pr ANOVA v mdulu nelineární regrese, lgistická regrese. D zadání pr rvnici zadejte vztah: Y = c / (1 + exp(-1 * b * (Lg(X) Lg(a)))), kde Y je slupec s výsledným parametrem a X je slupec s nelgaritmvanu kncentrací a a, b, c jsu parametry křivky. Pr mdel pužijte metdu nejmenších čtverců a Levenberg-Mardquardt algritmus. Zde musíte přibližně nastavit hdnty parametrů - c (pčáteční hdnta křivky - kntrla, strp dat), b (skln - většinu -1 až -3), a (dhadvaná 50% inhibice). Výsledky mdelu vlžte d MS Excel a mdelujte regresní křivku. Hdnta a je přím EC 50 včetně 95% intervalů splehlivsti. 16